CN111961648A - 一种肿瘤特异性t细胞的分离培养方法及由其获得的产品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肿瘤特异性T细胞的分离培养方法及由其获得的产品，所述分离培养方法为：首先对肿瘤患者的外周血进行预处理，再分离外周血中的单个核细胞，然后分离PD‑1阳性的单个核细胞，最后对PD‑1阳性的单个核细胞进行扩增，得到所述肿瘤特异性T细胞。本发明所涉及的分离培养肿瘤特异性T细胞的方法初始材料为肿瘤患者的外周血，无需使用患者的肿瘤组织或恶性胸腹水作为材料，取材更便捷，几乎所有的肿瘤患者均可方便采血，且无较大创伤；最终获得的T细胞肿瘤特异性高，且同时包含有CD4阳性和CD8阳性的T细胞；该方法的操作流程简单、所需时间较短。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种肿瘤特异性T细胞的分离培养方法及由其获得的产品。
背景技术
恶性肿瘤严重危害人类的生命与健康，其死亡率居各种疾病之首。肿瘤现有的三大常规治疗方法(即手术治疗、放射治疗及化学治疗)在过去的几十年里为提高肿瘤患者的生存率做出了重大贡献，但始终无法解决肿瘤的转移和复发问题，肿瘤患者的生存率近年来也不再有明显提高，三大常规治疗已遭遇到疗效瓶颈，迫切需要寻找新的能够突破肿瘤治疗疗效瓶颈的方法。
肿瘤特异性T淋巴细胞(CTL)即细胞毒性T淋巴细胞，是从抗原递呈细胞接受了抗原信息，并经过克隆扩增的可特异性识别和杀伤抗原特异性靶细胞的效应T淋巴细胞，CTL是机体清除癌变细胞的主要机制，在抗肿瘤免疫过程中发挥着主要作用。CTL不仅能通过颗粒酶和穿孔素等物质直接杀伤肿瘤细胞，还可以通过分泌一些细胞因子如IFNγ和TNFα等间接地杀伤肿瘤细胞。随着生物医学的发展，肿瘤特异性T淋巴细胞治疗近年来日益受到重视，显示出良好的应用前景，多种特异性CTL诱导培养方案应运而生。肿瘤特异性CTL治疗肿瘤疾病具有安全、靶向、高效的特点。
但是，肿瘤特异性CTL的诱导培养需要消耗大量的时间，且分离和培养步骤复杂，对技术的要求也很高，因此极大地限制了这项治疗方法在癌症患者身上的广泛运用。有学者在动物试验中发现培养体系中加入IL-2后可以扩增具有肿瘤细胞毒性的细胞，但研究发现该方法诱导细胞杀伤力不够强，诱导特异性CTL效率低下。Rosenberg等开发的TIL技术存在细胞难以获取的问题，也限制了其临床应用。且目前现有技术中分离培养肿瘤特异性T细胞所需的细胞来源主要为患者自体肿瘤组织或恶性胸腹水，获取途径不方便，且会给患者带来创伤。
CN107043749A公开了一种肿瘤浸润T淋巴细胞的分离方法，该发明所提供的从实体肿瘤中分离诱导培养肿瘤浸润T淋巴细胞的方法包括如下步骤：(1)将大小2-3mm3的肿瘤组织块加入含有分离诱导培养液的培养孔中进行培养；所述分离诱导培养液为仅含有IL-7和IL-15的RPMI-1640完全培养基；(2)每3-4天进行一次半量换液；(3)2-3周后，去除所述肿瘤组织块，培养孔中的细胞即为肿瘤浸润T淋巴细胞，采用本发明方法分离得到的TIL纯度高且具有更强的肿瘤细胞杀伤活性。但是该方法需要获取患者自体肿瘤组织较为麻烦，且耗时比较长。
CN109402054A公开了一种CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养方法，通过在培养基中同时添加一定量的细胞因子IL-2、IL-7和IL-21，并使培养过程中培养基中灭活自体血浆、细胞因子IL-2、IL-7和IL-21保持在一定的浓度范围内，从而提升CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养效果，提高CD4+记忆性T淋巴细胞的纯度及功能性。该发明的扩增培养方法可很好的适用于CD4+记忆性T淋巴细胞的扩增培养，能够诱导扩增出足够所需的细胞量，满足对该类T淋巴细胞体外扩增培养的需求。但该方法只能获取到CD4+T淋巴细胞。
综上，若能开发出一种源材料获取方式简单广泛、操作便捷、所需时间较短的肿瘤特异性T细胞的分离培养方法是非常有意义的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种肿瘤特异性T细胞的分离培养方法及由其获得的产品，此种分离培养方法操作流程简单，消耗时间短，原材料方便获取，且培养得到的T淋巴细胞的肿瘤特异性较高，同时包含有CD4阳性和CD8阳性的T淋巴细胞。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种肿瘤特异性T细胞的分离培养方法，所述分离培养方法为：首先对肿瘤患者的外周血进行预处理，再分离外周血中的单个核细胞，最后对PD-1阳性的单个核细胞进行扩增，得到所述肿瘤特异性T细胞。
绝大多数肿瘤患者在确诊之初不能进行手术，没有机会获取肿瘤组织，同时仅有部分瘤种(如肺癌、肝癌等)的患者具有恶性胸腹水，且比例较低，且并非所有胸腹水中都含有较多数量的T淋巴细胞，特异性T淋巴细胞数量更少，而本发明所涉及的分离培养肿瘤特异性T细胞的方法初始材料为肿瘤患者的外周血，无需使用患者的肿瘤组织或恶性胸腹水作为材料，取材更便捷，几乎所有的肿瘤患者均可方便采血，且无较大创伤；分离得到的T细胞肿瘤特异性高，且同时包含有CD4阳性和CD8阳性的T细胞；该方法的操作流程简单、所需时间较短。
在本发明中，所述预处理的方法可以为：使肿瘤患者在3周内接受PD-1抗体治疗。
所述接受PD-1抗体治疗的方式为：肿瘤患者按照已获批临床用的抗人PD-1抗体药物说明书进行一个周期的治疗(例如：按3mg/kg体重静脉注射纳武利尤单抗注射液)。
在本发明中，所述预处理的方法也可以为：取出肿瘤患者的外周血后在外周血中加入PD-1抗体，然后进行孵育。
若患者在3周内接受过PD-1抗体治疗，则可以直接进入后续的提取操作；若患者在3周内没有接受过PD-1抗体治疗，则需要先进行上述预处理操作，然后进入后续的提取流程。
采用上述第一种预处理方式具有如下优势：其一是可以提高外周血中原始的肿瘤特异性T细胞的比例；其二是可以提高PD-1阳性细胞活化增殖的能力。
优选地，所述PD-1抗体在外周血中的终浓度为0.2-0.8μg/mL，例如0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL、0.7μg/mL或0.8μg/mL等。
优选地，所述孵育的温度为0-6℃，例如0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃或6℃。
优选地，所述孵育的时间为0.5-24h，例如0.5h、1h、2h、4h、5h、8h、10h、12h、15h、20h或24h等。
在本发明中，所述肿瘤患者外周血包括肺癌、肾癌、肠癌、食管癌、恶性黑色素瘤或胆管癌患者的外周血。
所述外周血可以取自包括肺癌、肾癌、肠癌、食管癌、恶性黑色素瘤或胆管癌患者的外周血，初始材料的来源非常广泛，适用范围也较广。
优选地，所述分离肿瘤患者外周血中的单个核细胞的方法为：肿瘤患者外周血用Ficoll密度梯度法分离得到单个核细胞。
所述分离单个核细胞前无需对外周血用盐溶液等进行清洗即可直接用密度梯度法进行分离，大大简化了操作。
优选地，所述分离PD-1阳性的单个核细胞的方法为：将分离得到的单个核细胞与生物素修饰的抗人IgG4抗体进行一次共孵育，再加入抗生物素抗体或链霉亲和素包被的磁珠进行二次共孵育，磁力分离得到PD-1阳性的单个核细胞。
所述由PD-1阳性细胞扩增得到的细胞产品中包含CD4+和CD8+的T细胞，其比例为：1:12-4:1。
此处生物素修饰的抗人IgG4抗体也可以用生物素化的LAG-3抗体、TIM-3抗体等进行替换，此处磁力分选方式也可以用流式细胞仪分选方式替代。
随着PD-1抗体在临床中的应用愈发广泛，大部分肿瘤患者会接受该类药物的治疗，这些用药患者外周血中PD-1阳性细胞表面的PD-1分子已经被抗体结合，此时已不能直接利用PD-1抗体分离，此处利用IgG4抗体进行分离巧妙的规避了这一问题，且现有获批临床应用的PD-1抗体均为IgG4亚型。
优选地，所述一次共孵育的温度为20-30℃，例如20℃、22℃、24℃、25℃、26℃、28℃或30℃等。
优选地，所述一次共孵育的时间为10-30min，例如10min、15min、20min、25min、28min或30min等。
优选地，所述生物素修饰的抗人IgG4抗体的使用浓度为每107个单个核细胞使用1-4μg，例如1μg、1.5μg、2μg、2.5μg、3μg或4μg等。
优选地，所述二次共孵育的温度为20-30℃，例如20℃、22℃、24℃、25℃、26℃、28℃或30℃等。
优选地，所述二次共孵育的时间为5-20min，例如5min、8min、10min、12min、15min或20min等。
优选地，所述对PD-1阳性的单个核细胞进行扩增的方法为：将分离得到的PD-1阳性的单个核细胞用无血清培养液重悬，种入预包被培养瓶进行扩增，得到扩增后的所述肿瘤特异性T细胞。
优选地，所述预包被培养瓶是由重组人纤连蛋白片段(例如商品名为RetroNectinTM)和抗人CD3活化抗体(例如克隆号：OKT3)进行包被的培养瓶。
将培养瓶用重组人纤连蛋白片段和抗人CD3活化抗体同时进行进行包被处理，能使肿瘤特异性T细胞的扩增效果显著提高。
优选地，所述纤连蛋白的终浓度为4-8μg/mL，例如4μg/mL、4.5μg/mL、5μg/mL、5.5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL或8μg/mL等。
优选地，所述抗人CD3活化抗体的克隆号位OKT3，终浓度为1-2μg/mL，例如1μg/mL、1.2μg/mL、1.4μg/mL、1.6μg/mL、1.8μg/mL或2μg/mL等。
优选地，所述无血清培养液包括IL-2和蛋白激酶B抑制剂(AKTi)。
在无血清培养液中加入蛋白激酶B抑制剂(AKTi)可以使得扩增终产品中记忆性T淋巴细胞比例显著提高，其浓度选择0.5-2μM。
优选地，所述无血清培养液还包括IL-7、IL-15或IL-21中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合包括IL-7和IL-15的组合、IL-7和IL-15以及IL-21的组合等。
IL-2、IL-7、IL-15和IL-21的使用浓度分别为800-1200IU、8-12ng/mL、8-12ng/mL、8-12ng/mL。
作为本发明的优选技术方案，所述分离培养方法具体包括如下步骤：
(1)取肿瘤患者的外周血加入PD-1抗体使其终浓度为0.2-0.8μg/mL，在0-6℃下进行孵育0.5-24h；或使肿瘤患者在3周内接受PD-1抗体治疗；
(2)将步骤(1)得到的产品用Ficoll密度梯度法分离得到单个核细胞；
(3)将步骤(2)分离得到的单个核细胞与使用浓度为每107个单个核细胞使用2.5μg的生物素化的抗人IgG4抗体在20-30℃下共孵育10-30min，再加入抗生物素抗体或链霉亲和素包被的磁珠在20-30℃下共孵育5-20min，磁力分离得到PD-1阳性的单个核细胞；
(4)将步骤(3)分离得到的PD-1阳性的单个核细胞用包含有IL-2、IL-7、IL-15、IL-21和蛋白激酶B抑制剂的无血清培养液重悬，种入被4-8μg/mL纤连蛋白和1-2μg/mL抗人CD3抗体处理后的预包被培养瓶进行扩增，得到扩增后的肿瘤特异性T细胞。
另一方面，本发明提供一种使用如上所述的分离培养方法分离得到的肿瘤特异性T细胞。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所涉及的分离培养肿瘤特异性T细胞的方法初始材料为肿瘤患者的外周血，无需使用患者的肿瘤组织或恶性胸腹水作为材料，取材更便捷，几乎所有的肿瘤患者均可方便采血，且无较大创伤；相对于先筛选获得CD8阳性T细胞群、再从所获得T细胞群中筛选PD1阳性T细胞的现有技术，本发明分离得到的T细胞肿瘤特异性高，且分离得到的T细胞群中同时包含有CD4阳性和CD8阳性的T细胞，具有更强的肿瘤细胞杀伤活性；该方法的操作流程简单、所需时间较短。
附图说明
图1是五种培养方式获得的终产品内效应记忆性T细胞比例(CD4阳性细胞)。
图2是五种培养方式获得的终产品内效应记忆性T细胞比例(CD8阳性细胞)。
图3是实施例2中样本1在两种不同的预处理方式下的肿瘤特异性T细胞增殖倍数结果统计图。
图4是实施例2中样本2在两种不同的预处理方式下的肿瘤特异性T细胞增殖倍数结果统计图。
图5是实施例11中利用多色流式细胞仪检测由样本3-12得到的细胞终产品的组成成分统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1培养基中因子类型对细胞终产品中效应记忆性T淋巴细胞比例的影响
本实施例探究五种不同的培养方式对细胞终产品中效应记忆性T细胞(具体的表型为：CD3+CD8+CD45RA-CCR7-和CD3+CD4+CD45RA-CCR7-)比例的影响，其具体操作包括如下步骤：
(1)取3周内经过PD-1抗体治疗的肾癌患者的外周血；
(2)将步骤(1)得到的外周血用Ficoll密度梯度法分离得到单个核细胞；
(3)将步骤(2)分离得到的单个核细胞与使用浓度为每107个单个核细胞使用2.5μg的生物素化的抗人IgG4抗体在25℃下共孵育20min，再加入抗生物素抗体包被的磁珠在25℃下共孵育10min，磁力分离得到PD-1阳性的单个核细胞；
(4)将步骤(3)分离得到的PD-1阳性的单个核细胞分别用含有IL-2、含有IL-2、IL-7和IL-15、含有IL-2和IL-21、含有IL-2和AKTi以及同时含有IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、AKTi的无血清培养液重悬，种入被6μg/mL纤连蛋白和1.5μg/mL抗人CD3抗体处理后的预包被培养瓶进行扩增，10天后得到扩增后的肿瘤特异性T细胞产品(IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、AKTi的使用量分别为1000IU、10ng/mL、10ng/mL、10ng/mL、1μM)。
分别对终产品中CD4阳性细胞和CD8阳性细胞所包含的效应记忆性T细胞(TEM，即CD3+CD8+CD45RA-CCR7-和CD3+CD4+CD45RA-CCR7-)的比例进行统计，其值越高代表肿瘤特异性T细胞的扩增效果越好，结果如图1和图2所示(图中纵坐标中CD45RA-CCR7-即表征CD45RA和CCR7双阴性表达的效应记忆T细胞亚群，横坐标IL-2、IL-2/7/15、IL-2/21、IL-2/AKTi、IL-2/7/15/21/AKTi分别表示用含有IL-2、含有IL-2、IL-7和IL-15、含有IL-2和IL-21、含有IL-2和AKTi以及同时含有IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、AKTi的无血清培养液)：与分别在含有IL-2的培养液中加入IL-7、IL-15、IL-21相比，在含有IL-2的培养液中加入蛋白激酶B抑制剂可以显著提高T细胞的扩增效果，具有统计学差异。
实施例2两种不同的PD-1抗体预处理方式对PD-1阳性细胞增殖能力的影响
本实施例探究两种不同的PD-1抗体预处理方式对分离得到的肿瘤特异性T细胞扩增速度的影响，本实施例共进行两个样本的实验，其一是宫颈癌患者的外周血(样本1)，其二是恶性黑色素瘤患者的外周血(样本2)，具体操作包括如下步骤：
(1)分别在PD-1抗体药物治疗前、后(3周内)取宫颈癌患者和恶性黑色素瘤患者的外周血。未经PD-1抗体药物治疗的患者外周血中加入PD-1抗体使其终浓度为0.5μg/mL，在4℃下进行孵育0.5h，以此作为预处理组1；经过PD-1抗体药物治疗后的患者外周血直接用于步骤(2)，作为预处理组2；
(2)将步骤(1)得到的外周血用Ficoll密度梯度法分离得到单个核细胞；
(3)将步骤(2)分离得到的单个核细胞与使用浓度为每107个单个核细胞使用2.5μg的生物素化的抗人IgG4抗体在25℃下共孵育20min，再加入抗生物素抗体包被的磁珠在25℃下共孵育10min，磁力分离得到PD-1阳性的单个核细胞；
(4)将步骤(3)分离得到的PD-1阳性的单个核细胞用含有IL-2和AKTi的无血清培养液重悬，种入被6μg/mL纤连蛋白和1.5μg/mL抗人CD3抗体处理后的预包被培养瓶进行扩增，分别在0天、6天和14天后统计PD-1阳性T细胞的数量，结果如图3和图4所示：与预处理组1相比，预处理组2中的两个样本肿瘤特异性T细胞的扩增能力显著提高。
实施例3对分离得到T细胞的肿瘤特异性的评价试验(样本为肾癌患者外周血)
本实施例评价分离得到的T细胞识别自体来源肿瘤细胞的能力，用分泌IFN-γ细胞占CD8+和CD4+细胞的比例(即CD8+IFN-γ+％，CD4+IFN-γ+％)来进行表征，比例越高说明T细胞的肿瘤特异性越高。
具体操作包括如下步骤：
(1)试验共分为三组，分别为未分选组、PD-1阴性组和PD-1阳性组；
(2)取肾癌患者的外周血，添加PD-1抗体使其终浓度为0.5μg/mL并孵育(预处理)；
(3)将步骤(2)得到的外周血用Ficoll密度梯度法分离得到单个核细胞；
(4)将步骤(3)分离得到的单个核细胞与使用浓度为每107个单个核细胞使用2.5μg的生物素化的抗人IgG4抗体在25℃下共孵育20min，再加入抗生物素抗体包被的磁珠在25℃下共孵育10min，磁力分离得到PD-1阳性的单个核细胞，即PD-1阳性组；分选剩余部分为PD-1阴性组；不进行此步骤操作的为未分选组；
(5)将上述三组细胞分别用含有IL-2和AKTi的无血清培养液重悬，种入被6μg/mL纤连蛋白和1.5μg/mL抗人CD3抗体处理后的预包被培养瓶进行扩增，14天后得到扩增后的T细胞，使T细胞分别在有肿瘤细胞刺激和无肿瘤细胞刺激下，统计分泌IFN-γ细胞占CD8+和CD4+细胞的比例，具体方法为：
首先获取患者自体肿瘤细胞(来源于肿瘤组织)：将手术获取的肾癌组织剪碎，添加胶原酶、透明质酸酶、DNA酶于37℃恒温培养箱消化0.5-2h，之后用磷酸盐缓冲液洗两遍。然后用Ficoll梯度密度离心法获取肿瘤细胞，液氮罐内冻存备用(以此作为特异性T淋巴细胞的靶细胞)。
再进行特异性T淋巴细胞评价(共孵育法)：取上述三组培养的T细胞(未分选组、PD-1阴性组和PD-1阳性组)，经无血清培养液洗两遍后用添加IFN-γ分泌阻断剂BrefeldinA(浓度为5ng/mL)但不含任何细胞因子的无血清培养液重悬，与自体肿瘤细胞按1:1的比例混合，37℃恒温培养箱孵育6h后收细胞。细胞表面标记CD3，CD4，CD8荧光抗体后添加固定液固定，之后用胞内染色试剂盒破膜并标记IFN-γ荧光抗体，最后利用流式细胞仪检测分泌IFN-γ细胞占CD8+和CD4+细胞的比例(CD8+IFN-γ+％，CD4+IFN-γ+％)。其中，将IFN-γ抗体的同型对照(isotype)抗体标记组作为“同型对照组”，将未添加自体肿瘤细胞组作为“未刺激组”(体现T淋巴细胞自发分泌IFN-γ能力，即为背景值)，将共培养组作为“刺激组”(体现响应自体肿瘤细胞刺激的T淋巴细胞比例)。
根据实验设计，“刺激组”减去“未刺激组”得到该种细胞内特异性T细胞比例，以此评价所含肿瘤特异性T细胞的比例高低。该值越高，说明该种培养方式能够获取更多的肿瘤特异性T细胞。
结果如表1所示：在CD4+细胞亚群中，未分选组、PD-1阴性组和PD-1阳性组分别为0.62％、0.8％、1.19％，其中PD-1阳性组数值最高，表明所含肿瘤特异性T细胞最多；同样的，在CD8+细胞亚群中，未分选组、PD-1阴性组和PD-1阳性组分别为0.63％、0.68％、1.66％，其中PD-1阳性组数值最高，表明所含肿瘤特异性T细胞最多。
表1
实施例4对分离得到T细胞的肿瘤特异性的评价试验(样本为肺癌患者外周血)
具体操作包括如下步骤：
获取患者自体肿瘤细胞(来源于胸腹水)：将获取的恶性胸腹水离心，磷酸盐缓冲液重悬，用Ficoll梯度密度离心法获取肿瘤细胞，液氮罐内冻存备用(作为特异性T淋巴细胞的靶细胞)。
具体操作包括如下步骤：
(1)试验共分为三组，分别为未分选组、PD-1阴性组和PD-1阳性组；
(2)取肺癌患者的外周血，添加PD-1抗体使其终浓度为0.5μg/mL并孵育(预处理)；
(3)将步骤(2)得到的外周血用Ficoll密度梯度法分离得到单个核细胞；
(4)将步骤(3)分离得到的单个核细胞与使用浓度为每107个单个核细胞使用2.5μg的生物素化的抗人IgG4抗体在25℃下共孵育20min，再加入抗生物素抗体包被的磁珠在25℃下共孵育10min，磁力分离得到PD-1阳性的单个核细胞，即PD-1阳性组；分选剩余部分为PD-1阴性组；不进行此步骤操作的为未分选组；
(5)将上述三组细胞分别用含有IL-2和AKTi的无血清培养液重悬，种入被6μg/mL纤连蛋白和1.5μg/mL抗人CD3抗体处理后的预包被培养瓶进行扩增，14天后得到扩增后的T细胞，使T细胞分别在有肿瘤细胞刺激和无肿瘤细胞刺激下，统计分泌IFN-γ细胞占CD8+和CD4+细胞的比例，具体方法为：
首先获取患者自体肿瘤细胞(来源于胸腹水)：将获取的恶性胸腹水离心，磷酸盐缓冲液重悬，用Ficoll梯度密度离心法获取肿瘤细胞，液氮罐内冻存备用(以此作为特异性T淋巴细胞的靶细胞)。
再进行特异性T淋巴细胞评价(共孵育法)：取上述三组培养的T细胞(未分选组、PD-1阴性组和PD-1阳性组)，经无血清培养液洗两遍后用添加IFN-γ分泌阻断剂BrefeldinA(浓度为5ng/mL)但不含任何细胞因子的无血清培养液重悬，与自体肿瘤细胞按1:1的比例混合，37℃恒温培养箱孵育6h后收细胞。细胞表面标记CD3，CD4，CD8荧光抗体后添加固定液固定，之后用胞内染色试剂盒破膜并标记IFN-γ荧光抗体，最后利用流式细胞仪检测分泌IFN-γ细胞占CD8+和CD4+细胞的比例(CD8+IFN-γ+％，CD4+IFN-γ+％)。
结果如表2所示：在CD4+细胞亚群中，未分选组、PD-1阴性组和PD-1阳性组分别为0.09％、-0.03％、0.98％，其中PD-1阳性组数值最高，表明所含肿瘤特异性T细胞最多；同样的，在CD8+细胞亚群中，未分选组、PD-1阴性组和PD-1阳性组分别为0.61％、0.97％、3.25％，其中PD-1阳性组数值最高，表明所含肿瘤特异性T细胞最多。
表2
实施例5对分离得到T细胞的肿瘤特异性的评价试验(样本为恶性黑色素瘤患者外周血)
具体操作包括如下步骤：
(1)试验共分为三组，分别为未分选组、PD-1阴性组和PD-1阳性组；
(2)取恶性黑色素瘤患者的外周血，添加PD-1抗体使其终浓度为0.5μg/mL并孵育(预处理)；
(3)将步骤(2)得到的外周血用Ficoll密度梯度法分离得到单个核细胞；
(4)将步骤(3)分离得到的单个核细胞与使用浓度为每107个单个核细胞使用2.5μg的生物素化的抗人IgG4抗体在25℃下共孵育20min，再加入抗生物素抗体包被的磁珠在25℃下共孵育10min，磁力分离得到PD-1阳性的单个核细胞，即PD-1阳性组；分选剩余部分为PD-1阴性组；不进行此步骤操作的为未分选组；
(5)将上述三组细胞分别用含有IL-2和AKTi的无血清培养液重悬，种入被6μg/mL纤连蛋白和1.5μg/mL抗人CD3抗体处理后的预包被培养瓶进行扩增，14天后得到扩增后的T细胞，使T细胞分别在有肿瘤细胞刺激和无肿瘤细胞刺激下，统计分泌IFN-γ细胞占CD8+和CD4+细胞的比例，具体方法为：
首先获取患者自体肿瘤细胞(来源于肿瘤组织)：将手术获取的恶性黑色素瘤组织剪碎，添加胶原酶、透明质酸酶、DNA酶于37℃恒温培养箱消化0.5-2h，之后用磷酸盐缓冲液洗两遍。然后用Ficoll梯度密度离心法获取肿瘤细胞，液氮罐内冻存备用，以此作为特异性T淋巴细胞的靶细胞)。
再进行特异性T淋巴细胞评价(共孵育法)：与实施例3相同。
结果如表3所示：在CD4+细胞亚群中，未分选组、PD-1阴性组和PD-1阳性组分别为-0.13％、0.07％、0.51％，其中PD-1阳性组数值最高，表明所含肿瘤特异性T细胞最多；同样的，在CD8+细胞亚群中，未分选组、PD-1阴性组和PD-1阳性组分别为-0.15％、0.07％、0.5％，其中PD-1阳性组数值最高，表明所含肿瘤特异性T细胞最多。
表3
实施例6对分离得到T细胞的肿瘤特异性的评价试验(样本为食管癌患者外周血)
具体操作包括如下步骤：
(1)试验共分为三组，分别为未分选组、PD-1阴性组和PD-1阳性组；
(2)取食管癌患者的外周血，添加PD-1抗体使其终浓度为0.5μg/mL并孵育(预处理)；
(3)将步骤(2)得到的外周血用Ficoll密度梯度法分离得到单个核细胞；
(4)将步骤(3)分离得到的单个核细胞与使用浓度为每107个单个核细胞使用2.5μg的生物素化的抗人IgG4抗体在25℃下共孵育20min，再加入抗生物素抗体包被的磁珠在25℃下共孵育10min，磁力分离得到PD-1阳性的单个核细胞，即PD-1阳性组；分选剩余部分为PD-1阴性组；不进行此步骤操作的为未分选组；
(5)将上述三组细胞分别用含有IL-2和AKTi的无血清培养液重悬，种入被6μg/mL纤连蛋白和1.5μg/mL抗人CD3抗体处理后的预包被培养瓶进行扩增，14天后得到扩增后的T细胞，使T细胞分别在有肿瘤细胞刺激和无肿瘤细胞刺激下，统计分泌IFN-γ细胞占CD8+和CD4+细胞的比例，具体方法为：
首先获取患者自体肿瘤细胞(来源于肿瘤组织)：将手术获取的食管癌组织剪碎，添加胶原酶、透明质酸酶、DNA酶于37℃恒温培养箱消化0.5-2h，之后用磷酸盐缓冲液洗两遍。然后用Ficoll梯度密度离心法获取肿瘤细胞，液氮罐内冻存备用，以此作为特异性T淋巴细胞的靶细胞。
再进行特异性T淋巴细胞评价(共孵育法)：与实施例3相同。
结果如表4所示：在CD4+细胞亚群中，未分选组、PD-1阴性组和PD-1阳性组分别为0.15％、0.54％、1.36％，其中PD-1阳性组数值最高，表明所含肿瘤特异性T细胞最多；同样的，在CD8+细胞亚群中，未分选组、PD-1阴性组和PD-1阳性组分别为1.44％、2.1％、6.15％，其中PD-1阳性组数值最高，表明所含肿瘤特异性T细胞最多。
表4
实施例7对分离得到T细胞的肿瘤特异性的评价试验(样本为胆管癌患者外周血)
具体操作包括如下步骤：
(1)试验共分为三组，分别为未分选组、PD-1阴性组和PD-1阳性组；
(2)取胆管癌患者的外周血，添加PD-1抗体使其终浓度为0.5μg/mL并孵育(预处理)；
(3)将步骤(2)得到的外周血用Ficoll密度梯度法分离得到单个核细胞；
(4)将步骤(3)分离得到的单个核细胞与使用浓度为每107个单个核细胞使用2.5μg的生物素化的抗人IgG4抗体在25℃下共孵育20min，再加入抗生物素抗体包被的磁珠在25℃下共孵育10min，磁力分离得到PD-1阳性的单个核细胞，即PD-1阳性组；分选剩余部分为PD-1阴性组；不进行此步骤操作的为未分选组；
(5)将上述三组细胞分别用含有IL-2和AKTi的无血清培养液重悬，种入被6μg/mL纤连蛋白和1.5μg/mL抗人CD3抗体处理后的预包被培养瓶进行扩增，14天后得到扩增后的T细胞，使T细胞分别在有肿瘤细胞刺激和无肿瘤细胞刺激下，统计分泌IFN-γ细胞占CD8+和CD4+细胞的比例，具体方法为：
首先获取患者自体肿瘤细胞(来源于胸腹水)：将获取的恶性胸腹水离心，磷酸盐缓冲液重悬，用Ficoll梯度密度离心法获取肿瘤细胞，液氮罐内冻存备用(以此作为特异性T淋巴细胞的靶细胞)。
再进行特异性T淋巴细胞评价(共孵育法)：与实施例3相同。
结果如表5所示：在CD4+细胞亚群中，PD-1阴性组和PD-1阳性组分别为0.46％、0.3％，其中PD-1阳性组数值最高，表明所含肿瘤特异性T细胞最多；同样的，在CD8+细胞亚群中，PD-1阴性组和PD-1阳性组分别为-0.19％、1.02％，其中PD-1阳性组数值最高，表明所含肿瘤特异性T细胞最多。
表5
实施例8对分离得到T细胞的肿瘤特异性的评价试验(样本为肠癌患者外周血)
具体操作包括如下步骤：
(1)试验共分为三组，分别为未分选组、PD-1阴性组和PD-1阳性组；
(2)取肠癌患者的外周血，添加PD-1抗体使其终浓度为0.5μg/mL并孵育(预处理)；
(3)将步骤(2)得到的外周血用Ficoll密度梯度法分离得到单个核细胞；
(4)将步骤(3)分离得到的单个核细胞与使用浓度为每107个单个核细胞使用2.5μg的生物素化的抗人IgG4抗体在25℃下共孵育20min，再加入抗生物素抗体包被的磁珠在25℃下共孵育10min，磁力分离得到PD-1阳性的单个核细胞，即PD-1阳性组；分选剩余部分为PD-1阴性组；不进行此步骤操作的为未分选组；
(5)将上述三组细胞分别用含有IL-2和AKTi的无血清培养液重悬，种入被6μg/mL纤连蛋白和1.5μg/mL抗人CD3抗体处理后的预包被培养瓶进行扩增，14天后得到扩增后的T细胞，使T细胞分别在有肿瘤细胞刺激和无肿瘤细胞刺激下，统计分泌IFN-γ细胞占CD8+和CD4+细胞的比例，具体方法为：
首先获取患者自体肿瘤细胞(来源于胸腹水)：将获取的恶性胸腹水离心，磷酸盐缓冲液重悬，用Ficoll梯度密度离心法获取肿瘤细胞，液氮罐内冻存备用(以此作为特异性T淋巴细胞的靶细胞)。
再进行特异性T淋巴细胞评价(共孵育法)：与实施例3相同。
结果如表6所示：在CD4+细胞亚群中，PD-1阴性组和PD-1阳性组分别为5.37％、8.43％，其中PD-1阳性组数值最高，表明所含肿瘤特异性T细胞最多；同样的，在CD8+细胞亚群中，PD-1阴性组和PD-1阳性组分别为13.54％、20.3％，其中PD-1阳性组数值最高，表明所含肿瘤特异性T细胞最多。
表6
实施例9对分离得到T细胞的肿瘤特异性的评价试验(样本为与实施例3不同的另一肾癌患者外周血)
具体操作步骤与实施例3保持一致。
结果如表7所示，由表7数据可知：在CD4+细胞亚群中，未分选组、PD-1阴性组和PD-1阳性组分别为0.42％、7％，其中PD-1阳性组数值最高，表明所含肿瘤特异性T细胞最多；同样的，在CD8+细胞亚群中，未分选组、PD-1阴性组和PD-1阳性组分别为0.58％、8.64％，其中PD-1阳性组数值最高，表明所含肿瘤特异性T细胞最多。
表7
实施例10对分离得到T细胞的肿瘤特异性的评价试验(样本为与实施例5不同的另一恶性黑色素瘤患者外周血)
具体操作步骤与实施例5保持一致。
结果如表8所示，由表8数据可知：在CD4+细胞亚群中，未分选组、PD-1阴性组和PD-1阳性组分别为0.086％、-0.34％、0.38％，其中PD-1阳性组数值最高，表明所含肿瘤特异性T细胞最多；同样的，在CD8+细胞亚群中，未分选组、PD-1阴性组和PD-1阳性组分别为0.005％、-0.15％、0.71％，其中PD-1阳性组数值最高，表明所含肿瘤特异性T细胞最多。
表8
实施例11对扩增得到细胞终产品的组成成分的分析试验
本实施例探究经PD-1+细胞分选及扩增后得到的细胞产品的组成。本实施例共进行10个样本的实验，其中样本3-10取自恶性黑色素瘤患者的外周血样本，样本11取自肝癌患者的外周血样本，样本12取自肾癌患者的外周血样本，具体操作包括如下步骤：
(1)分别抽取3周内接受PD-1抗体药物治疗的肿瘤患者外周血；
(2)将步骤(1)得到的外周血用Ficoll密度梯度法分离得到外周血淋巴细胞；
(3)将步骤(2)分离得到的外周血淋巴细胞与使用浓度为每107个单个核细胞使用2.5μg的生物素化的抗人IgG4抗体在25℃下共孵育20min，再加入抗生物素抗体包被的磁珠在25℃下共孵育10min，磁力分离得到PD-1阳性的单个核细胞；
(4)将步骤(3)分离得到的PD-1阳性的单个核细胞用含有IL-2的无血清培养液重悬，种入被6μg/mL纤连蛋白和1.5μg/mL抗人CD3抗体处理后的预包被培养瓶进行扩增，在12-14天后取样进行组成成分分析；
(5)将步骤(4)的到的培养后细胞离心，并用PBS缓冲液洗1遍后，再用PBS缓冲液重悬(细胞密度保持105-106/mL)，添加荧光标记抗体混合液(包括：anti-CD3；anti-CD4；anti-CD8；anti-CD56/16；anti-CD45)于4度条件下孵育10-60分钟。再用PBS缓冲液洗2遍后重悬，进行多色流式细胞仪分析。
结果如表9所示，由表9数据可知：经PD-1+细胞分选及扩增后得到的细胞产品由CD4+T细胞、CD8+T细胞、NKT细胞和NK细胞组成。其中，CD4+T细胞群为CD45+CD3+CD4+CD8-；CD8+T细胞群为CD45+CD3+CD8+CD4-；NKT细胞群为CD45+CD3+CD56+/CD16+；NK细胞群为CD45+CD3-CD56+/CD16+。
表9
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种肿瘤特异性T细胞的分离培养方法及由其获得的产品，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (13)
1.一种肿瘤特异性T细胞的分离培养方法，其特征在于，所述分离培养方法为：首先对肿瘤患者的外周血进行预处理，再分离外周血中的单个核细胞，然后分离PD-1阳性的单个核细胞，最后对PD-1阳性的单个核细胞进行扩增，得到所述肿瘤特异性T细胞。
2.如权利要求1所述的肿瘤特异性T细胞的分离培养方法，其特征在于，所述预处理的方法为：使肿瘤患者在3周内接受PD-1抗体治疗。
3.如权利要求1所述的肿瘤特异性T细胞的分离培养方法，其特征在于，所述预处理的方法为：取出肿瘤患者的外周血后在外周血中加入PD-1抗体，然后进行孵育；
优选地，所述PD-1抗体在外周血中的终浓度为0.2-0.8μg/mL，更优选为0.5μg/mL；
优选地，所述孵育的温度为0-6℃，更优选为4℃；
优选地，所述孵育的时间为0.5-24h，更优选为0.5h。
4.如权利要求1所述的肿瘤特异性T细胞的分离培养方法，其特征在于，所述扩增得到的PD-1阳性T细胞由还表达CD4或CD8的T细胞组成。
5.如权利要求4所述的肿瘤特异性T细胞的分离培养方法，其特征在于，所述由PD-1阳性细胞扩增得到的细胞产品中还包含CD4+和CD8+的T细胞，其比例为：1:12-4:1。
6.如权利要4所述的肿瘤特异性T细胞的分离培养方法，其特征在于，所述选择的PD-1阳性T细胞中还包括NKT和NK细胞。
7.如权利要求1-6中任一项所述的肿瘤特异性T细胞的分离培养方法，其特征在于，所述肿瘤患者外周血包括肺癌、肾癌、肠癌、食管癌、恶性黑色素瘤或胆管癌患者的外周血。
8.如权利要求1-6中任一项所述的肿瘤特异性T细胞的分离培养方法，其特征在于，所述分离肿瘤患者外周血中的单个核细胞的方法为：肿瘤患者外周血用Ficoll密度梯度法分离得到单个核细胞。
9.如权利要求1-6中任一项所述的肿瘤特异性T细胞的分离培养方法，其特征在于，所述分离PD-1阳性的单个核细胞的方法为：将分离得到的单个核细胞与生物素化的抗人IgG4抗体进行一次共孵育，再加入抗生物素抗体或链霉亲和素包被的磁珠进行二次共孵育，磁力分离得到PD-1阳性的单个核细胞；
优选地，所述一次共孵育的温度为20-30℃，更优选的一次共孵育温度为25℃；
优选地，所述一次共孵育的时间为10-30min，更优选的二次共孵育时间为20min；
优选地，所述生物素化的抗人IgG4抗体的使用浓度为每107个单个核细胞使用1-4μg,，更优选的IgG4抗体的使用浓度为每107个单个核细胞使用2.5μg；
优选地，所述二次共孵育的温度为20-30℃，更优选的二次共孵育温度为25℃；
优选地，所述二次共孵育的时间为5-20min，更优选的二次共孵育时间为10min。
10.如权利要求1-6中任一项所述的肿瘤特异性T细胞的分离培养方法，其特征在于，所述对PD-1阳性的单个核细胞进行扩增的方法为：将分离得到的PD-1阳性的单个核细胞用无血清培养液重悬，种入预包被培养瓶进行扩增，得到扩增后的所述肿瘤特异性T细胞。
11.如权利要求10所述的肿瘤特异性T细胞的分离培养方法，其特征在于，所述预包被培养瓶是由重组人纤连蛋白片段和抗人CD3活化抗体进行包被的培养瓶；
优选地，所述纤连蛋白的终浓度为4-8μg/mL；
优选地，所述抗人CD3抗体的终浓度为1-2μg/mL；
优选地，所述无血清培养液包括白细胞介素2和蛋白激酶B抑制剂；
优选地，所述无血清培养液还包括白细胞介素7、白细胞介素15或白细胞介素21中的任意一种或至少两种的组合。
12.如权利要求1-6中任一项所述的肿瘤特异性T细胞的分离培养方法，其特征在于，所述分离培养方法具体包括如下步骤：
(1)取肿瘤患者的外周血加入PD-1抗体使其终浓度为0.2-0.8μg/mL，在0-6℃下进行孵育0.5-24h；或使肿瘤患者在3周内接受PD-1抗体治疗；
(2)将步骤(1)得到的产品用Ficoll密度梯度法分离得到单个核细胞；
(3)将步骤(2)分离得到的单个核细胞与浓度为每107个单个核细胞2.5μg的生物素化修饰的抗人IgG4抗体在20-30℃下共孵育10-30min，再加入抗生物素抗体或链霉亲和素包被的磁珠在20-30℃下共孵育5-20min，磁力分离得到PD-1阳性的单个核细胞；
(4)将步骤(3)分离得到的PD-1阳性的单个核细胞用包含有白细胞介素2、白细胞介素7、白细胞介素15、白细胞介素21和蛋白激酶B抑制剂的无血清培养液重悬，种入被4-8μg/mL重组人纤连蛋白片段和1-2μg/mL抗人CD3活化抗体处理后的预包被培养瓶进行扩增，得到扩增后的肿瘤特异性T细胞。
13.一种使用权利要求1-12中任一项所述的分离培养方法分离得到的肿瘤特异性T细胞。
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