CN105802908B - 一种体外制备肿瘤抗原特异性cd8+干细胞样记忆性t淋巴细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学和医学领域，涉及一种体外制备肿瘤抗原特异性的CD8+记忆性T淋巴干细胞的方法及其在抗肿瘤免疫反应中的应用。该方法包括以下步骤：将肿瘤抗原与未成熟的树突状细胞共孵育，获得特异性肿瘤抗原负载的成熟树突状细胞；将成熟树突状细胞与CD8+初始T细胞共培养，促进肿瘤抗原特异性的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞产生；分离获得能特异性识别特异肿瘤细胞的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞。该方法制备获得的肿瘤抗原特异性的CD8+记忆性T淋巴干细胞具有较好的抗肿瘤效果，特异性高，不良反应少。

Description

一种体外制备肿瘤抗原特异性CD8+干细胞样记忆性T淋巴细 胞的方法

技术领域

本发明涉及免疫学及肿瘤治疗领域。具体地说，本发明涉及一种体外制备肿瘤抗原特异性CD8+记忆干细胞样T淋巴细胞(T memory stem cell，Tscm)的方法。本发明还涉及所制备的肿瘤特异性Tscm可防治肿瘤的用途。

技术背景

目前肿瘤T淋巴细胞疗法，即通过制备肿瘤抗原特异性T细胞，然后分离并扩增到一定数量(～10¹⁰个)后再回输给病人，是一种非常有前景的肿瘤治疗策略。而抗原特异性T细胞的数量、活力、表型和回输后在体内存活时间是该技术的关键所在,所以国际上很多实验室都在努力寻找更好的方法制备、回输肿瘤抗原特异性T细胞以期产生更好的抗肿瘤疗效。肿瘤抗原特异性记忆T细胞(memory T cells)是一类具有抗肿瘤作用的T细胞亚型，当再次遇到同样抗原时能够产生快速且更强的抗肿瘤免疫应答。记忆T细胞通过是否表达趋化因子受体CCR7和L-Selectin(CD62L)可分为CD62L+CCR7+的中心记忆T细胞(Tcm)，CD62L-CCR7-的效应记忆T细胞(Tem)，CD62L-CCR7+的效应Te和CD62L+CCR7-的初始Tn细胞。Gattinoni等首先在小鼠中发现一类具有自我更新能力的抗原特异性CD8+T细胞，这些称为Tscm(T-memory stem cells)的表面标志CD62L^hiCD44^lowSca-1+。Tscm不仅能维持自我更新，在抗原的再次刺激分化为Tcm和Tem,临床前研究发现移植Tscm比Tcm和Tem在体内保持更长的存活时间。

人记忆性干细胞样T细胞(Tscm)是新发现的一个T细胞亚群.这一类群的细胞具有干细胞的特征,具有较强的多向分化潜能,Tscm细胞能够分化为中枢性记忆性T细胞(Tcm),效应性记忆性T细胞(Tem)和效应性T细胞(Tef),在分化的同时又能够维持自我更新。目前人们对Tscm细胞的生物学特点的深入研究及其在肿瘤免疫治疗中发挥着重要作用,为Tscm细胞应用于临床肿瘤的免疫治疗提供了依据。

这类肿瘤抗原特异性并在体内能自我更新的具有干细胞特征的记忆性T细胞(Tscm)，会产生持久的抗肿瘤效应，在免疫学和肿瘤治疗领域有着巨大的市场前景。但是，自体肿瘤性抗原免疫记忆的形成过程很复杂，须经过抗原提呈细胞对抗原的处理，加工和提呈，在适宜的抗原量及适宜时间的刺激下，活化的T细胞经历扩增期，在清除抗原后T细胞进入收缩期和记忆形成期。因此，目前尚无成熟方法能够通过体外制备具有肿瘤抗原特异性和干细胞特征的记忆性T细胞。

发明内容

本发明的目的是提供一种体外制备肿瘤抗原特异性CD8+记忆干细胞样T淋巴细胞(Tscm)的方法。

本发明的另一目的是应用发明的方法所制备的肿瘤特异性Tscm用于恶性肿瘤的预防和治疗。

理想的肿瘤抗原特异性CD8+记忆干细胞样T淋巴细胞能够产生持久的抗肿瘤效应，但是目前尚无体外制备肿瘤抗原特异性CD8+记忆干细胞样T淋巴细胞的方法。为了解决上述技术问题，本发明根据免疫记忆形成的规律，利用ICD诱导剂诱导发生免疫原性细胞死亡的肿瘤细胞更易被树突状细胞吞噬并处理，加工和提呈肿瘤抗原或人工合成肿瘤特异性抗原表位肽负载树突状细胞，继而激活CD8+初始T淋巴细胞，在干细胞分化抑制剂mTOR抑制剂和IL-7及IL-15作用下产生具有自我更新能力的肿瘤特异性的CD8+的Tscm，从而发挥持久的特异性抗肿瘤作用。

本发明提供了一种体外制备肿瘤抗原特异性CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞的方法，该方法包括以下步骤：

将肿瘤抗原与未成熟的树突状细胞共孵育，获得特异性肿瘤抗原负载的成熟树突状细胞；

将成熟树突状细胞与CD8+初始T细胞共培养，促进肿瘤抗原特异性的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞产生；

分离获得能特异性识别特异肿瘤细胞的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞。

所述的肿瘤抗原来自人工合成的特异性肿瘤抗原表位肽或者佐剂重组人钙网蛋白复合物。

所述的肿瘤抗原由肿瘤细胞在免疫原性细胞死亡(ICD)诱导剂作用下释放。ICD诱导剂可用1种，也可以按照合适比例联合应用2-4种。

例如，所述的免疫原性细胞死亡诱导剂是8％玫瑰红、甲胺喋呤、阿霉素或者奥沙利铂中的一种或者几种。

在本发明的一个实施例中，肿瘤抗原特异性的Tscm是人源性的。

所述的肿瘤细胞源自经处理后产生免疫原性细胞死亡的病人自体肿瘤组织细胞。

所述的肿瘤细胞包括血液系统肿瘤、实体瘤细胞、胸腹水脱落肿瘤细胞,或者对应的肿瘤干细胞。

所述的未成熟的树突状细胞通过单个核细胞在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4的作用下，诱导形成。

所述的单个核细胞来源于肿瘤患者、健康者或者脐带血。

较好的，将肿瘤抗原与未成熟的树突状细胞共孵育时，同时加入肿瘤坏死因子α。

所述的CD8+初始T细胞从悬浮的单个核细胞分选出。

在本发明的一个实施例中，加入干细胞分化抑制剂以促进肿瘤抗原特异性的特异肿瘤细胞的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞产生。

所述的干细胞分化抑制剂是mTOR抑制剂、白介素-7、白介素-15或者其组合。

所述的mTOR抑制剂是雷帕霉素或依维莫司。

另一方面，本发明提供了肿瘤抗原特异性CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞在制备抗肿瘤药剂中的应用。

肿瘤抗原特异性CD8+Tscm治疗的恶性肿瘤包括实体瘤和血液系统肿瘤。肿瘤抗原特异性CD8+Tscm可以在晚期肿瘤治疗中发挥特异性抗肿瘤作用，也可以在预防术后复发中发挥特异性抗肿瘤作用。

所述的肿瘤是实体瘤或者血液系统肿瘤。

所述的应用也可以是肿瘤抗原特异性CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞在制备肿瘤检测试剂盒中的应用。例如在肿瘤发生的高危人群中发挥特异性预防作用，或者在阻断和清除癌前病变中发挥特异性抗肿瘤作用。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明从免疫记忆形成的机理出发，以ICD诱导剂诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，释放危险信号分子及肿瘤抗原，提高树突状细胞摄取，加工和提呈抗原效果。同时，肿瘤全细胞抗原特异性Tscm抗肿瘤效果更佳。

(2)小分子多肽抗原性很弱，人工合成抗原表位肽与重组CRT蛋白复合物，促进树突状细胞摄取，加工和提呈抗原效果。并且容易合成和大规模量化生产以及同时使用多种抗原肽，便于诱导针对多种肿瘤抗原特异性的Tscm细胞。

(3)本发明有关的肿瘤细胞包括肿瘤干细胞，由于肿瘤干细胞全细胞抗原诱导的Tscm细胞可特异性清除相应的肿瘤干细胞，避免了目前针对肿瘤干细胞标志(如CD133等)的单克隆抗体及小分子靶向药物治疗所致的严重不良反应。

(4)本发明有关的干细胞分化抑制剂mTOR抑制剂和IL-7联合应用，提高Tscm产量。

(5)本发明采用CD8+初始T淋巴细胞，去除了抑制性的Treg及MDSCs，降低了免疫耐受的发生。

(6)本发明遵循免疫记忆形成规律，模拟体内抗原刺激T细胞活化的扩增期，抗原清除后T细胞收缩期及记忆形成期。

附图说明

图1为ICD诱导剂诱导肿瘤细胞CRT转位体现ICD示意图。ICD诱导剂诱导结肠癌细胞CT-26产生ICD，b和c组均可见CRT转位。a:对照组；b:阿霉素组；c:奥沙利铂组。

图2为Tscm细胞流式细胞仪检测鉴定结果示意图。经抗原活化的CD8+CD3+T淋巴细胞在IL-7和IL-15作用下(B)较对照组(A)产生CD3+CD8+CD62L+CCR7+CD95+分子表型的Tscm细胞显著增多。

图3为Tscm细胞特异性细胞毒试验示意图。结肠癌CT26细胞经奥沙利铂诱导ICD后，冲击树突状细胞激活CD8+初始T细胞，通过本发明方法获得的Tscm对CT26细胞较A20细胞明显的特异性细胞毒杀伤作用。

图4为预防肿瘤发生-再接种试验示意图。CT26荷瘤小鼠根治性手术后，输注肿瘤特异性CT26-Tscm细胞可明显预防对侧部位接种CT26细胞的成瘤，亦即预防术后复发，但对未输注CT26-Tscm细胞的对照组及无关小鼠淋巴瘤A20细胞接种的成瘤没有预防作用。

图5为肿瘤特异性CD8+Tscm细胞体外制备技术流程简图。

具体实施方式

用下列实施例和附图进一步阐述本发明。

在本发明的第一方面，提供了一种应用ICD诱导剂模拟体内诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，释放危险信号分子CRT或利用CRT与人工合成肿瘤抗原表位肽复合物，易被树突状细胞吞噬，处理，加工和提呈肿瘤细胞全抗原或人工合成多抗原性的方法。ICD诱导剂包括：1)8％玫瑰红(RB)；2)甲胺喋呤(MTX)；2)阿霉素(ADM)；4)奥沙利铂(L-OHP)。

在本发明的第二方面，提供了这些ICD诱导剂的合理使用方法。ICD诱导剂的合理组合方式包括：1)8％RB；2)8％RB+L-OHP；3)MTX+ADM；4)8％RB+L-OHP+ADM；5)8％RB+L-OHP+ADM+MTX；

在本发明的第三方面，提供了联合应用mTOR抑制剂和IL-7抑制干细胞分化方法。

在本发明的第四方面，提供了应用IL-15维持Tscm细胞干性的方法。

在本发明的第五方面，提供了按照免疫记忆形成规律，确立了抗原刺激的时间。亦即初始T细胞活化48小时后去除抗原负载的树突状细胞，分离出活化的CD8+T细胞，模拟体内抗原清除的方式产生Tscm的方法，这是Tscm产生的关键点。

例如，在本发明的优选实施例中，提供了一种体外制备肿瘤抗原特异性CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞的方法，包括：

(A)由肿瘤病人或健康供者外周血中分离得到的单个核细胞培养分别收集贴壁生长和悬浮生长的单个核细胞；(B)在适当浓度粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)的作用下，培养步骤(C)得到的贴壁生长的单核细胞，诱导形成未成熟的树突状细胞；(D)肿瘤抗原由新鲜肿瘤细胞在联合使用1至4种免疫原性细胞死亡(ICD)诱导剂作用下，释放出肿瘤抗原或人工合成的特异性肿瘤抗原表位肽和佐剂重组人钙网蛋白复合物，易被DC细胞摄取；(E)将步骤(B)得到的未成熟的树突状细胞与步骤(C)得到的肿瘤全细胞抗原共孵育，并适时加入肿瘤坏死因子α(TNF-α)，使所说的未成熟树突状细胞变为特异性肿瘤抗原负载的具有很强抗原递呈效应的成熟树突状细胞；(E)将步骤(A)中悬浮的单个核细胞用免疫磁珠分选出CD8+初始T细胞，并用无血清含白细胞介素2(IL-2)培基培养。(F)用步骤(D)得到的特异性肿瘤抗原负载的具有很强抗原递呈效应的成熟树突状细胞与步骤(E)中预先分选的CD8+初始T细胞共培养48小时后，收集活化的T细胞，加入抑制干细胞分化的mTOR抑制剂和白介素-7及维持干性的白介素-15，以促进肿瘤抗原特异性的Tscm产生；(G)分离步骤(F)得到能特异性识别同种肿瘤细胞的带有特定标记的CD8+干细胞样记忆性T淋巴细胞(Tscm)。

实施例1肿瘤细胞经ICD诱导剂诱导出现ICD特征性的CRT转位现象。

本发明采用ICD诱导剂诱导产生免疫原性细胞死亡的肿瘤细胞作为全细胞抗原的来源，具体步骤如下：

1.1手术切除肿瘤标本或粗针穿刺活检肿瘤组织，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净(以结肠癌CT26肿瘤为模型)；

1.2无菌生理盐水洗3次；用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；

1.3200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；

1.4用无血清培养基重悬细胞至1-2x 10⁷/ml，加入奥沙利铂或阿霉素等ICD诱导剂作用24小时，如果是用8％玫瑰红只需30分钟；然后提取部分进行检测ICD标志CRT的转位。实验结果见图1。

1.5加入离心管中，3000rpm，离心10min，去除部分上清后-80℃保存备用。

实施例2DC细胞的培养及鉴定

树突状细胞(Dendritic Cells，DC)是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells,APC)。现已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(Naive Tcells)增殖的APC，而其它APC(如单核巨噬细胞，B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞。DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。若将肿瘤抗原负载的DC与分选的CD8+初始T淋巴细胞共培养，在特定细胞因子作用下，可刺激机体产生肿瘤抗原特异性的Tscm细胞。

DC细胞的培养及鉴定步骤为：

2.1静脉采集抗凝外周血50ml-60ml；

2.2淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离纯化单个核细胞(PBMC)；

2.3无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90％以上的PBMC，细胞数量需达到1-3x10⁸。贴壁细胞(主要是CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF(500U/ml)和重组人IL-4(500U/ml)的无血清培养液，37℃，5％CO₂培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；

2.4每3d半量换液一次，并补足细胞因子；

2.5在培养的第5天，加入步骤2中获得的肿瘤抗原50mg/ml，对DC进行抗原负载；

2.6在培养的第6d，加入重组人TNF-a(500U/ml)，诱导DC细胞成熟；

2.7在培养的第7d，收获DC细胞，其数量应达到1×10⁶个以上；

2.8DC的质检：流式细胞仪检测DC细胞表面HLA-DR、CD83和CD86等分子的表达，以确定DC是否成熟，从而筛选到成熟的DC。

实施例3CD8+Tscm细胞的制备及鉴定

3.1PBMC用无血清培养液培养，收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至1-2x 10⁶/ml；

3.2用免疫磁珠法阳性选择CD8+初始T淋巴细胞；

3.3抗原负载的DC细胞和CD8+初始T细胞，按1∶10(数目比的比例共培养，无血清培养液中添加重组人IL-2(300U/ml)及重组人IL-7(300U/ml)和IL-15(300U/ml)；

3.4共培养3天后分离出T淋巴细胞继续添加重组人IL-2(300U/ml)及重组人IL-7(300U/ml)和IL-15(300U/ml)的培基培养，每3天半量换液一次。

3.5在第7d收集细胞，细胞数量应达到1×10⁶个以上；

3.6CD8+Tscm细胞的鉴定：流式细胞仪检测细胞表面CD8、CD62L，CCR7，CD95等分子的表达。

实验结果见图2。经抗原活化的CD8+CD3+T淋巴细胞在IL-7和IL-15作用下(B)较对照组(A)产生CD3+CD8+CD62L+CCR7+CD95+分子表型的Tscm细胞显著增多。

实施例4Tscm细胞特异性细胞毒杀伤效应

以体外制备的结肠癌细胞CT-26全细胞抗原特异性Tscm细胞为效应细胞，以结肠癌细胞CT-26细胞为靶细胞，鼠源淋巴瘤细胞A20作为对照靶细胞，将效应细胞与靶细胞按不同的比例(数目比)加入96孔U型板中，每孔含靶细胞1x 10⁴个，终体积为200μl，设3个复孔。培养4小时，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。

结果见图3。结肠癌CT26细胞经奥沙利铂诱导ICD后，冲击树突状细胞激活CD8+初始T细胞，通过本发明方法获得的Tscm对CT26细胞较A20细胞明显的特异性细胞毒杀伤作用。

实施例5Tscm预防肿瘤术后复发-再接种试验

制备Barb/C小鼠CT26肿瘤模型；待肿瘤直径达到0.5cm时手术性根治切除肿瘤标本无菌条件下，制成单细胞悬液；用无血清培养基重悬细胞至1-2x 10⁷/ml，加入奥沙利铂或阿霉素等ICD诱导剂作用24小时，如果是用8％玫瑰红只需30分钟；然后提取部分进行检测ICD标志CRT的转位。利用同一品系小鼠脾脏淋巴细胞按照肿瘤特异性Tscm制作流程(参见图5)制备CT26细胞抗原性Tscm。术后2周回输Tscm，继而在原接种区对侧部位接种5×10⁵CT26细胞，以接种鼠源5×10⁵A20细胞作为对照。观察4周后接种成瘤率。

结果见图4。CT26荷瘤小鼠根治性手术后，输注肿瘤特异性CT26-Tscm细胞可明显预防对侧部位接种CT26细胞的成瘤，亦即预防术后复发，但对未输注CT26-Tscm细胞的对照组及无关小鼠淋巴瘤A20细胞接种的成瘤没有预防作用。

在本发明中，建立了一种体外制备这种肿瘤抗原特异性CD8+Tscm细胞的新方法，利用此技术能够将病人外周血初始CD8+T细胞转变成肿瘤抗原特异性干细胞样T记忆细胞，回输后在体内存活时间更长，抗肿瘤效果更好。肿瘤抗原特异性Tscm细胞疗法有望成为一种临床肿瘤治疗和预防新模式。

本说明书中所描述的以上内容仅仅是对本发明所作的举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例作各种修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明说明书的内容或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种体外制备肿瘤抗原特异性CD8+ 干细胞样记忆性T淋巴细胞的方法,其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）将全细胞肿瘤抗原与未成熟的树突状细胞共孵育，获得特异性肿瘤抗原负载的成熟树突状细胞；

（2）将步骤（1）获得的成熟树突状细胞与CD8+ 初始T细胞共培养，在48小时后撤除抗原负载的成熟树突状细胞，诱导全细胞肿瘤抗原特异性的CD8+ 干细胞样记忆性T淋巴细胞产生；

（3）分离获得能特异性识别特异肿瘤细胞的CD8+ 干细胞样记忆性T淋巴细胞。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于，所述的全细胞肿瘤抗原通过肿瘤细胞在免疫原性细胞死亡诱导剂作用下释放获得。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于，所述的免疫原性细胞死亡诱导剂选自8%玫瑰红、甲胺喋呤、阿霉素或者奥沙利铂中的一种或者几种。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞源自经处理后产生免疫原性细胞死亡的病人自体肿瘤组织细胞。

5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于，所述的肿瘤细胞为血液系统肿瘤细胞、实体瘤细胞或者胸腹水脱落肿瘤细胞。

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