CN102352342B - 一种用于扩增cik的方法及一种cik细胞制剂 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫细胞体外培养领域，涉及一种用于扩增CIK的方法以及一种CIK细胞制剂，具体采用如下程序：a、应用淋巴细胞分离液分离出PBMC，将培养袋预先用CD3mAb和CD137mAb包被，将分离得到的PBMC用无血清培养基调整浓度之1×10⁶/ml，并加入IFN-γ至终浓度为1000u/ml，转移至培养袋中培养；b、培养24小时后加入CD3mAb、CD28mAb、CD137mAb，并加入配置的无血清培养基，配置的无血清培养基中添加了IL-1α、IL-2、IL-12及IL-15，连续培养7-21天后，离心收集获得的CIK细胞；c、b步骤的培养过程中，每隔3天对培养袋中的细胞进行计数，并根据细胞浓度补加培养基，每隔6天添加CD3mAb，CD28mAb，CD137mAb至相应浓度；从而提高了CIK细胞增殖细胞倍数和细胞毒活性。

Description

一种用于扩增CIK的方法及一种CIK细胞制剂

技术领域

本发明属于免疫细胞体外培养领域，涉及一种用于扩增CIK的方法，所述CIK细胞为经由外周血单个核细胞(PBMC)扩增培养成细胞因子诱导的杀伤细胞，本发明还进一步的提供了一种CIK细胞制剂。

背景技术

生物治疗是通过调动宿主天然防卫机制或给予天然产生的靶向性很强的物质来达到临床治疗效果，生物治疗领域中一个重要的方法就是免疫细胞疗法，即将分离的自身免疫细胞在体外通过细胞因子诱导，扩增初大量具有高度细胞毒活性的异质细胞群(CIK)，再回输至体内发挥治疗作用。此类免疫细胞的种类包括了淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)，肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)，细胞毒淋巴细胞(CTL)，CD3单抗激活的杀伤细胞(CD3AK)及细胞因子诱导的杀伤细胞。在众多的免疫细胞中，CIK细胞由于有杀瘤活性高，杀瘤谱广，对多种耐药细胞同样敏感以及对正常骨髓造血前提细胞毒性更小等优良特点，广泛的应用于临床。

与其它免疫细胞相比，CIK细胞是已知的杀伤活性最强的效应细胞之一。它是通过加入多种细胞因子，由外周血单个核细胞培养而来的一群异质细胞，CIK细胞临床治疗效果主要取决于回输细胞的数量和细胞毒活性。CIK细胞中最具细胞毒活性的是CD3+CD56+细胞(NKT细胞)，NKT细胞表面能够同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性又具备NK细胞的非MHC限制性杀瘤的特点，然而NKT细胞在正常的外周血中含量极低，仅为1％左右。因此，在体外培养中，提高CIK细胞的绝对数量和其中的NKT细胞的比例对提高临床治疗效果至关重要。

CIK细胞能通过体外诱导而大量增殖，一般的CIK制备方法是将分离的外周血单个核细胞(PBMC)用IFN-γ处理24小时后，加入CD3mAb，IL-1α和IL-2因子进行刺激诱导，最终获得一定数量的CIK细胞，但最终获得的CIK细胞的增值倍数和细胞毒活性都不够理想。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是常规CIK扩增方法所得到的CIK细胞增殖细胞倍数和细胞毒活性不够理想的问题，并针对该问题提供一种用于扩增CIK的方法。

本发明通过以下技术方案解决上述问题：

一种用于扩增CIK的方法，其特征在于，按如下程序实施：

a、应用淋巴细胞分离液分离出PBMC，将培养袋预先用CD3mAb和CD137mAb包被，将分离得到的PBMC用无血清培养基调整浓度之1×10⁶/ml，并加入IFN-γ至终浓度为1000u/ml，转移至培养袋中培养；

b、培养24小时后加入CD3mAb、CD28mAb、CD137mAb，并加入配置的无血清培养基，配置的无血清培养基中添加了IL-1α、IL-2、IL-12及IL-15，连续培养7-21天后，离心收集获得的CIK细胞；

c、b步骤的培养过程中，每隔3天对培养袋中的细胞进行计数，并根据细胞浓度补加培养基，每隔6天添加CD3mAb，CD28mAb，CD137mAb至相应浓度。

与常规的培养方法相比，本发明的有益效果表现在以下几方面：

第一，本发明所述用于扩增CIK的方法在a步骤采用了培养袋包被技术。试验表明，附着的单抗比游离的单抗对细胞的促有丝分裂作用更强，从而有助于提高了细胞的扩增水平；

第二，在b步骤使用了多种单抗。在CIK的培养体系中，CIK细胞是通过诱导活化的T细胞分化而来，CD3mAb作为抗原刺激提供了T细胞活化的第一信号，而CD28mAb作为T细胞表面的共刺激分子与其配体结合，提供了T细胞活化的第二信号，试验结果表明，共刺激分子的存在有利于增强T细胞的活化效果；而CD137/CD137L则是TNFR/TNF超家族成员之一，两者结合后介导的共刺激信号同样可刺激T细胞增殖，本发明所述用于扩增CIK的方法，在b步骤中同时加入了3种单抗，既相对降低了单个抗体的使用总量，又通过单抗相互间的协同作用刺激T细胞高通量地活化增殖，从而使收获的CIK细胞数量有了大比例的提高；

第三，在b步骤中使用了多个白细胞介素的组合，即延长了CIK细胞的存活周期又提高了细胞毒活性。IL-12主要由活化的巨噬细胞和B细胞产生，能刺激多种免疫细胞的增殖和杀伤作用，是TH0细胞想TH1细胞方向分化过程中的必要因子；而IL-15是一种多功能的细胞因子，是造血前体细胞向NK细胞定向发育的决定性因子，具有促进NK细胞增生，上调NK细胞毒活性，促进NK细胞分泌各种细胞因子参与免疫调节和趋化作用。常规的培养体系中仅应用了IL-1α及IL-2，本发明中通过加入了IL-12及IL-15，增加了多因子间的相互协同作用，不但可以促进CIK细胞的扩增数量及CD3+CD56+细胞比例的增加，还可以大幅度提高CIK细胞的毒活性。

本发明还进一步的对用于扩增CIK的方法中所涉及的各种浓度进行了限定，以使CIK细胞增殖细胞倍数和细胞毒活性进一步提高：

对于a步骤，一种较优的方案是a步骤中用于包被培养袋的CD3mAb的浓度为50ng/ml-30ug/ml，用于包被培养袋的CD137mAb的浓度为10ng/ml-20ug/ml；

一种更优的方案是，a步骤中用于包被培养袋的CD3mAb的浓度为0.5ug/ml-20ug/ml，用于包被培养袋的CD137mAb的浓度为50ng/ml-10ug/ml。

对于b步骤，一种较优的方案是b步骤中加入无血清培养基中的CD3mAb终浓度为5ng/ml-5ug/ml，加入无血清培养基中的CD28mAb终浓度为5ng/ml-5ug/ml，加入无血清培养基中的CD137mAb终浓度为1ng/ml-1ug/ml；

b步骤中所述的无血清培养基中，含有的IL-1α浓度为10u/ml-1000u/ml，含有的IL-2浓度为50u/ml-3000u/ml，含有的IL-12浓度为1ng/ml-100ng/ml，含有的IL-15浓度为1ng/ml-1000ng/ml；

一种更优的方案是b步骤中加入无血清培养基中的CD3mAb终浓度为50ng/ml-500ng/ml，加入无血清培养基中的CD28mAb终浓度为50ng/ml-500ng/ml，加入无血清培养基中的CD137mAb终浓度为5ng/ml-500ng/ml；

b步骤中所述的无血清培养基中，含有的IL-1α浓度为50u/ml-500u/ml，含有的IL-2浓度为100u/ml-2000u/ml，含有的IL-12浓度为5ng/ml-50ng/ml，含有的IL-15浓度为5ng/ml-500ng/ml。

本发明还提供了一种CIK细胞制剂，该细胞制剂包括由本发明所述用于扩增CIK细胞的方法制备的CIK细胞、白蛋白、IL-2以及生理盐水，制备方法一般是将CIK细胞重悬于含有白蛋白以及IL-2的生理盐水中。

就上段内容所提到的细胞制剂组成成分，本发明通过实验发现，在IL-2细胞因子的基础上，再添加白蛋白后，能够较不添加白蛋白之前，更有利于保持CIK细胞活性，提高细胞的存活率。

一种优选的方案是，所述生理盐水中白蛋白的浓度为5g/L～80g/L，生理盐水中IL-2的浓度为1×10⁵U/ml～1×10⁷U/ml；

一种更优的方案是，所述生理盐水中白蛋白的浓度为10g/L～40g/L，I生理盐水中L-2的浓度为1×10⁶U/ml～3×10⁶U/ml；

一种最优的方案是，所述生理盐水中白蛋白的浓度为25g/L，生理盐水中的IL-2的浓度为3×10⁶U/ml。

具体实施方式

实施例

本实施例的目的是通过与现有技术实施方案的对比，使本领域技术人员充分的了解本发明的技术方案及相应的技术效果，至于本实施例所用到的各种试剂均在市场上能够买到，不同厂家生产的试剂按照本领域常规处理后，不会造成本实施例实验结果的不同，所使用的无血清培养基为添加了2％自体血清的商品化无血清培养基。

(一)、本实施例所采用的用于扩增CIK的方法

一种扩增CIK的方法，包括：

①、应用血细胞分离机或从外周全血中获得外周血单个核细胞(PBMC)，将PBMC用无血清培养基悬浮，并调整浓度之1×10⁶/ml，将培养袋预先用10ug/ml CD3mAb和CD137mAb包被，并加入IFN-γ至终浓度为1000u/ml，转移至培养袋中培养；

②、将培养袋置于37℃，CO₂浓度为5％，湿度为100％的恒温培养箱中培养24小时后加入CD3mAb、CD28mAb、CD137mAb，并加入配置的无血清培养基，配置的无血清培养基中添加了IL-1α、IL-2、IL-12及IL-15，连续在37℃，CO₂浓度为5％，湿度为100％的培养箱中连续培养21天后，离心收集获得的CIK细胞；

其中，②步骤中加入无血清培养基中的CD28mAb终浓度为100ng/ml，加入无血清培养基中的CD137mAb终浓度为20ng/ml；

②步骤中所述的无血清培养基中，含有的IL-1α浓度为300u/ml，含有的IL-2浓度为1000u/ml，含有的IL-12浓度为10ng/ml，含有的IL-15浓度为50ng/ml；

③、②步骤的培养过程中，每隔3天对培养袋中的细胞进行计数，并根据细胞浓度补加培养基，每隔6天添加CD3mAb，CD28mAb，CD137mAb至相应浓度。

(二)、常规培养方法

将采集的外周血单个核细胞用无血清培养基调整浓度为1×10⁶U/ml，第1天加入IFN-γ1000U/ml，随后将培养液置于37℃，CO₂浓度为5％，湿度为100％的恒温培养箱中培养24小时；

随后加入IL-1α、IL-2以及CD3单抗，使得IL-1α、IL-2以及CD3单抗在培养基中的终浓度分别为300U/ml、1000U/ml以及500U/ml；

接着继续在37℃，CO₂浓度为5％，湿度为100％的恒温培养箱中培养，每隔3天添加培养基，使细胞浓度保持在1×10⁶U/ml，IL-1α、IL-2以及CD3单抗的浓度分别保持在300U/ml、1000U/ml以及500U/ml。

(三)、结果测试

分别在第7、14及21天收集由本实施例所述扩增CIK的方法及常规培养方法所培养的细胞用于各项测试。

以下从几个方面比较这两种制备方法获得的CIK细胞的差异性，常规组是以常规方法获得的CIK细胞，实验组是以本实施例所提供的方法制备的CIK细胞。

I、细胞增殖倍数的测定

将取得的CIK细胞用台盼蓝染色后再用血细胞计数器进行计数，将当前的细胞总数除以培养前的单个核细胞数，数值即为细胞的扩增倍数。用此方法可以动态观察细胞的增殖状况，具体情况见表1。

表1

培养天数	0	7	14	21
					常规组	1	12.47±4.12	52.37±5.27	83.42±6.77
实验组	1	20.25±3.67	90.31±5.69	145.85±8.26

结果显示，随着培养时间的延长，两组细胞的增长倍数都在提高，但实验组在每个时间节点上的增长倍数都大幅高于常规组，差异有统计学意义(P＜0.01)。两组细胞的扩增倍数都在21天达到最高峰。

II、两组细胞间表型分析比较

分别在第0、7、14、21天取两组CIK细胞，制成细胞悬液，洗涤后调整细胞浓度为1×10⁵U/ml，加入标记的单克隆抗体，于室温暗处孵育15分钟，洗去多余抗体，用上流式细胞仪检测，结果见表2。

表2  两组CIK细胞的表型分析对比

结果显示，随着培养时间的延长，两组细胞中的CD3+细胞及CD3+CD56+细胞比例都在增加，且两者之间的差异没有统计学意义；两组细胞中的CD3+CD4+细胞比例随着时间延长而降低，从第7天开始，两组间的差异有统计学意义；两组细胞中的CD3+CD56+细胞比例方面，实验组在每个时间节点均高于常规组，且差异有统计学意义(P＜0.01)。这表明两种方法都可以大幅提高CD+细胞的比例，但在CIK细胞中的CD3+CD56+细胞比例方面，实验组要明显优于常规组(见表2)。

III、两组细胞体外杀伤活性的测定(MTT法)

取对数生长期的K562肿瘤细胞株，重悬细胞浓度为1×10⁵/ml，5×10⁴/ml，2.5×10⁴/ml，每孔100ul铺于96孔平底板中，置于37℃，CO₂浓度为5％，湿度为100％的恒温培养箱中培养24小时待用；

将培养14天的两组CIK细胞重悬为1×10⁶/ml，加入前述96孔板中，使效靶比为10∶1、20∶1以及40∶1，每个浓度各设4个复孔，并设未与肿瘤细胞反应的两组CIK细胞为效应细胞空白对照，共培养48小时后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20ul，继续培养4小时后，离心弃上清，每孔加入DMSO 100ul，于570nm处测定吸光度数值，计算杀伤率，结果见表3。

杀伤率的公式如下：

杀伤率＝[1-(试验孔A值-效应细胞A值)/靶细胞对照孔A值]×100％

表3  两组CIK细胞体外杀伤活性的对比分析

结果显示，在不同的效靶比作用下，实验组对肿瘤细胞株的杀伤率均高于常规组，不同效靶比之间的差异有统计学意义(P＜0.05)，在相同效靶比条件下，实验组的杀伤率明显优于常规组，差异有统计学意义(P＜0.01)。

IV、流式检测两组细胞中细胞因子IFN-γ的表达水平

在两组细胞培养的第0、7、14、21天取样，流式检测CD3+CD56+细胞内IFN-γ的表达水平，结果见表4。

表4  两组细胞中NKT细胞中IFN-γ水平的比较分析

结果显示，未培养的PBMC中CD3+CD56+细胞中IFN-γ表达阳性百分率仅为(22.10±4.3)％，平均荧光强度(MFI)为(2.78±0.61)，至第7、14、21天，实验组中的CD3+CD56+细胞中IFN-γ表达阳性百分率分别达到了(68.76±3.89)％，(75.49±3.45)％，(64.37±3.19)％，而常规组则为(42.38±3.84)％，(55.21±5.32)％，(49.36±4.26)％，两组在第7、14、21天的差异均有统计学意义(P＜0.01)。且实验组中CD3+CD56+细胞表达IFN-γ的平均荧光强度也均高于常规组，两组数值的差异有统计学意义(P＜0.05)。

Claims (10)

1.一种用于扩增CIK的方法，其特征在于，按如下程序实施：

a、应用淋巴细胞分离液分离出PBMC，将培养袋预先用50ng/ml-30ug/ml 的CD3mAb和10ng/ml-20ug/ml 的CD137mAb包被，将分离得到的PBMC用无血清培养基调整浓度之l×10⁶／ml，并加入IFN-γ至终浓度为1000u/m1，转移至培养袋中培养；

b、培养24小时后加入5ng/ml-5ug/ml的CD3mAb、5ng/ml-5ug/ml的cD28mAb、1ng/ml-lug/ml的CD137mAb，并加入配置的无血清培养基，配置的无血清培养基中添加了10u/ml-1000u/ml的IL-1α、50u/ml-3000u/m1的IL-2、1ng/ml-l00ng/ml的IL-12及1ng/ml-1000ng/ml的IL-15，连续培养7-21天后，离心收集获得的CIK细胞；

c、b步骤的培养过程中，每隔3天对培养袋中的细胞进行计数，并根据细胞浓度补加培养基，每隔6天添加CD3mAb，CD28mAb，CD137mAb至相应浓度。

2.根据权利要求l所述的一种用于扩增CIK的方法，其特征在于，所述的无血清培养基是添加了2％自体血清的商品化无血清培养基。

3.根据权利要求l所述的一种用于扩增CIK的方法，其特征在于，a步骤中用于包被培养袋的CD3mAb的浓度为0.5ug/ml-20ug/m1，a步骤中的用于包被培养袋的CD137mAb的浓度为50ng/ml-10ug/m1。

4.根据权利要求l所述的一种用于扩增CIK的方法，其特征在于，b步骤中加入无血清培养基中的CD3mAb终浓度为50ng/ml-500ng/ml，加入无血清培养基中的CD28mAb终浓度为50ng/ml-500ng/ml，加入无血清培养基中的CD137mAb终浓度为5ng/ml-500ng/ml。

5.根据权利要求l所述的一种用于扩增CIK的方法，其特征在于，b步骤中所述的无血清培养基中，含有的IL-1α浓度为50u/ml-500u/ml，含有的IL-2浓度为100u/ml-2000u/m1，含有的IL-12浓度为5ng/ml-50ng/ml，含有的IL-15浓度为5ng/ml-500ng/ml。

6.根据权利要求l所述的一种用于扩增CIK的方法，其特征在于a步骤中用于包被培养袋的CD3mAb的浓度为10ug/ml，用于包被培养袋的CD137mAb的浓度为1ug/ml；

b步骤中加入无血清培养基中的CD28mAb终浓度为100ng/ml，加入无血清培养基中的CD137mAb终浓度为20ng/ml；

b步骤中所述的无血清培养基中，含有的IL-1α浓度为300u/ml，含有的IL-2浓度为1000u/ml，含有的IL-12浓度为10ng/ml，含有的IL-15浓度为50ng/ml。

7.一种CIK细胞制剂，包括由权利要求1至6任意一种用于扩增CIK的方法制备的CIK细胞、白蛋白、lL-2以及生理盐水。

8.根据权利要求7所述的一种CIK细胞制剂，其特征在于所述白蛋白在生理盐水中的浓度为5-80g/L，生理盐水中的IL-2的浓度为0.1-10×10⁶U/ml。

9.根据权利要求7所述的一种CIK细胞制剂，其特征在于所述白蛋白在生理盐水中的浓度为10-40g/L，生理盐水中的IL-2的浓度为l - 6×10⁶U/m1。

10.根据权利要求7所述的一种CIK细胞制剂，其特征在于所述白蛋白在生理盐水中的浓度为25g/L，生理盐水中的IL- 2的浓度为3×10⁶U/m1。