CN117568278A - 肌层浸润性膀胱癌类器官培养基及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于类器官技术领域。本发明公开了一种肌层浸润性膀胱癌类器官培养基，该肌层浸润性膀胱癌类器官培养基包括添加因子及基础培养基，添加因子包括缓冲液、抗生素、氨基酸、维生素、蛋白质、补充剂、抑制剂及细胞因子，基础培养基与添加因子配合。本发明还公开了一种肌层浸润性膀胱癌类器官培养基的制备方法。本发明还公开了一种肌层浸润性膀胱癌类器官培养基的应用。本发明通过肌层浸润性膀胱癌类器官培养基内存在的多种组分配合，实现对肌层浸润性膀胱癌细胞的增殖、促进生长及稳定作用，从而实现从肌层浸润性膀胱癌细胞构建肌层浸润性膀胱癌类器官，并实现构建肌层浸润性膀胱癌类器官的稳定及快速传代。

Description

肌层浸润性膀胱癌类器官培养基及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及类器官技术领域，尤其指一种肌层浸润性膀胱癌类器官培养基及其制备方法与应用。
背景技术
膀胱癌是男性第七大常见癌症，大约75％的膀胱癌是非肌层浸润性膀胱癌，大约25％的膀胱癌是肌层浸润性膀胱癌。分子和细胞生物学等新技术的发展使科学家们能够开发出类器官，在泌尿科外癌症领域，类器官主要用于研究不同疾病的过程。肌层浸润性膀胱癌是一种肿瘤朝着膀胱腔内生长的恶性病症，构建理想的模型可以为肌层浸润性膀胱癌的基础转化和临床试验研究提供技术平台，从而推进肌层浸润性膀胱癌治疗的个性化和精准化发展。
目前常用的肿瘤模型以2D癌细胞系和患者来源的动物移植模型为主，但是这两种模型有诸多局限性。近年来，类器官技术不断发展，类器官模型成为研究人类癌症的新型工具。与传统的二维细胞培养相比，类器官具有许多优势。在最近的研究中，已经证明类器官可以从多种不同的癌症类型发展而来，这些肿瘤来源的类器官保持类型和患者特异性特征。因此，建立肌层浸润性膀胱癌类器官模型不但有利于肌层浸润性膀胱癌的基础研究，而且有助于肌层浸润性膀胱癌的诊断与治疗，提高肌层浸润性膀胱癌患者的整体生存率。
然而目前肌层浸润性膀胱癌类器官的研究报道较为罕见，可能原因是肌层浸润性膀胱癌类器官培养基的研发较为困难，因为不同的肿瘤所处的体内环境不同，并且存在着较大的异质性，因此不同肿瘤类器官的培养基无法通用。此外，2D贴壁培养的肿瘤细胞系已经过永生化处理或实验室驯化，即使都是肌层浸润性膀胱癌细胞，用于构建和培养2D肿瘤细胞系的传统培养基也无法用于构建和培养肌层浸润性膀胱癌类器官。并且，要实现肌层浸润性膀胱癌类器官的构建和稳定及快速传代，必须要满足维持肌层浸润性膀胱癌细胞的增殖活性及激活其增殖通路等多方面的要求，因此要合理调配肌层浸润性膀胱癌类器官培养基的成分与剂量。因此当前生物医学技术领域仍急需一种能够实现肌层浸润性膀胱癌类器官的构建和稳定及快速传代的培养基。
发明内容
为了解决现有技术不足，本发明提供了一种能够实现从肌层浸润性膀胱癌细胞到肌层浸润性膀胱癌类器官构建的肌层浸润性膀胱癌类器官培养基及其制备方法与应用。
本发明提供了一种肌层浸润性膀胱癌类器官培养基，该肌层浸润性膀胱癌类器官培养基包括添加因子及基础培养基，基础培养基能够提供肌层浸润性膀胱癌细胞生长所需的基本营养物质和生长条件，添加因子为肌层浸润性膀胱癌细胞增殖提供营养物质。添加因子包括缓冲液、抗生素、氨基酸、维生素、蛋白质、补充剂、抑制剂及细胞因子，基础培养基用于与添加因子配合，缓冲液用于维持肌层浸润性膀胱癌细胞生长和生存环境，抗生素用于防止肌层浸润性膀胱癌细胞培养过程中的污染和抑制细菌生长，氨基酸用于提供肌层浸润性膀胱癌细胞生长所需的营养物质和维持肌层浸润性膀胱癌细胞的生理功能，维生素用于提供肌层浸润性膀胱癌细胞生长所需的营养物质和维持肌层浸润性膀胱癌细胞的生理功能，蛋白质用于维持肌层浸润性膀胱癌细胞结构及参与肌层浸润性膀胱癌细胞代谢，补充剂用于满足肌层浸润性膀胱癌细胞生长和代谢的需要，维持肌层浸润性膀胱癌细胞的健康状态，抑制剂用于抑制除肌层浸润性膀胱癌细胞外其他细胞生长，细胞因子用于进一步加快肌层浸润性膀胱癌细胞成长。本发明中添加因子中多种成分对肌层浸润性膀胱癌细胞的生长起到促进作用，多种成分对肌层浸润性膀胱癌细胞的生长起到稳定作用，多种成分促进肌层浸润性膀胱癌细胞增殖，通过肌层浸润性膀胱癌类器官培养基内各组分之间协调作用，实现从肌层浸润性膀胱癌细胞到肌层浸润性膀胱癌类器官的构建。本发明的肌层浸润性膀胱癌类器官培养基内具有多种促进生长增殖的成分且具有多种稳定肌层浸润性膀胱癌细胞生长的成分，构建的肌层浸润性膀胱癌类器官稳定且能够实现快速传代。
进一步地，缓冲液为hepes缓冲液，hepes缓冲液在广泛的pH范围内具有良好的稳定性，即使在高温或高浓度条件下也能保持稳定。hepes缓冲液低渗透压，可以减少对肌层浸润性膀胱癌细胞的损伤和压力。hepes缓冲液具有良好的溶解性，可以很好地溶解许多生物分子如蛋白质、核酸及多糖等，溶解后便于肌层浸润性膀胱癌细胞吸收。hepes缓冲液对肌层浸润性膀胱癌细胞无毒害作用，hepes缓冲液可调节pH以适应肌层浸润性膀胱癌细胞的培养需求。抗生素为青霉素-链霉素，青霉素-链霉素可以抑制多种细菌的生长和繁殖，便于肌层浸润性膀胱癌细胞增殖，青霉素和链霉素具有协同作用，可以共同发挥作用增强抗菌效果，这种协同作用可以减少抗生素的用量，降低副作用的发生。青霉素-链霉素的毒性较低，对肌层浸润性膀胱癌细胞危害较小。青霉素-链霉素价格低廉，易于获得和使用。氨基酸为L-谷氨酰胺，L-谷氨酰胺是细胞培养中重要的能量来源之一，可以促进肌层浸润性膀胱癌细胞的生长和增殖，提高肌层浸润性膀胱癌细胞的存活率和产量。L-谷氨酰胺是细胞内许多酶和蛋白质的组成成分，它可以维持肌层浸润性膀胱癌细胞的生理功能，如细胞代谢、信号传递、免疫防御等。L-谷氨酰胺可以减少肌层浸润性膀胱癌细胞培养过程中的污染和细胞损伤，提高肌层浸润性膀胱癌细胞培养的成功率。维生素为烟酰胺，烟酰胺用于提供肌层浸润性膀胱癌细胞生长所需的营养物质和维持细胞的生理功能。蛋白质包括Noggin及R-spondin1(Wnt通路相关蛋白)，Noggin能够促进细胞生长增殖，在肌层浸润性膀胱癌细胞培养中加入Noggin可以促进细胞增殖。Noggin能够抑制BMP信号通路的活性，在肌层浸润性膀胱癌细胞中，BMP信号通路的激活会导致肌层浸润性膀胱癌细胞分化和表型改变，加入Noggin可以抑制BMP信号通路的活性，从而维持肌层浸润性膀胱癌细胞的表型和功能。并且BMP信号通路的激活会导致部分肌层浸润性膀胱癌细胞凋亡，加入Noggin可以抑制BMP信号通路的活性，从而提高肌层浸润性膀胱癌细胞的存活率。R-spondin1(Wnt通路相关蛋白)能够促进细胞增殖，BMP信号通路的激活会导致部分肌层浸润性膀胱癌细胞凋亡，加入R-spondin1(Wnt通路相关蛋白)可以增强Wnt信号通路的活性，以此提高肌层浸润性膀胱癌细胞的存活率。补充剂包括去除维生素A的B27补充剂及N2补充剂，B27补充剂中含有多种维生素和生长因子，肌层浸润性膀胱癌细胞中加入B27补充剂可以促进肌层浸润性膀胱癌细胞的增殖，但B27补充剂中的维生素A会对细胞生长和存活产生不利影响，去除维生素A的B27补充剂可以避免这种不利影响，从而提高肌层浸润性膀胱癌细胞的存活率。N2补充剂中含有多种营养物质，如氨基酸、维生素及矿物质等，添加因子包括N2补充剂可以提供肌层浸润性膀胱癌细胞所需的营养，从而提高肌层浸润性膀胱癌细胞的存活率。抑制剂包括A83-01(TGF-βI型受体抑制剂)、SB202190(P38MAPK抑制剂)及Y27632(ROCK抑制剂)，抑制剂用于抑制除肌层浸润性膀胱癌细胞外其他细胞生长，防止其他细胞吸收添加因子内的生长物质影响肌层浸润性膀胱癌细胞增殖。细胞因子包括EGF(表皮生长因子)、bFGF(成纤维细胞生长因子)、FGF-10(角质细胞因子)及HGF(肝细胞生长因子)，在肌层浸润性膀胱癌细胞培养时EGF(表皮生长因子)、bFGF(成纤维细胞生长因子)、FGF-10(角质细胞因子)及HGF(肝细胞生长因子)均能够促进肌层浸润性膀胱癌细胞的生长和繁殖，增加肌层浸润性膀胱癌细胞数量，还可以支持肌层浸润性膀胱癌细胞的表型和功能。基础培养基为ADMEM/F-12培养基，ADMEM/F-12培养基具有广泛适用性，适用于多种细胞类型的培养。ADMEM/F-12培养基含有丰富的营养成分，能够满足肌层浸润性膀胱癌细胞生长和代谢的需要。ADMEM/F-12培养基可以维持肌层浸润性膀胱癌细胞的表型和功能，有利于细胞的发育与稳定。ADMEM/F-12培养基中含有多种生长因子和细胞因子，可以促进细胞的增殖。ADMEM/F-12培养基的稳定性较好，可以在较长时间内保持其营养成分和酸碱度的稳定。
进一步地，各组分在肌层浸润性膀胱癌类器官培养基中的终浓度为hepes缓冲液的浓度为大于等于5mM且小于等于10mM，青霉素-链霉素的浓度为大于等于0.5％vol且小于等于1％vol，L-谷氨酰胺的浓度为大于等于5mM且小于等于10mM，烟酰胺的浓度为大于等于5mM且小于等于10mM，Noggin的浓度为大于等于100ng/mL且小于等于200ng/mL，R-spondin1(Wnt通路相关蛋白)的浓度为大于等于250ng/mL且小于等于300ng/mL，去除维生素A的B27补充剂的浓度为大于等于1％vol且小于等于3％vol，N2补充剂的浓度为大于等于1％vol且小于等于1.5％vol，A83-01(TGF-βI型受体抑制剂)的浓度为大于等于0.5μM且小于等于1μM，SB202190(P38MAPK抑制剂)的浓度为大于等于0.5μM且小于等于1μM，Y27632(ROCK抑制剂)的浓度为大于等于10μM且小于等于15μM，EGF(表皮生长因子)的浓度为大于等于50ng/mL且小于等于100ng/mL，bFGF(成纤维细胞生长因子)的浓度为大于等于10ng/mL且小于等于20ng/mL，FGF-10(角质细胞因子)的浓度为大于等于10ng/mL且小于等于20ng/mL，HGF(肝细胞生长因子)的浓度为大于等于50ng/mL且小于等于100ng/mL。各组分在肌层浸润性膀胱癌类器官培养基中的终浓度需要具有一定的范围，组分浓度过高可能会对肌层浸润性膀胱癌细胞产生毒性，导致肌层浸润性膀胱癌细胞死亡或生长抑制，组分浓度过高还可能会影响肌层浸润性膀胱癌细胞分化，导致肌层浸润性膀胱癌细胞类型异常，组分浓度过低可能会影响肌层浸润性膀胱癌细胞的生长。本申请通过设置上述各组分浓度范围，在进行肌层浸润性膀胱癌细胞培养时，各组分浓度在上述范围内，能够防止肌层浸润性膀胱癌细胞培养出现异常，促进肌层浸润性膀胱癌细胞的培养。优选地，各组分在肌层浸润性膀胱癌类器官培养基中的终浓度为hepes缓冲液的浓度为10mM，青霉素-链霉素的浓度为1％vol，L-谷氨酰胺的浓度为10mM，烟酰胺的浓度为10mM，Noggin的浓度为100ng/mL，去除维生素A的B27补充剂的浓度为2％vol，N2补充剂的浓度为1％vol，A83-01(TGF-βI型受体抑制剂)的浓度为0.5μM，SB202190(P38MAPK抑制剂)的浓度为0.5μM，Y27632(ROCK抑制剂)的浓度为10μM，R-spondin1(Wnt通路相关蛋白)的浓度为250ng/mL，EGF(表皮生长因子)的浓度为100ng/mL，bFGF(成纤维细胞生长因子)的浓度为10ng/mL，FGF-10(角质细胞因子)的浓度为10ng/mL，HGF(肝细胞生长因子)的浓度为100ng/mL。
本发明公开了一种肌层浸润性膀胱癌类器官培养基的制备方法，包括如下步骤S1：配置添加因子，添加因子包括缓冲液、抗生素、氨基酸、维生素、蛋白质、补充剂、抑制剂及细胞因子，缓冲液的pH为大于等于7.2且小于等于7.4。S2：向基础培养基中依次加入配置好的缓冲液、抗生素、氨基酸、维生素、蛋白质、补充剂、抑制剂及细胞因子配置成为预备培养液，配置成预备培养液后的保存温度为大于等于2℃且小于等于5℃。S3：向预备培养液内加入抑制剂得到肌层浸润性膀胱癌类器官培养基。肌层浸润性膀胱癌细胞的最佳pH范围为大于等于7.2且小于等于7.4，这是肌层浸润性膀胱癌细胞发挥正常功能的最佳酸碱度，如果pH偏离这个范围会影响肌层浸润性膀胱癌细胞的代谢和生理功能，导致肌层浸润性膀胱癌细胞生长缓慢、形态异常甚至细胞死亡等问题。肌层浸润性膀胱癌细胞培养过程中，培养基中的营养物质和代谢产物会影响培养基的pH，细胞代谢产生的酸性物质和碱性物质会积累在培养基中导致培养基的pH发生变化，如果不控制培养基的pH，会导致培养基过酸或过碱，从而影响肌层浸润性膀胱癌细胞的生长和代谢，本申请hepes缓冲液的pH为大于等于7.2且小于等于7.4能够保持肌层浸润性膀胱癌细胞培养基内的酸碱平衡。配置好的预备培养液需要储存在适当的温度下，以保持其稳定性和有效性。该预备培养液的保存温度为大于等于2℃且小于等于5℃时可以帮助减缓微生物的生长，并维持营养成分的稳定性。
本发明公开了一种肌层浸润性膀胱癌类器官培养基的应用，一种肌层浸润性膀胱癌类器官培养基在构建肌层浸润性膀胱癌类器官中的应用。
进一步地，第一步，以肌层浸润性膀胱癌组织为起始原料，对肌层浸润性膀胱癌组织进行预处理，对预处理后的肌层浸润性膀胱癌组织进行消化，消化后获得肌层浸润性膀胱癌细胞，第二步，用基质胶将肌层浸润性膀胱癌细胞重悬后滴加至培养容器内，凝固形成含有肌层浸润性膀胱癌细胞的胶滴，第三步，向培养容器内加入包括如由上述任一制备方法制备得到的肌层浸润性膀胱癌类器官培养基，对含有肌层浸润性膀胱癌细胞的胶滴进行培养后获得肌层浸润性膀胱癌类器官。
进一步地，培养容器内的培养温度为大于等于35℃且小于等于37℃，培养容器内的CO2浓度为大于等于4％且小于等于6％，培养时间为大于等于7天且小于等于10天，培养容器内每2天-3天内更换一次肌层浸润性膀胱癌类器官培养基。
进一步地，第一步中消化的过程为预处理后的肌层浸润性膀胱癌组织与含胶原酶I的消化液一混合进行第一次消化，第一次消化终止反应后收集细胞与含分散酶II的消化液二混合进行第二次消化，第二次消化终止反应后再次收集细胞，将收集到的细胞与缓冲液混合后使用孔径为80μm-120μm滤网进行过滤，从滤液中收集细胞获得肌层浸润性膀胱癌细胞，在收集到的细胞与缓冲液混合之前，将收集到的细胞与红细胞裂解液混合进行裂红。在收集到的细胞与缓冲液混合之前，如果不进行裂红处理，红细胞会干扰实验结果，因为红细胞中含有血红蛋白和其他蛋白质，这些蛋白质会影响细胞的计数、形态和功能等方面的分析。此外红细胞还可能对肌层浸润性膀胱癌细胞培养造成负面影响，因为红细胞会释放一些有害物质如铁离子和自由基等，这些物质可能会对肌层浸润性膀胱癌细胞生长产生不利影响。因此在收集细胞后与缓冲液混合之前，先将收集到的细胞与红细胞裂解液混合进行裂红处理，裂红处理可以有效地去除红细胞，从而获得更纯净的细胞悬液。
进一步地，第一步中的预处理过程为清洗及剪切，第二步中，肌层浸润性膀胱癌细胞与基质胶的配比为1.5×105个-2.5×105个肌层浸润性膀胱癌细胞：80μL-120μL基质胶。
进一步地，消化液一为含有浓度为大于等于1mg/mL且小于等于3mg/mL胶原酶I的ADMEM/F-12培养基，消化液二为含有浓度为大于等于1μg/mL且小于等于3μg/mL分散酶II的ADMEM/F-12培养基。
本发明通过肌层浸润性膀胱癌类器官培养基内存在的多种组分配合，为肌层浸润性膀胱癌细胞提供稳定的pH环境及多种能量来源，其中部分组分能够减少细胞培养过程中的污染和细胞损伤，部分组分能够抑制其他细菌及微生物生长，部分组分共同作用促进肌层浸润性膀胱癌细胞的生长和增殖以实现肌层浸润性膀胱癌细胞的快速传代，部分组分对肌层浸润性膀胱癌细胞起到支持稳定的作用。通过通过肌层浸润性膀胱癌类器官培养基内存在的多种组分配合，能够实现从肌层浸润性膀胱癌细胞构建肌层浸润性膀胱癌类器官的稳定及快速传代。
附图说明
图1为本申请实施例中应用例1中的一种肌层浸润性膀胱癌类器官的结构示意图。
图2为本申请实施例中应用例2中的另一种肌层浸润性膀胱癌类器官的结构示意图。
图3为本申请实施例中对比应用例1中的另一种肌层浸润性膀胱癌类器官的结构示意图。
图4为本申请实施例中对比应用例2中的另一种肌层浸润性膀胱癌类器官的结构示意图。
具体实施方式
为了使本领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明具体实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
肌层浸润性膀胱癌类器官培养基的配置：配方如表1。
表1
对比例1
对比例1与实施例1的区别仅在于：将ADMEM/F-12培养基换成RPMI-1640培养基，其余成分及其终浓度均与实施例1相同。
对比例2
与实施例1的区别仅在于：不添加角质细胞因子EGF(表皮生长因子)，其余成分及其终浓度均与实施例1相同。
应用例1：肌层浸润性膀胱癌类器官的构建
采用按照实施例1中的方法配制的肌层浸润性膀胱癌类器官培养基，构建肌层浸润性膀胱癌类器官，具体步骤如下：
(1)清洗：手术或活检获取人肌层浸润性膀胱肿瘤组织，去除结缔组织及坏死部分等，用冷的含抗生素的PBS缓冲液清洗组织5次；
(2)剪碎：将组织依次用手术剪剪成肉末，可顺利通过1mL的吸头即可，均匀松散且不粘连(冰上低温操作)；
(3)消化：将组织转至15mL离心管中，加入适量消化液一(含1mg/mL胶原酶I的ADMEM/F-12培养基)吹打混匀后置37℃恒温摇床中30min，两倍体积冷的PBS缓冲液终止后离心收集细胞，加入消化液二(含1μg/mL分散酶II的ADMEM/F-12培养基)，吹打混匀后置37℃恒温摇床中30min；
(4)离心：消化后的细胞悬液经1500rpm，离心5min，弃上清；
(5)裂红：观察到出现肉眼可见的红色沉淀，加入3mL红细胞裂解液，混匀，冰上静置5min，加入4倍体积冷的PBS缓冲液进行终止反应，混匀，使用100μm滤网过滤，滤液经1500rpm，离心5min，弃上清；
(6)计数：加入ADMEM/F-12培养基重悬后进行计数，计数后1500rpm，离心5min，弃上清；
(7)接种：以2×105个细胞：100μL基质胶的比例，用Matrigel基质胶重悬混细胞(冰上低温操作)，将基质胶与细胞混合物以100μL/孔滴在24孔板中央，在37℃、浓度为5％CO2培养箱中凝固15min；
(8)沿孔板侧壁缓缓加入700μL肌层浸润性膀胱癌类器官培养基(按照实施例1中的方法配制)，置37℃、浓度为5％CO2培养箱中培养，培养期间每3天换液一次。在培养第0、2、6及12天时肌层浸润性膀胱癌类器官的生长情况分别如图1A、图1B、图1C及图1D。
应用例2：肌层浸润性膀胱癌类器官的传代培养
采用按照实施例1中的方法配制的肌层浸润性膀胱癌类器官培养基，构建肌层浸润性膀胱癌类器官，具体步骤如下：
S1：消化：收集应用例1中培养14天获得的肌层浸润性膀胱癌类器官，去除24孔板内的培养基，并使用PBS缓冲液清洗2次，以1mL/孔加入1×Tryple消化液至24孔板中，吹打混匀后放入37℃、浓度为5％CO2培养箱消化10min，加入等体积ADMEM/F-12培养基终止消化后，经1500rpm，离心5min，弃上清；
S2：铺板：按1:3的传代比例，将Matrigel基质胶与细胞沉淀混合后，将获得的混合物以100μL/孔滴在新的24孔板中，放入37℃、浓度为5％CO2培养箱，凝固15min；
S3：加培养基：待基质胶凝固后，每孔加入700μL预热的肌层浸润性膀胱癌类器官培养基(按照实施例1中的方法配制)，放入37℃、浓度为5％CO2培养箱中孵育，在第0、2及10天时类器官的生长情况分别如图2A、图2B及图2C。
对比应用例1：肌层浸润性膀胱癌类器官的构建
采用按照对比例1中的方法配制的肌层浸润性膀胱癌类器官培养基，构建肌层浸润性膀胱癌类器官，具体步骤如下：
(1)清洗：手术或活检获取人肌层浸润性膀胱肿瘤组织，去除结缔组织及坏死部分等，用冷的含抗生素的PBS缓冲液清洗组织5次；
(2)剪碎：将组织依次用手术剪剪成肉末，可顺利通过1mL的吸头即可，均匀松散且不粘连(冰上低温操作)；
(3)消化：将组织转至15mL离心管中，加入适量消化液一(含1mg/mL胶原酶I的ADMEM/F-12培养基)吹打混匀后置37℃恒温摇床中30min，两倍体积冷的PBS缓冲液终止后离心收集细胞，加入消化液二(含1μg/mL分散酶II的ADMEM/F-12培养基)，吹打混匀后置37℃恒温摇床中30min；
(4)离心：消化后的细胞悬液经1500rpm，离心5min，弃上清；
(5)裂红：观察到出现肉眼可见的红色沉淀，加入3mL红细胞裂解液，混匀，冰上静置5min，加入4倍体积冷的PBS缓冲液进行终止反应，混匀，使用100μm滤网过滤，滤液经1500rpm，离心5min，弃上清；
(6)计数：加入ADMEM/F-12培养基重悬后进行计数；计数后1500rpm，离心5min，弃上清；
(7)接种：以2×105个细胞：100μL基质胶的比例，用Matrigel基质胶重悬混细胞(冰上低温操作)，将基质胶与细胞混合物以100μL/孔滴在24孔板中央，在37℃下、浓度为5％CO2培养箱中凝固15min；
(8)沿孔板侧壁缓缓加入700μL肌层浸润性膀胱癌类器官培养基(按照对比例1中的方法配制)，置37℃、浓度为5％CO2培养箱中培养，培养期间每3天换液一次。图3A和图3B分别为应用例1和本对比应用例1中培养第8天时的类器官生长情况。
对比应用例2：肌层浸润性膀胱癌类器官的构建
采用按照对比例2中的方法配制的肌层浸润性膀胱癌类器官培养基，构建肌层浸润性膀胱癌类器官，具体步骤如下：
(1)清洗：手术或活检获取人肌层浸润性膀胱肿瘤组织，去除结缔组织及坏死部分等，用冷的含抗生素的PBS缓冲液清洗组织5次；
(2)剪碎：将组织依次用手术剪剪成肉末，可顺利通过1mL的吸头即可，均匀松散且不粘连(冰上低温操作)；
(3)消化：将组织转至15mL离心管中，加入适量消化液一(含1mg/mL胶原酶I的ADMEM/F-12培养基)吹打混匀后置37℃恒温摇床中30min，两倍体积冷的PBS缓冲液终止后离心收集细胞，加入消化液二(含1μg/mL分散酶II的DMEM/F12培养基)，吹打混匀后置37℃恒温摇床中30min；
(4)离心：消化后的细胞悬液经1500rpm，离心5min，弃上清；
(5)裂红：观察到出现肉眼可见的红色沉淀，加入3mL红细胞裂解液，混匀，冰上静置5min，加入4倍体积冷的PBS缓冲液进行终止反应，混匀，使用100μm滤网过滤，滤液经1500rpm，离心5min，弃上清；
(6)计数：加入DMEM/F12培养基重悬后进行计数；
(7)接种：以2×105个细胞：100μL基质胶的比例，用Matrigel基质胶重悬混细胞(冰上低温操作)，将基质胶与细胞混合物以100μL/孔滴在24孔板中央，在37℃下、浓度为5％培养箱中凝固15min；
(8)沿孔板侧壁缓缓加入700μL肌层浸润性膀胱癌类器官培养基(按照对比例2中的方法配制)，在37℃下、浓度为5％的CO2培养箱中培养，培养期间每3天换液一次。图4A和图4B分别为应用例1和本对比应用例2中培养第8天时的类器官生长情况。
结果分析：
应用例1：从图1可以看出，应用例1中使用本发明的一种肌层浸润性膀胱癌类器官培养基，能够较快地获得肌层浸润性膀胱癌类器官，并且得到的类器官结构形态清晰完整且在生长过程中较为稳定。
应用例2：从图2可以看出，利用实施例1中的培养基进行肌层浸润性膀胱癌类器官的构建和传代培养，能够实现肌层浸润性膀胱癌类器官的稳定传代，以及传代后的稳定、快速生长。
对比应用例1：从图3中可以看出，若将肌层浸润性膀胱癌类器官培养基中的ADMEM/F-12换成RPMI-1640，会造成肌层浸润性膀胱癌类器官生长发育缓慢及活性差。
对比应用例2：从图4中可以看出，若在肌层浸润性膀胱癌类器官培养基中不添加角质细胞因子EGF(表皮生长因子)，则会造成肌层浸润性膀胱癌类器官生长发育缓慢及活性差。
综上所述，本发明的各个组分都不能缺少或替换，本发明通过肌层浸润性膀胱癌类器官培养基内存在的多种组分配合，实现对肌层浸润性膀胱癌胞的增殖、促进生长及稳定作用，从而实现从肌层浸润性膀胱癌细胞构建肌层浸润性膀胱癌类器官，并实现构建肌层浸润性膀胱癌类器官的稳定及快速传代。
应当理解的是，对于本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种肌层浸润性膀胱癌类器官培养基，其特征在于，包括：
添加因子，该添加因子包括缓冲液、抗生素、氨基酸、维生素、蛋白质、补充剂、抑制剂及细胞因子；
基础培养基，该基础培养基与添加因子配合。
2.根据权利要求1所述的一种肌层浸润性膀胱癌类器官培养基，其特征在于：缓冲液为hepes缓冲液；
抗生素为青霉素-链霉素；
氨基酸为L-谷氨酰胺；
维生素为烟酰胺；
蛋白质包括Noggin及R-spondin1(Wnt通路相关蛋白)；
补充剂包括去除维生素A的B27补充剂及N2补充剂；
抑制剂包括A83-01(TGF-βI型受体抑制剂)、SB202190(P38MAPK抑制剂)及Y27632(ROCK抑制剂)；
细胞因子包括EGF(表皮生长因子)、bFGF(成纤维细胞生长因子)、FGF-10(角质细胞因子)及HGF(肝细胞生长因子)；
基础培养基为ADMEM/F-12培养基。
3.根据权利要求2所述的一种肌层浸润性膀胱癌类器官培养基，其特征在于：各组分在肌层浸润性膀胱癌类器官培养基中的终浓度为：
hepes缓冲液的浓度为大于等于5mM且小于等于10mM；
青霉素-链霉素的浓度为大于等于0.5％vol且小于等于1％vol；
L-谷氨酰胺的浓度为大于等于5mM且小于等于10mM；
烟酰胺的浓度为大于等于5mM且小于等于10mM；
Noggin的浓度为大于等于100ng/mL且小于等于200ng/mL；
R-spondin1(Wnt通路相关蛋白)的浓度为大于等于250ng/mL且小于等于300ng/mL；
去除维生素A的B27补充剂的浓度为大于等于1％vol且小于等于3％vol；
N2补充剂的浓度为大于等于1％vol且小于等于1.5％vol；
A83-01(TGF-βI型受体抑制剂)的浓度为大于等于0.5μM且小于等于1μM；SB202190(P38MAPK抑制剂)的浓度为大于等于0.5μM且小于等于1μM；Y27632(ROCK抑制剂)的浓度为大于等于10μM且小于等于15μM；
EGF(表皮生长因子)的浓度为大于等于50ng/mL且小于等于100ng/mL；
bFGF(成纤维细胞生长因子)的浓度为大于等于10ng/mL且小于等于20ng/mL；
FGF-10(角质细胞因子)的浓度为大于等于10ng/mL且小于等于20ng/mL；
HGF(肝细胞生长因子)的浓度为大于等于50ng/mL且小于等于100ng/mL。
4.一种肌层浸润性膀胱癌类器官培养基的制备方法，其特征在于，包括：
S1：配置添加因子，添加因子包括缓冲液、抗生素、氨基酸、维生素、蛋白质、补充剂、抑制剂及细胞因子，缓冲液的pH为大于等于7.2且小于等于7.4；
S2：向基础培养基中依次加入配置好的缓冲液、抗生素、氨基酸、维生素、蛋白质、补充剂、抑制剂及细胞因子配置成为预备培养液，配置成预备培养液后的保存温度为大于等于2℃且小于等于5℃；
S3：向预备培养液内再次加入抑制剂得到肌层浸润性膀胱癌类器官培养基。
5.一种肌层浸润性膀胱癌类器官培养基的应用，其特征在于，包括：
肌层浸润性膀胱癌类器官培养基在构建肌层浸润性膀胱癌类器官中的应用。
6.根据权利要求5所述的一种肌层浸润性膀胱癌类器官培养基的应用，其特征在于：
第一步，以肌层浸润性膀胱癌组织为起始原料，对肌层浸润性膀胱癌组织进行预处理，对预处理后的肌层浸润性膀胱癌组织进行消化，消化后获得肌层浸润性膀胱癌细胞；
第二步，用基质胶将肌层浸润性膀胱癌细胞重悬后滴加至培养容器内，凝固形成含有肌层浸润性膀胱癌细胞的胶滴；
第三步，向培养容器内加入如由权利要求1-3中所述的肌层浸润性膀胱癌类器官培养基或如权利要求4中的制备方法制备得到的肌层浸润性膀胱癌类器官培养基，对含有肌层浸润性膀胱癌细胞的胶滴进行培养后获得肌层浸润性膀胱癌类器官。
7.根据权利要求6所述的一种肌层浸润性膀胱癌类器官培养基的应用，其特征在于：
培养容器内的培养温度为大于等于35℃且小于等于37℃，培养容器内的CO2浓度为大于等于4％且小于等于6％，培养时间为大于等于7天且小于等于10天，培养容器内每2天-3天内更换一次肌层浸润性膀胱癌类器官培养基。
8.根据权利要求6所述的一种肌层浸润性膀胱癌类器官培养基的应用，其特征在于：
第一步中的预处理过程为清洗及剪切；
第二步中，肌层浸润性膀胱癌细胞与基质胶的配比为1.5×105个-2.5×105：80μL-120μL。
9.根据权利要求6所述的一种肌层浸润性膀胱癌类器官培养基的应用，其特征在于：
第一步中消化的过程为预处理后的肌层浸润性膀胱癌组织与消化液一混合进行第一次消化，第一次消化终止反应后收集细胞，收集的细胞与消化液二混合进行第二次消化，第二次消化终止反应后再次收集细胞，将收集到的细胞与缓冲液混合后使用孔径为80μm-120μm滤网进行过滤，从滤液中收集细胞获得肌层浸润性膀胱癌细胞；
在收集到的细胞与缓冲液混合之前，将收集到的细胞与红细胞裂解液混合进行裂红。
10.根据权利要求9所述的一种肌层浸润性膀胱癌类器官培养基的应用，其特征在于：
消化液一为含有浓度为大于等于1mg/mL且小于等于3mg/mL胶原酶I的ADMEM/F-12培养基，消化液二为含有浓度为大于等于1μg/mL且小于等于3μg/mL分散酶II的ADMEM/F-12培养基。
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