CN117025508A - 肾上皮前体样细胞及其制备方法、制剂和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种肾上皮前体样细胞的制备方法,包括以下步骤:提供肾原代细胞;将所述肾原代细胞放入重编程培养基中进行退分化培养,直至所述肾上皮前体样细胞的融合度不低于80%,使用胰酶消化液对所述肾上皮前体样细胞进行消化处理,以得到肾上皮前体样细胞,其中,所述重编程培养基包括基础培养基、氢化可的松、霍乱霉素、胰岛素、腺嘌呤、转铁蛋白和三碘甲状腺原氨酸。本发明解决了现有技术中的肾上皮前体样细胞的制备存在体外难以扩增的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及肾上皮前体样细胞及其制备方法、制剂和应用。
背景技术
终末期肾病是急慢性肾病不断发展的结果,传统的药物治疗和透析治疗难以逆转肾脏结构的损伤和肾功能的持续下降,最后不可避免的会进展为终末期肾病。肾脏功能的基本单位是肾单位(Nephron),肾单位主要包括肾小球与肾小管。研究显示,成体肾脏无法完整再生肾单位,但是肾小管上皮具有损伤修复及再生的潜能。研究显示,在人类成体肾单位中存在前体细胞,包括位于肾小球囊以及散布在肾小管中的表达CD133+和CD24+的上皮前体细胞。基于对肾小管上皮细胞进行谱系示踪的小鼠模型发现,终末分化的肾小管上皮细胞在肾脏受到损伤时可脱分化为表达SOX9+的前体细胞,证明RTCs具有细胞命运可塑性。研究表明,人尿液中可能直接提取得到肾脏上皮前体细胞,但是由于其含量低,从尿液中分离提取需要繁琐的步骤且效率较低。
尿液是肾脏上皮细胞的可靠来源,从尿液中获取肾脏上皮细胞并用于肾脏上皮细胞再生治疗有无创安全的优势。终末分化的肾脏上皮细胞具有命运可塑性,使用肾脏上皮前体细胞缓解急慢性肾损伤是一种具有极大潜力的新型疗法,但是目前从尿液中分离成体肾上皮前体细胞需要繁琐的培养步骤,包括饲养层细胞的使用以及单克隆筛选,成体肾上皮前体细胞体外培养的来源还有成体肾组织分选以及胚胎干细胞(英文名称为Embryonicstem cell,简称为ESCs)或诱导性多能干细胞(英文名称为Induced pluripotent stemcells,简称为iPSCs)分化,然而不论哪种方式都存在低效、步骤繁琐、安全性差、细胞难以扩增等问题。
因此,有必要提供一种肾上皮前体样细胞及其制备方法、制剂和应用以解决现有技术中存在的上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供肾上皮前体样细胞及其制备方法、制剂和应用,以解决现有技术中的肾上皮前体样细胞的制备存在体外难以扩增的问题。
为实现上述目的,本发明的肾上皮前体样细胞的制备方法,包括以下步骤:
S0:提供肾原代细胞;
S1:将所述肾原代细胞放入重编程培养基中进行退分化培养,直至所述肾上皮前体样细胞的融合度不低于80%,使用胰酶消化液对所述肾上皮前体样细胞进行消化处理,以得到肾上皮前体样细胞,其中,所述重编程培养基包括基础培养基、氢化可的松、霍乱霉素、胰岛素、腺嘌呤、转铁蛋白和三碘甲状腺原氨酸。
本发明肾前体样细胞的制备方法的有益效果在于:通过将所述肾原代细胞放入重编程培养基中进行退分化培养,所述重编程培养基包括基础培养基、氢化可的松、霍乱霉素、胰岛素、腺嘌呤、转铁蛋白和激动剂,以使得所述肾原代细胞不断实现自我更新和增殖,从而本申请解决了现有技术中的肾上皮前体样细胞的制备存在体外难以扩增的问题。
优选的,所述肾上皮前体样细胞的制备方法还包括以下步骤:S2:将所述肾上皮前体样细胞在所述重编程培养基中进行扩增培养,直至所述肾上皮前体样细胞的融合度不低于80%后,使用所述胰酶消化液对所述肾上皮前体样细胞进行消化处理,以得到传代的肾上皮前体样细胞。
优选的,所述重编程培养基还包括生长因子、ROCK激酶抑制剂、Wnt信号通路激动剂、TGF-β信号抑制剂、营养补充剂和缓冲液。
优选的,以占所述基础培养基的体积计,所述氢化可的松的含量为0.3-0.5微克/毫升,所述霍乱霉素的含量为0.5×10-10-1.5×10-10M,所述胰岛素的含量为4.5-5.5纳克/毫升,所述腺嘌呤的含量为1.3×10-4-2.3×10-4M,所述转铁蛋白的含量为4.5-5.5微克/毫升,所述三碘甲状腺原氨酸的含量为1.5×10-9-2.5×10-9M。
优选的,以占所述基础培养基的体积计,所述生长因子的含量为50-90纳克/毫升,所述ROCK激酶抑制剂的含量为8-12μM,所述Wnt信号通路激动剂的含量为2-4μM,所述TGF-β信号抑制剂的含量为0.5-1.5μM,所述营养补充剂的含量为0.5-1.5%,所述缓冲液的体积含量不超过5%。
优选的,所述肾上皮前体样细胞阳性表达CD24、CD133、SOX9、CD44中的至少一种。
本发明又提供了一种肾上皮前体样细胞,所述肾上皮前体样细胞通过所述肾上皮前体样细胞的制备方法制备得到。
本发明肾上皮前体样细胞的有益效果在于:所述肾上皮前体样细胞制备方法简单,得到的肾上皮前体样细胞能够降低肾损伤对人体的影响。
本发明又提供了一种肾上皮前体样细胞制剂,所述肾上皮前体样细胞制剂包括所述肾上皮前体样细胞和药学上可接受的载体。
本发明肾上皮前体样细胞制剂的有益效果在于:得到的肾上皮前体样细胞制剂能够缓解肾缺血再灌注导致的肾损伤及肾间质纤维化。
优选的,所述药学上可接受的载体包括生理盐水和复方电解质注射液中的任意一种。
优选的,使用所述肾上皮前体样细胞制剂干预体内动物模型后考察对肾损伤的影响。
优选的,所述动物模型包括单侧小鼠肾缺血再灌注模型。
附图说明
图1为本发明实施例的第四代肾上皮前体样细胞形态的照片示意图;
图2为本发明实施例的第十代肾上皮前体样细胞形态的照片示意图;
图3为本发明实施例的第三代对照肾上皮前体样细胞形态的照片示意图;
图4为本发明的重编程培养基和基础培养基对肾上皮前体样细胞扩增培养的对比曲线图;
图5为本发明实施例的肾上皮前体样细胞的基因表达标志物CD133的情况示意图;
图6为本发明实施例的肾上皮前体样细胞的基因表达标志物SOX9的情况示意图;
图7为本发明实施例的肾上皮前体样细胞的基因表达标志物CD24的情况示意图;
图8为本发明实施例的肾上皮前体样细胞的基因表达标志物CD44的情况示意图;
图9为对照组和实验组中血清肌酐的含量示意图;
图10为对照组和实验组取左肾组织进行picro-Sirius天狼星红染色和Masson三色染色进行染色后得到的照片对比图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。除非另外定义,此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同,而不排除其他元件或者物件。
细胞治疗目前已经被应用于多种人类疾病,多种人类疾病包括:胰岛细胞移植、自体软骨细胞软骨修复、B细胞治疗系统性红斑狼疮、造血干细胞移植治疗癌症等,通过对肾上皮前体样细胞的培养以制备肾上皮前体样细胞,然后可能通过肾上皮前体样细胞或者细胞分泌因子对病变肾脏组织进行结构和功能修复、组织肾上皮前体样细胞再生的新疗法给肾脏疾病带来了新的希望。
目前从尿液中分离成体肾上皮前体样细胞涉及到饲养层细胞的使用以及单克隆筛选,步骤繁琐且增加了污染风险;而从成体组织中分离肾上皮前体样细胞需要对人体进行侵入式操作,且流式或免疫磁珠分选步骤繁琐,并且由于可能的细胞污染限制了其实际应用;而ESCs/iPSCs分化同样步骤繁琐,且安全性受到广泛质疑。
建立新型的尿液来源肾上皮前体样细胞的制备方法,更好地利用尿液这一细胞来源,建立创新的细胞替代治疗方法,实现急性肾病治疗手段和疗效的新突破。本发明建立了尿液来源脱落上皮重编程为肾脏上皮前体的技术体系,无需人体侵入性操作、饲养层细胞、单克隆分选或经过iPSC stage,通过化学重编程方法高效获取阳性表达CD24、CD44、CD133和SOX9中任意一项的肾脏上皮前体样细胞,且本发明得到的肾上皮前体样细胞能够显著缓解小鼠肾脏缺血再灌注损伤,因此,尿液来源的肾上皮前体样细胞可以应用于临床急性肾损伤的治疗。
本发明提供了一种肾上皮前体样细胞的制备方法,包括以下步骤:
S0:提供肾原代细胞;
S1:将所述肾原代细胞放入重编程培养基中进行退分化培养,直至所述肾上皮前体样细胞的融合度不低于80%,使用胰酶消化液对所述肾上皮前体样细胞进行消化处理,以得到肾上皮前体样细胞,其中,所述重编程培养基包括基础培养基、氢化可的松、霍乱霉素、胰岛素、腺嘌呤、转铁蛋白和三碘甲状腺原氨酸。
具体的,通过将所述肾原代细胞放入重编程培养基中进行退分化培养,所述重编程培养基包括基础培养基、氢化可的松、霍乱霉素、胰岛素、腺嘌呤、转铁蛋白和激动剂,以使得所述肾原代细胞不断实现自我更新和增殖,从而本申请解决了现有技术中的肾上皮前体样细胞的制备存在体外难以扩增的问题。
本发明一些实施例,所述肾上皮前体样细胞的制备方法还包括以下步骤:S2:将所述肾上皮前体样细胞在所述重编程培养基中进行扩增培养,直至所述肾上皮前体样细胞的融合度不低于80%后,使用所述胰酶消化液对所述肾上皮前体样细胞进行消化处理,以得到传代的肾上皮前体样细胞。
本发明一些实施例,所述重编程培养基还包括生长因子、ROCK激酶抑制剂、Wnt信号通路激动剂、TGF-β信号抑制剂、营养补充剂和缓冲液。
本发明一些具体实施例,所述生长因子包括表皮生长因子和碱性成纤维生长因子,所述表皮生长因子来源于近岸生物,所述碱性成纤维生长因子来源于近岸生物;所述ROCK激酶抑制剂Y-27632来源于陶术生物,所述Wnt信号通路激动剂CHIR99021来源于陶术生物,所述TGF-β信号抑制剂A8301来源于陶术生物,所述营养补充剂包括N2营养补充剂和B27营养补充剂,所述N2营养补充剂来源于Thermo Fisher。
本发明一些实施例,以占所述基础培养基的体积计,所述氢化可的松的含量为0.3-0.5微克/毫升,所述霍乱霉素的含量为0.5×10-10-1.5×10-10M,所述胰岛素的含量为4.5-5.5纳克/毫升,所述腺嘌呤的含量为1.3×10-4-2.3×10-4M,所述转铁蛋白的含量为4.5-5.5微克/毫升,所述三碘甲状腺原氨酸的含量为1.5×10-9-2.5×10-9M。
本发明一些实施例,以占所述基础培养基的体积计,所述生长因子的含量为50-90纳克/毫升,所述ROCK激酶抑制剂的含量为8-12μM,所述Wnt信号通路激动剂的含量为2-4μM,所述TGF-β信号抑制剂的含量为0.5-1.5μM,所述营养补充剂的含量为0.5-1.5%,所述缓冲液的体积含量不超过5%。
本发明一些具体实施例,所述生长因子包括表皮生长因子和碱性成纤维生长因子,以占所述基础培养基的体积计,所述表皮生长因子的含量为10-30纳克/毫升,所述碱性成纤维生长因子的含量为40-60纳克/毫升。
本发明一些实施例,所述肾上皮前体样细胞阳性表达CD24、CD133、SOX9、CD44中的至少一种。
本发明又提供了一种肾上皮前体样细胞,所述肾上皮前体样细胞通过所述肾上皮前体样细胞的制备方法制备得到。具体的,所述肾上皮前体样细胞制备方法简单,得到的肾上皮前体样细胞能够降低肾损伤对人体的影响。
本发明又提供了一种肾上皮前体样细胞制剂,所述肾上皮前体样细胞制剂包括所述肾上皮前体样细胞和药学上可接受的载体。得到的肾上皮前体样细胞制剂能够缓解肾缺血再灌注导致的肾损伤及肾间质纤维化。
本发明一些实施例,所述药学上可接受的载体包括生理盐水和复方电解质注射液中的任意一种。
本发明一些实施例,使用所述肾上皮前体样细胞制剂干预体内动物模型后考察对肾损伤的影响。
本发明一些实施例,所述动物模型包括单侧小鼠肾缺血再灌注模型。
实施例
一、起始组织性质以及来源合法性声明:
以健康成人尿液作为起始原料获取阳性表达CD24、CD133和SOX9的肾上皮前体样细胞。具体的,所述健康成人尿液来源于年龄不超过70岁的健康成人志愿者,经医学检查无传染性病毒感染,志愿者对尿液样本的获取目的充分知情,并签署了知情同意书。
二、人肾原代细胞的获取
使用离心管收集健康成人尿液样本,使用与尿液样本等量PBS稀释后,立即将离心管放入离心机中进行离心处理,离心处理结束后,弃离心管中的上清,收集离心管中的人肾原代细胞,其中,离心处理的转速为400g,离心处理的温度4摄氏度,离心处理的时间为10分钟。
三、肾上皮前体样细胞的获取
重编程培养基组分包括:以占基础培养基DMEM/F12(来源于武汉普诺赛生命科技有限公司)的体积计,含量为20纳克/毫升的上皮细胞生长因子EGF,含量为50纳克/毫升的碱性成纤维细胞生长因子bFGF,含量为1%的营养补充剂N2(1X),含量为1%的B27营养补充剂(1X),含量为10μM的ROCK激酶抑制剂Y-27632,含量为3μM的Wnt信号通路激动剂CHIR99021,含量为1μM的TGF-β信号抑制剂A8301,含量为0.4微克/毫升的化可的松,含量为10-10M的霍乱霉素,含量为5纳克/毫升的胰岛素,含量为1.8×10-4M的腺嘌呤,含量为5微克/毫升的转铁蛋白,含量为2×10-9M的三碘甲状腺原氨酸,含量为10%的FBS。
图1为本发明实施例的第四代肾上皮前体样细胞形态的照片示意图;图2为本发明实施例的第十代肾上皮前体样细胞形态的照片示意图;图3为本发明实施例的第三代对照肾上皮前体样细胞形态的照片示意图。
将肾原代细胞以10000个/平方厘米的接种面积置于6孔板中,每孔加2毫升重编程培养基进行退分化培养,直至肾上皮前体样细胞的融合度不低于80%后,使用胰酶消化液进行消化处理,消化处理的时间为5分钟,将肾上皮前体样细胞再继续使用重编程培养基进行扩增培养,直至肾上皮前体样细胞的融合度不低于80%后,使用胰酶消化液进行消化处理,消化处理的时间为5分钟,以得到第一代肾上皮前体样细胞(记为P1),循环扩增培养,以得到第四代肾上皮前体样细胞,第四代肾上皮前体样细胞(记为P4)形态的示意图参照图1;继续使用重编程培养基进行扩增培养至第十代,第十代肾上皮前体样细胞(记为P10)形态的示意图参照图2。
将肾原代细胞以10000个/平方厘米的接种面积置于6孔板中,每孔加2毫升基础培养基进行退分化培养以得到对照肾上皮前体样细胞,直至对照肾上皮前体样细胞的融合度不低于80%后,使用胰酶消化液进行消化处理,消化处理的时间为5分钟,将对照肾上皮前体样细胞再继续使用基础培养基进行扩增培养,直至对照肾上皮前体样细胞的融合度不低于80%后,使用胰酶消化液进行消化处理,消化处理的时间为5分钟,以得到第一代对照肾上皮前体样细胞,循环扩增培养,以得到第三代对照人上皮肾前体样细胞,参照图3,使用基础培养基最多只能培养到第五代肾上皮前体样细胞。
参照图1、图2和图3,图1和图2表明使用重编程培养基培养的肾上皮前体样细胞即使培养到第十代依然具备上皮细胞样形态,说明重编程培养基支持肾上皮前体样细胞的长期扩增;图3表明,使用基础培养基培养的肾上皮前体样细胞传代至第三代便已衰老,说明除了基础培养基之外的其他成分对肾上皮前体样细胞的持续扩充不可或缺。
肾上皮前体样细胞使用重编程培养基在体外进行扩增培养,至少可以扩增培养到第十代,肾上皮前体样细胞每代的增殖能力见表1。
表1肾上皮前体样细胞的增殖能力
通过表1可以,肾上皮前体样细胞的增殖能力随着代次的增加呈现先升高后降低的趋势,在第一代时,肾上皮前体样细胞的增殖能力最大,第十代肾上皮前体样细胞的增殖能力相较于第九代肾上皮前体样细胞的增殖能力略有增长。
图4为本发明的重编程培养基和基础培养基对肾上皮前体样细胞扩增培养的对比曲线图。
参照图4,横坐标代表细胞代数,纵坐标代表总细胞数,从图4中可以看到,使用重编程培养基可以在体外扩增培养肾上皮前体样细胞至少十代,且肾上皮前体样细胞的数量每代都成指数增长,而使用基础培养基在体外扩增培养肾上皮前体样细胞最多只能培养五代,且在第五代时肾上皮前体样细胞基本为零,与基础培养基相比,使用本发明的重编程培养基可以在体外持续扩增培养肾上皮前体样细胞,且肾上皮前体样细胞的数量呈指数增加。
四、对肾上皮前体样细胞进行流式检测
图5为本发明实施例的肾上皮前体样细胞的基因表达标志物CD133的情况示意图;图6为本发明实施例的肾上皮前体样细胞的基因表达标志物SOX9的情况示意图;图7为本发明实施例的肾上皮前体样细胞的基因表达标志物CD24的情况示意图;图8为本发明实施例的肾上皮前体样细胞的基因表达标志物CD44的情况示意图。
将肾上皮前体样细胞与重编程培养基分离后,用无菌PBS缓冲液润洗肾上皮前体样细胞,然后用胰酶消化液对肾上皮前体样细胞进行消化处理后再进行离心处理,离心处理结束后收集细胞沉淀物;向细胞沉淀物加入100微升染色缓冲液(来源于Thermo Fisher)重悬细胞至流式管中,再分别加入5微升待测流式抗体孵育20分钟后,每个流式管中用400微升染色缓冲液重悬后,以得到细胞悬浮液,对细胞悬浮液进行流式检测,
流式检测具体步骤:P4代肾上皮前体样细胞,吸弃重编程培养基,使用5ml无菌PBS缓冲液润洗,然后用往培养皿中滴加2ml胰酶消化液进行消化处理得到细胞混合物,将细胞混合物置于15ml离心管中,将离心管放入离心机中,以200g的速率进行转速进行5分钟的离心处理,弃去离心处理后的细胞混合物的上层清液,得到细胞沉淀物。
向细胞沉淀物中加入700μL的染色缓冲液对细胞沉淀物进行重悬,将重悬后的细胞沉淀物转移到6个1.5ml离心管,规格为100μL/管。分别往上述6个1.5ml离心管中加入3μL的待测流式抗体,吹打混匀。将离心管置于2-8℃冰箱静置30分钟后,按照800微升/管的剂量往每个离心管中加入无菌PBS缓冲液,然后将离心管放入离心机中,以300g的转速进行5分钟的离心处理。离心结束后,弃上清,往每个离心管中加入400μL染色缓冲液对细胞沉淀物进行重悬,然后转移至流式管中,将重悬后的细胞混合物进行表面标志物的流式检测。
表面标志物流式检测使用到的抗体名称是:CD24、CD44、CD133。
其中CD24购自abcam,货号为ab290730;CD44购自abcam,货号为ab254530;CD133购自BD Biosciences,货号为566596;染色缓冲液购自BD Biosciences,货号为554656,胰酶消化液购自源培,货号为S310JV。
对P4代的肾上皮前体样细胞进行胞内标志物染色:
P4代肾上皮前体样细胞,吸弃重编程培养基,使用5ml无菌PBS缓冲液润洗,然后用往培养皿中滴加2ml胰酶消化液进行消化处理得到细胞混合物,将细胞混合物置于15ml离心管中,将离心管放入离心机中,以200g的速率进行转速进行5分钟的离心处理,弃去离心处理后的细胞混合物的上层清液,得到细胞沉淀物。
向细胞沉淀物中加入1ml固定穿膜液,将离心管放入于2-8℃冰箱静置50分钟,往离心管中加入2ml无菌PBS缓冲液,将离心管以300g的转速进行5分钟的离心处理,离心结束后,往离心管中加入500微升染色缓冲液进行重悬。将重悬后的细胞沉淀物转移到4个1.5ml离心管,规格为100μL/管。分别往上述4个1.5ml离心管中加入5μL的待测流式抗体,吹打混匀,将离心管放入37℃下含有5%CO2的培养箱中静置30分钟。孵育完毕,按照800微升/管的剂量往每个离心管中加入无菌PBS缓冲液,然后将离心管放入离心机中,以300g的速率进行转速进行5分钟的离心处理。离心结束后,弃上清,往每个离心管中加入400μL染色缓冲液对细胞沉淀物进行重悬,然后转移至流式管中,将重悬后的细胞混合物进行胞内标志物的流式检测。
胞内标志物流式检测使用到的抗体名称为:Sox9。
Sox9购自abcam,货号为ab208427;固定穿膜液购自BD Biosciences,货号为554714,胰酶消化液购自源培,货号为S310JV,染色缓冲液购自BD Biosciences,货号为554656。流式检测结果见图5、图6、图7和图8。
参照图5、图6、图7和图8,标志物CD133的阳性峰的阳性率为70.5%,标志物SOX9的阳性峰的阳性率为99.8%,标志物CD24的阳性峰的阳性率为77.1%,标志物CD44的阳性峰的阳性率为99.6%,阳性峰的阳性率大于70%说明肾上皮前体样细胞阳性表达该标志物,因此,本发明的肾上皮前体样细胞阳性表达CD133、SOX9、CD24和CD44。
五、肾上皮前体样细胞制剂的制备:
将第四代肾上皮前体样细胞从液氮罐中取出,置于干冰上转运;将第四代肾上皮前体样细胞立即没于37摄氏度水浴锅中,轻轻摇晃,至第四代肾上皮前体样细胞完全融化,左右晃匀,注意软管接头处不要浸入水浴锅内,将融化后的第四代肾上皮前体样细胞用移液枪取出,加入50毫升无菌离心管中,将离心管放入离心机中进行离心处理,离心机的转速为200g,离心处理的时间为5分钟,离心处理结束后,弃上清,用0.9%氯化钠注射液将第四代肾上皮前体样细胞稀释以制得肾上皮前体样细胞制剂,控制每毫升肾上皮前体样细胞制剂中含有2×107个肾上皮前体样细胞。
六、肾上皮前体样细胞在动物模型中的应用,并进行效果论证:
细胞治疗目前已经被应用于多种人类疾病,包括:胰岛细胞移植、自体软骨细胞软骨修复、B细胞治疗系统性红斑狼疮、造血干细胞移植治疗癌症等。而通过对肾上皮前体样细胞的培养和应用,通过细胞或者细胞分泌因子对病变肾脏组织进行结构和功能修复、组织细胞再生的新疗法给肾脏疾病带来了新的希望。
既往研究证明外源性输注肾上皮前体样细胞能在小鼠模型中缓解多种急性肾损伤。通过静脉输注阳性表达CD133和CD24的肾上皮前体样细胞,能够在免疫缺陷小鼠中缓解横纹肌溶解诱导的急性肾损伤;同样肾上皮前体样细胞在阿霉素诱导的局灶节段性肾小球硬化(FSGS)小鼠模型中有降低蛋白尿并改善肾小球损伤的功能。
动物模型是指单侧小鼠肾缺血再灌注模型。
单侧小鼠肾缺血再灌注模型的制备方法包括以下步骤:选取8-9周岁的C57BL/6小鼠,C57BL/6小鼠经气体麻醉后,沿C57BL/6小鼠腹部的正中线做1.5~2.0厘米的切口,逐层分离皮肤和腹膜,最后进入C57BL/6小鼠的腹腔,找到肾蒂后用无损伤微型动脉夹迅速阻断左右肾蒂,可见C57BL/6小鼠的肾脏由鲜红色变为紫黑色,无损伤微型动脉夹的阻断时间为22分钟,然后去除无损伤微型动脉夹,手术结束,缝合切口关闭腹腔,以得到单侧小鼠肾缺血再灌注模型。
对单侧小鼠肾缺血再灌注模型注射肾上皮前体样细胞制剂作为实验组,具体步骤包括:通过尾静脉将肾上皮前体样细胞制剂注射到部分单侧小鼠缺血再灌注模型中,按照每只小鼠1×106个肾上皮前体样细胞给药;对单侧小鼠肾缺血再灌注模型注射PBS缓冲液作为对照组,具体步骤包括,通过尾静脉将PBS缓冲液注射到部分单侧小鼠缺血再灌注模型中。
图9为对照组和实验组中血清肌酐的含量示意图;图10为对照组和实验组取左肾组织进行picro-Sirius天狼星红染色和Masson三色染色进行染色后得到的照片对比图,图10中比例尺为100μm。
实验组和对照组中的单侧小鼠缺血再灌注模型于注射后,经过14天,用二氧化碳安乐死小鼠后,从小鼠的心脏中抽取血液5毫升,将5毫升血液置于促凝管中,将促凝管放入离心机中进行离心处理,离心处理的离心速度为3000rpm,离心处理的离心时间为10分钟,离心处理结束后取促凝管中的上清,分别检测实验组和对照组中的血清肌酐的含量,具体参照图8;将实验组和对照组中的单侧小鼠缺血再灌注模型中的小鼠的左肾沿冠状面切为两半,一半固定于体积分数为10%的福尔马林溶液中,室温保存,将左肾固定在4%多聚甲醛(PFA)中,并包埋在石蜡中,随后切割成4μm厚的切片,左肾切片常规用picro-Sirius天狼星红染色和Masson三色(MT)染色进行胶原沉积染色,具体参照图9。
参照图9,纵坐标Serum Cr代表的是血清肌酐的含量,单位为μmol/L,从图中可以看到,实验组小鼠中的血清肌酐低于对照组小鼠中的血清肌酐,说明通过本发明的肾上皮前体样细胞制剂的治疗,实验组小鼠的肾损伤得到缓解;参照图10,对照组小鼠的肾近端肾小管结构丢失、远端肾小管扩张,可见管型,出现了间质纤维化,实验组小鼠的肾小管结构及间质纤维化情况较对照组有明显改善,可见,本发明的肾上皮前体样细胞制剂能够缓解肾缺血再灌注损伤以及肾缺血再灌注引起的肾纤维化。
建立创新的尿液来源肾上皮前体样细胞制备方法,更好地利用尿液这一细胞来源,建立创新的细胞替代治疗方法,实现急性肾病治疗手段和疗效的新突破。我们建立了尿液来源脱落上皮重编程为肾脏上皮前体样细胞的技术体系,无需人体侵入性操作、饲养层细胞、单克隆分选或经过iPSC stage,通过化学重编程方法高效获取阳性表达CD24、CD44、CD133和SOX9的肾脏上皮前体样细胞,能够显著缓解小鼠肾脏缺血再灌注损伤,因此,尿液来源的肾脏上皮前体样细胞可能可以应用于临床急性肾损伤的治疗。
虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式,但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是,能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是,应理解,这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且,在此说明的本发明可有其它的实施方式,并且可通过多种方式实施或实现。
Claims (11)
1.一种肾上皮前体样细胞的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S0:提供肾原代细胞;
S1:将所述肾原代细胞放入重编程培养基中进行退分化培养,直至所述肾上皮前体样细胞的融合度不低于80%,使用胰酶消化液对所述肾上皮前体样细胞进行消化处理,以得到肾上皮前体样细胞,其中,所述重编程培养基包括基础培养基、氢化可的松、霍乱霉素、胰岛素、腺嘌呤、转铁蛋白和三碘甲状腺原氨酸。
2.根据权利要求1所述的肾上皮前体样细胞的制备方法,其特征在于,还包括以下步骤:
S2:将所述肾上皮前体样细胞在所述重编程培养基中进行扩增培养,直至所述肾上皮前体样细胞的融合度不低于80%后,使用所述胰酶消化液对所述肾上皮前体样细胞进行消化处理,以得到传代的肾上皮前体样细胞。
3.根据权利要求2所述的肾上皮前体样细胞的制备方法,其特征在于,所述重编程培养基还包括生长因子、ROCK激酶抑制剂、Wnt信号通路激动剂、TGF-β信号抑制剂、营养补充剂和缓冲液。
4.根据权利要求3所述的肾上皮前体样细胞的制备方法,其特征在于,以占所述基础培养基的体积计,所述氢化可的松的含量为0.3-0.5微克/毫升,所述霍乱霉素的含量为0.5×10-10-1.5×10-10M,所述胰岛素的含量为4.5-5.5纳克/毫升,所述腺嘌呤的含量为1.3×10-4-2.3×10-4M,所述转铁蛋白的含量为4.5-5.5微克/毫升,所述三碘甲状腺原氨酸的含量为1.5×10-9-2.5×10-9M。
5.根据权利要求4所述的肾上皮前体样细胞的制备方法,其特征在于,以占所述基础培养基的体积计,所述生长因子的含量为50-90纳克/毫升,所述ROCK激酶抑制剂的含量为8-12μM,所述Wnt信号通路激动剂的含量为2-4μM,所述TGF-β信号抑制剂的含量为0.5-1.5μM,所述营养补充剂的含量为0.5-1.5%,所述缓冲液的体积含量不超过5%。
6.根据权利要求1所述的肾上皮前体样细胞的制备方法,其特征在于,所述肾上皮前体样细胞阳性表达CD24、CD133、SOX9、CD44中的至少一种。
7.一种肾上皮前体样细胞,其特征在于,通过权利要求1-6任一项所述的肾上皮前体样细胞的制备方法制备得到。
8.一种肾上皮前体样细胞制剂,其特征在于,包括权利要求7所述的肾上皮前体样细胞和药学上可接受的载体。
9.根据权利要求8所述的肾上皮前体样细胞制剂,其特征在于,所述药学上可接受的载体包括生理盐水和复方电解质注射液中的任意一种。
10.一种肾上皮前体样细胞制剂的应用,其特征在于,使用如权利要求8-9任一项所述的肾上皮前体样细胞制剂干预体内动物模型后考察对肾损伤的影响。
11.根据权利要求10所述的肾上皮前体样细胞制剂的应用,其特征在于,所述动物模型包括单侧小鼠肾缺血再灌注模型。
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