CN112094811A - 一种car-t细胞的复苏方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种CAR‑T细胞的复苏方法，包括以下步骤：液氮中取出装有CAR‑T细胞及冻存液的冻存袋，加入36～40℃预热的复苏液，冻存袋于36～40℃水浴条件下1～2min摇晃化冻，离心，弃上清；加入36～40℃预热的复苏液混合，离心，弃上清，用细胞培养基重悬细胞；所述复苏液包括以下成分：L‑脯氨酸10～50μg/L、亚硒酸钠10‑100mg/L、丙酮酸钠2.0～2.2mg/L、NaOH 0.2～0.5mg/L、氯化镁0.2～0.4mg/L、黄芪甲苷15～25mg/L、白术内酯Ⅱ10～50mg/L、泛影酸钠15～30mg/L，余量是细胞培养基。采用本发明复苏方法，能够很好的保持细胞的活率、增殖能力和清除肿瘤细胞的能力。且该法操作简便，成本较低，利于产业化使用。

Description

一种CAR-T细胞的复苏方法
技术领域
本发明涉及CAR-T细胞技术领域，具体涉及一种CAR-T细胞的复苏方法。
背景技术
CAR-T细胞是将人工设计的外源性嵌合抗原受体(CAR)导入到T细胞内后得到的一种改造过的T细胞。CAR-T细胞因在白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、脑胶质瘤等恶性肿瘤治疗中表现出良好的治疗效果而备受关注。在CAR-T细胞的应用过程中，由于细胞制剂制备周期、治疗时机等因素的影响，常常需要对其进行液氮冻存，使用时对其进行复苏。对冻存细胞复苏时，通常是将冻存管或冻存袋直接置于37℃迅速解冻，再加入完全生长培养基重悬细胞，离心后弃去上清，加入培养基继续培养。本研究前期对CAR-T细胞的冻存方法进行改良，使用由泊洛沙姆、西兰花多糖、瓜儿豆蛋白等成分构成的冻存液进行冻存。泊洛沙姆、西兰花多糖、瓜儿豆蛋白等形成的网络结构，具有良好的CAR-T细胞保护作用，避免CAR-T细胞在液氮长期冻存过程中被损伤。但研究过程中发现，使用该冻存液后，若采用常规的复苏方法，仍然不能使冻存后的细胞达到最佳的增殖能力和清除肿瘤细胞的能力。鉴于此，有必要对CAR-T细胞的复苏方法进一步进行改良。
发明内容
为进一步提高CAR-T细胞复苏后的增殖能力和清除肿瘤细胞的能力，本发明提供一种改良后的CAR-T细胞复苏方法。
本发明方案包括以下方面：
一种CAR-T细胞的复苏方法，包括以下步骤：
液氮中取出装有CAR-T细胞及冻存液的冻存袋，加入36～40℃预热的复苏液，冻存袋于36～40℃水浴条件下1～2min摇晃化冻，离心，弃上清；加入36～40℃预热的复苏液混合，离心，弃上清，用细胞培养基重悬细胞；
所述复苏液包括以下成分：L-脯氨酸10～50μg/L、亚硒酸钠10～100mg/L、丙酮酸钠2.0～2.2mg/L、NaOH 0.2～0.5mg/L、氯化镁0.2～0.4mg/L、黄芪甲苷15～25mg/L、白术内酯Ⅱ10～50mg/L、泛影酸钠15～30mg/L，余量是细胞培养基。
优选的，两次复苏液的加入量均为细胞冻存液的2～3倍体积。
优选的，离心参数为500～600rpm离心1～2min。
优选的，所述细胞培养基为RPMI-1640培养基。
优选的，所述复苏液包括以下成分：L-脯氨酸25μg/L、亚硒酸钠50mg/L、丙酮酸钠2.2mg/L、NaOH 0.5mg/L、氯化镁0.4mg/L、黄芪甲苷20mg/L、白术内酯Ⅱ25mg/L、泛影酸钠18mg/L，余量是细胞培养基。
另一方面，本发明提供一种CAR-T细胞复苏液，该复苏液包括以下成分：L-脯氨酸10～50μg/L、亚硒酸钠10～100mg/L、丙酮酸钠2.0～2.2mg/L、NaOH 0.2～0.5mg/L、氯化镁0.2～0.4mg/L、黄芪甲苷15～25mg/L、白术内酯Ⅱ10～50mg/L、泛影酸钠15～30mg/L，余量是细胞培养基。
优选的，所述CAR-T细胞复苏液包括以下成分：L-脯氨酸25μg/L、亚硒酸钠50mg/L、丙酮酸钠2.2mg/L、NaOH 0.5mg/L、氯化镁0.4mg/L、黄芪甲苷20mg/L、白术内酯Ⅱ25mg/L、泛影酸钠18mg/L，余量是细胞培养基。
本发明所取得的有益效果：
本发明提出一种新的CAR-T细胞复苏方法，主要基于前期使用的冻存液的性质进行复苏方法的改进，对复苏液使用时机及复苏液成分进行优化。采用本发明复苏方法，能够很好的保持细胞的活率、增殖能力和清除肿瘤细胞的能力。
高速离心可能导致局部的温度变化，从而影响到CAR-T细胞的活力，进而影响CAR-T细胞的功效。采用本发明的复苏方法，仅需在500～600rpm条件下离心1～2min，不仅降低了复苏过程中高速离心对细胞产生的二次损伤。
本发明所提供的复苏方法，操作简便，成本较低，利于产业化使用。
附图说明
图1：细胞增殖效果检测结果统计图。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种CAR-T细胞的复苏方法，包括以下步骤：
液氮中取出装有CAR-T细胞及冻存液的冻存袋，加入36～40℃预热的复苏液，冻存袋于36～40℃水浴条件下1～2min摇晃化冻，500rpm离心1～2min，弃上清；加入36～40℃预热的复苏液，500rpm离心1～2min，弃上清，用RPMI-1640培养基重悬细胞；其中，两次复苏液的加入量均为细胞冻存液的2～3倍体积。
所述复苏液包括以下成分：L-脯氨酸50μg/L、亚硒酸钠10mg/L、丙酮酸钠2.2mg/L、NaOH 0.2mg/L、氯化镁0.2mg/L、黄芪甲苷25mg/L、白术内酯Ⅱ10mg/L、泛影酸钠30mg/L，余量是RPMI-1640培养基。
实施例2
一种CAR-T细胞的复苏方法，包括以下步骤：
液氮中取出装有CAR-T细胞及冻存液的冻存袋，加入36～40℃预热的复苏液，冻存袋于36～40℃水浴条件下1～2min摇晃化冻，600rpm离心1～2min，弃上清；加入36～40℃预热的复苏液，600rpm离心1～2min，弃上清，用RPMI-1640培养基重悬细胞；其中，两次复苏液的加入量均为细胞冻存液的2～3倍体积。
所述复苏液包括以下成分：L-脯氨酸50μg/L、亚硒酸钠10mg/L、丙酮酸钠2.2mg/L、NaOH 0.2mg/L、氯化镁0.2mg/L、黄芪甲苷25mg/L、白术内酯Ⅱ10mg/L、泛影酸钠30mg/L，余量是RPMI-1640培养基。
实施例3
本例与实施例1的区别是：
所述复苏液包括以下成分：L-脯氨酸25μg/L、亚硒酸钠50mg/L、丙酮酸钠2.2mg/L、NaOH 0.5mg/L、氯化镁0.4mg/L、黄芪甲苷20mg/L、白术内酯Ⅱ25mg/L、泛影酸钠18mg/L，余量是RPMI-1640培养基。
实施例4
本例与实施例1的区别是：
所述复苏液包括以下成分：L-脯氨酸10μg/L、亚硒酸钠100mg/L、丙酮酸钠2.0mg/L、NaOH 0.5mg/L、氯化镁0.4mg/L、黄芪甲苷15mg/L、白术内酯Ⅱ50mg/L、泛影酸钠15mg/L，余量是RPMI-1640培养基。
实施例5
本例与实施例1的区别是：
离心参数是：1500rpm离心10min。
对比例1
本例与实施例1的区别是：
一种CAR-T细胞的复苏方法，包括以下步骤：
液氮中取出装有CAR-T细胞及冻存液的冻存袋，冻存袋于36～40℃水浴条件下1～2min摇晃化冻，500rpm离心1～2min，弃上清；加入36～40℃预热的复苏液，500rpm离心1～2min，弃上清，用RPMI-1640培养基重悬细胞。
对比例2
本例与实施例1的区别是：
所述复苏液包括以下成分：L-脯氨酸50μg/L、亚硒酸钠10mg/L、丙酮酸钠2.2mg/L、NaOH 0.8mg/L、氯化镁0.2mg/L、黄芪甲苷50mg/L、白术内酯Ⅱ60mg/L、泛影酸钠10mg/L，余量是RPMI-1640培养基。
对比例3
本例与实施例1的区别是：
一种CAR-T细胞的复苏方法，包括以下步骤：
液氮中取出装有CAR-T细胞及冻存液的冻存袋，冻存袋于36～40℃水浴条件下1～2min摇晃化冻，500rpm离心1～2min，弃上清；用RPMI-1640培养基重悬细胞。
实验例：
本发明中CAR-T细胞的制备、质量管理过程参照CMBA/T 004.1-2018《嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T细胞)制剂制备质量管理规范标准》进行。CAR-T细胞的制备方法可参照现有技术，例如李鹏等的《CD19-CART治疗B细胞血液恶性肿瘤的临床前研究》。
CAR-T细胞的冻存方法为：(1)泊洛沙姆108配置成质量浓度2.5％的水溶液；将泊洛沙姆水溶液、DMSO与RPMI-1640培养基混合，得混合培养液；
(2)用步骤(1)的混合培养液悬浮CAR-T细胞(密度是106个/mL)，细胞在2℃预冻30min；保温加入氯化钠、西兰花多糖和瓜儿豆蛋白，混合后将细胞悬液置于冻存袋中转入-30℃放置50min，-50℃放置5h，然后-196℃液氮冻存。泊洛沙姆水溶液、氯化钠、西兰花多糖、瓜儿豆蛋白、DMSO和RPMI-1640培养基的质量比为1:1:25:10:15:48。
1.实验方法：
冻存3个月后，液氮中取出装有CAR-T细胞及冻存液的冻存袋，按照实施例和对比例的方法进行复苏。
1.1细胞活率检测：
取单细胞悬浮液，稀释，0.4％台酚蓝操作液与单细胞悬液按1:9混匀；光学显微镜观察，活细胞无染色，死细胞被染色。细胞活率＝(总细胞数-死细胞数)/总细胞数×100％。培养基为空白对照组。
1.2细胞增殖效果检测：
1×105/mL细胞悬液加入至细胞培养板中，100uL/孔。共设置4个培养板，每个培养板分组。每隔24h取出一块培养板，加入20uL/孔MTS溶液，37℃、5％CO2培养箱孵育2h，酶标仪检测OD492nm。培养基为空白对照组。
1.3CAR-T细胞体外清除肿瘤细胞的能力检测：
以NALM-6细胞为靶细胞，通过靶细胞CFSE稀释测定法进行检测。
2.实验结果
2.1细胞活率检测结果：
结果显示实施例与对比例细胞活率相当，无统计学差异。
2.2细胞增殖效果检测结果：
结果见图1。结果显示：
实施例组细胞复苏培养24h、48h的增殖速度明显快于对比例组。说明本发明的复苏方法对CAR-T细胞增殖能力影响小，而常规的37℃水浴在一定程度上降低了CAR-T细胞的增殖能力。
2.3 CAR-T细胞体外清除肿瘤细胞的能力检测结果：
表3细胞毒性百分比(效靶比E:T＝3:1)
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 对比例1 对比例2 对比例3
39.2±1.1 40.7±0.5 42.8±0.7 38.8±1.0 37.2±2.1 36.5±1.0 38.3±0.8 34.3±0.4
结果显示：冻存3个月后，采用本发明复苏方法进行复苏，对CAR-T细胞清除肿瘤细胞能力影响小，而常规的37℃水浴复苏方法对细胞有一定程度的损伤，进而降低了CAR-T细胞清除肿瘤细胞能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种CAR-T细胞的复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：
液氮中取出装有CAR-T细胞及冻存液的冻存袋，加入36～40℃预热的复苏液，冻存袋于36～40℃水浴条件下1～2min摇晃化冻，离心，弃上清；加入36～40℃预热的复苏液混合，离心，弃上清，用细胞培养基重悬细胞；
所述复苏液包括以下成分：L-脯氨酸10～50μg/L、亚硒酸钠10～100mg/L、丙酮酸钠2.0～2.2mg/L、NaOH 0.2～0.5mg/L、氯化镁0.2～0.4mg/L、黄芪甲苷15～25mg/L、白术内酯Ⅱ10～50mg/L、泛影酸钠15～30mg/L，余量是细胞培养基。
2.根据权利要求1所述的CAR-T细胞冻存方法，其特征在于，两次复苏液的加入量均为细胞冻存液的2～3倍体积。
3.根据权利要求1所述的CAR-T细胞冻存方法，其特征在于，离心参数为500～600rpm离心1～2min。
4.根据权利要求1所述的CAR-T细胞冻存方法，其特征在于，所述细胞培养基为RPMI-1640培养基。
5.根据权利要求1所述的CAR-T细胞冻存方法，其特征在于，所述复苏液包括以下成分：L-脯氨酸25μg/L、亚硒酸钠50mg/L、丙酮酸钠2.2mg/L、NaOH 0.5mg/L、氯化镁0.4mg/L、黄芪甲苷20mg/L、白术内酯Ⅱ25mg/L、泛影酸钠18mg/L，余量是细胞培养基。
6.一种CAR-T细胞复苏液，其特征在于，包括以下成分：L-脯氨酸10～50μg/L、亚硒酸钠10～100mg/L、丙酮酸钠2.0～2.2mg/L、NaOH 0.2～0.5mg/L、氯化镁0.2～0.4mg/L、黄芪甲苷15～25mg/L、白术内酯Ⅱ10～50mg/L、泛影酸钠15～30mg/L，余量是细胞培养基。
7.根据权利要求6所述的CAR-T细胞复苏液，其特征在于，包括以下成分：L-脯氨酸25μg/L、亚硒酸钠50mg/L、丙酮酸钠2.2mg/L、NaOH 0.5mg/L、氯化镁0.4mg/L、黄芪甲苷20mg/L、白术内酯Ⅱ25mg/L、泛影酸钠18mg/L，余量是细胞培养基。
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