CN111838134A

CN111838134A - 一种肿瘤组织转运液与用途

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Publication number: CN111838134A
Application number: CN202010760181.3A
Authority: CN
Inventors: 屠志刚; 刘晗青
Original assignee: Jiangsu Laisen Biotechnology Research Institute Co ltd
Current assignee: Jiangsu Laisen Biotechnology Research Institute Co ltd
Priority date: 2020-07-31
Filing date: 2020-07-31
Publication date: 2020-10-30

Abstract

本发明属生物技术领域，具体涉及一种肿瘤组织转运液与用途。本发明所提供的肿瘤组织转运液的组分中包括多种抗生素和营养因子，其成分确定、不含血清，可以显著改善以往的组织转运液营养成分贫乏的缺点，在很大程度上避免了肿瘤样本在保存或运输中的活性降低。提供的转运液制备简单，可以有效提高新鲜肿瘤样本的活性，能够很好的保护肿瘤样本细胞形态，其可以显著增加PDX的成模率，缩短造模时间；针对PDX肿瘤模型的建立具有巨大帮助，具有较高的商业应用价值。

Description

一种肿瘤组织转运液与用途

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种肿瘤组织转运液与用途。

背景技术

PDX (Patient-Derived tumor Xenograft)人源肿瘤异种移植模型，是指将肿瘤患者的肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠体内，依靠小鼠提供的微环境进行生长而建成的一种肿瘤模型。PDX模型保留有患者的肿瘤组织，保留有原代肿瘤的组织学、遗传学特征并维持有病人肿瘤的异质性。目前，PDX肿瘤模型作为检测药物反应平台，模拟不同药物在体内的代谢途径及对肿瘤的治疗效果。PDX肿瘤模型药效学结果与临床有很高的相关性，其药效结果同临床一致性更高、可避免使用对患者无效的药物、缩短治疗周期、节省费用、减少无效治疗的毒副反应，大大提高治愈成功率，降低癌症治疗门槛。

PDX肿瘤模型建立的成功与否很大程度上取决于肿瘤样本的活性，在肿瘤样本移植过程中需要采用保存液来维持肿瘤组织的活性。目前常见的肿瘤组织体外保存液成分简单，主要为基础培养基、抗生素等，缺乏肿瘤细胞生长和代谢所必须的丰富的营养成份，导致组织活性降低，易发生污染，致使PDX建膜成功率降低，且成本高、实验难度大。

发明内容

有鉴于此，本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种肿瘤组织体外转运液及其应用。提供的体外转运液能够维持体外肿瘤组织的生物活性，提高成瘤率，延长肿瘤组织体外转运过程的转运时间，进一步提高PDX建膜的成功率。

本发明的上述目的通过如下技术方案得以实现：

一方面，本发明提供了一种肿瘤组织转运液，所述组织转运液以DMEM高糖培养基为基础培养基，所述的组织转运液还含有0.5~4 mg/ml胰岛素、1~15 mMTRF、0.5~2%非必需氨基酸、0.5~2% L-谷氨酰胺、18~72 ng/ml皮质醇、0. 1~1.1 mg/ml转铁蛋白和0.1~1 μg/ml亚硒酸钠。所述的组织转运液还含有抗生素，作为优选，所述的抗生素为青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素中的一种或多种。

在一个实施方案中，所述的组抗生素为100 unit/ml青霉素，100μg/ml 链霉素，50mg/ml 庆大霉素和0.25 mg/ml 两性霉素。

在进一步的实施方案中，所述的肿瘤组织转运液还含有1~2 mg/ml胰岛素、6~7mMTRF、0.5~2%非必需氨基酸、0.5~2% L-谷氨酰胺、30~36 ng/ml皮质醇、0.4~0.55 mg/ml转铁蛋白、0.1~1 μg/ml亚硒酸钠、100 unit/ml青霉素，100μg/ml 链霉素，50 mg/ml 庆大霉素和0.25 mg/ml 两性霉素。

另一方面，本发明还提供了上述肿瘤组织转运液在促进人源肿瘤异种移植成瘤中的用途。

进一步地，所述的用途之一为在人源肿瘤异种移植过程中延长肿瘤组织体外转运时间。另外，所述的用途之一为在人源肿瘤异种移植过程中提高肿瘤组织成瘤率。

进一步地，所述的肿瘤为肺癌或乳腺癌。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明所提供的肿瘤组织转运液的组分中包括多种抗生素和营养因子，其成分确定、不含血清，可以显著改善以往的组织转运液营养成分贫乏的缺点，在很大程度上避免了肿瘤样本在保存或运输中的活性降低。提供的转运液制备简单，经验证，本发明所提供的组织转运液可以有效提高新鲜肿瘤样本的活性，能够很好的保护肿瘤样本细胞形态，其可以显著增加PDX的成模率，缩短造模时间；尤其针对肺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌的PDX肿瘤模型的建立具有巨大帮助，具有较高的商业应用价值。

具体实施方式

本发明公开了一种肿瘤组织转运液与用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。

试剂：DMEM高糖培养基、胰岛素、青霉素、链霉素、两性霉素、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、皮质醇、转铁蛋白、亚硒酸钠均购自于Thermo Fisher，TRF购自于Abcam，庆大霉素购自于上海生工。

实施例1：肿瘤组织转运液的配置

本发明以DMEM高糖培养基作为基础培养基，用于维持组织活性的基本培养物质；胰岛素（Insulin）用于维持组织细胞对葡萄糖的摄取和利用；促甲状腺素释放因子（TRF）又称促甲状腺激素释放激素，用于维持组织细胞活性；皮质醇是一类糖皮质激素，用于维持组织细胞内糖、脂、蛋白质的代谢，加入转铁蛋白负责运载由红细胞降解释放的铁，维持细胞代谢；加入谷氨酰胺与非必需氨基酸主要是为了补充添加组织细胞代谢所需要的氨基酸；加入亚硒酸钠补充微量元素；加入青霉素、链霉素、庆大霉素、两性霉素类抗生素是为预防组织在转运过程被细菌类物生物污染。

取50ml无菌离心管，在DMEM（高糖）培养基中加入4 mg/ml 胰岛素、15 mM TRF、100unit/ml 青霉素、100μg/ml 链霉素、50 mg/ml 庆大霉素、0.25 mg/ml 两性霉素、2%非必需氨基酸、2% L-谷氨酰胺、72 ng/ml 皮质醇、1.1 mg/ml转铁蛋白和1μg/ml亚硒酸钠后配制得到肿瘤组织转运液。

实施例2：肿瘤组织转运液的配制

取50ml无菌离心管，在DMEM（高糖）培养基中加入0.5 mg/ml 胰岛素、1mM TRF、100unit/ml 青霉素、100μg/ml 链霉素、50 mg/ml 庆大霉素、0.25 mg/ml 两性霉素、0.5%非必需氨基酸、0.5% L-谷氨酰胺、18 ng/ml 皮质醇、0.1mg/ml转铁蛋白和0.1μg/ml亚硒酸钠后配制得到肿瘤组织转运液。

实施例3：肿瘤组织转运液的配置

取50ml无菌离心管，在DMEM（高糖）培养基中加入1 mg/ml 胰岛素、6 mM TRF、100unit/ml 青霉素、100μg/ml 链霉素、50 mg/ml 庆大霉素、0.25 mg/ml 两性霉素、2%非必需氨基酸、2% L-谷氨酰胺、30 ng/ml 皮质醇、0.4 mg/ml转铁蛋白和0.6μg/ml亚硒酸钠后配制得到肿瘤组织转运液。

实施例4：肿瘤组织转运液的配置

取50ml无菌离心管，在DMEM（高糖）培养基中加入2mg/ml 胰岛素、7 mM TRF、100 unit/ml 青霉素、100μg/ml 链霉素、50 mg/ml 庆大霉素、0.25 mg/ml 两性霉素、1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺、36 ng/ml 皮质醇、0.55mg/ml转铁蛋白和0.5μg/ml亚硒酸钠后配制得到肿瘤组织转运液。

实施例5：转运液对人源肿瘤异种移植模型中肿瘤成瘤率的影响

制备人源肿瘤异种移植模型：分别以人的乳腺癌细胞株异种移植后的肿瘤组织MCF-7和MDA-MB-231作为样本，当组织块长到100 mm³大小时，从裸鼠体内切除，切成2-3 mm³大小。分别取新鲜的组织块各10个，随机均分为实验组和对照组；实验组组织块浸泡在5 ml实施例1所制备的肿瘤组织转运液中，对照组相同条件下放入同体积的DMEM（高糖）培养基（含100 unit/ml 青霉素，100 μg/ml 链霉素）中，实验组和对照组均在冰上放置4小时后，植入裸鼠皮下。统计成瘤的成功率和成瘤时间。

表1.肿瘤成瘤成功率对比表

	实验组（MCF-7）	对照组（MCF-7）	实验组（MDA-MB-231）	对照组（MDA-MB-231）
					成瘤时间（天）	15.4	18.9	17.8	22.8
成瘤成功率（%）	80	60	90	70

由表1可知，与对照组相比，本发明所提供的肿瘤组织转运液可以明显缩短成瘤时间，且提高肿瘤组织块植入小鼠皮下的成瘤率。

实施例6：转运液对肿瘤组织保存时间的影响

分别以人的肺癌细胞株异种移植后的肿瘤组织A549和PC9作为样本，当组织块长到150mm³大小时，从裸鼠体内切除，切成2-3 mm³大小。分别取新鲜的组织块各50个，随机均分为5组，测试在不同保存时间后的成瘤时间和成瘤成功率。各组组织块在4°C转运液中分别保存4小时、24小时、48小时、72小时和96小时；后植入裸鼠皮下。分别统计成瘤成功率和成瘤时间。

表2.保存时间对对肿瘤成瘤率的影响

保存时间	4 h	24 h	48 h	72 h	96 h
						A549成瘤时间 (天）	15.6	18.3	21.6	26.8	32
A549成瘤成功率 (%)	90	80	70	50	40
						PC9成瘤时间 (天）	23.5	26.8	29.9	33.6	38.6
PC9成瘤成功率 (%)	80	80	60	50	30

由表2可知，本发明所提供的肿瘤组织转运液可以长时间维持肿瘤组织的活性，即使在转运液中保存96小时后，肿瘤组织仍能保持相当的成瘤成功率，且肿瘤组织在转运液中时间越少，成瘤时间越短，成功率越高。

以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种肿瘤组织转运液，其特征在于，所述组织转运液以DMEM高糖培养基为基础培养基，所述的组织转运液还含有0.5~4 mg/ml胰岛素、1~15 mM TRF、0.5~2%非必需氨基酸、0.5~2% L-谷氨酰胺、18~72 ng/ml皮质醇、0. 1~1.1 mg/ml转铁蛋白和0.1~1 μg/ml亚硒酸钠。

2.根据权利要求1所述的肿瘤组织转运液，其特征在于，所述的组织转运液还含有抗生素，所述的抗生素为100 unit/ml青霉素，100μg/ml 链霉素，50 mg/ml 庆大霉素和0.25mg/ml 两性霉素。

3.根据权利要求1所述的肿瘤组织转运液，其特征在于，所述的肿瘤组织转运液以DMEM高糖培养基为基础培养基，含有1~2 mg/ml胰岛素、6~7 mMTRF、0.5~2%非必需氨基酸、0.5~2% L-谷氨酰胺、30~36 ng/ml皮质醇、0.4~0.55 mg/ml转铁蛋白、0.1~1 μg/ml亚硒酸钠、100 unit/ml青霉素，100μg/ml 链霉素，50 mg/ml 庆大霉素和0.25 mg/ml 两性霉素。

4.权利要求1所述的肿瘤组织转运液在促进人源肿瘤异种移植中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述用途为人源肿瘤异种移植过程中延长肿瘤组织体外转运时间。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述用途为人源肿瘤异种移植过程中提高肿瘤组织成瘤率。

7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为肺癌或乳腺癌。