CN110904027B - 适用于哺乳动物细胞悬浮培养复苏的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于哺乳动物细胞悬浮培养复苏的方法，首先将从液氮中取出的冻存细胞放入37℃恒温水浴锅中震荡温育150~190s；然后将其放入配制的细胞复苏液中，置于37℃，5%CO₂恒温恒湿培养箱中静置培养复苏2天，最后将细胞悬液全部转移至摇瓶中，置于37℃，5%CO₂，100rpm恒温恒湿摇床培养2天，细胞复苏完成。本发明方法简单，由于增加了细胞在细胞复苏液中静置复苏的步骤，保证了复苏后的细胞活率高，不易老化，增殖能力得以提高，可满足多种不同哺乳动物悬浮细胞复苏的需要。

Description

适用于哺乳动物细胞悬浮培养复苏的方法

技术领域

本发明涉及生物、医药等领域所用的细胞复苏方法，尤其是涉及一种适用于哺乳动物细胞悬浮培养复苏的方法。

背景技术

细胞冷冻与复苏是细胞培养的常规操作，可以解决细胞因为连续继代造成的退变或转换。细胞冷冻就是将其放置在液氮中长期超低温保存，在超低温条件下，细胞内部的生化反应极为缓慢，甚至终止。当研究需要时，可以适当的方式将冻存的细胞恢复至常温，此时细胞的形态结构保存正常，生化反应恢复。

哺乳动物悬浮培养细胞包括CHO（中国仓鼠卵巢细胞）、293（人肾上皮细胞）等，平时将细胞放置在液氮中超低温长期保存，悬浮复苏时，将其置于摇瓶培养液中，直接放入摇床上进行复苏。一些细胞较耐剪切，直接摇床复苏非常方便，但还有一些细胞刚复苏时较为脆弱，摇床会对细胞产生一定的剪切力，影响细胞复苏质量，即直接采用摇瓶复苏会造成活率低、易老化，且细胞恢复慢，增殖能力差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于哺乳动物细胞悬浮培养复苏的方法，能够使复苏后的细胞活率高、不易老化且增殖能力好。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的适用于哺乳动物细胞悬浮培养复苏的方法，包括下述步骤：

第一步，从液氮中迅速取出冻存的细胞，放入37℃恒温水浴锅中震荡温育150~190s；

第二步，在细胞培养瓶中按比例加入预热好的培养基及添加剂，配制成细胞复苏液；

第三步，将第一步处理后的细胞加入到第二步盛装有细胞复苏液的培养瓶中，混合均匀后置于37℃，5%CO₂恒温恒湿培养箱中静置培养复苏；

第四步，复苏2天后，取出细胞培养瓶，将瓶中的细胞悬液全部转移至摇瓶中，置于37℃，5%CO₂，100rpm恒温恒湿摇床培养2d，细胞复苏完成。

所述第二步用的添加剂是由L-Glutamine 4mM/L、Insulin 17mM/L、Transferrin1.3 mM/L和Riboflavin 0.38 mM/L配制而成。

所述第二步用的培养基预热至37℃。

本发明的优点在于方法简单，由于增加了细胞在细胞复苏液中静置复苏的步骤，可保证复苏后的细胞活率高，不易老化，增殖能力得以提高，满足了多种不同哺乳动物悬浮细胞复苏的需要。

附图说明

图1是分别采用本发明方法和常规方法复苏的细胞密度增长对比。

图2是分别采用本发明方法和常规方法复苏的细胞活率对比。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明方法做更详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。

需要说明的是：本发明方法中所用的试剂均为市售产品，所用的培养瓶、温浴锅和摇瓶、摇床均为市售产品。

实施例1 采用本发明方法复苏冻存在-147℃液氮中的哺乳动物细胞，具体步骤为：

第一步，从液氮中迅速取出冻存的细胞，放入37℃恒温水浴锅中震荡温育150~190s；注意：温育时间不能超过190s，如果溶化时间过长，冻存液DMSO会对细胞造成损伤；

第二步，在T225方瓶中加入49ml预热至37℃的培养基（通用方法，不同细胞使用不同的培养基）和500ul自制添加剂，配制成细胞复苏液；其中自制添加剂是由L-Glutamine（厂家sigma，货号G8540-100g）4mM/L，Insulin（厂家sigma，货号91077C-250MG）17mM/L，Transferrin（厂家sigma，货号T8158-100MG）1.3 mM/L，Riboflavin（厂家sigma，货号R9504-25G）0.38 mM/L配制而成；

第三步，将第一步处理好的细胞加入到第二步盛装有细胞复苏液的方瓶中，混合均匀后置于37℃，5%CO₂恒温恒湿培养箱中静置培养复苏2天；

第四步，复苏2天后，取出方瓶，将瓶中的细胞悬液全部转移至250ml摇瓶中，置于37℃，5%CO₂，100rpm恒温恒湿摇床培养2d，细胞复苏完成。

实施例2 按常规悬浮方法复苏与实施例1相同的哺乳动物细胞，具体步骤为：

第一步，从液氮中迅速取出冻存的细胞，放入37℃恒温水浴锅中温育，直至全部溶化；

第二步，在125ml摇瓶中加入29ml预热至37℃的培养基；

第三步，将第一步处理好的细胞加入到第二步盛装有培养基的摇瓶中，混合均匀后置于37℃，5%CO₂100rpm恒温恒湿摇床培养复苏2天。

实施例3 复苏细胞增殖能力和活率对比

1、按血球计数板人工细胞计数方法将实施例1和实施例2复苏的细胞进行增殖能力对比，其结果如图1所示，从图中可看出，按照本发明方法复苏的细胞72h后，细胞密度比前一天翻倍，说明细胞已恢复正常状态，证明本发明方法复苏的细胞密度增长稳定。

2、按血球计数板人工细胞计数方法将实施例1和实施例2复苏的细胞进行活率对比，其结果如图2所示，从图中可看出，按照本发明方法复苏的细胞72h后，细胞活率可维持在90%以上，说明复苏细胞状态良好，证明本发明方法复苏的细胞活率更好。

Claims (1)

1.一种适用于哺乳动物细胞悬浮培养复苏的方法，其特征在于：包括下述步骤：

第一步，从液氮中迅速取出冻存的细胞，放入37℃恒温水浴锅中震荡温育150～190s；

第二步，在细胞培养瓶中按比例加入预热至37℃的培养基及添加剂，配制成细胞复苏液；其中，所述添加剂是由L-谷氨酰胺 4mM/L、胰岛素17mM/L、人转铁蛋白1.3 mM/L和核黄素0.38 mM/L配制而成；

第三步，将第一步处理后的细胞加入到第二步盛装有细胞复苏液的培养瓶中，混合均匀后置于37℃，5%CO₂恒温恒湿培养箱中静置培养复苏；

第四步，复苏2天后，取出细胞培养瓶，将瓶中的细胞悬液全部转移至摇瓶中，置于37℃，5%CO₂，100rpm恒温恒湿摇床培养2天，细胞复苏完成。

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