CN113151170B - 一种高纯度外周血cik细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高纯度外周血CIK细胞的培养方法，包括步骤：将外周血单个核细胞加入含纯因子的自体血清的淋巴细胞无血清培养基中培养16天左右；培养期间，每隔2～3天需要多次添加含纯因子的培养基；培养结束后，经离心处理和氯化钠溶液清洗，达到外周血CIK细胞；向外周血CIK细胞中加入人血清白蛋白后并用氯化钠溶液定容，获得高纯度外周血CIK细胞。该培养方法，外周血单个核对自体血清无免疫排斥反应，细胞更纯，安全性更高；CIK细胞纯度高、生长快；CIK细胞杀伤活率高，具有较强的杀伤肿瘤细胞效果且扩增倍率高。

Description

一种高纯度外周血CIK细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及细胞学领域，尤其涉及一种高纯度外周血CIK细胞的培养方法。
背景技术
CIK细胞(Cytokine Induced Killer Cell)，是一类由多种细胞因子诱导的杀伤细胞，是介导细胞毒活性最强的免疫细胞，兼具有T淋巴细胞的高度杀瘤活性和NK细胞非主要组织相兼容复合物(MHC)的限制性杀瘤效应。CIK细胞其具有增殖速度快、杀瘤活性高等优点，具有TIL、LAK细胞无法比拟的优势。
现阶段而言，CIK细胞培养是将分离的外周血血单个核细胞(PBMC)用IFN-γ处理24小时后，加入CD3单抗，IL-1α和IL-2因子进行刺激诱导，获得一定数量的CIK细胞，但最终获得的CIK细胞中有效细胞含量纯度低、细胞杀伤活性弱、且细胞扩增倍率相对不高。
发明内容
基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种高纯度、高扩增倍数的外周血CIK细胞的培养方法。
本发明的技术方案如下：
一种高纯度外周血CIK细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1、从外周血中分离出单个核细胞，将所述单个核细胞加入自体血清的淋巴细胞无血清培养基中且该培养基中添加有细胞因子；静置培养16天；
S2、静置培养期间，每隔2～3天需要添加含所述细胞因子的淋巴细胞无血清培养基；
S3、细胞培养结束后，将培养好的外周血CIK细胞收集到离心管中进行离心处理后，收集外周血CIK细胞并用氯化钠溶液反复洗涤2次或3次；
S4、往步骤S3的洗涤后获得的外周血CIK细胞中加入人血清白蛋白，并用氯化钠溶液定容，得到所述高纯度外周血CIK细胞。
较好地，所述培养方法中，所述细胞因子包括IL-2、IL-15、IL-18、CD3单克隆抗体、IFN-γ、IL-1β、他克莫司及达肝素钠。
较好地，所述培养方法的步骤S2中，静置培养期间，第3天和第6天，分别需要添加含所述细胞因子的淋巴细胞无血清培养基。
较好地，所述培养方法的步骤S1和S2中，所述细胞因子中，IL-2的浓度为10～3000IU/ml、IL-15的浓度为5～500ng/ml、IL-18的浓度为5～500ng/ml、CD3单克隆抗体的浓度为5～1000ng/ml、IFN-γ的浓度为10～500μg/ml、IL-1β的浓度为10～200ng/ml、他克莫司的浓度为0.01～5ng/ml及达肝素钠的浓度为5～500IU/ml。
较好地，所述培养方法的步骤S1中，所述自体血清是经过56℃灭活过的自体血清，浓度为1-20％。
较好地，所述培养方法的步骤S2中，静置培养期间，第8天、第10天、第12天及第14天，分别需要添加含所述IL-2、他克莫司及达肝素钠的淋巴细胞无血清培养基；较好地，所述IL-2、他克莫司和达肝素钠的浓度分别为10～3000IU/ml、0.01～5ng/ml和5～500IU/ml。
较好地，所述培养方法中，所述淋巴细胞无血清培养基包括GT-T551H3培养基、CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基及RPMI-1640培养基中的一种
较好地，所述培养方法中，在所述细胞培养过程中，细胞浓度控制在1×106个/ml～3×106个/ml。
较好地，所述培养方法的步骤S3中，氯化钠溶液的浓度为0.9wt％；所述静置培养的条件为：在温度为环境温度为37℃、体积百分比为含量为5％及相对饱和湿度为100％的CO2的培养箱中培养。
较好地，所述培养方法的步骤S4中，向外周血CIK细胞中加入体积百分比为10％的人血清白蛋白10ml，并用0.9wt％氯化钠溶液定容至200ml。
与常规的培养方法相比，本发明的有益效果表现在以下几方面：
(1)、单个核细胞的分离来源于外周血，外周血单个核对自体血清无免疫排斥反应，细胞更纯，安全性更高；
(2)、培养出的CIK细胞纯度高、生长快且扩增倍率高；
(3)、培养出的CIK细胞杀伤活率高，具有较强的杀伤肿瘤细胞效果。
附图说明
图1为本发明中实施例1、2、3及对比例的外周血免疫细胞CIK生长曲线图；
图2为本发明中实施例1、2、3及对比例的外周血免疫细胞CIK扩增倍率曲线图；
图3为本发明中实施例1、2、3及对比例的外周血免疫细胞CIK对肿瘤细胞K562的杀伤曲线图；
图4a、4b、4c、4d分别为实施例1、2、3及对比例的外周血免疫细胞CIK培养16天后的CD3+CD56+表型检测图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
本发明中一些常用的术语说明如下：
IL-2：白细胞介素2；
IL-15：白细胞介素15；
IL-18：白细胞介素18；
IL-1β：白细胞介素1β；
IFN-γ：干扰素γ；
CD3单抗：细胞表面分子3单克隆抗体，可与T淋巴细胞表面的CD3F分子进行特异性结合。
本发明中，所采用的用于外周血CIK细胞的培养方法，具体操作如下：
1、外周血单个核细胞的分离
(1)粗分离
将血液分装到两支规格为50ml的离心管(标记为1号和2号离心管)中，每支离心管分装30ml，并计算血液体积。
用3ml规格的巴氏吸管吸取血样，滴2滴到EP管中，进行血细胞分析仪检测细胞数量。
将离心管中的血液离心处理；离心过程中，离心力为650g、离心时间为10min，且先升8档、后降8档。
另外准备两支相同规格的离心管(标记为3号和4号)，每支离心管加入15ml淋巴细胞分离液。
(2)血浆制备
两支装有全血的离心管离心结束后，将离心管转移至安全柜台面，用25ml移液管吸取上层血浆至一支新的离心管(标记为5号)中。取1ml血浆作为留样，标记并放置于-20度冰箱储存。将装有剩余血浆的5号离心管封口膜封口，放置56℃水浴锅，灭火30min。
灭活结束后，立即将装有血浆的5号离心管放置在-20℃冰箱中15min，随后，取出5号离心管进行离心处理，此时，离心力为3000g、离心时间为10min。
最后，将5号离心管中的血浆上清液倒入至另一支新的离心管(标记为6号)中，封口，置于2-8℃冰箱中冷冻保存，待用。
(3)单个核细胞制备
用生理盐水1:1稀释上述1号和2号离心管中剩余下层血细胞并混匀。并将对应的将血细胞稀释液分别加入到盛有淋巴细胞分离液的3号和4号离心管中。处理过程如下：
倾斜45°装有淋巴分离液的3号和4号离心管，分别用电动移液器将少量血细胞悬液加入到分离液上方1cm处，把血细胞悬液铺开；倾斜离心管的目的是使悬液与分离液接触。
再继续沿3号和4号离心管壁缓慢加入剩余的细胞悬液。操作时，切勿打乱液面界面，每管最多加到45ml。完后，保持3号和4号离心管竖直放置，小心转移放置到离心机中，进行离心处理，离心力为650g、离心时间为30分钟，且升1档，降0档。
3号和4号离心管离心结束，小心取出离心管，可清晰看到细胞分层。注意轻拿轻放，保持离心管竖直放置，以免破坏细胞分层。缓慢转移到安全柜中，用10ml移液管将上层残留血浆去除后剩余2ml，再分别吸取3号和4号离心管中第二层白膜细胞约10ml加入到另外新的对应离心管(标记为7号和8号)中。
往7号和8号离心管中分别加入生理盐水到50ml刻度，混匀。将7号和8号离心管离心处理，离心力为650g、离心时间为10min，且离心时升8档、将8档。离心结束后，分别向7号和8号离心管内加入5～10ml生理盐水重悬细胞，将各离心管中的细胞沉淀后，合并收集到7号离心管中，并添加生理盐水补足到50ml刻度，再用10ml移液管吹打均匀后，滴2滴到EP管中，进行计数。
计数结束，从细胞液中取5×107数目单个核细胞单独装入到8号离心管中并重悬到50ml。随后将8号离心管进行离心处理，离心力为300g、离心时间为10min，且离心时升8档、降8档。离心结束后，弃去上清，沉淀物即为所需的单个核细胞，也成为外周血单个核细胞(PBMC)。
2、外周血CIK细胞的培养
1)、将外周血单个核细胞转至培养瓶中，放入培养箱中静置培养3天，且在培养瓶中有添加了IL-2、IL-15、IL-18、CD3单克隆抗体、IFN-γ、IL-1β、他克莫司和达肝素钠等细胞因子的自体血清的淋巴细胞无血清培养基。
该步骤1)中，细胞因子包括IL-2、IL-15、IL-18、CD3单克隆抗体、IFN-γ、IL-1β、他克莫司及达肝素钠，且细胞因子中，IL-2的浓度为10～3000IU/ml、IL-15的浓度为5～500ng/ml、IL-18的浓度为5～500ng/ml、CD3单克隆抗体的浓度为5～1000ng/ml、IFN-γ的浓度为10～500μg/ml、IL-1β的浓度为10～200ng/ml、他克莫司的浓度为0.01～5ng/ml及达肝素钠的浓度为5～500IU/ml；自体血清是经过56℃灭活过的自体血清，浓度为1～20％。
淋巴细胞无血清培养基包括GT-T551H3培养基、CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基及RPMI-1640培养基中的一种。
同时，细胞静置培养过程中，细胞浓度控制在1×106个/ml～3×106个/ml范围内。
培养箱中静置培养的条件为：环境温度为37℃、体积百分比为含量为5％及相对饱和湿度为100％的CO2。
其中：
IL-2：促进CIK细胞的生长、增殖；
IL-15、IL-18：协同作用刺激诱导CIK细胞分化、增殖，增强CIK杀伤活性及产生细胞因子；
CD3单克隆抗体、IFN-γ、IL-1β：刺激诱导CIK细胞的形成和产生细胞因子；
他克莫司：抑制T细胞的增殖，提高CIK细胞纯度；
达肝素钠：防止细胞生长结团，提高细胞存活数量。
2)、在培养瓶中细胞静置培养的第3天(细胞接种日为第0天)和第6天，分别加入含细胞因子的自体血清的淋巴细胞无血清培养基。
该步骤中，细胞因子中，IL-2的浓度为10～3000IU/ml、IL-15的浓度为5～500ng/ml、IL-18的浓度为5～500ng/ml、CD3单克隆抗体的浓度为5～1000ng/ml、IFN-γ的浓度为10～500μg/ml、IL-1β的浓度为10～200ng/ml、他克莫司的浓度为0.01～5ng/ml及达肝素钠的浓度为5～500IU/ml。
同时，细胞静置培养过程中，细胞浓度控制在1×106个/ml～3×106个/ml范围内。
3)、从第8天开始，细胞培养转至培养袋中培养，此时，需要添加含IL-2、他克莫司和达肝素钠的淋巴细胞无血清培养基，使得细胞浓度控制在1×106个/ml～3×106个/ml范围内；其中，IL-2、他克莫司和达肝素钠的浓度分别为10～3000IU/ml、0.01～5ng/ml和5～500IU/ml。
4)、细胞培养第10天，此时，需要添加含IL-2、他克莫司和达肝素钠的淋巴细胞无血清培养基，使得细胞浓度控制在1×106个/ml～3×106个/ml范围内；其中，IL-2、他克莫司和达肝素钠的浓度分别为10～3000IU/ml、0.01～5ng/ml和5～500IU/ml。
5)、细胞培养第12天，此时，需要添加含IL-2、他克莫司和达肝素钠的淋巴细胞无血清培养基，使得细胞浓度控制在1×106个/ml～3×106个/ml范围内；其中，IL-2、他克莫司和达肝素钠的浓度分别为10～3000IU/ml、0.01～5ng/ml和5～500IU/ml。
6)、细胞培养第14天，此时，需要添加含IL-2、他克莫司和达肝素钠的淋巴细胞无血清培养基，使得细胞浓度控制在1×106个/ml～3×106个/ml范围内；其中，IL-2、他克莫司和达肝素钠的浓度分别为10～3000IU/ml、0.01～5ng/ml和5～500IU/ml。
7)、细胞培养第16天完成后，将培养袋中外周血CIK细胞及培养液一同转至离心管中，进行离心处理并去除上层液，并对采用氯化钠溶液对下层的外周血CIK细胞进行反复离心洗涤2～3次；最后用定容器收集离心管下层的沉淀物，并网沉淀物中加入人血清白蛋白，再用氯化钠溶液定容至200ml，得到高纯度外周血CIK细胞；其中，氯化钠溶液的浓度为0.9wt％，人血清白蛋白体积百分比浓度为10％、且加入量人血清白蛋白10ml；人血清白蛋白可以防止细胞结团，保持细胞活率。
与常规的培养方法相比，本发明的有益效果表现在以下几方面：
(1)、单个核细胞的分离来源于外周血，外周血单个核对自体血清无免疫排斥反应，细胞更纯，安全性更高；
(2)、培养出的CIK细胞纯度高、生长快且扩增倍率高；
(3)、培养出的CIK细胞杀伤活率高，具有较强的杀伤肿瘤细胞效果。
一、下面通过几个实施例进一步详细描述本发明外周血CIK细胞的培养
实施例1
将含细胞因子的最终浓度为10％自体血清的CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基加入到T175细胞培养瓶中，且培养基的最终体积为25ml；随后将2×106个/ml的上述制得的外周血单个核细胞加入CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基中，放入培养箱中静置培养3天，该培养箱的环境温度为37℃、环境气氛为体积百分比为5％的CO2及相对饱和湿度为100％的CO2；其中，细胞因子中包括：最终浓度为1000IU/ml的IL-2、最终浓度为50ng/ml的IL-15、最终浓度为50ng/ml的IL-18、最终浓度为200ng/ml的CD3单克隆抗体、最终浓度为80μg/ml的IFN-γ、最终浓度为40ng/ml的IL-1β、最终浓度为2ng/ml的他克莫司、最终浓度为100IU/ml的达肝素钠。
第3天，往细胞培养瓶中加入50ml含上述细胞因子的浓度为10％自体血清的CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基，进行细胞培养；其中，上述细胞因子包括：最终浓度为1000IU/ml的IL-2、最终浓度为50ng/ml的IL-15、最终浓度为50ng/ml的IL-18、最终浓度为200ng/ml的CD3单克隆抗体、最终浓度为80μg/ml的IFN-γ、最终浓度为40ng/ml的IL-1β、最终浓度为2ng/ml的他克莫司、最终浓度为100IU/ml的达肝素钠。
第6天，再次往细胞培养瓶中加入120ml含上述细胞因子的体积百分比为10％自体血清的CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基，继续进行细胞培养；其中，上述细胞因子包括：最终浓度为1000IU/ml的IL-2、最终浓度为50ng/ml的IL-15、最终浓度为50ng/ml的IL-18、最终浓度为200ng/ml的CD3单克隆抗体、最终浓度为80μg/ml的IFN-γ、最终浓度为40ng/ml的IL-1β、最终浓度为2ng/ml的他克莫司、最终浓度为100IU/ml的达肝素钠。
第8天，将细胞连同培养液转至两个2000ml规格的细胞培养袋中，同时往细胞培养袋中添加含最终浓度为1000IU/ml的IL-2、最终浓度为2ng/ml的他克莫司和最终浓度为100IU/ml的达肝素钠的CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基400ml；继续在培养箱中进行细胞培养。
第10天，再次往细胞培养袋中添加含最终浓度为1000IU/ml的IL-2、最终浓度为2ng/ml的他克莫司和最终浓度为100IU/ml的达肝素钠的CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基600ml；
第12天，往细胞培养袋中继续添加含最终浓度为1000IU/ml的IL-2、最终浓度为2ng/ml的他克莫司和最终浓度为100IU/ml的达肝素钠的CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基800ml；
第14天，最后一次添加含最终浓度为1000IU/ml的IL-2、最终浓度为2ng/ml的他克莫司和最终浓度为100IU/ml的达肝素钠的CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基1000ml；
第16天，停止培养，将培养好的外周血CIK细胞用离心管收集，离心处理，去除上层液，并用氯化钠溶液反复离心洗涤3次；最后用定容器收集离心管下层的沉淀物，并往沉淀物中加入10ml的10％的人血清白蛋白后再用氯化钠溶液定容至200ml，得到高纯度外周血CIK细胞产品。
实施例2
将含细胞因子的最终浓度为1％自体血清的GT-T551H3淋巴细胞无血清培养基加入到T175细胞培养瓶中，且培养基的最终体积为50ml；随后将1×106个/ml的上述制得的外周血单个核细胞加入GT-T551H3淋巴细胞无血清培养基中，放入培养箱中静置培养3天，该培养箱的环境温度为37℃、环境气氛为体积百分比为5％的CO2及相对饱和湿度为100％的CO2；其中，上述细胞因子包括：最终浓度为10IU/ml的IL-2、最终浓度为5ng/ml的IL-15、最终浓度为5ng/ml的IL-18、最终浓度为5ng/ml的CD3单克隆抗体、最终浓度为10μg/ml的IFN-γ、最终浓度为10ng/ml的IL-1β、最终浓度为0.01ng/ml的他克莫司、最终浓度为5IU/ml的达肝素钠。
第3天，往细胞培养瓶中加入50ml含上述细胞因子的浓度为1％自体血清的GT-T551H3淋巴细胞无血清培养基，进行细胞培养；其中，上述细胞因子包括：最终浓度为10IU/ml的IL-2、最终浓度为5ng/ml的IL-15、最终浓度为5ng/ml的IL-18、最终浓度为5ng/ml的CD3单克隆抗体、最终浓度为10μg/ml的IFN-γ、最终浓度为10ng/ml的IL-1β、最终浓度为0.01ng/ml的他克莫司、最终浓度为5IU/ml的达肝素钠。
第6天，再次往细胞培养瓶中加入120ml含上述细胞因子体积百分比为1％自体血清的GT-T551H3淋巴细胞无血清培养基，继续进行细胞培养；其中，上述细胞因子包括：最终浓度为10IU/ml的IL-2、最终浓度为5ng/ml的IL-15、最终浓度为5ng/ml的IL-18、最终浓度为5ng/ml的CD3单克隆抗体、最终浓度为10μg/ml的IFN-γ、最终浓度为10ng/ml的IL-1β、最终浓度为0.01ng/ml的他克莫司、最终浓度为5IU/ml的达肝素钠。
第8天，将细胞连同培养液转至两个2000ml规格的细胞培养袋中，同时往细胞培养袋中添加含最终浓度为10IU/ml的IL-2、最终浓度为0.01ng/ml的他克莫司和最终浓度为5IU/ml的达肝素钠的GT-T551H3淋巴细胞无血清培养基400ml；继续在培养箱中进行细胞培养。
第10天，再次往细胞培养袋中添加含最终浓度为10IU/ml的IL-2、最终浓度为0.01ng/ml的他克莫司和最终浓度为5IU/ml的达肝素钠的GT-T551H3淋巴细胞无血清培养基600ml；
第12天，往细胞培养袋中继续添加含最终浓度为10IU/ml的IL-2、最终浓度为0.01ng/ml的他克莫司和最终浓度为5IU/ml的达肝素钠的GT-T551H3淋巴细胞无血清培养基800ml；
第14天，最后一次添加含最终浓度为10IU/ml的IL-2、最终浓度为0.01ng/ml的他克莫司和最终浓度为5IU/ml的达肝素钠的GT-T551H3淋巴细胞无血清培养基1000ml；
第16天，停止培养，将培养好的外周血CIK细胞用离心管收集，离心处理，去除上层液，并用氯化钠溶液反复离心洗涤2次；最后用定容器收集离心管下层的沉淀物，并往沉淀物中加入10ml的20％的人血清白蛋白后再用氯化钠溶液定容至200ml，得到高纯度外周血CIK细胞产品。
实施例3
将含细胞因子的最终浓度为20％自体血清的RPMI-1640淋巴细胞无血清培养基加入到T175细胞培养瓶中，且培养基的最终体积为13.3ml；随后将3×106个/ml的上述制得的外周血单个核细胞加入RPMI-1640淋巴细胞无血清培养基中，放入培养箱中静置培养3天，该培养箱的环境温度为37℃、环境气氛为体积百分比为5％的CO2及相对饱和湿度为100％的CO2；其中，上述细胞因子包括：最终浓度为3000IU/ml的IL-2、最终浓度为500ng/ml的IL-15、最终浓度为500ng/ml的IL-18、最终浓度为1000ng/ml的CD3单克隆抗体、最终浓度为500μg/ml的IFN-γ、最终浓度为200ng/ml的IL-1β、最终浓度为5ng/ml的他克莫司、最终浓度为500IU/ml的达肝素钠。
第3天，往细胞培养瓶中加入50ml含上述细胞因子的浓度为20％自体血清的RPMI-1640淋巴细胞无血清培养基，进行细胞培养；其中，上述细胞因子包括：最终浓度为3000IU/ml的IL-2、最终浓度为500ng/ml的IL-15、最终浓度为500ng/ml的IL-18、最终浓度为1000ng/ml的CD3单克隆抗体、最终浓度为500μg/ml的IFN-γ、最终浓度为200ng/ml的IL-1β、最终浓度为5ng/ml的他克莫司、最终浓度为500IU/ml的达肝素钠。
第6天，再次往细胞培养瓶中加入120ml含上述细胞因子体积百分比为20％自体血清的RPMI-1640淋巴细胞无血清培养基，继续进行细胞培养；其中，上述细胞因子包括：最终浓度为3000IU/ml的IL-2、最终浓度为500ng/ml的IL-15、最终浓度为500ng/ml的IL-18、最终浓度为1000ng/ml的CD3单克隆抗体、最终浓度为500μg/ml的IFN-γ、最终浓度为200ng/ml的IL-1β、最终浓度为5ng/ml的他克莫司、最终浓度为500IU/ml的达肝素钠。
第8天，将细胞连同培养液转至两个2000ml规格的细胞培养袋中，同时往细胞培养袋中添加含最终浓度为3000IU/ml的IL-2、最终浓度为5ng/ml的他克莫司和最终浓度为500IU/ml的达肝素钠的RPMI-1640淋巴细胞无血清培养基400ml；继续在培养箱中进行细胞培养。
第10天，再次往细胞培养袋中添加含最终浓度为3000IU/ml的IL-2、最终浓度为5ng/ml的他克莫司和最终浓度为500IU/ml的达肝素钠的RPMI-1640淋巴细胞无血清培养基600ml；
第12天，往细胞培养袋中继续添加含最终浓度为3000IU/ml的IL-2、最终浓度为5ng/ml的他克莫司和最终浓度为500IU/ml的达肝素钠的RPMI-1640淋巴细胞无血清培养基800ml；
第14天，最后一次添加含最终浓度为3000IU/ml的IL-2、最终浓度为5ng/ml的他克莫司和最终浓度为500IU/ml的达肝素钠的RPMI-1640淋巴细胞无血清培养基1000ml；
第16天，停止培养，将培养好的外周血CIK细胞用离心管收集，离心处理，去除上层液，并用氯化钠溶液反复离心洗涤3次；最后用定容器收集离心管下层的沉淀物，并往沉淀物中加入10ml的10％的人血清白蛋白后再用氯化钠溶液定容至200ml，得到高纯度外周血CIK细胞产品。
对比例(常规CIK细胞培养方法)
取2×106个/ml的上述制得的外周血单个核细胞加入到含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基的培养瓶中，50ml培养基中添加有细胞因子IFN-γ，细胞因子IFN-γ在培养基中的最终浓度分别是1200ng/ml；将培养瓶放入环境温度为37℃、环境气氛为体积百分比为5％的CO2及相对饱和湿度为100％的CO2的培养箱中静置培养3天。
第2天，往细胞培养瓶中加入IL-1β、IL-2、CD3-单抗等因子，进行细胞培养；其中，IFN-γ、IL-2、CD3-单抗体蛋白在培养基中的最终浓度分别是1200ng/ml、120ng/ml及200U/ml。
第3至14天，每两天往细胞培养瓶中加入400ml含IL-2的RPMI-1640培养基，继续进行细胞培养；其中，IL-2在培养基中的最终浓度分别是2700ng/ml。
第16天，停止培养，将培养好的外周血CIK细胞用离心管收集，离心处理，去除上层液，并用氯化钠溶液反复离心洗涤3次；最后用定容器收集离心管下层的沉淀物，并往沉淀物中加入10ml的10％的人血清白蛋白后再用氯化钠溶液定容至200ml，得到外周血CIK细胞产品。
二、实验测试结果表征
(一)、CIK细胞生长测定
图1表示外周血CIK细胞培养生长曲线图；其中，PB-CIK01、PB-CIK02、PB-CIK03、PB-CIK04等曲线分别表示实施例1、实施例2、实施例3、对比例中外周血CIK细胞培养生长曲线。图1显示，细胞经过16天的培养增殖后，本发明培养方法中，他克莫司纯因子的刺激作用下，抑制了T细胞的增殖、提升了CIK细胞的纯度；而达肝素钠此细胞纯因子的刺激作用下，可以防止CIK细胞黏连成团，提升了细胞存活数量；总之，本发明培养液能有效提高CIK细胞的增殖倍数，使CIK细胞数量达到近1.86×1010/ml，远大于对比例中培养CIK细胞的数量0.95×1010个/ml；如表1所示。表1中，分别表示实施例1、实施例2、实施例3、对比例中，外周血CIK细胞在第0、2、6、8、10、12、14、16天后测得的细胞生长数量；其中，实施例1、实施例2、实施例3分别对应对比例的1.96倍、1.78倍和1.56倍。
表1外周血CIK细胞生长数量表(×108/ml)
Figure BDA0003088213240000141
(二)、外周血CIK细胞增殖数量的测定
分别取实施例1至3、对比例培养的CIK细胞，用台盼蓝染色后再用细胞计数器进行计数，将当前的细胞总数除以培养前的单个核细胞数，数值即为细胞的扩增倍数。用此方法可以动态观察细胞的增殖状况，如图2所示。图2中，PB-CIK01、PB-CIK02、PB-CIK03、PB-CIK04等曲线分别表示实施例1、实施例2、实施例3、对比例中外周血CIK细胞扩增倍率曲线。
由图2中可知，细胞经过16天的培养增殖后，本发明培养方法，在CIK细胞生长、增殖过程中，他克莫司可以通过连续刺激作用，抑制外周血T细胞的增殖，达到提升CIK细胞生长、增殖的作用；而达肝素钠又可止CIK细胞黏连成团，提升了单个CIK细胞的存活数量，进而达到CIK细胞的有效增殖倍数，使CIK细胞扩增百世达到300～370倍，远大于对比例CIK细胞的扩增倍数190倍，如表2所示；表2中，分别表示实施例1、实施例2、实施例3、对比例中外周血CIK细胞在第0、2、6、8、10、12、14、16天后测得的扩增倍率值；其中，实施例1、实施例2、实施例3分别对应对比例的1.96倍、1.78倍和1.59倍。
表2外周血CIK细胞扩增倍率表
Figure BDA0003088213240000151
(三)、CIK细胞冻存前后的活率检测
将实施例1至3、对比例的细胞进行台盼蓝染色后，用细胞计数板进行细胞计数，计算出细胞数和细胞活率，如表3。
表3细胞数和细胞活率表
Figure BDA0003088213240000152
从表3中可以看出，实施例1至3的细胞数量以及细胞活率，远高于对比例，也就说明实施例1至3培养液培养的CIK细胞扩增比例远高于对比例，尤其是实施例1。
(四)、外周血CIK细胞杀伤活性测试
取实施例1至3、对比例培养16天后的外周血CIK细胞且细胞数量相同。转至3组离心管组(每组离心管组4支离心管，每组都对应有实施例1至3、对比例中培养的CIK细胞)中，然后采用各自对应的培养液，将3组离心管组分别调整浓度约为1.0×106/ml、2.0×106/ml、4.0×106/ml的细胞悬液，作为3组效应细胞。
K562细胞作为靶细胞，按照效靶比1:1、5:1、10:1、20:1进行靶细胞K562和效应细胞CIK细胞进行铺孔，每组3个复孔。CIK细胞和K562靶细胞的每个孔分别为500μl。每孔加入500μl实施例1至3、对比例中各自对应的培养基。
效应细胞CIK细胞自然释放组：1.0×106/ml、2.0×106/ml、4.0×106/ml的CIK细胞，每孔500μl，每组3个复孔，每孔加入500μl。
K562靶细胞最大释放组：1.0×105/ml的靶细胞，每孔500μl，每组3个复孔，每孔加入500μl培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养40分钟。
K562靶细胞自然释放组：1.0×105/ml的靶细胞，每孔500μl，每组3个复孔，每孔加入500μl。
培养液空白对照试验组：每孔500μl，每组3个复孔，每孔加入500μl。
铺板后，将培养板250g离心4分钟，置于于37℃、5％CO2培养箱中培养4小时。在培养结束后前45分钟，取出培养板，在靶细胞最大释放组加入解冻液，250g离心4分钟，继续培养45分钟取出，之后轻轻混匀细胞，再300g离心5min，收集上清液，用LDH(乳酸脱氢酶)测定492nm波长的吸光度值。
杀伤活性按照如下公式计算：
杀伤活性＝(A-B-C)/(D-C)×100％；
其中：
A-表示试验组吸光度值校正值；
B-表示效应细胞自然释放组；
C-表示靶细胞自然释放组；
D-表示靶细胞最大释放组；
测试结果见表4和图3
表4 CIK细胞对K562靶细胞的杀伤活性检测
组别 1:1 5:1 10:1 20:1
实施例1 39.90％ 66.20％ 82.90％ 133.80％
实施例2 11.70％ 35.60％ 46.70％ 77.50％
实施例3 15.89％ 42.60％ 75.40％ 115.08％
对比例 5.93％ 23.74％ 34.12％ 65.58％
由表4可知，在杀伤K562细胞时，本发明方法诱导的CIK细胞比对比例诱导的CIK细胞的杀伤效果更好，差异较明显，说明采用本发明实施例提供的培养方法培养CIK细胞，可以增强杀伤肿瘤的活性。尤其是，实施例1培养的CIK细胞杀伤活性最强，以及效靶比为20:1组，CIK细胞的杀伤性活性也是最好的。
如图3所示，外周血CIK细胞对肿瘤细胞K562的杀伤曲线图；其中，PB-CIK01、PB-CIK02、PB-CIK03、PB-CIK04等曲线分别表示实施例1、实施例2、实施例3、对比例中对应外周血CIK细胞杀伤活性率曲线。
(五)、外周血CIK细胞免疫表型检测
第16天后，分别取实施例1至3、对比例培养的外周血CIK细胞，制成细胞悬液并调整细胞浓度为1×105个/ml，加入标记的CD3+CD56+单克隆抗体，于室温暗处孵育15分钟，洗去多余抗体，用上流式细胞仪检测，测试结果如图4a、4b、4c、4d所示的外周血CIK细胞表型分析图。由图4a、4b、4c、4d说明，实施例1至3培养的外周血CIK细胞，培养基中添加的纯因子组合使得CD3+CD56+细胞含量高达64.15％，比对比例含量(14.06％)高出78.1％。图中4a、4b、4c、4d还说明，实施例1至3中培养的CIK细胞中CD3+细胞比例，相对对比例中培养的CIK细胞中CD3+CD56+细胞比例明显增加,也就是说，实施例1至3培养的CIK细胞扩增明显，纯因子组分对CD3+CD56+细胞有较强的诱导作用。
应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种高纯度外周血CIK细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、从外周血中分离出单个核细胞，将所述单个核细胞加入自体血清的淋巴细胞无血清培养基中且该培养基中添加有细胞因子；静置培养16天；
S2、静置培养期间，每隔2～3天需要添加含所述细胞因子的淋巴细胞无血清培养基；
S3、细胞培养结束后，将培养好的外周血CIK细胞收集到离心管中进行离心处理后，收集外周血CIK细胞并用氯化钠溶液反复洗涤2～3次；
S4、往步骤S3的洗涤后获得的外周血CIK细胞中加入人血清白蛋白，并用氯化钠溶液定容，得到所述高纯度外周血CIK细胞；
所述步骤S2中，静置培养期间，第3天和第6天，分别需要添加含所述细胞因子的淋巴细胞无血清培养基；
所述步骤S1和S2中，所述细胞因子中，IL-2的浓度为10～3000IU/ml、IL-15的浓度为5～500ng/ml、IL-18的浓度为5～500ng/ml、CD3单克隆抗体的浓度为5～1000ng/ml、IFN-γ的浓度为10～500μg/ml、IL-1β的浓度为10～200ng/ml、他克莫司的浓度为0.01～5ng/ml及达肝素钠的浓度为5～500IU/ml；
所述步骤S2中，静置培养期间，第8天、第10天、第12天及第14天，分别需要添加含所述IL-2、他克莫司及达肝素钠的淋巴细胞无血清培养基；
所述IL-2、他克莫司和达肝素钠的浓度分别为10～3000IU/ml、0.01～5ng/ml和5～500IU/ml。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述自体血清是经过56℃灭活过的自体血清，浓度为1～20％。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述淋巴细胞无血清培养基包括GT-T551H3培养基、CorningKBM581淋巴细胞无血清培养基及RPMI-1640培养基中的一种。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，在所述细胞培养过程中，细胞浓度控制在1×106个/ml～3×106个/ml。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤S3中，氯化钠溶液的浓度为0.9wt％。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤S4中，向外周血CIK细胞中加入体积百分比为10％的人血清白蛋白10ml，并用0.9wt％氯化钠溶液定容至200ml。
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