CN105018418B - 含Endothelin-1的人类卵母细胞体外成熟培养液和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含有Endothelin‑1的人类卵母细胞体外成熟培养液，由A液和B液组成，A液：ET‑1，r‑FSH，体积分数10%SSS；B液：ET‑1，r‑FSH，hCG，体积分数10%SSS，溶剂均为常规基础培养液。本发明通过研究证明该培养液和培养方法具有促进人卵母细胞体外成熟，尤其是胞质成熟的能力，并可提高卵母细胞体外受精后的胚胎发育潜能。本发明是根据人未成熟卵母细胞体外培养时胞质与细胞核发育不平衡影响胚胎体外发育潜能的现状，结合ET‑1在卵丘细胞中的生物学功能和作用研制而成，所述培养液可在体外进行人卵母细胞培养中的应用，有助于优化IVM过程，值得推广应用。

Description

含Endothelin-1的人类卵母细胞体外成熟培养液和应用

技术领域

本发明属于生殖医学的生物医学技术领域，涉及一种含有Endothelin-1（ET-1）的人类卵母细胞体外成熟培养液，以及在进行人类未成熟卵母细胞体外成熟培养中的应用。

背景技术

人卵母细胞体外成熟(in vitro maturation, IVM)是指通过体外培养，使卵泡内的未成熟卵母细胞发育成为成熟的第二次减数分裂中期(MⅡ)卵母细胞，受精分裂成胚胎并移植获得妊娠的技术。与常规的体外授精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryotransfer）相比，IVM可以降低大剂量促排卵药物费用，节约就医时间，更重要的是可以避免药物刺激卵巢带来的副作用。而在生殖医学的某些领域，IVM更是有不可替代的作用，如：对有卵巢过度刺激综合症风险的病人进行IVM可最大程度避免卵巢过度刺激综合症的发生；在更安全的条件下，实现肿瘤患者的生育能力保存；为卵子捐赠提供无需刺激的捐赠途径等。虽然IVM技术有着广泛的应用前景，但由于体外成熟的卵母细胞进行体外受精后，其受精，分裂和囊胚形成率均显著低于IVF技术，所以IVM技术的成功率仍不能与常规IVF技术相比。

在人类卵母细胞体内成熟环境中，卵子处在完整的卵泡中，卵细胞和卵丘细胞、颗粒细胞、卵泡膜细胞等形成了一个复杂精细的微环境调节系统，使细胞质和细胞核高度同步化发育。只有模仿卵泡的微环境才能提高体外成熟卵细胞的成熟率、受精率和发育潜能。目前IVM技术虽然已经有很大提高，但因对卵母细胞发育成熟机制及所需环境条件认识有限，IVM仍有许多问题亟待解决。

在目前已经推广应用人类的ART技术中，IVM成功率最不稳定。其中突出的问题是细胞核与细胞质成熟的不同步。IVM将未成熟的卵母细胞从中等大小的卵泡中分离出来，致使卵母细胞成熟环境受到影响和干扰。体外培养虽可以获得一定比例的自发细胞核成熟，但是细胞质成熟常不能同步完成，致使卵母细胞缺乏某些支持胚胎发育的关键细胞质成分，出现部分生长因子的表达和印记改变，发生染色体和纺锤体结构异常，进而导致IVM卵母细胞受精和胚胎发育能力下降。

ET-1是内皮素(endothelin, ET)家族的一个重要成员,具有重要的生理功能。ET-1以及EDNRA基因敲除小鼠在出生后不久死去。ET-1在呼吸、心血管、泌尿各系统起调节作用并能影响肿瘤的发生、发展、转移。此外，ET-1在生殖激素调节、妊娠、分娩等生殖过程中也起着重要作用。我们前期研究发现hCG可以刺激卵巢的颗粒细胞和卵丘细胞产生ET-1，并与卵丘细胞上的ET-1 A受体（endothelin receptor type A, EDNRA）结合，从而突破次黄嘌呤维持的减数分裂阻滞，使减数分裂重启，促进卵母细胞的成熟。

到目前为止，尚未见有关ET-1应用于人类卵母细胞体外成熟技术领域的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种含有ET-1的人类卵母细胞体外成熟培养液，所述人卵母细胞体外成熟培养液组成如下：A液：ET-1 100ng/ml，0.075IU/ml r-FSH，体积分数10%人血清替代物（Serum Substitute Supplement, SSS），溶剂为常规基础培养液；B液：ET-1100ng/ml，0.075IU/ml r-FSH，0.5IU/ml hCG，体积分数10%SSS，溶剂为常规基础培养液。基础培养液是指G-IVF。

为实现上述目的，本发明将卵母细胞-卵丘复合体（Oocyte cumulus complexes,OCC）置于含有ET-1的体外成熟培养液A液中进行培养，含有ET-1和r-FSH且不含hCG的A液有助于维持卵丘细胞持续供给卵母细胞cAMP，保持减数分裂阻滞，有助于细胞浆的发育成熟。在培养一段时间后将OCC转入体外成熟培养液B液中进行培养，含有ET-1，r-FSH和hCG的B液有助于卵母细胞核浆同步发育，促进卵母细胞成熟。

ET-1购自英国TOCRIS公司，r-FSH（果那芬）购自瑞士Serono公司，HCG（艾泽）购自瑞士Serono公司。SSS购自美国Irvine公司。G-IVF购自瑞典vitrolife公司。

本发明所述血清替代物不仅仅指SSS，还包括其他可以用于人类辅助生殖领域的血清替代物。

本发明的另一个目的是提供所述的含有ET-1的人类卵母细胞体外成熟培养液在体外进行人卵母细胞培养中的应用，通过以下步骤实现：

1、配制人类卵母细胞体外成熟培养液，组成如下：A液：ET-1 100ng/ml，0.075IU/ml r-FSH，体积分数10%SSS，溶剂为常规基础培养液；B液：ET-1 100ng/ml，0.075IU/ml r-FSH，0.5IU/ml hCG，体积分数10%SSS，溶剂为常规基础培养液。基础培养液是指G-IVF。

2、在四孔培养皿中加入含有ET-1的人类卵母细胞体外成熟培养液（A液与B液）各两孔，每孔750μl，并放置于含6%CO₂，37℃，饱和湿度的恒温培养箱中平衡6小时以上。

3、使用双腔取卵针以较低的负压（约90mmHg）在B超引导下吸取卵泡中的OCC，将已经吸取在试管中的未成熟OCC在体式显微镜下仔细找出，并使用斜面转动法初步鉴定卵母细胞是否成熟，一切操作都需要在37℃的热台上完成。

所述斜面转动法是指在体式显微镜下，将培养皿倾斜约10-15°，并将OCC沿培养皿外缘小心转动，由于外缘在转动的过程中液体量减少，可以使OCC充分展开，进而较容易鉴别含有生殖泡（GV）的未成熟卵母细胞。

4、将卵泡穿刺取卵术中取出的未成熟OCC在卵母细胞体外成熟培养液A液中漂洗两遍，随后将OCC转移入新的卵母细胞体外成熟培养液A液中培养10小时。

10小时后，将未成熟OCC转移入卵母细胞体外成熟培养液B液中漂洗两遍，随后将OCC转移入新的卵母细胞体外成熟培养液B液中培养14小时。

5、体外培养24小时后，将未成熟OCC转移至透明质酸酶溶液中使用灭菌巴氏吸管吹打数次，使卵丘细胞疏松易剥离，再用140μm口径剥卵针将卵母细胞周围的卵丘细胞小心剥除。

所用的透明质酸酶（HYASE-10X）购自瑞典vitrolife公司，使用前稀释10倍。

6、在倒置显微镜下确认明显排出极体的MII（Meiosis II）卵母细胞为成熟的卵母细胞，将成熟的卵母细胞使用玻璃吸管小心转移至G-1培养液中，并置于含6%CO₂，37℃，饱和湿度的恒温培养箱中，即完成细胞培养。择时以ICSI方式进行体外授精。

本发明通过研究证明该培养液和培养方法具有促进人卵母细胞体外成熟，尤其是胞质成熟的能力，并可提高卵母细胞体外受精后的胚胎发育潜能。本发明所涉及的人未成熟卵母细胞体外成熟培养液和培养方法是根据人未成熟卵母细胞体外培养（IVM）时胞质与细胞核发育不平衡影响胚胎体外发育潜能的现状，结合ET-1在卵丘细胞中的生物学功能和作用研制而成。含有ET-1成分的培养液通过序贯加入性激素（r-FSH/hCG）进行培养可以使卵母细胞核浆发育趋于同步，提高胚胎的受精率和发育潜能，有助于优化IVM过程，值得推广应用。

具体实施方式

本发明结合具体实施例做进一步说明，本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例一：配制含有ET-1的人类卵母细胞体外成熟培养液

A液：称取ET-1 10μg，7.5IU r-FSH，10ml SSS，用G-IVF定容至100ml，混匀，使用0.22μm的微孔过滤膜（Millipore）抽滤后存放入4℃冰箱。

B液：称取ET-1 10μg，7.5IU r-FSH，10ml SSS和50IU hCG，用G-IVF定容至100ml，混匀，使用0.22μm的微孔过滤膜（Millipore）抽滤后存放入4℃冰箱。

实施例二：含有ET-1的人类卵母细胞体外成熟培养液用于人类卵母细胞体外成熟培养

将人类未成熟卵母细胞-卵丘复合物（OCC）分为三组，分别在G-IVF培养液（对照组）、含有0.075IU/ml r-FSH，0.5IU/ml hCG，体积分数10%SSS的G-IVF培养液和实施例一制备的含有ET-1的人类卵母细胞体外成熟培养液中进行体外成熟培养，随后进行ICSI方式体外受精。具体方法如下：

1、试剂平衡预热：在不同的四孔培养皿中分别加入含体积分数10%SSS的G-IVF培养液（对照组）、含有0.075IU/ml r-FSH，0.5IU/ml HCG，体积分数10%SSS的G-IVF培养液和实施例一制备的含有ET-1的人类卵母细胞体外成熟培养液。特别要指出的是含有ET-1的人卵母细胞体外成熟培养液加入方法为A液与B液各两孔，每孔750μl。并放置于含6%CO₂，37℃，饱和湿度的恒温培养箱中平衡6小时以上。

2、人类未成熟卵母细胞的获取：使用双腔取卵针以较低的负压（约90mmHg）在B超引导下吸取卵泡中的OCC。在37℃的热台上将已经吸取在试管中的未成熟OCC在体式显微镜下仔细找出，并使用斜面转动法初步鉴定卵母细胞是否成熟。

3、未成熟卵母细胞的体外培养：将卵泡穿刺取卵术中取出的未成熟OCC分别在含体积分数10%SSS的G-IVF培养液（对照组）、含有0.075IU/ml r-FSH，0.5IU/ml HCG，体积分数10%SSS的G-IVF培养液和实施例一制备的含有ET-1的人类卵母细胞体外成熟培养液中培养共计24小时。在含有ET-1的人类卵母细胞体外成熟培养液中培养应注意首先在卵母细胞体外成熟培养液A液中漂洗两遍，随后将OCC转移入新的卵母细胞体外成熟培养液A液中培养10小时。10小时后，将未成熟OCC转移入卵母细胞体外成熟培养液B液中漂洗两遍，随后将OCC转移入新的卵母细胞体外成熟培养液B液中培养14小时。

4、OCC脱卵丘细胞：体外培养24小时后，将未成熟OCC转移至1X透明质酸酶溶液中使用灭菌巴氏吸管吹打数次，使卵丘细胞疏松易剥离，再用140μm口径剥卵针将卵母细胞周围的卵丘细胞小心剥除。

5、授精：在倒置显微镜下确认明显排出极体的MII卵母细胞为成熟的卵母细胞。将成熟的卵母细胞使用玻璃吸管小心转移至G-1培养液中，并置于含6%CO₂，37℃，饱和湿度的恒温培养箱中，择时以ICSI方式进行体外授精。

6、胚胎观察：在ICSI受精后的第1天（D1）观察受精情况，以双原核出现判定正常受精。第2天（D2）观察胚胎分裂情况。第5天（D5）观察囊胚形成情况。

结果显示：体外成熟培养24小时后，含r-FSH，hCG，SSS的G-IVF组和实施例1体外成熟培养液组的成熟率分别为82.67%和88.05%，均高于对照组。D1观察受精情况发现含r-FSH，hCG，SSS的G-IVF组和实施例1体外成熟培养液组的受精率分别为68.92%和74.58%，均高于对照组。D2分裂率统计显示实施例1体外成熟培养液组的分裂率为94.19%，高于对照组（80.96%）和含r-FSH，hCG，SSS的G-IVF组（87.34%）。D5囊胚形成率显示实施例1体外成熟培养液组的囊胚形成率（22.86%）均高于高于对照组（11.50%）和含r-FSH，hCG，SSS的G-IVF组（13.45%）。（见表1）

注：^a：相对于对照组P<0.05，^b：相对于对照组P<0.05，^c：相对于对照组P<0.05，^c*：相对于含r-FSH，HCG，SSS的G-IVF组P<0.05，^d：相对于对照组和含r-FSH，HCG，SSS的G-IVF组P<0.05。

实验结果证明，使用实施例1的体外成熟培养液进行人未成熟卵母细胞体外培养可以有效促进核浆发育平衡，提高胚胎的分裂率和囊胚形成率，进而增强胚胎发育潜能。值得在临床辅助生殖中开展IVM时推广应用。

Claims (1)

1.一种含Endothelin-1的人类卵母细胞体外成熟培养液在进行人卵母细胞培养中的应用：其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）配制人类卵母细胞体外成熟培养液，A液：ET-1 100ng/ml，0.075IU/ml r-FSH，体积分数10%人血清替代物，溶剂为常规基础培养液，B液：ET-1 100ng/ml，0.075IU/ml r-FSH，0.5IU/ml hCG，体积分数10%人血清替代物，溶剂为常规基础培养液，常规基础培养液为G-IVF培养液；

（2）将人类卵母细胞体外成熟培养液放置于含6%CO₂，37℃，饱和湿度的恒温培养箱中平衡6小时以上；

（3）将未成熟卵母细胞-卵丘复合体在卵母细胞体外成熟培养液A液中漂洗两遍，随后将未成熟卵母细胞-卵丘复合体转移入新的A液中培养10小时；

（4）10小时后，将未成熟卵母细胞-卵丘复合体转移入B液中漂洗两遍，随后将卵母细胞-卵丘复合体转移入新的B液中培养14小时；

（5）14小时后，将未成熟卵母细胞-卵丘复合体转移至透明质酸酶溶液中吹打数次，再用剥卵针将卵母细胞周围的卵丘细胞小心剥除；

（6）在倒置显微镜下确认明显排出极体的Meiosis II卵母细胞为成熟的卵母细胞，将成熟的卵母细胞使用玻璃吸管小心转移至G-I培养液中，并置于含6%CO₂，37℃，饱和湿度的恒温培养箱中，即完成细胞培养。