CN102533776A - 一种疫苗佐剂ccl19及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种疫苗佐剂CCL19及制备方法和应用。该佐剂制备方法简单，质量易于控制，易大规模生产，易保存和运输，成本低。实验结果表明该佐剂能够同时显著提高机体细胞免疫和体液免疫的水平，能增强黏膜表面抗原特异性的抗体水平。

Description

一种疫苗佐剂CCL19及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程、蛋白质工程和免疫学领域，具体地说，本发明涉及一种疫苗佐剂CCL19，同时还涉及一种疫苗佐剂CCL19的制备方法，还涉及一种疫苗佐剂CCL19的用途。

背景技术

在人类对抗疾病的过程中，疫苗发挥着至关重要的作用。自从第一个疫苗——天花疫苗的发明以来，许多曾经致死的疾病都因为相应疫苗的研制成功而得以攻克或使其死亡率大大降低。然后，至今仍然存在许多疾病急待有效疫苗的出现，如艾滋病、流感等，以及一些新生的病毒性疾病，如禽流感、SARS、拉沙热等(Rappuoli，R.，C.W.Mandl，et al.(2011).″Vaccines for the twenty-first century society.″Nat RevImmunol.)。改良或研制出一个有效的疫苗可以从很多方面着手，其中选用合适佐剂是一种有效且易行的方法。合适的佐剂可以增强抗原的抗原性和免疫原性，从而使机体产生足够强的免疫力(包括体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫等)，抵抗致病病原体的入侵和/或致病。

一个理想的佐剂应具有刺激机体针对抗原产生更强的免疫应答反应，而佐剂本身不具有或具有较弱的抗原性和免疫原性，不对机体产生其它副作用。细胞因子，由于其特殊的性质：一方面，它参与免疫系统的调节，与机体的免疫能力密切相关，另一方面，由于它是机体自身蛋白，从而本身不具有抗原性和免疫原性，近年来，成为疫苗佐剂研究的热点对象。IFN-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-15、IL-18和IL-21等都已证明具有较好的佐剂效应(Bolesta，E.，A.Kowalczyk，et al.(2006).″Increased level and longevity ofprotective immune responses induced by DNA vaccine expressing the HIV-1 Env glycoprotein when combinedwith IL-21 and IL-15 gene delivery.″J Immunol 177(1)：177-191.)(专利号：200510119721.5；200710306039.6；200610147664.6；200510119720.0；200480036307.1)。CC趋化因子配体19(CCL19)，又称为EBI1趋化因子(ELC)，或者巨噬细胞炎性蛋白3b(MIP-3-beta)，组成型表达于多种淋巴器官中位于T细胞区的基质细胞和树突状细胞。CCL19通过与其受体CCR7的作用，趋化吸引

静态T细胞和树突状细胞向局部淋巴结和淋巴组织迁移(Nagira，M.，T.Imai，et al.(1997).″Molecular Cloning of a Novel Human CCChemokine Secondary Lymphoid-Tissue Chemokine That Is a Potent Chemoattractant for Lymphocytes andMapped to Chromosome 9p13.″Journal of Biological Chemistry 272(31)：19518-19524；Baekkevold，E.S.，T.Yamanaka，et al.(2001).″The CCR7 ligand elc(CCL19)is transcytosed in high endothelial venules and mediatesT cell recruitment.″J Exp Med 193(9)：1105-1112；Yanagawa，Y.and K.Onoe(2002).″CCL19 induces rapiddendritic extension of murine dendritic cells.″Blood 100(6)：1948-1956；Marsland，B.J.，P.Battig，et al.(2005).″CCL19 and CCL21 induce a potent proinfiammatory differentiation program in licensed dendritic cells.″Immunity 22(4)：493-505.)。Joo-Hye Song等人研究发现，CCR7-CCL19/CCL21调控的树突状细胞在舌下腺免疫(黏膜免疫的一种)中起到重要的作用(Song，J.H.，J.I.Kim，et al.(2009).″CCR7-CCL19/CCL21-regulated dendritic cells are responsible for effectiveness of sublingual vaccmation.″JImmunol 182(11)：6851-6860.)。另外，还有研究发现，CCL19具有诱导Th1型T细胞免疫应答和抗肿瘤的效用(Hillinger，S.，S.-C.Yang，et al.(2003).″EBV-Induced Molecule 1 Ligand Chemokine(ELC/CCL19)Promotes IFN-{gamma-Dependent Antitumor Responses in a Lung Cancer Model.″J Immunol 171(12)：6457-6465；Hillinger，S.，S.C.Yang，et al.(2006).″CCL19reduces tumour burden in a model of advanced lungcancer.″Br J Cancer 94(7)：1029-1034；Westermann，J.，T.Nguyen-Hoai，et al.(2007).″CCL19(ELC)as anadjuvant for DNA vaccination：induction of a TH1-type T-cell response and enhancement of antitumor immunity.″Cancer Gene Ther 14(6)：523-532.)。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种疫苗的佐剂CCL19，这种佐剂可以使低应答的疫苗产生强而有效的免疫反应，这种强而有效的免疫反应包括机体针对抗原产生的有效体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫应答反应。

本发明的另一个目的是在于提供了一种疫苗的佐剂CCL19的制备方法，该制备方法过程简单，质量易于控制，适合于大规模生产，制成的佐剂易于储存和运输。

本发明的再一个目的是在于提供了一种疫苗的佐剂CCL19在肌肉注射型、滴鼻免疫型(两类)疫苗药物中的应用，该佐剂能够显著增强机体针对疫苗产生的免疫应答反应，这些免疫应答反应包括体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫反应。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

本发明所述的佐剂是指包含有CCL19基因(基因型佐剂)、蛋白(蛋白型佐剂)或生物活性片段(多肽型佐剂)的佐剂。

一种疫苗佐剂CCL19的制备方法，其步骤是：

1.从免疫接种受体分离得到脾脏细胞或外周血单核细胞(PBMC)，并抽提其总mRNA(试剂盒购自invitrogen公司)；

2.通过RT-PCR技术(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版)，将所得mRNA逆转录为单链cDNA(相关试剂购自invitrogen公司)；

3.设计CCL19特异性扩增的PCR引物对，并通过引物对在基因两端分别引入合适酶切位点，然后通过PCR(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版)扩增得到CCL19基因片段；所述的引物对为(引物所引入酶切位点为下划线所标示序列，酶切位点名称标注于引物后的括号内)：

小鼠：

正义链引物：5′-ATTAGAATTCATGGCCCCCCGTGTGACCCCACTCC-3′(EcoRI)

反义链引物：5′-TCTCTCGAGTCAAGACACAGGGCTCCTTCTGGTG-3′(XhoI)人：

正义链引物：5′-ATGAATTCATGGCCCTGCTACTGGCCCT-3′(EcoRI)

反义链引物：5′-TTCTCGAGTTAACTGCTGCGGCGCTTCA-3′(XhoI)

4.对CCL19基因片段和pcDNA3.1(+)(invitrogen公司)，分别进行双酶切(NEB公司)，酶切得到的粘性末端片段通过T4连接酶(NEB公司)连接，得到重组表达质粒；

5.将连接产物转化大肠杆菌DH5α(TaKaRa公司)，然后将大肠杆菌在LB培养基中大量扩增培养，最后从培养好的大肠杆菌提取重组质粒(质粒提取试剂盒购自Omega公司)；

6.重组质粒序列测定(上海桑尼公司)后，序列正确的重组质粒即为本发明所述的基因型佐剂CCL19-pcDNA3.1。其中一种分离的基因(小鼠源基因型佐剂CCL19)，其序列为SEQ ID 1所示核苷酸序列，一种分离的基因(人源基因型佐剂CCL19)，其序列为SEQ ID 3所示核苷酸序列。

7.序列正确的CCL19全长序列或者部分序列，通过PCR扩增后，亚克隆至原核表达载体pET-28a(Novagen公司)，转化到大肠杆菌Rosetta菌株(Novagen公司)，通过原核表达和纯化后，得到蛋白型或多肽型CCL19佐剂(方法与申请人已申请的专利“重组融合蛋白CLD的多肽、编码序列及制备方法和应用”相同，具体步骤参见该专利。专利申请号：201110030466.2)。其中一种表达并纯化的蛋白质(小鼠源蛋白型佐剂CCL19)，其序列为SEQ ID 2所示的氨基酸序列，一种表达并纯化的蛋白质(人源蛋白型佐剂CCL19)，其序列为SEQ ID 4所示氨基酸序列。

重组融合蛋白CLD的氨基酸序列的制备方法(专利申请号：201110030466.2)，其步骤是：

重组融合蛋白的表达与纯化：

A、表达载体转化菌株E.coli Rosetta菌株(市售，Novagen公司)，挑取单菌落至试管培养过夜，按照1∶100比例扩大培养至OD值为0.6-1.0，加入IPTG至终浓度为1mM，诱导4-5小时后离心收集菌体，冰浴条件下超声破碎，离心收集包含体。包含体用含1M盐酸胍的溶液洗涤两次，然后用含有5mM DTT的盐酸胍溶液溶解，室温(20-25℃，以下相同)100rpm震荡4小时，4℃，12000rpm离心30分钟，上清过0.45μm滤膜过滤。上清稀释在含10％(体积，以下相同)甘油，20mM Tris，500mM NaCl复性缓冲液中，1mM还原型谷胱甘肽/0.2mM氧化型谷胱甘肽作为氧化还原对，4℃条件下，复性24小时。

B、复性蛋白经镍螯合His-蛋白亲和层析树脂纯化后，用透析液(5％体积甘油，20mM Tris，0.2MNaCl)透析除去咪唑，平衡后，产物用超滤管浓缩。将各个复性融合蛋白浓缩至一定浓度，纯度检测采用SDS-PAGE，表明获得的蛋白纯度可以达到90％以上。

一种疫苗的佐剂CCL19在肌肉注射型、滴鼻免疫型(两类)疫苗(药物)中的应用，其使用步骤是：

1.肌肉注射型疫苗：将从大肠杆菌中提取的重组质粒CCL19-pcDNA3.1和质粒形式的抗原溶于生理盐水中，混合均匀。然后将混合均匀的抗原佐剂混合物注射至小鼠后腿股四头肌中，并以100V，50ms的脉冲电压正反极各电击三次，促进质粒转染入肌肉细胞。

2.滴鼻免疫型疫苗：蛋白形式的抗原与1％的Chitosan混合均匀，制备成抗原滴鼻样品；溶于超纯水中的重组质粒CCL19-pcDNA3.1与PEI(in vivo-jet PEI，Polyplus transfection公司)混合，制备成佐剂滴鼻样品(具体步骤参见产品说明书)。免疫时，先将小鼠麻醉，然后将样品逐滴滴入小鼠鼻孔。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.佐剂为免疫受体自身基因，因而佐剂本身不会作为抗原引起机体的免疫应答反应，对机体的副作用小；

2.佐剂的制备方法简单，质量易于控制，易大规模生产，易保存和运输，成本低；

3.经相关实验证明，本发明所述的佐剂CCL19，可以增强机体对抗原的免疫应答反应。与未使用佐剂的对照组小鼠相比，通过CCL19增强的实验组小鼠，其血清中抗原特异性IgG水平有显著上升(其中肌注免疫方式的小鼠血清中抗原特异性IgG水平由619753.075上升为2665890.2，升高4.3倍；滴鼻免疫方式的小鼠血清中抗原特异性IgG水平由359839.26上升为1863976.18，升高5.2倍)，同时，反映CTL水平的分泌IFN-γ抗原特异性脾脏淋巴细胞也有明显增多(其中肌注免疫方式的小鼠脾脏中分泌IFN-γ抗原特异性脾脏淋巴细胞由每一百万细胞中28.9个上升为每一百万细胞中178.2个，升高6.2倍)。另外，实验组小鼠阴道分泌的IgA和IgG水平也有显著提高，说明其黏膜免疫水平也得到增强(其中肌注免疫方式的小鼠阴道分泌的抗原特异性IgA水平由219.81836上升为1062.1312，升高4.8倍；滴鼻免疫方式的小鼠阴道分泌的抗原特异性IgG和IgA水平分别由356.635774和2892.94002上升为4214.6454和11843.5774，分别升高11.8倍和4.1倍)。

附图说明

图1为一种佐剂mCCL19通过肌注免疫方式提高免疫后小鼠血清中抗原特异性抗体IgG的水平示意图。

pCN140+VECTOR为对照组，pCN140+mCCL19为实验组。数据统计分析采用双尾t检验，p值小于0.05认为组间有显著差异，p值小于0.01认为组间有极显著差异。p值标示于柱状图上方。

图2为一种佐剂mCCL19通过肌注免疫方式提高免疫后小鼠阴道黏膜表面抗原特异性抗体IgA的水平示意图。

pCN140+VECTOR为对照组，pCN140+mCCL19为实验组。数据统计分析采用双尾t检验，p值小于0.05认为组间有显著差异，p值小于0.01认为组间有极显著差异。p值标示于柱状图上方。

图3为一种佐剂mCCL19通过肌注免疫方式提高免疫后小鼠脾脏中抗原特异性分泌INF-γ的淋巴细胞数示意图。

pCN140+VECTOR为对照组，pCN140+mCCL19为实验组。数据统计分析采用双尾t检验，p值小于0.05认为组间有显著差异，p值小于0.01认为组间有极显著差异。p值标示于柱状图上方。

图4为一种佐剂mCCL19通过滴鼻免疫方式提高免疫后小鼠血清中抗原特异性抗体IgG的水平示意图。

CN140+VECTOR为对照组，CN140+mCCL19为实验组。数据统计分析采用双尾t检验，p值小于0.05认为组间有显著差异，p值小于0.01认为组间有极显著差异。p值标示于柱状图上方。

图5为一种佐剂mCCL19通过滴鼻免疫方式提高免疫后小鼠阴道黏膜表面抗原特异性抗体的水平示意图。

图5A为阴道冲洗样中抗原特异性IgA抗体水平；图5B为阴道冲洗样中抗原特异性IgG抗体水平。CN140+VECTOR为对照组，CN140+mCCL19为实验组。数据统计分析采用双尾t检验，p值小于0.05认为组间有显著差异，p值小于0.01认为组间有极显著差异。p值标示于柱状图上方。

具体实施方式

实施例1：

一种疫苗佐剂CCL19的制备方法，其步骤是：

1.从免疫接种受体分离得到脾脏细胞或外周血单核细胞(PBMC)，并抽提其总mRNA(试剂盒购自invitrogen公司)；

2.通过RT-PCR技术(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版)，将所得mRNA逆转录为单链cDNA(相关试剂购自invitrogen公司)；

3.设计CCL19特异性扩增的PCR引物对，并通过引物对在基因两端分别引入合适酶切位点，然后通过PCR(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版)扩增得到CCL19基因片段；所述的引物对为(引物所引入酶切位点为下划线所标示序列，酶切位点名称标注于引物后的括号内)：小鼠：

正义链引物：5′-ATTAGAATTCATGGCCCCCCGTGTGACCCCACTCC-3′(EcoRI)

反义链引物：5′-TCTCTCGAGTCAAGACACAGGGCTCCTTCTGGTG-3′(XhoI)人：

正义链引物：5′-ATGAATTCATGGCCCTGCTACTGGCCCT-3′(EcoRI)

反义链引物：5′-TTCTCGAGTTAACTGCTGCGGCGCTTCA-3′(XhoI)

4.对CCL19基因片段和pcDNA3.1(+)(invitrogen公司)，分别进行双酶切(NEB公司)，酶切得到的粘性末端片段通过T4连接酶(NEB公司)连接，得到重组表达质粒；

5.将连接产物转化大肠杆菌DH5α(TaKaRa公司)，然后将大肠杆菌在LB培养基中大量扩增培养，最后从培养好的大肠杆菌提取重组质粒(质粒提取试剂盒购自Omega公司)；

6.重组质粒序列测定(上海桑尼公司)后，序列正确的重组质粒即为本发明所述的基因型佐剂CCL19-pcDNA3.1。其中一种分离的基因(小鼠源基因型佐剂CCL19)，其序列为SEQ ID 1所示核苷酸序列，一种分离的基因(人源基因型佐剂CCL19)，其序列为SEQ ID 3所示核苷酸序列。

7.序列正确的CCL19全长序列或者部分序列，通过PCR扩增后，亚克隆至原核表达载体pET-28a(Novagen公司)，转化到大肠杆菌Rosetta菌株(Novagen公司)，通过原核表达和纯化后，得到蛋白型或多肽型CCL19佐剂(方法与申请人已申请的专利“重组融合蛋白CLD的多肽、编码序列及制备方法和应用”相同，具体步骤参见该专利。专利申请号：201110030466.2)。其中一种表达并纯化的蛋白质(小鼠源蛋白型佐剂CCL19)，其序列为SEQ ID 2所示的氨基酸序列，一种表达并纯化的蛋白质(人源蛋白型佐剂CCL19)，其序列为SEQ ID 4所示氨基酸序列。

重组融合蛋白CLD的氨基酸序列的制备方法(专利申请号：201110030466.2)，其步骤是：

重组融合蛋白的表达与纯化：

A、表达载体转化菌株E.coli Rosetta菌株(市售，Novagen公司)，挑取单菌落至试管培养过夜，按照1∶100比例扩大培养至OD值为0.6-1.0，加入IPTG至终浓度为1mM，诱导4-5小时后离心收集菌体，冰浴条件下超声破碎，离心收集包含体。包含体用含1M盐酸胍的溶液洗涤两次，然后用含有5mM DTT的盐酸胍溶液溶解，室温(20-25℃，以下相同)100rpm震荡4小时，4℃，12000rpm离心30分钟，上清过0.45μm滤膜过滤。上清稀释在含10％(体积，以下相同)甘油，20mM Tris，500mM NaCl复性缓冲液中，1mM还原型谷胱甘肽/0.2mM氧化型谷胱甘肽作为氧化还原对，4℃条件下，复性24小时。

B、复性蛋白经镍螯合His-蛋白亲和层析树脂纯化后，用透析液(5％体积甘油，20mM Tris，0.2MNaCl)透析除去咪唑，平衡后，产物用超滤管浓缩。将各个复性融合蛋白浓缩至一定浓度，纯度检测采用SDS-PAGE，表明获得的蛋白纯度可以达到90％以上。

实施例2：

一种疫苗佐剂CCL19在肌肉注射型疫苗(药物)中的应用，其步骤是：

小鼠源CCL19(mCCL19)与质粒抗原pCN54-gp140共免疫BALB/c小鼠增强小鼠针对CN54-gp140的体液免疫、细胞免疫及黏膜免疫水平

1.疫苗组成：

抗原：经密码子优化的pCN54-gp140质粒(简称pCN140，CN54为HIV-107B’/C亚型)(Cranage，Fraser et al.2011)

佐剂：mCCL19-pcDNA3.1(简称mCCL19)

对照：pcDNA3.1(+)空载体(简称VECTOR，invitrogen公司)

每只小鼠每次免疫剂量为：抗原50μg、佐剂或者对照100μg，用生理盐水稀释至总体积80μl，蜗旋混匀。

2.实验设计

1)实验分组

实验组：pCN140(50μg)+mCCL19(100μg)

对照组：pCN140(50μg)+VECTOR(100μg)

2)免疫策略

SPF级6至8周龄、雌性BALB/c小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)随机分成两组，每组5只，饲养于SPF级实验动物房。小鼠免疫以3周为一免疫周期，分别在0、3、6周对小鼠进行免疫。免疫采用肌肉注射加电击加强的方式。混合均匀的疫苗与佐剂注射于小鼠左右两只后腿股四头肌(40μl/腿)，并以100V，50ms的脉冲电压正反极各电击三次，促进质粒形式的抗原和佐剂成分转染入肌肉细胞。

3)样品采集：

血样和阴道冲洗样：分别于免疫前和三免一周采集。血样通过眼眶后静脉丛采集，采集后置于4℃，4-6小时，离心取血清，-80℃保存，备用。阴道冲洗样用100μl含蛋白酶抵制剂(Roche公司)的PBS冲洗阴道得到。采集后，离心取上清，-80℃保存，备用。

脾脏细胞和肠系膜淋巴结细胞：采集于三免一周。小鼠经断颈处死后，取其脾脏和肠系膜淋巴结，通过70μm尼龙网滤器(BD Falcon公司)研磨过滤，得到单细胞悬液，再经淋巴细胞分离液分选后，得到淋巴细胞悬液。得到的淋巴细胞便可用于后续实验。

3.结果和结论：

1)血清和阴道冲洗样中CN140特异性IgG、IgA滴度：

样品中CN140抗原特异性IgG、IgA滴度均采用终点滴度ELISA进行测定，具体方法如下：96孔ELISA板(NUNC MaxiSorp，Thermo Scientific公司)用5μg/ml的CN140蛋白50μl/孔于室温(20-25℃，上下相同)包被过夜。包被好的板子经PBS+0.05％Tween洗涤和1％BSA于37℃封闭一小时后，将小鼠样品按适合稀释度加入ELISA板，并以1∶3做梯度稀释，然后置于37℃孵育一小时。经PBS+0.05％Tween洗涤后，加入HRP标记的检测二抗。测定IgG滴度时，加入山羊抗小鼠IgG-HRP(1∶5000稀释，Abcam公司)，37℃孵育一小时；测定IgA滴定时，先后加入山羊抗小鼠IgA-Biotin(1∶5000稀释，Southern Biotechnology公司)，37℃孵育一小时和Streptavidin-HRP(1∶5000，R&D公司)，37℃孵育30分钟。孵育好的ELISA板经TMB(Sigma公司)显色5分钟，加入1M H₂SO₄终止反应，分别读取450nm和570nm(参照波长)的OD值。最后，以阴性样品OD₄₅₀的平均值+3倍标准差为截断值，计算各样品抗体终点滴度。实验结果见说明附图1和图2。图1为血清中抗原特异性IgG滴度；图2为阴道冲洗样中抗原特异性IgA滴度。数据统计分析采用双尾t检验，p值小于0.05认为组间有显著差异，p值小于0.01认为组间有极显著差异。

从实验结果可以看出，与对照组相比，经mCCL19和pCN140共免疫的小鼠，其血清中CN140特异性的IgG和阴道冲洗样中CN140特异性的IgA滴度都有显著升高，说明mCCL19能够增强小鼠针对抗原的体液免疫应答和黏膜免疫应答。

2)脾脏细胞INF-γELISPOT：

该实验使用的小鼠INF-γELISPOT试剂盒(购自达科为生物科技有限公司)，实验步骤按照产品说明书进行。简述如下：小鼠脾脏淋巴细胞经活细胞计数后，加入ELISPOT板中，1×10⁶/孔，每个小鼠样品设三个重复(实验孔)，并设阴性和阳性平行对照。实验孔加入刺激物CN140蛋白至20μg/ml，阳性对照孔加入concanavalinA(Sigma公司)，阴性对照加入培养基。将各孔体积用培养基调至100μl，混匀，于37℃、5％CO₂培养箱中培养72小时。然后低渗破碎细胞并清洗ELISPOT板，分别加入生物素检测抗体和Streptavidin-HRP并于37℃孵育1小时。AEC显色于37℃进行，约25分钟，然后用自来水清洗终止反应，室温晾干后，读板，计数，分析数据(Biosys公司)。实验结果见说明附图3。数据统计分析采用双尾t检验，p值小于0.05认为组间有显著差异，p值小于0.01认为组间有极显著差异。

从实验结果可以看出，与对照组相比，经mCCL19和pCN140共免疫的小鼠，其脾脏中CN140特异性、分泌INF-γ的T淋巴细胞有显著增多，说明mCCL19能够增强小鼠针对抗原的细胞免疫应答反应。

实施例3：

一种疫苗佐剂CCL19在滴鼻免疫型疫苗(药物)中的应用，其步骤是：

小鼠源CCL19(mCCL19)与蛋白抗原CN54-gp140共免疫BALB/c小鼠增强小鼠针对CN54-gp140的体液免疫及黏膜免疫水平

1.疫苗组成：

抗原：CN54-gp140蛋白(简称CN140，由Polymun Scientific公司表达并纯化，CN54为HIV-107B’/C亚型)

佐剂：mCCL19-pcDNA3.1(简称mCCL19)

对照：pcDNA3.1(+)空载体(简称VECTOR，invitrogen公司)

每只小鼠每次免疫剂量为：抗原5μg、佐剂或者对照15μg。

抗原配制：5μg CN54-gp140蛋白溶于含1％Chitosan的生理盐水中，蜗旋混匀。

佐剂配制：使用商用的佐剂PEI(in vivo-jet PEI，Polyplus transfection公司)，15μg佐剂或对照载体与PEI混合(N/P＝7，总体积为30μl)，详细步骤参见产品说明书。

2.实验设计：

1)实验分组

实验组：CN140(5μg)+mCCL19(15μg)

对照组：CN140(5μg)+VECTOR(15μg)

2)免疫策略

SPF级6至8周龄、雌性BALB/c小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)随机分成两组，每组5只，饲养于SPF级实验动物房。小鼠免疫以3周为一免疫周期，分别在0、3、6周对小鼠进行免疫，蛋白免疫先于质粒免疫三天进行。蛋白免疫和质粒免疫均采用滴鼻方式：

小鼠经麻醉后，将样品逐滴滴入小鼠鼻孔。

3)样品采集

样品采集方法同应用实例1。

3.结果和结论：

1)血清和阴道冲洗样中CN140特异性IgG、IgA滴度

样品中CN140抗原特异性IgG、IgA滴度均采用终点滴度ELISA进行测定，方法与应用实例2相同。实验结果见说明图4和图5。图4为血清中抗原特异性IgG滴度；图5A为阴道冲洗样中抗原特异性IgA滴度；图5B为阴道冲洗样中抗原特异性IgG滴度。数据统计分析采用双尾t检验，p值小于0.05认为组间有显著差异，p值小于0.01认为组间有极显著差异。从实验结果可以看出，与对照组相比，经mCCL19和CN140共免疫的小鼠，其血清中CN140特异性的IgG和阴道冲洗样中CN140特异性的IgG和IgA滴度都有显著升高，说明mCCL19能够增强小鼠针对抗原的体液免疫应答和黏膜免疫应答。

4.总结论

CCL19作为免疫佐剂，能够显著提高机体针对抗原的体液免疫、细胞免疫以及黏膜免疫水平。

Claims (7)

1.一种分离的基因，其序列为SEQ ID 1所示的核苷酸序列。

2.一种表达并纯化的蛋白质，其序列为SEQ ID 2所示的氨基酸序列。

3.一种分离的基因，其序列为SEQ ID 3所示的核苷酸序列。

4.一种表达并纯化的蛋白质，其序列为SEQ ID 4所示的氨基酸序列。

5.权利要求1至4所述的一种疫苗佐剂CCL19的制备方法，其步骤是：

A、从免疫接种受体分离得到脾脏细胞或外周血单核细胞，并抽提其总mRNA；

B、通过RT-PCR技术，将所得mRNA逆转录为单链cDNA；

C、设计CCL19特异性扩增的PCR引物对，并通过引物对在基因两端分别引入合适酶切位点，然后通过PCR扩增得到CCL19基因片段；所述的引物对为：

小鼠：

正义链引物：5′-ATTAGAATTCATGGCCCCCCGTGTGACCCCACTCC-3′

反义链引物：5′-TCTCTCGAGTCAAGACACAGGGCTCCTTCTGGTG-3′

人：

正义链引物：5′-ATGAATTCATGGCCCTGCTACTGGCCCT-3′

反义链引物：5′-TTCTCGAGTTAACTGCTGCGGCGCTTCA-3′

D、对CCL19基因片段和pcDNA3.1(+)，分别进行双酶切，酶切得到的粘性末端片段通过T4连接酶连接，得到重组表达质粒；

E、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后将大肠杆菌在LB培养基中大量扩增培养，最后从培养好的大肠杆菌提取重组质粒；

F、重组质粒序列测定后，序列正确的重组质粒即为本发明所述的基因型佐剂CCL19-pcDNA3.1。

6.权利要求1至5中所述的一种疫苗佐剂CCL19在肌肉注射型疫苗中的应用。

7.权利要求1至5中所述的一种疫苗佐剂CCL19在滴鼻免疫型疫苗中的应用。

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