CN109943527A - 促进脐带血t细胞体外扩增并维持高比例tscm亚群的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进脐带血T细胞体外扩增并维持高比例T_SCM亚群的方法，它通过将环黄芪醇与细胞因子IL‑7和细胞因子IL‑15联用，加入到T细胞的体外培养液中，促进T细胞扩增及维持高比例T_SCM亚群。本发明成功探究低浓度CAG联合IL‑7和IL‑15在体外长期促进脐带血来源T细胞扩增的同时，能够保持高比例的T_SCM细胞亚群。这种新的体外培养方式，为T细胞体外长期培养和包括CAR‑T细胞疗法在内的免疫疗法奠定实验基础。

Description

促进脐带血T细胞体外扩增并维持高比例TSCM亚群的方法

技术领域

本发明属于细胞学领域，具体涉及一种促进脐带血T细胞体外扩增并维持高比例T_SCM亚群的方法。

背景技术

免疫细胞疗法是最具前景的肿瘤治疗手段，包括肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor-Infiltrating Lymphocytes,TIL)治疗、T细胞受体嵌合型T细胞(T cell ReceptorEngineered-T cell,TCR-T)治疗和嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen ReceptorEngineered T-cell,CAR-T)治疗等。其中TIL治疗是从患者肿瘤组织中分离得到肿瘤浸润淋巴细胞，体外扩增后，将具有肿瘤细胞杀伤活性的细胞群回输患者体内的治疗手段，是目前治疗黑色素瘤最有效的细胞疗法；而TCR-T治疗和CAR-T治疗都是通过基因改造技术提高T细胞特异性识别和杀伤肿瘤细胞的能力，在体外扩增后回输患者体内治疗血液恶性肿瘤，同时有实验研究正寻求新靶点以治疗实体瘤。TCR-T或CAR-T等免疫细胞疗法发挥杀伤肿瘤作用的细胞亚群都是CD8⁺T细胞活化后的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)，然而CTL细胞属于T细胞分化终末阶段的效应性T细胞(Effector T cell,T_E)，大量终末阶段的T_E细胞回输体内后，T细胞功能易衰竭，导致扩增能力有限，且并无免疫记忆维持能力，影响治疗效果。同时，有研究证明，干细胞样中心记忆性T细胞(stem cell-likecentral memory T cells,T_SCM)是一类不仅具有干细胞样自我更新和不断增殖能力特性，又具有记忆性T细胞的抗肿瘤作用和免疫记忆性的T细胞亚群。抗原刺激后可以产生大量T_E细胞。有研究表明CAR-T_SCM细胞的抗肿瘤作用优于其他T细胞亚群构建的CAR-T细胞。因此，在T细胞体外扩增的同时，保持高比例的T_SCM亚群可以提高以T细胞为基础的免疫细胞治疗的临床疗效。

环黄芪醇(Cycloastragenol，CAG)是从中药黄芪提取的主要皂苷成分，属于三萜皂苷类化合物，是黄芪甲苷的苷元。CAG具有免疫调节、抗炎、抗氧化、抗缺血性脑损伤、抗衰老等作用，例如：CAG通过抑制NLRP3炎性小体抑制炎症，预防小鼠心肌细胞纤维化；或通过抑制NF-κB活性作为炎症诱导的前列腺癌化学治疗的辅助治疗等。同时，CAG是中药提取化合物中现今唯一发现的端粒酶激活剂，能够有效激活神经元细胞的端粒酶活性，可以作为抑郁症的辅助治疗；或者通过影响端粒酶活性和klotho基因的表达延缓人胚胎肺成纤维细胞衰老，从而被认为具有抗衰老的作用。另外，有研究表明，高浓度(5、10、20μM)CAG可抑制CONA诱导的T细胞活化、增殖；低浓度(1μM)CAG会适度地延缓感染HIV病毒的人外周血来源的CD8⁺T淋巴细胞端粒的缩短，提高T细胞扩增的潜力。但低浓度CAG是否也能提高脐带血来源的T细胞增殖，目前未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：提供一种促进脐带血T细胞体外扩增的方法，另外，提供一种促进脐带血T细胞体外扩增时维持高比例T_SCM亚群的方法。

本发明的技术方案为：

一种促进脐带血T细胞体外扩增的方法，它通过将环黄芪醇与细胞因子IL-7和细胞因子IL-15联用，加入到T细胞的体外培养液中，促进T细胞扩增。

进一步地，所述环黄芪醇的浓度为0.2μM～1μM。

进一步地，细胞因子IL-7的浓度为5ng/ml，细胞因子IL-15的浓度为5ng/ml。

优选地，所述环黄芪醇的浓度为0.2μM。

一种促进脐带血T细胞体外扩增时维持高比例T_SCM亚群的方法，它通过将环黄芪醇与细胞因子IL-7和细胞因子IL-15联用，加入到脐带血T细胞的体外培养液中，促进脐带血T细胞体外扩增时维持高比例T_SCM亚群。

进一步地，所述环黄芪醇的浓度为0.2μM～1μM。

进一步地，细胞因子IL-7的浓度为5ng/ml，细胞因子IL-15的浓度为5ng/ml。

优选地，所述环黄芪醇的浓度为0.2μM。

目前，T_SCM体外扩增培养方式尚未统一。关于T细胞刺激活化，目前T细胞活化方式多采用抗CD3单抗/抗CD28单抗偶联磁珠或抗CD3单抗包被在酶联板上的方式进行。鉴于抗体偶联磁珠可以充分与细胞接触，刺激活化细胞，本发明采用了抗CD3单抗/抗CD28单抗偶联磁珠方式，观察了7天的细胞增殖情况。关于T细胞体外扩增培养，培养基添加不同细胞因子可影响T细胞各亚群比例，维持T_SCM细胞的比例亦不相同。白介素2(IL-2)、IL-15、IL-7单独诱导培养的T_SCM比例分别为20％、20-30％和50％左右，IL-7和IL-15联合使用培养的T_SCM比例为55-60％左右^[30,35]。IL-7和IL-15联用虽然在体外扩增T细胞效果不及其他培养方式，但是能维持CD45RA⁺CD197⁺CD8⁺T细胞，即T_SCM细胞比例在一个较高的水平。因此，本发明选用培养基添加IL-7和IL-15细胞因子的培养方案，来探究不同浓度CAG与IL-7和IL-15三者联用对脐带血来源T细胞扩增和T_SCM细胞亚群的影响。为了能完整观察到不同浓度CAG对目前活化T细胞体外培养体系的影响，我们定在活化T细胞体积已逐渐恢复原来基线水平的第11天进行测定。

中药黄芪具有益气养元、扶正祛邪、养心通脉、健脾利湿、托毒生肌的功用，其有效成分CAG(环黄芪醇)。CAG是从黄芪提取的主要皂苷成分，为三萜皂苷类化合物，被认为具有抗衰老、抗炎、抗纤维化、抗菌、保护肝脏和内皮等多种药理作用。研究证实，高浓度CAG会抑制T细胞扩增，而低浓度的CAG可以激活端粒酶活性缩短端粒，促进T细胞增殖。因此，本发明在T细胞一旦被抗-CD3/CD28单抗偶联磁珠活化后立即加入含不同浓度的CAG联合IL-7和IL-15的培养液中培养11天。结果显示，在原T细胞培养体系中加入0.2μM或1μMCAG时，T细胞11天的累积增殖倍数和CD8⁺T细胞亚群中T_SCM比例均优于其他实验组与溶剂对照组。其中当CAG浓度为0.2μM时，T细胞累积增殖倍数最高，且CD8⁺T细胞中T_SCM占比维持在88％左右，高于文献报道的IL-7和IL-15联用可维持55-60％的T_SCM细胞亚群，证实低浓度的CAG可以显著促进脐带血来源的T细胞扩增，并保持细胞亚群中较高的T_SCM比例。而当CAG浓度为5μM并联合IL-7和IL-15诱导培养T细胞11天，T细胞累积增殖倍数与单纯IL-7和IL-15诱导培养组无统计学差异，表明高浓度CAG与IL-7和IL-15联用无促进T细胞增殖的作用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明成功探究低浓度CAG联合IL-7和IL-15在体外长期促进脐带血来源T细胞扩增的同时，能够保持高比例的T_SCM细胞亚群。这种新的体外培养方式，为T细胞体外长期培养和包括CAR-T细胞疗法在内的免疫疗法奠定实验基础。

附图说明

图1不同磁珠细胞比例对T细胞增殖倍数的影响；a).Activatedhuman umbilicalcord blood T cells and identification of CD4⁺/CD8⁺T cellby anti-CD3/CD28 beadson day 7；b).CD3⁺T cell proliferation after UCBMC activated on day 7.All dataare represented as mean±SD,n＝3；

图2不同浓度CAG联合IL-7和IL-15对活化T细胞扩增的影响；All data arerepresented as mean±SD,n＝3；

图3不同浓度CAG联合IL-7和IL-15促进T细胞扩增中维持较高T_SCM比例；

a).Detection of CD45RA⁺CD197⁺CD8⁺T cell expression on day 11；b).Comparison of CD8⁺T_SCM Positive percentage on day 11.All data are representedas mean±SD,n＝3。

具体实施方式

实施例1

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器

环黄芪醇(HPLC≥98％)购自成都曼思特生物公司。RPMI1640培养基购自Hyclone公司。Fetal Bovine Serum(FBS)购自BOVOGEN公司。Lymphoprep淋巴分离液购自Axis-shield公司。青霉素链霉素双抗购自Gibco公司。白介素7(IL-7)、白介素15(IL-15)购自Cellgenix公司。Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28购自Gibco公司。FITC anti-humanCD45RA、APC/cy7 anti-humanCD8、PE/cy7 anti-humanCD4、PE anti-humanCD197(CCR7)、PE anti-humanCD3、CFSE购自BD公司。ACEA NovoCyte系列流式细胞仪(ACEANovoCyte 3130)购自ACEA Biosciences公司。低速离心机、CO₂培养箱购自Thermo Fisher公司。

1.1 1.2脐带血单个核细胞(Umbilical Cord Blood Mononuclear Cell,UCBMC)分离

人脐带血来源于健康产妇捐赠(已获知情同意)，离心190g，10分钟，去除血浆。加入原血3倍体积常温PBS稀释后，用2倍原脐带血体积淋巴细胞分离液进行密度梯度离心600g,20分钟，小心吸取中间层白膜，获脐带血单个核细胞UCBMC。

1.2 T细胞的活化

取少量UCBMC进行抗CD3-PE抗体染色，流式计数CD3⁺T细胞绝对数。含5ng/ml IL-7和5ng/ml IL-15的RPMI 1640完全培养基调整细胞密度，以1.0×10⁵个CD3⁺T细胞/孔铺96孔细胞培养板，每孔分别加入0.5、1、2、3倍CD3⁺T细胞数量的CD3/CD28抗体偶联磁珠进行刺激活化，无磁珠刺激组为空白对照组。每组设2个复孔，每组实验重复三次。37℃培养箱中静置培养，采取半量补液方式连续培养7天。第7天采用APC/cy7 anti-humanCD8、PE/cy7 anti-humanCD4室温染色15分钟，流式检测各组CD4⁺与CD8⁺T绝对细胞数，计算CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞总数的7天累积增殖倍数。

1.3 CAG对活化T细胞培养的处理

20mg CAG溶于1.019ml DMSO，配制80mM CAG母液。采用RPMI 1640完全培养基(含5ng/ml IL-7和5ng/ml IL-15)进一步分别配制CAG工作浓度0.04、0.2、1、5μM。在CD3/CD28抗体偶联磁珠：CD3⁺T细胞为3:1、RPMI 1640完全培养基(含5ng/ml IL-7和5ng/ml IL-15)的培养条件下，以1.0×10⁵个细胞/孔接种于96孔培养板，设置0、0.04、0.2、1、5μM不同浓度CAG处理组。由于各CAG工作浓度组中DMSO最高浓度为0.006％，因此0μM CAG组即为DMSO溶剂对照组，其DMSO浓度为0.006％。置于含5％CO₂的37℃培养箱中静置培养，细胞每3天半量换液，持续培养11天进行检测。每组设2个复孔,每组实验重复三次。

1.4流式检测T细胞绝对数与T_SCM亚群比例

每组各取20ul细胞悬液，采用FITC anti-humanCD45RA、APC/cy7 anti–humanCD8、PE anti–humanCD197(CCR7)、PE/cy7 anti–humanCD4室温染色，流式检测CD4⁺与CD8⁺T细胞绝对细胞数和CD45RA⁺CD197⁺CD8⁺T细胞亚群的比例，计算CD3⁺T细胞增殖倍数，分析各组CD45RA⁺CD197⁺CD8⁺T细胞比例情况。

1.5统计学分析

用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析。数据统计均采用one-way ANOVA检验。所有实验重复至少3次。数据结果以“均值±标准差”的形式表示。

2结果

2.1T细胞活化条件优化

以不同比例的CD3/CD28抗体偶联磁珠与CD3⁺T细胞比刺激活化UCBMC，于RPMI1640完全培养基(含5ng/ml IL-7和IL15)培养7天。流式检测CD4⁺T和CD8⁺T绝对细胞数(图1中a)，获得CD3⁺T绝对细胞数。结果所示，以3:1磁珠细胞比活化T细胞，培养7天所获得的绝对CD3⁺T细胞数最高,增殖倍数为6.28±0.22(n＝3),其它组与之相比均有显著性差异。因此我们按照3:1磁珠细胞比作为T细胞活化条件进行后续实验。

2.2不同浓度CAG联合IL-7和IL-15促T细胞扩增

流式检测不同浓度CAG联合IL-7和IL-15诱导培养的T细胞，结果如图2所示，各组T细胞均有不同程度的增殖。当CAG浓度为0.2μM联合IL-7和IL-15时，连续培养11天的累积细胞增殖倍数为20.87±1.92(n＝3)，高于0.04μM组16.64±0.70(n＝3)、1μM组18.43±1.91(n＝3)、5μM组12.01±1.21(n＝3)、0μM组(即DMSO溶剂对照组)14.10±2.11(n＝3)和空白对照组14.23±1.84(n＝3)。DMSO溶剂对照组与空白组相比无显著性差异(P>0.05)，表明作为CAG母液配制的DMSO溶剂在本系统中对活化T细胞增殖无显著影响。0.2μM CAG和1μM CAG处理组与DMSO溶剂对照组相比均具有显著差异(P＜0.05)，表明低浓度CAG与IL-7和IL-15联合使用可以促进T细胞增殖。5μM CAG组与DMSO溶剂对照组相比差异不显著，无统计学意义，提示高浓度CAG并无促T细胞增殖作用。

2.3不同浓度CAG联合IL-7和IL-15促进T细胞扩增中维持较高T_SCM比例

CD45RA⁺是原始T细胞特异性表型，CD197⁺是记忆性T细胞的特异性表型，CD45RA⁺CD197⁺共表达可以用于T_SCM细胞亚群的检测。在不同CAG处理组条件下连续培养活化T细胞11天后，各组CD8⁺T细胞中T_SCM细胞亚群比例情况见图3中a、b所示：0.2μM CAG组的CD45RA⁺CD197⁺CD8⁺T细胞比例为88.05％±1.63(n＝3)，均高于其它处理组，如0.04μM CAG组77.17％±1.55(n＝3)、1μM CAG组82.34％±1.84(n＝3)、5μM CAG组81.06％±1.28(n＝3)和DMSO溶剂对照组76.98％±2.09(n＝3)以及空白对照组76.76％±1.67(n＝3)。0.2μM、1μM、5μM CAG组分别与DMSO溶剂对照组相比，均具有显著性差异(P＜0.05)，表明CAG可促进活化扩增的CD8⁺T细胞中T_SCM细胞亚群的比例。

本发明成功探究低浓度CAG联合IL-7和IL-15在体外长期促进脐带血来源T细胞扩增的同时，能够保持高比例的T_SCM细胞亚群。这种新的体外培养方式，为T细胞体外长期培养和包括CAR-T细胞疗法在内的免疫疗法奠定实验基础。

Claims (8)

1.一种促进脐带血T细胞体外扩增的方法，其特征在于，它通过将环黄芪醇与细胞因子IL-7和细胞因子IL-15联用，加入到T细胞的体外培养液中，促进T细胞扩增。

2.根据权利要求1所述的一种促进脐带血T细胞体外扩增的方法，其特征在于，所述环黄芪醇的浓度为0.2μM～1μM。

3.根据权利要求1所述的一种促进脐带血T细胞体外扩增的方法，其特征在于，细胞因子IL-7的浓度为5ng/ml，细胞因子IL-15的浓度为5ng/ml。

4.根据权利要求2或3所述的一种促进脐带血T细胞体外扩增的方法，其特征在于，所述环黄芪醇的浓度为0.2μM。

5.一种促进脐带血T细胞体外扩增时维持高比例T_SCM亚群的方法，其特征在于，它通过将环黄芪醇与细胞因子IL-7和细胞因子IL-15联用，加入到脐带血T细胞的体外培养液中，促进脐带血T细胞体外扩增时维持高比例T_SCM亚群。

6.根据权利要求5所述的一种促进脐带血T细胞体外扩增时维持高比例T_SCM亚群的方法，其特征在于，所述环黄芪醇的浓度为0.2μM～1μM。

7.根据权利要求5所述的一种促进脐带血T细胞体外扩增时维持高比例T_SCM亚群的方法，其特征在于，细胞因子IL-7的浓度为5ng/ml，细胞因子IL-15的浓度为5ng/ml。

8.根据权利要求6或7所述的一种促进脐带血T细胞体外扩增时维持高比例T_SCM亚群的方法，其特征在于，所述环黄芪醇的浓度为0.2μM。