CN104371974A - 一种自体外周血淋巴细胞cik的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种自体外周血淋巴细胞的培养方法，包括如下步骤：（1）从外周血中分离单个核细胞，重悬于X-VIVO15无血清培养基中，使细胞浓度为1×106个/mL，培养3天；（2）补加X-VIVO15无血清培养基至100mL，添加IL-21×103U/mL，培养1天；（3）补加X-VIVO15无血清培养基至200-240mL，添加IL-21×103U/mL，培养3天；（4）补加X-VIVO15无血清培养基至1000ml，添加IL-21×103U/mL、CTLA-4mAb100ng/mL、PD-1mAb100ng/mL；（5）培养5-7天，制得自体外周血淋巴细胞。本发明通过向X-VIVO15无血清培养基中添加多种单抗及细胞因子，提高效应细胞群活化效率和扩增效率。特别是体外加载CTLA-4、PD-1抗体以覆盖所有CIK细胞表面的CTLA-4、PD-1分子，有效的降低了T调节细胞的含量，进一步提高CIK细胞对肿瘤的杀伤作用。
Description
技术领域
本发明属于免疫细胞体外培养技术领域，特别涉及一种自体外周血淋巴细胞CIK的培养方法。
背景技术
过继性免疫疗法是将致敏淋巴细胞（具有特异免疫力）或其产物输给细胞免疫功能低下者（如肿瘤病人），使其获得抗肿瘤免疫力，它是用来治疗肿瘤的一种免疫疗法。
细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cells，CIK）是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子（如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。
肿瘤组织的免疫逃逸性就是指肿瘤细胞通过多种机制逃避机体免疫系统识别和攻击，从而得以在体内生存和增殖的现象。机体免疫系统具有免疫监视功能，当体内出现恶变细胞时，免疫系统能够识别并通过免疫机制特异地清除这些“非己”细胞，抵御肿瘤的发生发展。然而，恶变细胞在某些情况下能通过多种机制逃避机体的免疫监视，在体内迅速增殖，形成肿瘤。也就是说：一方面，机体可通过天然和获得性免疫抵抗肿瘤的发生；另一方面，肿瘤细胞可通过多种机制逃避机体免疫的识别和攻击。其分子机理在于免疫T细胞包括CIK细胞，在其细胞表面表达着一类受体，它们的作用是一但与其相应的配体结合，就能产生一系列信号来抑制或削弱T细胞的活力。生物体通过这一机制来控制T细胞的杀伤作用，以避免它们攻击自身细胞，产生自身免疫反应。而CTLA4、PD-1分子就是这类受体。在免疫T细胞被激活、扩增的各个步骤中，一旦遭遇到表达着辅助激活配体（B7-1，CD80，CD86）的树突细胞或肿瘤细胞时，激活的T细胞通过提高CTLA-4、PD-1分子的表达，其中CTLA-4分子使之替代CD28与B7-1结合，而PD-1分子与PD-L分子接合，从而提高了T调节细胞的负调节功能，降低T细胞的杀伤功能。
目前现有的CIK技术的不足：在肿瘤的微环境中T细胞表面CTLA4和PD-1的表达量升高，与APC上的相应的配体接合，从而介导免疫负调控机制，抑制T细胞的杀伤功能。现有的CIK技术没有考虑到T调节细胞含量对肿瘤免疫逃逸的影响。用CTLA-4和PD-1单克隆抗体用来抑制T调节细胞在理论上和实验中均得到证实。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种培养自体外周血淋巴细胞的方法。
本发明中一些常用的术语说明如下；
PBMC ：外周血单个核细胞；
IL-2 ：白细胞介素2；
IL-1α ：白细胞介素1α；
IFN-γ ：干扰素γ；
CD3mAb ：细胞表面分子3单克隆抗体；
CD28mAb ：细胞表面分子28单克隆抗体；
CTLA-4mAb ：CTLA-4单克隆抗体；
PD-1mAb ：PD-1单克隆抗体。
本发明的技术方案如下：
一种自体外周血淋巴细胞CIK的培养方法，包括如下步骤：
（1）从外周血中分离外周血单个核细胞，重悬于X-VIVO15无血清培养基中，使外周血单个核细胞的细胞浓度为1×106个/mL，静置培养3天；
（2）向步骤（1）制得的培养液中补加X-VIVO15无血清培养基至100mL，同时添加IL-2，使IL-2 的浓度为1×103U/mL，静置培养1天；
（3）向步骤（2）制得的培养液中补加X-VIVO15无血清培养基至200-240mL，同时添加IL-2，使IL-2 的浓度为1×103U/mL，静置培养3天，
（4）将步骤（3）制得的培养液中补加X-VIVO15无血清培养基至1000mL，同时添加IL-2，使IL-2 的浓度为1×103U/mL，添加CTLA-4mAb 100ng/mL、PD-1mAb 100ng/mL；
（5）将步骤（4）制得的培养液静置培养5-7天，制得自体外周血淋巴细胞。
其中，步骤（1）的X-VIVO15无血清培养基添加了以下组分：rhIFN-γ 1000U/mL、胸腺法新 500ng/mL、rhIL-1a 100U/mL、CD3mAb 100ng/mL、CD28mAb 100ng/mL。
其中，所述步骤（1）～（4）中的静置培养条件为在温度为37℃、CO2体积百分比为含量为7.5%、相对饱和湿度为100% 的CO2培养箱中培养。
其中，所述步骤（5）还包括将制得的自体外周血淋巴细胞经离心后，重悬于保存液中，所述保存液含有如下组分：体积百分比为20% 的人血清白蛋白5mL，0.9wt% 氯化钠溶液定容至100mL。
本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
（1）CTLA-4浓度（ng/mL）：
0、100和500；
（2）PD-1浓度（ng/mL）：
0、100和500；
为此，本发明提出了以下9种实验筛选条件：
实验条件1：
（1）从外周血中分离外周血单个核细胞，重悬于X-VIVO15无血清培养基中，使外周血单个核细胞的细胞浓度为1×106个/mL，在37℃、7.5%CO2 CO2培养箱中培养静置培养3天；
（2）向步骤（1）制得的培养液中补加X-VIVO15无血清培养基至100mL，同时添加IL-2，使IL-2 的浓度为1×103U/mL，在37℃、7.5%CO2 CO2培养箱中静置培养1天；
（3）向步骤（2）制得的培养液中补加X-VIVO15无血清培养基至200-240mL，同时添加IL-2，使IL-2 的浓度为1×103U/mL，在37℃、7.5%CO2 CO2培养箱中静置培养3天；
（4）将步骤（3）制得的培养液中补加X-VIVO15无血清培养基至1000mL，同时添加IL-2，使IL-2 的浓度为1×103U/mL，添加CTLA-4mAb 0ng/mL、PD-1mAb 0ng/mL；
（5）将步骤（4）制得的培养液在37℃、7.5%CO2 CO2培养箱中静置培养5-7天，制得自体外周血淋巴细胞；
（6）取1*106个自体淋巴细胞，离心收集，并用流式细胞仪检测CD4+CD25+细胞所占百分比。
实验条件2―9，实验操作如实验条件1所示，各实验条件及实验结果如下：
以上结果表明，实验条件9的CTLA-4、PD-1浓度降低T调节细胞含量较优，实验条件5的CTLA-4、PD-1浓度降低T调节细胞含量更优。
本发明的有益效果如下：本发明可以有效抑制CIK细胞中的抑制性T调节细胞的含量，提高CIK细胞的杀伤活性。
附图说明
图1：培养第1天CIK CD3+CD56+细胞流式细胞仪检测结果；
图2：培养第1天CIK CD3+CD8+细胞流式细胞仪检测结果；
图3：培养第1天CIK CD4+CD25+细胞流式细胞仪检测结果；
图4：培养第7天CIK CD3+CD56+细胞流式细胞仪检测结果；
图5：培养第7天CIK CD3+CD8+细胞流式细胞仪检测结果；
图6：培养第7天CIK CD4+CD25+细胞流式细胞仪检测结果；
图7：培养第14天CIK CD3+CD56+细胞流式细胞仪检测结果；
图8：培养第14天CIK CD3+CD8+细胞流式细胞仪检测结果；
图9：培养第14天CIK CD4+CD25+细胞流式细胞仪检测结果；
图10：CIK细胞生长曲线；
图11：未加入PD-1、CTLA-4抗体培养第14天CIK CD3+CD56+细胞流式细胞仪检测结果；
图12：未加入PD-1、CTLA-4抗体培养第14天CIK CD3+CD8+细胞流式细胞仪检测结果；
图13：未加入PD-1、CTLA-4抗体培养第14天CIK CD4+CD25+细胞流式细胞仪检测结果；
图14：加入PD-1、CTLA-4抗体培养第14天CIK CD3+CD56+细胞流式细胞仪检测结果；
图15：加入PD-1、CTLA-4抗体培养第14天CIK CD3+CD8+细胞流式细胞仪检测结果；
图16：加入PD-1、CTLA-4抗体培养第14天CIK CD4+CD25+细胞流式细胞仪检测结果。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
具体地，关于下面实施例中涉及的原料生产厂家如下：
PBMC，采自肿瘤患者外周血，经分离后得到；
Ficoll，购自GE公司；
IL-2，购自山东泉港药业有限公司；
PHA-p，购自Sigma公司；
IL-1α，购自R&D Systems公司；
CD3mAb，购自R&D Systems公司；
CD28mAb，购自R&D Systems公司；
IFN-γ，购自上海凯茂生物医药有限公司；
CTLA-4，购自Biolegend公司；
PD-1，购自Biolegend公司；
CCK-8试剂盒，购自日本同仁化工；
胸腺法新，购自意大利培森药厂；
X-VIVO15培养基，购自LONZA公司。
实施例1 一种提取外周血单个核细胞的方法
一种提取外周血单个核细胞的方法，包括如下步骤：
（1）用枸橼酸钠抗凝管采集外周血30-100mL，将外周血转移至50mL离心管中，2000rmp，离心15min；
（2）弃上层血浆，用生理盐水稀释血细胞，使得血细胞:生理盐水为1:1，混匀；
（3）吸取15mLFicoll淋巴细胞分离液于50mL离心管中，将混匀的细胞悬液均匀缓慢地加至上层，形成完整的界面；
（4）1600rpm，离心20min，可见明显分层；
（5）收集界面单个核细胞，用PBS洗涤2次；
（6）用PBS重悬细胞并计数，备用。
实施例2 一种培养CIK细胞的方法
一种培养CIK细胞的方法，包括如下步骤：
（1）将实施例1分离得到的单个核细胞用X-VIVO15无血清培养基调整细胞浓度为1*106个/mL，放置37℃，7.5%CO2培养箱培养；
（2）第3天，加入X-VIVO15无血清培养基至100mL，并加入1000U/mL IL-2；
（3）第4天，加入X-VIVO15无血清培养基至240mL，并补加 IL-2使其浓度不变；
（4）第7天，将细胞悬液装入1.8L培养袋中，补加X-VIVO无血清培养基至1000mL，添加IL-2保持其浓度为1000U/mL，同时添加CTLA-4mAb 100ng/mL、PD-1mAb 100ng/mL；
（5）第14天将培养好的CIK细胞离心收集，并用0.9wt% 氯化钠溶液洗涤2次，将收集好的细胞加入体积百分比为20% 的人血清白蛋白5mL，并用0.9wt% 氯化钠溶液定容至100mL。
实施例3 CIK细胞的免疫表型检测
CIK细胞的免疫表型检测，包括步骤如下：
（1）分别取培养第1、7、14天的细胞，转移入流式检测管，加3mLPBS充分混匀，离心洗涤细胞（离心条件：1600rpm，5min）。倾去离心上清，根据细胞样本浓度和体积，用适量PBS悬浮细胞，调整细胞浓度为1x105个/ml；
（2）荧光标记细胞：标记流式检测管，每一样本标记4管，分别为管1：IgG-FITC/IgG-PE、管2：CD3-FITC/CD56-PE、管3：CD3-FITC/CD8-PE、管4：CD4-FITC/CD25-PE，每管中加入相应的荧光抗体，每种抗体量为8μL，每管加入100ul待测细胞样本悬液；
（3）漩涡振荡器上轻轻转动混匀,室温避光孵育15min；
（4）加3mLPBS洗涤，离心，1600rpm，5min，丢弃上清，加入500ulPBS悬浮沉淀，充分混匀；
（5）上机检测，结果见图1-9和表1。
表1 不同培养时间CIK细胞的免疫表型（%）
| 培养时间 | 第1天 | 第7天 | 第14天 |
| CD3+CD56+ | 1.0 | 10.9 | 21.8 |
| CD3+CD8+ | 13.3 | 62.2 | 82.1 |
| CD4+CD25+ | 5.1 | 20.8 | 1.0 |
由上述图和表可知肿瘤病人的T调节细胞含量比较高，正常人的T调节细胞占白细胞比例在1%左右。在细胞培养过程中，T调节细胞随着细胞的扩增，含量越来越多，在第7天我们加入了CTLA-4、PD-1单抗，以封闭负调节细胞。到了第14天，T调节细胞达到正常人水平。CD3+CD56+细胞和CD3+CD8+细胞随着培养天数的增加，所占比例逐渐增大。
实施例4 CIK细胞生长曲线测定
分别取培养的第1、7、14、18、21天的CIK细胞，用血分仪进行计数，绘制CIK细胞的生长曲线。结果见表2和图10。
表2 不同培养时间CIK细胞的扩增数目
| 培养天数 | 第1天 | 第7天 | 第14天 | 第18天 | 第21天 |
| 细胞数目*108 | 0.52 | 11.3 | 53.1 | 68.5 | 95.8 |
由上述表2和图10可知CIK培养在第1-7天细胞基本呈直线缓慢生长趋势，在第7天后开始达到对数生长期，到第21天达到最大数值。
实施例5 CIK细胞杀伤活性检测
取培养至第14 天的CIK细胞，肾癌细胞系ACHN，（购自中国科学院上海细胞研究所）按40:1、20:1和10:1的比例铺于96孔板中在37℃、体积百分比为7.5%CO2的条件下进行共培养，培养24h 后每孔加入CCK-8试剂10μL进行染色，在培养箱中（37℃、体积百分比为7.5%CO2）孵育2h后在450nm的波长下检测每个孔的OD值，按如下公式计算CIK细胞的杀伤率，结果如表3所示。
细胞存活率(％)=（实验组A450 平均值-调零组A450 平均值）/（对照组A450 平均值-调零组A450 平均值）×100%；
杀瘤活性（%）=1-细胞存活率。
表3不同效靶比CIK对肾癌细胞系ACHN的杀伤活性（%，X±SD）
| 效靶比 | 10:1 | 20:1 | 40:1 |
| 结果 | 51.23±2.08 | 63.44±3.16 | 85.24±3.38 |
由上述表3的结果可知，CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，有明显的效靶比。当效靶比为10:1时，CIK细胞肿瘤杀伤活性为51.23%。效靶比越高，CIK细胞杀伤肿瘤活性越强，到效靶比40:1时，CIK细胞肿瘤杀伤活性为85.24%。
实施例6 添加PD-1单抗、CTLA-4单抗与未添加PD-1单抗、CTLA-4单抗CIK细胞流式表型对比
分别取培养至第14天的添加PD-1单抗、CTLA-4单抗和未添加PD-1单抗、CTLA-4单抗的CIK细胞，方法与实施例3 CIK免疫表型检测相同，检测CIK细胞免疫表型。结果见图11-16和表4。
表4 添加PD-1单抗、CTLA-4单抗和未添加PD-1单抗、CTLA-4单抗的CIK细胞的免疫表型（%）
| 免疫表型 | 未添加PD-1单抗、CTLA-4单抗 | 添加PD-1单抗、CTLA-4单抗 |
| CD3+CD56+ | 13.4 | 10.6 |
| CD3+CD8+ | 60.1 | 76.0 |
| CD4+CD25+ | 11.0 | 1.0 |
由上述图11-16表4的结果可知，CIK细胞在未添加PD-1单抗、CTLA-4单抗CD4+CD25+T细胞含量比较高，达到CIK细胞总量的11.0%。而添加PD-1单抗、CTLA-4单抗后CD4+CD25+T细胞含量显著降低，达到CIK细胞总量的1.0%。同时CD3+CD8+杀伤性T细胞含量有所增加，达到CIK细胞总量的76%。
Claims (4)
1.一种自体外周血淋巴细胞CIK的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）从外周血中分离外周血单个核细胞，重悬于X-VIVO15无血清培养基中，使外周血单个核细胞的细胞浓度为1×106个/mL，静置培养3天；
（2）向步骤（1）制得的培养液中补加X-VIVO15无血清培养基至100mL，同时添加IL-2，使IL-2的浓度为1×103U/mL，静置培养1天；
（3）向步骤（2）制得的培养液中补加X-VIVO15无血清培养基至200-240mL，同时添加IL-2，使IL-2的浓度为1×103U/mL，静置培养3天；
（4）将步骤（3）制得的培养液中补加X-VIVO15无血清培养基至1000mL，同时添加IL-2，使IL-2的浓度为1×103U/mL，添加CTLA-4mAb 100ng/mL、PD-1mAb 100ng/mL；
（5）将步骤（4）制得的培养液静置培养5-7天，制得自体外周血淋巴细胞。
2.权利要求书1所述的一种自体外周血淋巴细胞CIK培养方法，其特征在于，其中步骤（1）的X-VIVO15无血清培养基添加以下组分：rhIFN-γ1000U/mL、胸腺法新 500ng/mL、rhIL-1a 100U/mL、CD3mAb 100ng/mL、CD28mAb 100ng/mL。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）～（4）中的静置培养条件为在温度为37℃、CO2体积百分比为含量为7.5%、相对饱和湿度为100% 的CO2培养箱中培养。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）还包括将制得的自体外周血淋巴细胞经离心后，重悬于保存液中，所述保存液含有如下组分：体积百分比为20%的人血清白蛋白5mL，0.9wt%氯化钠溶液定容至100mL。
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