CN117025507A

CN117025507A - 肺前体样细胞的制备方法和应用

Info

Publication number: CN117025507A
Application number: CN202310522433.2A
Authority: CN
Inventors: 周伸奥; 周丽
Original assignee: Shanghai Celliver Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Celliver Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-05-10
Filing date: 2023-05-09
Publication date: 2023-11-10
Also published as: WO2023217126A1; WO2023217125A1; CN117025503A; CN117025505A; CN117025506A; CN117025504A; WO2023217121A1; CN117018032A; WO2023217134A1; WO2023217123A1; CN117025508A; CN117018033A; WO2023217130A1; WO2023217129A1; CN117025502A; WO2023217128A1; WO2023217132A1

Abstract

本发明提供了一种肺前体样细胞的制备方法和应用，肺前体样细胞的制备方法，包括以下步骤：取肺组织，将肺组织经过消化分离后得到原代肺细胞；使用重编程培养基对原代肺细胞进行培养直至细胞融合度不低于80％，得到肺前体样细胞。将肺组织经过消化分离后得到原代肺细胞，使用重编程培养基对原代肺细胞进行培养直至细胞融合度不低于80％，得到肺前体样细胞，实现原代肺细胞退分化，并使得肺前体样细胞在体外快速且大量的扩增，无任何外源基因，操作安全且可靠，批次产量高，能够实现单个供体多人、多次治疗；肺前体样细胞能应用于受损肺组织的修复。

Description

肺前体样细胞的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种肺前体样细胞的制备方法和应用。

背景技术

肺脏是人体的重要器官，在执行呼吸任务的过程中，难免会接触外来或内在的有害物质(如大气污染、烟草、细菌病毒或血液中的毒性物质)，往往导致肺脏组织的大规模损伤，从而引发急慢性的肺损伤疾病(如呼吸窘迫综合征ARDS、慢性阻塞性肺病COPD、间质性肺病ILD、支气管扩张BE和特发性肺纤维化IPF等)。目前，对于这些疾病的治疗并无有效手段逆转疾病的进程，患者随着时间的推移，疾病逐年加重，难以治愈，最终导致死亡。

临床上针对肺组织损伤疾病如肺纤维化常用药物包括糖皮质激素、免疫抑制剂、抗凝药物等化学药物。2014年10月15日FDA批准尼达尼布(Nintedanib，商品名：Ofev)和吡非尼酮(Pirfenidone，商品名：Esbriet)两种新的口服药物用于特发性肺纤维化治疗，但均无法治愈肺纤维化，只起到延缓疾病进展的作用，治疗效果不理想且不良反应大。随着科学的发展，细胞治疗逐渐出现在大众视野里，间充质干细胞因其具有旁分泌、抗炎、免疫调节以及抗氧化等多种功能，被广泛尝试应用于多种疾病的治疗，其中包括肺纤维化和慢性阻塞性肺病。但是，间充质干细胞主要通过改变肺部炎症微环境进而促进肺的损伤修复和功能恢复，不能诱导肝组织再生，同时，间充质干细胞治疗肺损伤具有低移植率和低局部生存率的缺陷，因此间充质干细胞治疗肺纤维化等肺组织损伤的长期疗效还有待观察。

目前肺前体样细胞已被证明可以分化再生新的气道细胞和肺泡上皮细胞，重构血-气交换单元，修复损伤肺组织，在治疗慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化等肺部疾病中取得了很好的疗效。同济大学的左为教授研发的自体肺前体样细胞也被应用在治疗肺纤维化疾病上。2018年研究团队成功在患者肺部支气管上皮分离出SOX9阳性的肺脏前体细胞并将其应用于临床实验中，术后3-12个月，患者肺功能有效改善且保持良好。

但目前用于治疗肺组织损伤疾病的肺前体样细胞存在以下缺陷：

1.ESCs/iPSCs分化肺前体样细胞治疗：目前ESCs/iPSCs诱导分化治疗肺脏疾病报道较少，主要原因是干细胞体外诱导分化为肺脏细胞的培养方案仍不成熟，缺乏统一规范的标准。iPSCs有发展成畸胎瘤的风险。并且ESCs/iPSCs分化得到的肺前体样细胞，MHC二类分子表达水平高，患者需要长期系统性接受免疫抑制剂的治疗，给患者带来很多痛苦和困扰，iPSCs分化程度不纯还有致瘤的风险。

2.自体肺前体样细胞治疗：通过支气管镜从患者细支气管(3-4级)刷取气道细胞，要求患者对这种取气道细胞的方式有较高的耐受性。当患者呼吸道症状严重时是很难耐受这种气道刮取细胞方式，因此自体肺前体样细胞在来源上受到很大的局限，同时受众群体大大缩小。

因此，有必要提供一种新型的肺前体样细胞的制备方法和应用，以实现了肺前体样细胞在体外的大量扩增，并应用于受损肺组织的修复。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肺前体样细胞的制备方法和应用，能够实现了肺前体样细胞在体外的大量扩增，并应用于受损肺组织的修复。

为实现上述目的，本发明的所述肺前体样细胞的制备方法，包括以下步骤：

S1：取肺组织，将所述肺组织经过消化分离后得到原代肺细胞；

S2：使用重编程培养基对所述原代肺细胞进行培养直至细胞融合度不低于80％，得到肺前体样细胞。

所述肺前体样细胞的制备方法的有益效果在于：

将所述肺组织经过消化分离后得到原代肺细胞，使用所述重编程培养基对所述原代肺细胞进行培养直至细胞融合度不低于80％，得到肺前体样细胞，实现所述原代肺细胞退分化，并使得所述肺前体样细胞在体外快速且大量的扩增，无任何外源基因，操作安全且可靠，批次产量高，能够实现单个供体多人、多次治疗；所述肺前体样细胞能应用于受损肺组织的修复。

可选的，在所述S1中，所述肺组织的来源于不能用于移植的正常肺组织。

可选的，在所述S1中，所述肺组织经过消化分离后得到原代肺细胞的步骤包括：

S10：将所述肺组织用无菌PBS缓冲液依次进行清洗处理和消毒处理，然后将所述肺组织进行剪碎处理以得到肺组织碎块；

S11：往所述肺组织碎块中加入自配胶原酶，将所述肺组织碎块在37摄氏度下进行30分钟的孵育，得到原代肺细胞悬液；

S12：对所述原代肺细胞悬液进行筛网分选，然后收集得到肺细胞滤液；

S13：对所述肺细胞滤液进行离心处理，弃去上清，得到肺细胞沉淀物；

S14：向所述肺细胞沉淀物中加入红细胞溶解平衡液进行重悬得到肺细胞混合液，然后将所述肺细胞混合液进行离心处理，弃去上清，得到肺细胞沉淀；

S15：重复所述S14直至在所述肺细胞沉淀中观察不到红细胞为止。

可选的，在所述S10中，所述肺组织经过剪碎处理后的尺寸为1-2mm³。

可选的，在所述S11中，以占所述自配胶原酶的体积百分比计，所述自配胶原酶的组分包括：25％-50％的中性蛋白酶II和50％-75％的II型胶原酶。其有益效果在于：所述自配胶原酶能使所述肺组织碎块充分的消化。

可选的，在所述S12中，对所述原代肺细胞悬液进行筛网分选时，使用的细胞滤器的孔径为60～80微米。

可选的，在所述S13中，对所述肺细胞滤液进行离心处理时，离心速率为1000rpm，离心时间为5分钟。

可选的，在所述S14中，将所述肺细胞混合液进行离心处理时，离心处理的转速为1000rpm，离心时间为5分钟。

可选的，在所述S2中，所述重编程培养基包括基础培养基、营养补充剂、生长因子、TGF-β信号抑制剂、Wnt信号通路激活剂和ROCK激酶抑制剂。

可选的，以占所述基础培养基的体积计，所述生长因子的含量为10-50纳克/毫升，所述ROCK激酶抑制剂的含量为1-20微摩尔，所述Wnt信号通路激活剂的含量为1-10微摩尔，所述TGF-β信号抑制剂的含量为1-10微摩尔，所述营养补充剂的体积含量不超过10％。

可选的，所述基础培养基为Ham’s F-12培养基。

可选的，所述生长因子为表皮生长因子、成纤维细胞生长因子的至少一种。

可选的，所述营养补充剂包括N2、B27的至少一种。

进一步可选的，所述ROCK激酶抑制剂包括Y-27632。

进一步可选的，所述Wnt信号通路激活剂包括CHIR-99021。

进一步可选的，TGF-β信号抑制剂包括A-8301。

可选的，在所述S2中，所述重编程培养基还包括三碘甲状腺原氨酸、氢化可的松。其有益效果在于：所述三碘甲状腺原氨酸和所述氢化可的松的能够保证所述肺前体样细胞的增殖和维持所述肺前体样细胞的标志物。

进一步可选的，所述三碘甲状腺原氨酸的含量为2微克/毫升，所述氢化可的松的含量为0.5微克/毫升。

可选的，在所述S2后，还包括步骤S3：将所述肺前体样细胞进行消化处理后，使用所述重编程培养基进行传代培养得到传代肺前体样细胞，传代培养的细胞代数不小于20代。其有益效果在于：将所述肺前体样细胞消化处理后，使用所述重编程培养基进行传代培养得到传代肺前体样细胞，可以将所述肺前体样细胞在维持上皮前体形态下稳定传代，实现了所述肺前体样细胞在体外的大量扩增。

可选的，在所述S3中，使用所述重编程培养基进行传代培养的步骤包括：

S31：吸弃所述重编程培养基的上清液，用无菌PBS缓冲液清洗两次所述肺前体样细胞，往所述肺前体样细胞中加入胰酶消化液进行5-8分钟的消化处理，得到混合溶液；

S32：将所述混合溶液进行离心处理，弃除上清液，得到肺前体样细胞沉淀；

S33：将所述肺前体样细胞沉淀进行细胞计数，然后将所述肺前体样细胞接种在所述重编程培养基中，得到第一代肺前体样细胞；

S34：使用所述重编程培养基对所述第一代肺前体样细胞进行传代培养。

可选的，在所述S32中，将所述混合溶液进行离心处理时，离心速率为200g，离心时间为5分钟。

可选的，所述肺前体样细胞阳性表达至少一种特征标志物。

可选的，所述特征标志物的表达率为不低于50％且不高于99％。其有益效果在于：所述特征标志物表达率达标的细胞，为本发明专利里定义的所述肺前体样细胞。

进一步可选的，所述特征标志物的表达率高于70％。

可选的，至少一种所述特征标志物包括CD24、CD73、CD326、CK19、Sox9的至少一种。

可选的，所述肺前体样细胞阴性表达至少一种MHC二类分子，至少一种所述MHC二类分子包括HLA-DR/DP/DQ的至少一种。其有益效果在于：所述肺前体样细胞不表达MHC-Ⅱ类抗原，患者移植所述肺前体样细胞后，患者机体无法通过MHC-II类分子识别该种外源细胞，不会对其产生免疫攻击，因此产生排异反应的可能性小。

可选的，使用分化培养基对所述肺前体样细胞进行分化培养，能够得到气道分泌细胞，Ⅰ型肺泡细胞和Ⅱ型肺泡细胞中的至少一种。

可选的，所述分化培养基包括基础培养基、营养添加物、生长因子。

进一步可选的，所述基础培养基为DMEM/F-12培养基。

进一步可选的，所述生长因子包括成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子中的至少一种。

进一步可选的，所述营养添加物包括转铁蛋白和牛血清白蛋白的至少一种。

进一步可选的，以占所述基础培养基的体积计，所述成纤维细胞生长因子的含量为10-100纳克/毫升，所述转铁蛋白的含量为2-10微克/毫升，所述牛血清白蛋白的体积含量不超过10％。

本发明还提供一种肺前体样细胞的应用，使用如上所述的肺前体样细胞的制备方法制备得到的所述肺前体样细胞干预体内动物模型。其有益效果在于：所述肺前体样细胞能用于修复受损肺组织。

可选的，所述动物体内模型包括大鼠慢性阻塞性肺病模型、小鼠特发性肺纤维化模型中的任意一种。

附图说明

图1为本发明提供的实施例2-1中P3代肺前体样细胞的倒置显微镜成像照片示意图；

图2为本发明提供的实施例2-1中P23代肺前体样细胞的倒置显微镜成像照片示意图；

图3为本发明提供的实施例2-1中P5代肺前体样细胞的倒置显微镜成像照片示意图；

图4为本发明提供的实施例2-2中使用对照培养基传代培养的P5肺前体样细胞倒置显微镜成像照片示意图；

图5为本发明提供的实施例2-3中不同培养基上的肺前体样细胞生长曲线；

图6为本发明提供的实施例3中P3代肺前体样细胞的表面标记物流式检测图；

图7为本发明提供的实施例3中P3代肺前体样细胞的胞内标记物流式检测图；

图8为本发明提供的实施例4中P6代肺前体样细胞分化前后的基因表达图；

图9为本发明提供的实施例5-1中造模组、气道给药组、尾静脉给药组和正常组的大鼠耗气量变化曲线图；

图10为本发明提供的实施例5-2中造模组、气道给药组、尾静脉给药组和正常组的大鼠肺组织干湿重比图；

图11为本发明提供的实施例5-3中造模组、气道给药组、尾静脉给药组和正常组的大鼠肺组织Masson染色结果图；

图12为本发明提供的实施例6-1中模型对照组、气道给药组、尾静脉给药组和正常对照组小鼠呼吸频率变化曲线图；

图13为本发明提供的实施例6-2中模型对照组、气道给药组、尾静脉给药组和正常对照组小鼠动脉血气分析结果图。

图14为本发明提供的实施例6-3中模型对照组、气道给药组、尾静脉给药组和正常对照组小鼠的肺组织HE染色结果图；

图15为本发明提供的实施例6-3中模型对照组、气道给药组、尾静脉给药组和正常对照组小鼠的肺组织Masson染色结果图；

图16为本发明提供的实施例6-4中模型对照组、气道给药组、尾静脉给药组和正常对照组小鼠的肺组织纤维化分子蛋白浓度检测结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。

针对现有技术存在的问题，本发明的实施例提供了一种肺前体样细胞的制备方法和应用，能够实现了肺前体样细胞在体外的大量扩增，并应用于受损肺组织的修复。

本发明的所述肺前体样细胞的制备方法，包括以下步骤：

所述肺前体样细胞的制备方法的优点在于：

一些实施例中，在所述S1中，所述肺组织的来源于不能用于移植的正常肺组织。

一些实施例中，在所述S1中，所述肺组织经过消化分离后得到原代肺细胞的步骤包括：

一些实施例中，在所述S10中，所述肺组织经过剪碎处理后的尺寸为1-2mm³。

一些实施例中，在所述S11中，以占所述自配胶原酶的体积百分比计，所述自配胶原酶的组分包括：25％-50％的中性蛋白酶II和50％-75％的II型胶原酶。其优点在于：所述自配胶原酶能使所述肺组织碎块充分的消化。

一些实施例中，在所述S12中，对所述原代肺细胞悬液进行筛网分选时，使用的细胞滤器的孔径为60～80微米。

一些实施例中，在所述S13中，对所述肺细胞滤液进行离心处理时，离心速率为1000rpm，离心时间为5分钟。

一些实施例中，在所述S14中，将所述肺细胞混合液进行离心处理时，离心处理的转速为1000rpm，离心时间为5分钟。

一些实施例中，在所述S2中，所述重编程培养基包括基础培养基、营养补充剂、生长因子、TGF-β信号抑制剂、Wnt信号通路激活剂和ROCK激酶抑制剂。

一些实施例中，以占所述基础培养基的体积计，所述生长因子的含量为10-50纳克/毫升，所述ROCK激酶抑制剂的含量为1-20微摩尔，所述Wnt信号通路激活剂的含量为1-10微摩尔，所述TGF-β信号抑制剂的含量为1-10微摩尔，所述营养补充剂的体积含量不超过10％。

一些实施例中，所述基础培养基为Ham’s F-12培养基。

一些实施例中，所述生长因子为表皮生长因子、成纤维细胞生长因子的至少一种。

一些实施例中，所述营养补充剂包括N2、B27的至少一种。

一些具体实施例中，所述ROCK激酶抑制剂包括Y-27632。

一些具体实施例中，所述Wnt信号通路激活剂包括CHIR-99021。

一些具体实施例中，TGF-β信号抑制剂包括A-8301。

一些实施例中，在所述S2中，所述重编程培养基还包括三碘甲状腺原氨酸、氢化可的松。其优点在于：所述三碘甲状腺原氨酸和所述氢化可的松的能够保证所述肺前体样细胞的增殖和维持所述肺前体样细胞的标志物。

一些实施例中，所述三碘甲状腺原氨酸的含量为2微克/毫升，所述氢化可的松的含量为0.5微克/毫升。

一些实施例中，在所述S2后，还包括步骤S3：将所述肺前体样细胞进行消化处理后，使用所述重编程培养基进行传代培养得到传代肺前体样细胞，传代培养的细胞代数不小于20代。其有益效果在于：将所述肺前体样细胞消化处理后，使用所述重编程培养基进行传代培养得到传代肺前体样细胞，可以将所述肺前体样细胞在维持上皮前体形态下稳定传代，实现了所述肺前体样细胞在体外的大量扩增。

一些实施例中，在所述S3中，使用所述重编程培养基进行传代培养的步骤包括：

S31：吸弃所述重编程培养基的上清液，用无菌PBS缓冲液清洗两次，往所述肺前体样细胞中加入胰酶消化液进行5-8分钟的消化处理，得到混合溶液；

一些实施例中，在所述S32中，将所述混合溶液进行离心处理时，离心速率为200g，离心时间为5分钟。

一些实施例中，所述肺前体样细胞阳性表达至少一种特征标志物。

一些实施例中，所述特征标志物的表达率为不低于50％且不高于99％。其优点在于：所述特征标志物表达率达标的细胞，为本发明专利里定义的所述肺前体样细胞。

一些具体实施例中，所述特征标志物的表达率高于70％。

一些实施例中，至少一种所述特征标志物包括CD24、CD73、CD326、CK19、Sox9的至少一种。

一些实施例中，所述肺前体样细胞阴性表达至少一种MHC二类分子，至少一种所述MHC二类分子包括HLA-DR/DP/DQ的至少一种。其优点在于：所述肺前体样细胞不表达MHC-Ⅱ类抗原，患者移植所述肺前体样细胞后，患者机体无法通过MHC-II类分子识别该种外源细胞，不会对其产生免疫攻击，因此产生排异反应的可能性小。

一些实施例中，使用分化培养基对所述肺前体样细胞进行分化培养，能够得到气道分泌细胞，Ⅰ型肺泡细胞和Ⅱ型肺泡细胞中的至少一种。

一些实施例中，所述分化培养基包括基础培养基、营养添加物、生长因子。

一些具体实施例中，所述基础培养基为DMEM/F-12培养基。

一些具体实施例中，所述生长因子包括成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子中的至少一种。

一些具体实施例中，所述营养添加物包括转铁蛋白和牛血清白蛋白的至少一种。

一些具体实施例中，以占所述基础培养基的体积计，所述成纤维细胞生长因子的含量为10-100纳克/毫升，所述转铁蛋白的含量为2-10微克/毫升，所述牛血清白蛋白的体积含量不超过10％。

本发明还提供一种肺前体样细胞的应用，使用如上所述的肺前体样细胞的制备方法制备得到的所述肺前体样细胞干预体内动物模型。其优点在于：所述肺前体样细胞能用于修复受损肺组织。

一些实施例中，所述动物体内模型包括大鼠慢性阻塞性肺病模型、小鼠特发性肺纤维化模型中的任意一种。

以下通过具体的实施例进行详细说明：

实施例1

本实施例提供了原代肺细胞的获取

一、起始组织性质以及来源合法性声明：

以不能用于移植的正常肺组织作为起始原料。

具体的，所述不能用于移植的正常肺组织经病理检查显示为正常肺组织。

具体的，所述不能用于移植的正常肺组织为来源于年龄不超过70岁的患者的手术样本，患者经医学检查无传染性病毒感染，患者在术前6个月内未使用过类固醇激素药物。患者在术前对手术样本的获取目的充分知情，并签署了知情同意书。

二、具体操作步骤：

配制自配胶原酶：以占所述自配胶原酶的体积百分比计，用无菌PBS缓冲液配置含有25％中性蛋白酶II和75％ II型胶原酶的自配胶原酶。

其中，中性蛋白酶II购自Sigma，货号d4693；II型胶原酶购自爱必信生物，货号为abs47048001；无菌PBS缓冲液购自源培，货号B310KJ。

获取正常的肺组织，使用无菌PBS缓冲液对获取的肺组织进行清洗，并将清洗后的肺组织放入10mL含有1％的庆大霉素的PBS缓冲液中浸泡5分钟进行消毒处理，将消毒处理后的肺组织进行剪碎处理，使剪碎后的肺组织大小为1-2mm³，将剪碎后的肺组织转移至15mL的离心管中，往离心管中加入5mL的自配胶原酶并将离心管放置在37℃下含有5％CO₂的培养箱中孵育30分钟获得细胞悬液。其中，自配胶原酶的体积和肺组织重量比为10：1，即1g组织加入10mL胶原酶。

向细胞悬液加入等量体积的无菌PBS缓冲液进行稀释，然后使用70微米的细胞滤器对细胞悬液进行筛网分选，收集细胞滤液并去除细胞悬液中的粘液和未消化组织。然后，将细胞滤液放入离心机中，以1000rpm的转速对细胞滤液离心处理5分钟，弃去离心处理后的细胞滤液的上层清液，得到细胞沉淀。

向得到的细胞沉淀加入2mL红细胞溶解平衡液得到细胞混合液，对细胞混合液进行重悬，再次将重悬后的细胞混合液放入离心机中，以1000rpm的转速对细胞混合液离心处理5分钟，弃去离心处理后的细胞混合液的上层清液，得到离心处理后的细胞沉淀，重复向离心处理后的细胞沉淀中加入红细胞溶解平衡液，并再次进行重悬和离心的过程，直至再次离心得到的细胞沉淀中观察不到红细胞为止，完成红细胞裂解去除，得到原代肺细胞，记为Pr代肺细胞。具体的，每次离心处理的速率为1000rpm，离心时间为5分钟。

其中，红细胞溶解平衡液购自索莱宝，货号为R1010。

实施例2-1

以1E+04个/平方厘米的接种密度将实施例1中获得的Pr代肺细胞接种于6孔板的培养板上，往培养板的每个孔加2毫升的重编程培养基进行细胞培养，每两天更换一次新的培养液，直至培养板的每个孔中的细胞融合度不低于80％且细胞生长状态良好，完成扩增培养。其中，培养板购自Corning，货号为3516。

吸弃培养板上的重编程培养基的上清液，用无菌PBS缓冲液清洗两次培养板，往培养板的每个孔中滴加1mL的胰酶消化液进行5-8分钟的消化处理，得到混合溶液；将混合溶液以200g的离心速率进行5分钟的离心处理，得到细胞沉淀，将细胞沉淀中的细胞进行细胞计数，按1E+04个/cm²的密度接种在重编程培养基中，得到第一代肺前体样细胞，记为P1代肺前体样细胞。其中，胰酶消化液购自源培，货号为S310JV。

将P1代肺前体样细胞按照1E+04个/cm²的比例接种入新的重编程培养基中按照上述操作进行传代培养到第3代，细胞融合度不低于80％且生长状态良好，第3代肺前体样细胞记作P3代肺前体样细胞。

将P3代肺前体样细胞按照1E+04个/cm²的密度接种入新的重编程培养基中按照上述操作进行传代培养到第23代，第23代肺前体样细胞记作P23代肺前体样细胞，细胞形态未发生明显变化且生长状态良好。

使用的重编程培养基组成如下：Ham’s F-12基础培养基，以及以占Ham’sF-12基础培养基的体积计，含量为1％的N2营养补充剂、含量为2％的B27营养补充剂；含量为20ng/mL的上皮细胞生长因子EGF，含量为50ng/mL的成纤维细胞生长因子bFGF，含量为2ug/mL三碘甲状腺原氨酸(陶术，T1653)，含量为0.5μg/mL氢化可的松，含量为10uM的ROCK激酶抑制剂Y-27632，含量为3uM的Wnt信号通路激活剂CHIR-99021，含量为1uM的TGF-β信号抑制剂A8301。

其中，上皮细胞生长因子EGF购自abcam，货号为ab259398；ROCK激酶抑制剂Y-27632购自TargetMol，货号为T1870；Wnt信号通路激活剂CHIR-99021购自TargetMol，货号为T2310；TGF-β信号抑制剂A-8301购自TargetMol，货号为T3031；成纤维细胞生长因子bFGF购自biorbyt，货号为orb80024；Ham’sF-12基础培养基购自Thermo Fisher，货号为31765035；三碘甲状腺原氨酸购自陶术生物，货号为T1653；氢化可的松购自陶术生物，货号为T1614；N2营养补充剂(1X)购自Thermo Fisher，货号为17502048；B27营养补充剂(1X)购自Thermo Fisher，货号为12587010。

本实施例使用重编程培养基对实施例1中获得的Pr代肺细胞传代培养后，通过计算得到每一代肺前体样细胞扩增倍数，具体数据见表1。

表1

通过表1的数据可以得知，P23代肺前体样细胞的扩增速率较P3代肺前体样细胞相比未发生明显变化，说明使用重编程培养基时，且肺前体样细胞体外增殖稳定。

本实施例对于P3代肺前体样细胞和P23代肺前体样细胞通过倒置显微镜成像，细胞图片见图1和图2，图1为本发明提供的实施例2-1中P3代肺前体样细胞的倒置显微镜成像图；图2为本发明提供的实施例2-1中P23代肺前体样细胞的倒置显微镜成像图。

参照图1和图2可知，P23代肺前体样细胞的细胞形态较P3代肺前体样细胞相比未发生明显变化，说明使用重编程培养基时，且肺前体样细胞体外增殖稳定。

实施例2-2

将实施例1中获得的Pr代肺细胞接种于对照培养基上进行扩增培养和传代培养至P5代，与实施例2-1中用重编程培养基扩增培养和传代培养Pr代肺细胞形成对照组，本实施例的培养步骤与实施例2-1中一致。

对照培养基相对于重编程培养基缺少了三碘甲状腺原氨酸和氢化可的松，其余成分及含量与重编程培养基一致。

对本实施例中传代培养的P5肺前体样细胞和实施例2-1中使用重编程培养基传代培养的P5代肺前体样细胞进行倒置显微镜成像并拍照，细胞图片见图3和图4，图3为本发明提供的实施例2-1中P5代肺前体样细胞的倒置显微镜成像图；图4为本发明提供的实施例2-2中使用对照培养基传代培养的P5肺前体样细胞倒置显微镜成像图。

参照图3和图4可知，对照培养基将实施例1中获得的Pr代肺细胞传代培养到P5代时，肺前体样细胞状态变差、直径变大、细胞质透明化摊开，无法继续增殖，因此，重编程培养基的细胞培养能力远大于对照培养基，重编程培养基中的三碘甲状腺原氨酸和氢化可的松的能够保证所述肺前体样细胞的增殖。

实施例2-3

使用DMEM+FBS培养基对实施例1中获得的Pr代肺细胞进行扩增培养和传代培养，与实施例2-1中用重编程培养基扩增培养和传代培养Pr代肺细胞形成对照组，本实施例的培养步骤与实施例2-1中一致。

使用到的DMEM+FBS培养基组成如下：以占DMEM+FBS培养基的体积百分比计，包括90％DMEM培养基和10％FBS培养基。

其中，DMEM培养基购自源培，货号为L110KJ；FBS培养基购自Corning，货号为35081-CV。

实施例2-1中使用重编程培养基培养的肺前体样细胞生长曲线和本实施例中使用DMEM+FBS培养基培养的肺前体样细胞生长曲线绘制在一张图上，参见图5。

图5为本发明提供的实施例2-3中不同培养基上的肺前体样细胞生长曲线。参照图5可知，使用重编程培养基培养的肺前体样细胞体外培养至少可以扩增至第23代，而使用DMEM+FBS培养基培养的肺前体样细胞体外培养最多扩增至第4代，说明了使用重编程培养基培养的肺前体样细胞的增殖能力远大于使用DMEM+FBS培养基的肺前体样细胞，重编程培养基的细胞培养能力远大于DMEM+FBS培养基。

实施例3

使用流式细胞术对经实施例2-1得到的P3代肺前体样细胞进行鉴别分析。

对实施例2-1中的P3代的肺前体样细胞进行表面标志物染色：

采样实施例2-1中的P3代肺前体样细胞，吸弃重编程培养基，使用5mL无菌PBS缓冲液润洗，然后用往培养皿中滴加2mL胰酶消化液进行消化处理得到细胞混合物，将细胞混合物置于15mL离心管中，将离心管放入离心机中，以200g的速率进行转速进行5分钟的离心处理，弃去离心处理后的细胞混合物的上层清液，得到细胞沉淀物。

向细胞沉淀物中加入700μL的染色缓冲液对细胞沉淀物进行重悬，将重悬后的细胞沉淀物转移到6个1.5mL离心管，规格为100μL/管。分别往上述6个1.5mL离心管中加入5μL的待测流式抗体，吹打混匀。将离心管置于2-8℃冰箱静置30分钟后，按照800微升/管的剂量往每个离心管中加入无菌PBS缓冲液，然后将离心管放入离心机中，以300g的转速进行5分钟的离心处理。离心结束后，弃上清，往每个离心管中加入400μL染色缓冲液对细胞沉淀物进行重悬，然后转移至流式管中，将重悬后的细胞混合物进行表面标志物的流式检测。

表面标志物流式检测使用到的抗体名称是：CD326、CD90、CD73、CD24、CD44、HLV-DR/DP/DQ。

其中，CD326购自BD Biosciences，货号为565399；CD90购自BD Biosciences，货号为555595；CD73购自BD Biosciences，货号为561254；CD24购自abcam，货号为ab290730；CD44购自abcam，货号为ab254530；HLV-DR/DP/DQ购自abcam，货号为ab7856；染色缓冲液购自BD Biosciences，货号为554656，胰酶消化液购自源培，货号为S310JV。

对实施例2-1中的P3代的肺前体样细胞进行胞内标志物染色：

向细胞沉淀物中加入1mL固定穿膜液，将离心管放入于2-8℃冰箱静置50分钟，往离心管中加入2mL无菌PBS缓冲液，将离心管以300g的转速进行5分钟的离心处理，离心结束后，往离心管中加入500微升染色缓冲液进行重悬。将重悬后的细胞沉淀物转移到4个1.5mL离心管，规格为100μL/管。分别往上述4个1.5mL离心管中加入5μL的待测流式抗体，吹打混匀，将离心管放入37℃下含有5％CO₂的培养箱中静置30分钟。孵育完毕，按照800微升/管的剂量往每个离心管中加入无菌PBS缓冲液，然后将离心管放入离心机中，以300g的速率进行转速进行5分钟的离心处理。离心结束后，弃上清，往每个离心管中加入400μL染色缓冲液对细胞沉淀物进行重悬，然后转移至流式管中，将重悬后的细胞混合物进行胞内标志物的流式检测。

胞内标志物流式检测使用到的抗体名称为：krt5、P63、CK19、Sox9。

其中，krt5购自abcam，货号为ab270900；P63购自abcam，货号为ab246727；CK19购自abcam，货号为ab205445；Sox9购自abcam，货号为ab208427；固定穿膜液购自BDBiosciences，货号为554714，胰酶消化液购自源培，货号为S310JV，染色缓冲液购自BDBiosciences，货号为554656。

P3代肺前体样细胞的表面标志物的流式检测图和胞内标志物的流式检测图见图6和图7。图6为本发明提供的实施例3中P3代肺前体样细胞的表面标记物流式检测图；图7为本发明提供的实施例3中P3代肺前体样细胞的胞内标记物流式检测图。

参照图6可知，实施例2中使用重编程培养基培养的P3代肺前体样细胞阳性表达了表面标志物CD24、CD73、和CD326，阴性表达了表面标志物HLA-DRPQ；参照图7可知，实施例2中使用重编程培养基培养的P3代肺前体样细胞阳性表达了胞内标志物SOX9和CK19。实施例2中使用重编程培养基培养的P3代肺前体样细胞阳性表达了肺前体相关标志物CD24、CD73、CD326、CK19、SOX9，且CD326/CD24/CD73/CK19/SOX9的表达率高于70％，P3代肺前体样细胞表现出肺前体样细胞特性；实施例2中使用重编程培养基培养的P3代肺前体样细胞阴性表达HLA-DRPQ，说明该细胞不表达MHC-Ⅱ类抗原，患者移植该细胞后机体无法通过免疫系统的MHC-II类抗原识别该种细胞，患者机体的免疫系统不会对其产生免疫攻击，因此患者机体产生排异反应的可能性小。

实施例4

采样实施例2-1中传代培养的P6代肺前体样细胞，将其进行分化培养，并对分化前后肺前体样细胞的标记物进行实时荧光定量PCR检测。

肺前体样细胞分化前后的基因表达标志物种类见表2。

表2

当实施例2-1中用重编程培养基培养的P6代肺前体样细胞汇合度达到80％后，采样部分P6代肺前体样细胞将其转移入15mL的离心管中，将离心管放入离心机中，以200g的转速对离心管中的细胞混合物进行5分钟的离心处理，弃去离心处理后的上层清液得到细胞沉淀物，然后收集细胞用实时荧光定量PCR进行检测。

当实施例2-1中用重编程培养基培养的P6代肺前体样细胞汇合度达到80％后，采样部分P6代肺前体样细胞，弃去重编程培养基的上清液，用10mL无菌PBS缓冲液清洗2次，然后将P6代肺前体样细胞加入分化培养基，置于37℃下含有5％CO₂的培养箱分化7天，然后收集细胞并用实时荧光定量PCR进行检测。

使用荧光定量PCR仪器(生产厂家：Applied Biosystems，货号：7300Plus)对分化培养后肺前体样细胞进行荧光测试，具体的测试方法为本领域技术人员的常规技术手段，在此不再详细赘述。

使用的分化培养基组成如下：DMEM/F-12基础培养基，以及以占DMEM/F-12基础培养基的体积计，含量为50ng/mL的成纤维细胞生长因子bFGF，含量为5μg/mL的转铁蛋白，含量为20ng/mL的肝细胞生长因子HGF和含量为5％牛血清白蛋白。

其中，DMEM/F-12基础培养基购自源培，货号为L310KJ；成纤维细胞生长因子bFGF购自biorbyt，货号为orb80024；肝细胞生长因子HGF购自abcam，货号为ab632；转铁蛋白购自索莱宝，货号为T8010；牛血清白蛋白购自索莱宝，货号为A8020。

分化前后P6代肺前体样细胞基因表达情况见图8，图8为本发明提供的实施例4中P6代肺前体样细胞分化前后的基因表达图。图8的纵坐标为肺前体的基因表达标志物的表达量。参照图8可知，使用分化培养基培养的肺前体样细胞的HOPX表达量较分化前的肺前体样细胞明显增加28倍，而HOPX是肺泡Ⅰ型细胞的标记物，证明肺前体样细胞可以分化再生形成肺泡Ⅰ型细胞。

实施例5

本实施例提供了大鼠慢性阻塞性肺病(COPD)模型的建模方法，并使用实施例2中的肺前体样细胞对大鼠慢性阻塞性肺病(COPD)模型进行干预，考察实施例2中的肺前体样细胞对慢性阻塞性肺病的作用。

本实施例使用购自北京维通利华公司的16只7周龄SPF级雄性SD大鼠进行造模，大鼠的体重平均达到180g。

配制诱导剂：称取10mg的LPS倒入烧杯中，往烧杯中加入1mL的NS，充分涡旋溶解后制成10mg/mL的LPS母液。称取6mg粉末状的24U的PPE倒入另一烧杯中，往烧杯中加入1.8mL的NS和0.2mL的上述配置的LPS母液，充分涡旋溶解后，制备得到含有1mg/mL的LPS和24U/mLPPE的诱导剂。将诱导剂置于2～8℃下避光暂存，现配现用。

其中，LPS购自Sigma，货号为L2630；NS购自辰欣药业股份有限公司，货号为2102020728；PPE购自Sigma，货号为E1250。

大鼠慢性阻塞性肺病(COPD)模型的造模：使用异氟烷将大鼠进行麻醉处理，将诱导剂装入给药装置，并将给药装置经口插入麻醉后的大鼠气管内，快速向大鼠气管内推入100μL的诱导剂，诱导剂推入结束后将大鼠放回笼盒饲养。诱导剂每天推入一次，连续推入3天，完成大鼠造模。

肺前体样细胞对大鼠慢性阻塞性肺病(COPD)模型的干预实验：

采样实施例2-1中的P3代肺前体样细胞，加入NS配置成肺前体样细胞的细胞制剂。NS购自辰欣药业股份有限公司，货号为2102020728。

大鼠分组情况如下：对十二只大鼠进行造模，造模完成后，将大鼠不做任何处理回笼饲养一天，然后按照大鼠的呼吸频率和耗气量将大鼠随机分成三组，每组四只，分别为造模组、气道给药组和尾静脉给药组；剩余四只大鼠，不做任何处理，作为正常组。

造模组、气道给药组和尾静脉给药组的大鼠使用肺前体样细胞的细胞制剂的情况如下：

造模组：不做任何处理。

气道给药组：将肺前体样细胞的细胞制剂装入给药装置，并将给药装置经口插入大鼠气管内，快速向大鼠气管内推入肺前体样细胞的细胞制剂，以0.1mL/只的标准进行单次给药。

尾静脉给药组：将肺前体样细胞的细胞制剂通过尾静脉注射入大鼠体内，以1mL/只的标准进行单次注射给药。

具体对大鼠的给药数据见表3。

表3

然后将所有大鼠放回笼盒饲养21天。

实施例5-1

大鼠耗气量的测量具体操作步骤：将大鼠使用异氟烷麻醉后进行气管插管，将2mL注射器(内含20μL水柱)连接气管导管，记录注射器10秒内水柱下降体积，该体积为大鼠的耗气量。

其中，注射器购自KDL，批号为20191123。

将所有大鼠分别于干预实验前第4天，干预实验当天未给药时、干预实验后第7天、干预实验后第21天进行耗气量的测量。

图9为本发明提供的实施例5-1中造模组、气道给药组、尾静脉给药组和正常组的大鼠耗气量变化曲线图。参照图9可知，造模组、气道给药组和尾静脉给药组的大鼠在造模后耗气量相对于正常组的大鼠严重下降，造模后的大鼠呼吸困难，肺部受损；在给大鼠使用肺前体样细胞后，气道给药组和尾静脉给药组的大鼠耗气量均明显大于造模组的大鼠耗气量，说明肺前体样细胞能够改善造模后的大鼠肺功能。

实施例5-2

肺组织干湿重比是反应肺水肿的直接指标，也是反应肺损伤严重程度的敏感指标，干湿重比(W/D)越大，肺损伤程度越高。

将所有的大鼠给药21天后，从大鼠的尾静脉注射舒泰50，将大鼠深度麻醉后从大鼠腹主动脉放血，最后大鼠颈椎脱臼处死。其中，舒泰50购自维克，货号为785T。

分别取出造模组、气道给药组、尾静脉给药组和正常组的大鼠死后的右侧肺组织进行称重，记录数据，然后将造模组、气道给药组、尾静脉给药组和正常组的大鼠死后的右侧肺组织放入烘箱内于70℃下干燥处理72h，再次称重，计算造模组、气道给药组、尾静脉给药组和正常组的大鼠死后的右侧肺组织干湿重比。

图10为本发明提供的实施例5-2中造模组、气道给药组、尾静脉给药组和正常组的大鼠肺组织干湿重比图。参照图10可知，造模组、气道给药组和尾静脉给药组的大鼠在造模后肺组织干湿重比相对于正常组的大鼠较高；在给大鼠使用肺前体样细胞后，气道给药组和尾静脉给药组的大鼠的肺组织干湿重比均明显小于造模组的大鼠肺组织干湿重比，说明肺前体样细胞能够修复造模后的大鼠肺损伤，使大鼠的肺损伤程度降低。

实施例5-3

分别取出实施例5-2中造模组、气道给药组、尾静脉给药组和正常组的大鼠死后的左侧肺组织进行Masson染色检测。

图11为本发明提供的实施例5-3中造模组、气道给药组、尾静脉给药组和正常组的大鼠肺组织Masson染色结果图；图中比例尺为1000微米。参照图11可知，造模组、气道给药组和尾静脉给药组的大鼠在造模后左肺组织可以看到明显的炎性细胞浸润，且组织结构完整性低于正常组的大鼠；在给大鼠使用肺前体样细胞后，造模组、气道给药组和尾静脉给药组的大鼠相比，气道给药组和尾静脉给药组大鼠的左肺组织纤维化程度均明显低于造模组，且气道给药组和尾静脉给药组大鼠的左肺组织的炎性细胞的浸润程度均明显低于造模组，说明肺前体样细胞能够改善造模后的大鼠肺组织的炎症，降低肺组织炎性细胞的浸润。

结合实施例5-1至5-3，得出结论实施例2-1中经过重编程培养基培养出的肺前体样细胞在治疗大鼠慢性阻塞性肺病时可以修复损伤肺组织，减少炎性细胞的浸润，有效改善肺功能。

实施例6

本实施例提供了小鼠特发性肺纤维化(IPF)模型的建模方法，并使用实施例2中的肺前体样细胞对小鼠特发性肺纤维化(IPF)模型进行干预，考察实施例2中的肺前体样细胞对特发性肺纤维化的作用。

本实施例使用购自查士利华医药技术(上海)有限公司的12只7周龄雄性C57BL/6小鼠进行建模，小鼠的体重平均达到25g。

小鼠特发性肺纤维化(IPF)模型的建模：使用异氟烷将建模组的九只小鼠进行麻醉处理，用20G动脉留置针对小鼠进行气管插管，随后用小动物呼吸机对小鼠进行2小时机械通气，诱导建立小鼠肺纤维化模型。其中，小动物呼吸机的参数设置为：FiO2：0.2，VT：20mL/kg，呼吸频率(RR)70次/分钟。

肺前体样细胞对小鼠特发性肺纤维化(IPF)模型的干预实验：

采样实施例2-1中的P3代肺前体样细胞，加入NS配置成肺前体样细胞制剂。NS购自辰欣药业股份有限公司，货号为2102020728。

小鼠分组情况如下：随机对九只小鼠进行造模，造模完成后，将小鼠随机分成三组，每组三只，分别为模型对照组、气道给药组和尾静脉给药组，并对气道给药组和尾静脉给药组的小鼠立即使用肺前体样细胞的细胞制剂；剩余三只小鼠，不做任何处理，作为正常对照组。

模型对照组、气道给药组和尾静脉给药组的小鼠使用肺前体样细胞的细胞制剂的情况如下：

模型对照组：不做任何处理。

气道给药组：将肺前体样细胞的细胞装入给药装置，并将给药装置经口插入小鼠气管内，快速向小鼠气管内推入肺前体样细胞的细胞制剂，以1×10⁶/50μL的标准进行单次给药。

尾静脉给药组：将肺前体样细胞的细胞通过尾静脉注射入小鼠体内，以1×10⁶/100μL的标准进行单次注射给药。

具体对小鼠的给药情况见表4。

表4

然后将建模组小鼠和正常对照组小鼠在笼盒饲养7天

实施例6-1

小鼠呼吸频率的测量具体操作步骤：将小鼠使用异氟烷麻醉后进行气管插管，将1mL注射器(内含20μL水柱)连接气管导管，记录注射器10秒内水柱上下移动次数，该次数为小鼠的呼吸频率。

其中，注射器购自KDL，批号为20191123。

将所有小鼠分别于干预实验当天未给药时、干预实验后第7天进行呼吸频率的测量。

图12为本发明提供的实施例6-1中模型对照组、气道给药组、尾静脉给药组和正常对照组小鼠呼吸频率变化曲线图；参照图12可知，模型对照组、气道给药组和尾静脉给药组的小鼠在造模后呼吸频率相对于正常对照组的小鼠严重上升，造模后的小鼠表现出明显的呼吸急促，呼吸频率显著增加，肺部受损；在给小鼠使用肺前体样细胞后，气道给药组和尾静脉给药组的小鼠呼吸频率均明显低于模型对照组的小鼠呼吸频率，说明肺前体样细胞能够改善建模后的小鼠肺功能。

实施例6-2

干预实验后第7天，分别取模型对照组、气道给药组、尾静脉给药组和正常对照组的小鼠的1mL动脉血，将小鼠的静脉血滴入肝素钠抗凝管中，然后将肝素钠抗凝管放入血气分析仪中，使用血气分析仪检测小鼠动脉血的血气指标。

其中，肝素钠抗凝管中购自BD，货号为367874；血气分析仪购自西尔曼科技，型号为G100。

图13为本发明提供的实施例6-2中模型对照组、气道给药组、尾静脉给药组和正常对照组小鼠动脉血气分析结果图。参照图13可知，与正常对照组相比，模型对照组、气道给药组、尾静脉给药组的小鼠动脉血的二氧化碳分压明显升高，氧分压明显降低，二氧化碳分压的升高导致血液PH值降低，证明造模后的小鼠的肺通气功能受阻；在给小鼠使用肺前体样细胞后，气道给药组和尾静脉给药组的小鼠相对于模型对照组的小鼠动脉血的二氧化碳分压明显降低，氧分压明显升高，二氧化碳分压的降低导致血液PH值升高，说明肺前体样细胞能够使小鼠肺通气功能一定程度改善。

实施例6-3

通过气管向模型对照组、气道给药组、尾静脉给药组和正常对照组的小鼠的左肺灌注2ml的10％福尔马林溶液，结扎气管，将左肺浸泡于10％福尔马林溶液进行固定，将左肺外送第三方做HE和Masson染色。

其中，福尔马林溶液购自上海瑞雨生物科技有限公司，货号为#Bry-0018。

(1)使用HE染色，图14为本发明提供的实施例6-3中模型对照组、气道给药组、尾静脉给药组和正常对照组小鼠的肺组织HE染色结果图；图中比例尺为1000微米，参照图14可知，模型对照组、气道给药组和尾静脉给药组的小鼠在造模后小鼠肺组织有明显的炎性细胞浸润，证明造模后的小鼠的肺组织受损，引发肺组织炎症；在给药肺前体样细胞后，气道给药组和尾静脉给药组的小鼠肺组织的炎性细胞浸润程度均明显低于模型对照组的小鼠肺组织的炎性细胞浸润程度，说明肺前体样细胞能够改善建模后的小鼠肺组织的炎症，降低肺组织炎性细胞的浸润。

(2)使用Masson染色，图15为本发明提供的实施例6-3中模型对照组、气道给药组、尾静脉给药组和正常对照组小鼠的肺组织Masson染色结果图；图中比例尺为1000微米，参照图15可知，模型对照组、气道给药组和尾静脉给药组的小鼠在造模后肺组织蓝染区域面积明显多于正常对照组的小鼠肺组织蓝染区域面积，证明造模后的小鼠的肺组织纤维化；在给药肺前体样细胞后，气道给药组和尾静脉给药组的小鼠肺组织的蓝染区域面积明显低于模型对照的小鼠，说明肺前体样细胞能够显著降低建模后的小鼠肺组织的纤维化程度。

实施例6-4

双向结扎模型对照组、气道给药组、尾静脉给药组和正常对照组的小鼠的右支气管，剪下小鼠的右肺。剪下1cm²大的右肺组织，迅速放入液氮冷冻2分钟，用蛋白免疫印迹检测模型对照组、气道给药组、尾静脉给药组和正常对照组的小鼠右肺组织的纤维化因子COL1A1、Fibronectin、α-SMA。图16为本发明提供的实施例6-4中模型对照组、气道给药组、尾静脉给药组和正常对照组小鼠的肺组织纤维化分子蛋白浓度检测结果图。参照图16可知，模型对照组、气道给药组、尾静脉给药组的小鼠在造模后COL1A1的蛋白表达量明显多于正常对照组的小鼠的COL1A1的蛋白表达量；在给药肺前体样细胞后，气道给药组、尾静脉给药组的小鼠的COL1A1的蛋白表达量显著低于模型对照组的小鼠的COL1A1的蛋白表达量，说明肺前体样细胞可以显著降低建模后的小鼠肺组织的纤维化程度。

结合实施例6-1至6-4，得出结论实施例2-1中经过重编程培养基培养出的肺前体样细胞在治疗小鼠肺纤维化可以减轻肺组织纤维化程度，减少炎性细胞的浸润，有效改善呼吸功能。

虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。

Claims

1.一种肺前体样细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的肺前体样细胞的制备方法，其特征在于，在所述S1中，所述肺组织经过消化分离后得到原代肺细胞的步骤包括：

3.根据权利要求2所述的肺前体样细胞的制备方法，其特征在于，在所述S11中，以占所述自配胶原酶的体积百分比计，所述自配胶原酶的组分包括：25％-50％的中性蛋白酶II和50％-75％的II型胶原酶。

4.根据权利要求1所述的肺前体样细胞的制备方法，其特征在于，在所述S2中，所述重编程培养基包括基础培养基、营养补充剂、生长因子、TGF-β信号抑制剂、Wnt信号通路激活剂和ROCK激酶抑制剂。

5.根据权利要求4所述的肺前体样细胞的制备方法，其特征在于，以占所述基础培养基的体积计，所述生长因子的含量为10-50纳克/毫升，所述ROCK激酶抑制剂的含量为1-20微摩尔，所述Wnt信号通路激活剂的含量为1-10微摩尔，所述TGF-β信号抑制剂的含量为1-10微摩尔，所述营养补充剂的体积含量不超过10％。

6.根据权利要求1所述的肺前体样细胞的制备方法，其特征在于，在所述S2中，所述重编程培养基还包括三碘甲状腺原氨酸、氢化可的松。

7.根据权利要求1所述的肺前体样细胞的制备方法，其特征在于，所述肺前体样细胞阳性表达至少一种特征标志物。

8.根据权利要求7所述的肺前体样细胞的制备方法，其特征在于，所述特征标志物的表达率为不低于50％且不高于99％。

9.根据权利要求7所述的肺前体样细胞的制备方法，其特征在于，至少一种所述特征标志物包括CD24、CD73、CD326、CK19、Sox9的至少一种。

10.根据权利要求1所述的肺前体样细胞的制备方法，其特征在于，所述肺前体样细胞阴性表达至少一种MHC二类分子，至少一种所述MHC二类分子包括HLA-DR/DP/DQ的至少一种。

11.一种肺前体样细胞的应用，其特征在于，使用如权利要求1所述的肺前体样细胞的制备方法制备得到的所述肺前体样细胞干预体内动物模型。

12.根据权利要求11所述的肺前体样细胞的应用，其特征在于，所述动物体内模型包括大鼠慢性阻塞性肺病模型、小鼠特发性肺纤维化模型中的任意一种。