JP7526375B1 - マウス腸管オルガノイドを腸内分泌細胞に指向性分化するように誘導する培地及びその使用 - Google Patents

マウス腸管オルガノイドを腸内分泌細胞に指向性分化するように誘導する培地及びその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】マウス腸管オルガノイドを腸内分泌細胞に指向性分化するように誘導する培地及びその使用を提供する。【解決手段】本発明は、マウス小腸オルガノイド標準条件（ＥＮＲ）培地にＭｅｋ阻害剤ＰＤ０３２５９０１、Ｗｎｔ阻害剤ＩＷＰ－２、Ｎｏｔｃｈ阻害剤ＤＡＰＴを添加してマウス小腸オルガノイドを成熟腸内分泌細胞に分化するように誘導し、マウス腸管内分泌細胞誘導モデルの構築を実現する。この誘導培地を使用してマウス腸管オルガノイドを腸内分泌細胞に指向性分化するように誘導する。マウスの小腸オルガノイドの分化が開始してから２日ごとに培地を更新し、４日間分化した後、培養液を吸引して取り除き、ＰＢＳ緩衝液を追加して吹き付け、遠心分離し、上澄み液を捨て、４℃Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭにおいて、再懸濁し、遠心分離し、上澄み液を捨て、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ及びＭａｔｒｉｇｅｌマトリゲルに再懸濁する。【選択図】図４

Description

本発明は、オルガノイドの誘導培養の技術分野に属し、具体的にはマウス腸管オルガノイドを腸内分泌細胞に指向性分化するように誘導する培地及びその使用である。
小腸内分泌細胞は、小腸幹細胞から分化されてなり、腸管全体に分布し、腸管分泌、運動、消化吸収、血糖調節及び代謝等の生理的活動を調節する。それはさまざまな種類の腸管ホルモンを分泌でき、内分泌と傍分泌を通じて、腸管蠕動、血管収縮、栄養吸収、上皮成長及び中枢生物リズム調節等において重要な役割を果たす。同時に、医薬、栄養、組織プロジェクト向けの非臨床的および臨床システムに関する研究において、重要な役割を伴う。過去には、腸内分泌細胞の体外研究は常に細胞系のレベルにとどまり、単一層で培養され、通常の腸内分泌細胞に比べて、細胞環境、遺伝的背景、機能的特性に大きな差異がある。
研究では、腸管内のＬｇｒ５＋腸管幹細胞は、パネート細胞、内分泌細胞、腸上皮細胞などを含む、腸上皮に全ての型の細胞に分化する可能性があることが示されている。したがって、小腸陰窩におけるＬｇｒ５＋腸管幹細胞を抽出して誘導すると、自分自身を維持して増殖できる腸管オルガノイドを形成できる。該オルガノイド内には、すべての腸管上皮細胞型が含まれ、腸管と類似の細胞環境を持ち、さらに、腸管ホルモンの発現方式は天然腸管に類似する。ただし、腸管オルガノイドでは、腸内泌細胞は、１％だけであり、現在の培養方法は、その特定の分化方向を制御することにより腸内分泌細胞群を取得しにくいことを考慮し、したがって、安定的、効率的、便利なマウス腸管内分泌細胞誘導モデルの構築方法を開発することが緊急である。
これを考慮して、本発明は、マウスの小腸オルガノイドを処理して成熟腸内分泌細胞への指向性分化を成功且つ、迅速に行うことができる誘導培地を提供することを目的とする。
上記発明の目的を達成するために、本発明は以下の技術的解決手段を提供する。
本発明は、誘導培地を提供し、前記培地成分は、腸管オルガノイド標準条件ＥＮＲ培地１０～１５ｍＬ、Ｍｅｋ阻害剤ＰＤ０３２５９０１ ０．５～２μｍ、Ｗｎｔ阻害剤ＩＷＰ－２ ３～８μｍ及びＮｏｔｃｈ阻害剤ＤＡＰＴ ８～１５μｍを含み、前記ＥＮＲ培地成分はＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地１０～１５ｍｌ、Ｇｌｕｔａｍａｘ １００～１５０μＬ、Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒ １００～１５０μＬ、Ｎ－２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １００～１５０μＬ、Ｂ－２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １００～１５０μＬ、マイシリン １００～１５０μＬ、Ｎｏｇｇｉｎ ８０～１２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ１ ４００～６００ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ ３０～８０ｎｇ／ｍｌである。
本発明はまた、前記誘導培地を使用してマウス小腸オルガノイドを培養するステップを含むマウス腸管オルガノイドを腸内分泌細胞に指向性分化するように誘導する方法を提供する。
好ましくは、前記培養の条件は３５～３７℃、５％ＣＯ２である。
好ましくは、マウスの小腸オルガノイドの分化が開始してから２日ごとに培地を更新し、４日間分化した後、培養液を吸引して取り除き、ＰＢＳ緩衝液を追加して吹き付け、遠心分離し、上澄み液を捨て、４℃Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭにおいて再懸濁し、遠心分離し、上澄み液を捨て、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ及びＭａｔｒｉｇｅｌマトリゲルに再懸濁する。
より好ましくは、前記遠心分離の条件は、０～４℃で、２８０～２９０ｇを２～８ｍｉｎ遠心分離することである。
好ましくは、前記マウス小腸オルガノイドは、マウス小腸陰窩乾細胞を腸管オルガノイド標準条件ＥＮＲ培地において、５～７日間培養した後に継代培養して得られたものである。
より好ましくは、前記腸管オルガノイド標準条件ＥＮＲ培地成分はＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地１０～１５ｍｌ、Ｇｌｕｔａｍａｘ １００～１５０μＬ、Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒ １００～１５０μＬ、Ｎ－２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １００～１５０μＬ、Ｂ－２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １００～１５０μＬ、マイシリン １００～１５０μＬ、Ｎｏｇｇｉｎ ８０～１２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ１ ４００～６００ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ ３０～８０ｎｇ／ｍｌである。
より好ましくは、前記継代比率は１：３～１：５である。
より好ましくは、前記マウス小腸陰窩乾細胞は、マウス小腸組織をＥＤＴＡで消化処理して得られたものである。
本発明はまた、前記誘導培地又は前記方法の、マウス腸内分泌細胞オルガノイドモデルの構築における使用を提供する。
従来技術と比較して、本発明は以下の有益な効果を有する。
本発明によって提供される誘導培地は、マウスの小腸オルガノイドを腸内分泌細胞に指向性分化する。免疫蛍光検出により、対照群と比較して、本発明の誘導培地で処理された腸内分泌細胞マーカーの数は９８５％増加し、ｑＲＴ－ＰＣＲによりオルガノイドにおける各種の細胞マーカーｍＲＮＡ発現量を検出し、ＣＣＫ（Ｉ細胞）、ＧＬＰ－１（Ｌ細胞）、Ｇｈｒｅｌｉｎ（Ａ細胞）、Ｓｅｃｒｔｉｎ（Ｓ細胞）、ＧＩＰ（Ｋ細胞）及びＳｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ（Ｄ細胞）等の、小腸の一般的な内分泌細胞サブ型の標識したホルモンｍＲＮＡ発現量はすべて、大幅に増加した。結果は、本発明の誘導培地で、マウスの小腸オルガノイドを処理して成熟腸内分泌細胞への指向性分化を可能にし、マウス腸管内分泌細胞の誘導モデルをうまく構築することに有利であることを示している。該モデルは、２Ｄ細胞モデルより腸管細胞環境をよりよくシミュレートでき、これは、さまざまな疾患モデルの、腸内分泌細胞及びその腸管ホルモンの分泌への影響及び分子メカニズムを探求するために使用でき、また、腸管の栄養と健康、腸管内分泌疾患のスクリーニング及び安全評価を研究するためにも使用できる。
腸管オルガノイド標準条件ＥＮＲ培地を使用して培養したマウス小腸オルガノイドの１～８日間の培養成長状態図である。 異なる培地条件下での小腸オルガノイドの０日目と４日目の成長状態図である。 異なる培地条件下での小腸オルガノイドの腸内分泌細胞マーカー免疫蛍光検出結果である。 本発明の誘導培地条件下での小腸オルガノイドにおける細胞マーカーｍＲＮＡ発現量結果である。
本発明は、誘導培地を提供し、前記培地成分は好ましくは、腸管オルガノイド標準条件ＥＮＲ培地１０～１５ｍＬ、Ｍｅｋ阻害剤ＰＤ０３２５９０１ ０．５～２μｍ、Ｗｎｔ阻害剤ＩＷＰ－２ ３～８μｍ及びＮｏｔｃｈ阻害剤ＤＡＰＴ ８～１５μｍを含み、前記腸管オルガノイド標準条件ＥＮＲ培地成分は好ましくは、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地１０～１５ｍｌ、Ｇｌｕｔａｍａｘ １００～１５０μＬ、Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒ １００～１５０μＬ、Ｎ－２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １００～１５０μＬ、Ｂ－２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １００～１５０μＬ、マイシリン １００～１５０μＬ、Ｎｏｇｇｉｎ ８０～１２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ１ ４００～６００ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ ３０～８０ｎｇ／ｍｌであり、より好ましくは、前記培地成分は、腸管オルガノイド標準条件ＥＮＲ培地１２ｍＬ、Ｍｅｋ阻害剤ＰＤ０３２５９０１ １μｍ、Ｗｎｔ阻害剤ＩＷＰ－２ ５μｍ及びＮｏｔｃｈ阻害剤ＤＡＰＴ １０μｍを含み、前記腸管オルガノイド標準条件ＥＮＲ培地成分はより好ましくは、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地１２ｍｌ、Ｇｌｕｔａｍａｘ １２０μＬ、Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒ １２０μＬ、Ｎ－２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １２０μＬ、Ｂ－２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １２０μＬ、マイシリン １２０μＬ、Ｎｏｇｇｉｎ １００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ１ ５００ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ ５０ｎｇ／ｍｌである。本発明において、前記Ｍｅｋ阻害剤ＰＤ０３２５９０１、Ｗｎｔ阻害剤ＩＷＰ－２及びＮｏｔｃｈ阻害剤ＤＡＰＴ阻害剤はＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓから購入し、前記Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ 培地、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒ、Ｎ－２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｂ－２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ及びマイシリンは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、前記Ｎｏｇｇｉｎ、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ１及びＥＧＦは、Ｐｒｏｐｅｒｔｅｃｈから購入する。
本発明はまた、マウス腸管オルガノイドを腸内分泌細胞に指向性分化するように誘導する方法を提供し、前記誘導培地を使用してマウス小腸オルガノイドを培養するステップを含む。
本発明において、前記培養の条件は３５～３７℃、５％ＣＯ２である。
本発明において、マウスの小腸オルガノイドの分化が開始してから２日ごとに培地を更新し、４日間分化した後、培養液を吸引し取り除き、ＰＢＳ緩衝液を追加して吹き付け、遠心分離し、上澄み液を捨て、４℃Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭにおいて、再懸濁し、遠心分離し、上澄み液を捨て、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ及びＭａｔｒｉｇｅｌマトリゲルに再懸濁する。
本発明において、前記遠心分離の条件は好ましくは、０～４℃で、２８０～２９０ｇを２～８ｍｉｎ遠心分離することである。
本発明において、前記マウス小腸オルガノイドは、マウス小腸陰窩乾細胞を腸管オルガノイド標準条件ＥＮＲ培地において、５～７日間培養した後に継代培養して得られたものである。本発明の具体的な実施例において、前記培養条件は、３７℃及び５％ＣＯ２で培養することである。本発明において、前記継代回数は好ましくは、３～４回であり、継代培養により、オルガノイドの状態をよく保持できる。
本発明において、前記腸管オルガノイド標準条件ＥＮＲ培地成分は好ましくは、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地１０～１５ｍｌ、Ｇｌｕｔａｍａｘ １００～１５０μＬ、Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒ １００～１５０μＬ、Ｎ－２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １００～１５０μＬ、Ｂ－２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １００～１５０μＬ、マイシリン １００～１５０μＬ、Ｎｏｇｇｉｎ ８０～１２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ１ ４００～６００ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ ３０～８０ｎｇ／ｍｌであり、より好ましくは、腸管オルガノイド標準条件ＥＮＲ培地成分はＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地１２ｍｌ、Ｇｌｕｔａｍａｘ １２０μＬ、Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒ １２０μＬ、Ｎ－２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １２０μＬ、Ｂ－２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １２０μＬ、Ｇｌｕｔａｍａｘ １２０μＬ、Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒ １２０μＬ、Ｎ－２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １２０μＬ、Ｂ－２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １２０μＬ、マイシリン １２０μＬ、Ｎｏｇｇｉｎ １００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ１ ５００ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ ５０ｎｇ／ｍｌである。
本発明において、前記継代比率は好ましくは１：３～１：５、より好ましくは１：４である。本発明の継代比率は、陰窩の状態に応じて継代比率を適切に調整することができる。
本発明において、前記マウス小腸陰窩乾細胞は、マウス小腸組織をＥＤＴＡで消化処理して得られたものである。ＥＤＴＡで消化した後、小腸組織は緩くなり、外部の機械的力の作用の下で、小腸陰窩は組織から分離され、外部の機械的力により数回繰り返して、異なる留分混合を得ることができ、また、より高い陰窩の含有量とより少ない柔細胞を持つ留分を選択して細胞培養用プレートにおいて、培養することもできる。本発明の具体的な実施例において、得られた小腸組織切片を２５ｍＬ ４℃的ＥＤＴＡ溶液に再懸濁し、且つ０～４℃の条件下で振動台に置いて、２０ｒｐｍ回転速度で３０～６０分間培養し、ＥＤＴＡを含む上澄み液を除去し、ＰＢＳで３回洗い流し、組織切片を０．１％ＢＳＡを含む４℃ＰＢＳに再懸濁し、ピペットを使用して上下に３回吹き付ける。ほとんどの腸組織切片が底に沈むまで、静置し、上澄み液を慎重に除去し、７０μｍフィルターを使用して濾過し、ろ液をＥＰ管に収集し、ろ液を「留分１」としてマークし、ステップを３回繰返し、留分２～４を得る。本発明の具体的な実施例において、好ましくは、留分３及び留分４を使用して後続培養用の陰窩を行う。
本発明はまた、前記誘導培地又は前記方法の、マウス腸内分泌細胞オルガノイドモデルの構築における使用を提供する。
本発明によって提供される技術的解決手段は、実施例を参照しながら以下に詳細に説明されるが、それらは、本発明の保護の範囲を制限するものとして理解することはできない。
実施例１
誘導培地は、腸管オルガノイド標準条件（ＥＮＲ）培地１２ｍｌ、Ｍｅｋ阻害剤ＰＤ０３２５９０１ １μｍ、Ｗｎｔ阻害剤ＩＷＰ－２ ５μｍ及びＮｏｔｃｈ阻害剤ＤＡＰＴ １０μｍを含み、前記腸管オルガノイド標準条件（ＥＮＲ）培地成分はＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地１２ｍｌ、Ｇｌｕｔａｍａｘ １２０μＬ、Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒ １２０μＬ、Ｎ－２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １２０μＬ、Ｂ－２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １２０μＬ、マイシリン １２０μＬ、Ｎｏｇｇｉｎ １００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ１ ５００ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ ５０ｎｇ／ｍｌを含有した。
実施例２
誘導培地は、腸管オルガノイド標準条件（ＥＮＲ）培地１０ｍｌ、Ｍｅｋ阻害剤ＰＤ０３２５９０１ ０．５μｍ、Ｗｎｔ阻害剤ＩＷＰ－２ ３μｍ及びＮｏｔｃｈ阻害剤ＤＡＰＴ ８μｍを含み、前記腸管オルガノイド標準条件（ＥＮＲ）培地成分はＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地１０ｍｌ、Ｇｌｕｔａｍａｘ １００ μＬ、Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒ １００μＬ、Ｎ－２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １００μＬ、Ｂ－２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １００μＬ、Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒ １００μＬ、Ｎ－２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １００μＬ、Ｂ－２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １００μＬ、マイシリン １００μＬ、Ｎｏｇｇｉｎ ８０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ１ ４００ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ ３０ｎｇ／ｍｌであった。
実施例３
誘導培地は、腸管オルガノイド標準条件（ＥＮＲ）培地１５ｍｌ、Ｍｅｋ阻害剤ＰＤ０３２５９０１ ２μｍ、Ｗｎｔ阻害剤ＩＷＰ－２ ８μｍ及びＮｏｔｃｈ阻害剤ＤＡＰＴ １５μｍを含み、前記腸管オルガノイド標準条件（ＥＮＲ）培地成分はＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地１５ｍｌ、Ｇｌｕｔａｍａｘ １５０μＬ、Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒ １５０μＬ、Ｎ－２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １５０μＬ、Ｂ－２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １５０μＬ、マイシリン １５０μＬ、Ｎｏｇｇｉｎ １２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ１ ６００ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ ８０ｎｇ／ｍｌであった。
比較例１
実施例１と異なることは、Ｗｎｔ阻害剤ＩＷＰ－２およびＮｏｔｃｈ阻害剤ＤＡＰＴを添加しないことであり、他の成分や投与量は変更されなかった。
比較例２
実施例１と異なることは、Ｍｅｋ阻害剤ＰＤ０３２５９０１およびＮｏｔｃｈ阻害剤ＤＡＰＴを添加しないことであり、他の成分や投与量は変更されなかった。
比較例３
実施例１と異なることは、Ｍｅｋ阻害剤ＰＤ０３２５９０１およびＷｎｔ阻害剤ＩＷＰ－２を添加しないことであり、他の成分や投与量は変更されなかった。
比較例４
実施例１と異なることは、Ｎｏｔｃｈ阻害剤ＤＡＰＴを追加しないことであり、他の成分や投与量は変更されなかった。
比較例５
実施例１と異なることは、Ｗｎｔ阻害剤ＩＷＰ－２を添加しないことであり、他の成分や投与量は変更されなかった。
比較例６
実施例１と異なることは、Ｍｅｋ阻害剤ＰＤ０３２５９０１を添加しないことであり、他の成分や投与量は変更されなかった。
実施例４
マウス小腸オルガノイドを腸内分泌細胞に指向性分化ように誘導する方法は、
マウスを頸椎を脱臼させてマウスを屠殺した後、マウスの胃の近くで約２０ｃｍの長さの小腸を取り、鑷子を使用して、腸管外部の膜、血管、脂肪を除去し、縦方向に解剖した後、１％マイシリン含有の４℃で予冷された無菌ＰＢＳ緩衝液ピペットを使用して、吹き付けてきれいになるまで洗い流したステップ（１）と、
処理された小腸セグメントを眼科用剪刀で約２～５ｍｍの腸セグメントに剪断し、５０ｍｌの無菌ＥＰ管内に移し、１０ｍＬのピペットをＰＢＳで事前に湿潤し、かつ腸管切片を上下に３回パージし、その後に静置して切片を重力により沈降させ、上澄み液を吸引し、１５ｍＬ ＰＢＳを追加し、上澄み液が浄化になるまで上記ステップを１５から２０回繰返したステップ（２）と、
上澄み液を除去し、組織セグメントを２５ｍＬ４℃のＥＤＴＡ溶液に再懸濁し、４℃の条件下で振動台に置いて２０ｒｐｍの回転速度で３０分間培養したステップ（３）と、
ＥＤＴＡを含む上澄み液を除去し、ＰＢＳで３回洗い流し、組織切片を０．１％ＢＳＡを含む１０ｍＬの４℃ ＰＢＳに再懸濁し、ピペットを使用して上下に３回吹き付けた。ほとんどの腸組織切片が底に沈むまで、静置し、上澄み液を慎重に除去し、７０μｍフィルターを使用して濾過し、ろ液を５０ｍＬのＥＰ管に収集し、ろ液を「留分１」としてマークし、ステップを３回繰返し、留分２～４を得たステップ（４）と、
４℃ですべての留分を２９０ｇで５分間遠心分離し、上澄み液を慎重に捨て、０．１％ＢＳＡを含む１０ｍＬのＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、各試験管の懸濁液を１５ｍＬのＥＰ管に移し、４℃で２００ｇを５分間遠心分離し、１０ｍＬの４℃ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭに再懸濁したステップ（５）と、
すべての留分から１０μＬを取り出し、反転顕微鏡を使用して留分の質量を確認し、一般的な場合、留分３及び４は、後続培養用の陰窩により適したステップ（６）と、
１０μＬサンプルにおける陰窩の数量を計算し、それにより留分における１ミリリットルあたりの陰窩の数を計算し、必要な孔数＊２００個陰窩１ミリリットルあたりの留分を抽出し、４℃で２００ｇを５分間遠心分離し、必要な孔数＊２５μＬ腸管オルガノイド標準条件（ＥＮＲ）培地に再懸濁し、必要な孔数＊２５μＬ Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリゲルを追加し、上下に吸引して吹き付けて沈殿を再懸濁し、気泡の生成を避けるために注意し、ここで、腸管オルガノイド標準条件（ＥＮＲ）培地成分はＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地１５ｍｌ、Ｇｌｕｔａｍａｘ １５０ μＬ、Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒ １５０μＬ、Ｎ－２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １５０μＬ、Ｂ－２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １５０μＬ、Ｇｌｕｔａｍａｘ １５０μＬ、Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒ １５０μＬ、Ｎ－２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １５０μＬ、Ｂ－２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １５０μＬ、マイシリン １５０μＬ、Ｎｏｇｇｉｎ １２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ１ ６００ ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ ８０ｎｇ／ｍｌであったステップ（７）と、
陰窩を事前に予熱した２４ウェルプレートに追加し、サンプルは、各孔の中央に凝固液滴を形成する必要があり、マトリゲルが完全に凝固するまで培養用プレートを３７℃で１０分間静置し、ピペットを使用して孔側壁に沿って各孔に５００μＬ腸管オルガノイド標準条件（ＥＮＲ）培地を軽く添加し、無菌ＰＢＳを他の液滴が接種されていない孔に添加し、培養器に入れて３７℃及び５％ＣＯ２で培養し、３日ごとに培地を置換し、一般的には、５～７日間後に継代培養を行い、継代比率は１：４であったステップ（８）と、
３回継代した後、陰窩をプレートに広げ、マトリゲルが完全に凝固するまで５００μＬ実施例１の誘導培地を追加し、培養器に入れて３７℃及び５％ＣＯ２で培養し、分化が開始してから２日ごとに培地を更新したステップ（９）と、
４日間分化した後、細胞培養用プレートにおける培養液を吸引し、各孔に４℃で予冷された１ｍＬのＰＢＳ緩衝液を追加し、１０回吹き付け、腸管オルガノイドを壊れ、４℃で２９０ｇを５分間遠心分離し、上澄み液を捨て、１０ｍＬの４℃ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭに再懸濁し、４℃で２００ｇを５分間遠心分離し、上澄み液を捨て、必要な孔数＊２５μＬ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ及びマトリゲルに再懸濁したステップ（１０）と、
陰窩を均一に広げ、マトリゲルが完全に凝固するまで５００μＬ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭを追加し、実験処理を待ったステップ（１１）と、を含む。
試験例１
実施例４のステップによれば、ステップ（９）の誘導培養中、実施例１の誘導培地をそれぞれ、比較例１～比較例６の誘導培地に置き換えて小腸オルガノイドに対して誘導培養を行い、単独の腸管オルガノイド標準条件（ＥＮＲ）培地で培養したマウス小腸オルガノイドを対照として、合計８組であった。異なる培養条件下でのオルガノイドの形態及び成長状態を観察した。
図１によると、腸管オルガノイド標準条件（ＥＮＲ）培地で培養して得られたマウス小腸オルガノイドの１～８日間の培養成長状態が分かり、抽出されたマウス腸管陰窩乾細胞は、マトリゲルにおいて培養して分化され、気球状の中空腸オルガノイドを形成し、その中央の空洞には絨毛のような上皮細胞が含まれた。２～４日間培養した後、陰窩乾細胞は絶えず増殖し、上皮細胞に分化して、腸オルガノイドの体積を増加させた。４～６日間培養した後、オルガノイド上皮細胞から外向きに折り畳み新しい萌芽のような構造ドメインを形成し、内部には、腸管陰窩乾細胞を含み、それを分離すると、新しい腸管オルガノイドを形成することができる。培養時間が増えると、死亡した上皮細胞が中央の空洞に落ち、８日目に顕微鏡の下に黒い影を形成し、大量の細胞アポトーシス因子が含まれた。
図２によると、小腸オルガノイドの、異なる培地（単独のＭＥＫ、Ｗｎｔ、Ｗｎｔ、Ｎｏｔｃｈ阻害剤で処理又は共同処理後）条件下での０日目と４日目の成長状態が分かり、明らかに、４日後、ｉＭｅｋ／ｉＷｎｔ／ｉＮｏｔｃｈ（３ｉ）組の成長状態は良好であったが、ｉＮｏｔｃｈ、ｉＭｅｋ、ｉＭｅｋ／ｉＮｏｔｃｈ組には、多くのオルガノイド死があった。実験では、Ｗｎｔ、Ｎｏｔｃｈ及びＭｅｋ経路を組み合わせて抑制することのみによって、腸管陰窩幹細胞の増殖を防ぎ、オルガノイド全体の過度の増加によりアポトーシスプロセスを開始することを避けることができることが示された。
試験例２
ＣｈｇＡ検出：遠心分離によりＭａｔｒｉｇｅｌマトリゲルを取り外し、試験例１で得られた異なる培養条件下での腸管オルガノイドをそれぞれリジンでコーティングされているスライドガラスに移し、４％パラホルムアルデヒドを使用して、４℃の冷蔵庫で一晩固定した。パラホルムアルデヒドを吸着し、ＰＢＳで３回洗浄し、室温で０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で細胞膜を１０分間破砕し、ＰＢＳで３回洗浄した。次に３％ＢＳＡを用いて室温で３０分間閉じ、スライドガラスを３回洗浄した後、一次抗体（クロモグラニンＡ（Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ Ａ、ＣｈｇＡ）抗体、ａｂｃａｍ）及び二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ、ａｂｃａｍ）を培養し、封入し、観察して撮影した。ここでＤＰＡＩは細胞核の位置をマークし、ＣｈｇＡは腸内分泌細胞をマークした。
図３の結果によると、免疫蛍光により検出された各組の各オルガノイドの腸内分泌細胞マーカーＣｈｇＡの数（ＣｈｇＡは緑、ＤＰＡＩは青）を示し、結果は、ＥＮＲ組に比べて、ｉＭｅｋ／ｉＷｎｔ／ｉＮｏｔｃｈ（３ｉ）によって共同で処理された腸内分泌細胞マーカーの数が９８５％増加し、差異が顕著であったことを示した。
試験例３
遺伝子検出：実施例１の誘導培地で４日間培養した後のマウス腸内分泌オルガノイド又はＥＮＲ培地で培養したマウス小腸オルガノイドを、ウェルプレート内の培地を吸引し、各孔に直接４００μＬ Ｔｒｉｚｏｌを追加して溶解し、吹き付けて室温で５分間静置し、ＲＮＡ抽出及び逆転写を行った。ｑＲＴ－ＰＣＲによりオルガノイドにおける各種の細胞マーカーｍＲＮＡ発現量、腸内分泌細胞の成熟マーク遺伝子、小腸の一般的な内分泌細胞サブ型の標識したホルモンｍＲＮＡ発現量を検出した。
図４の結果によると、ｑＲＴ－ＰＣＲによりオルガノイドにおける各種の細胞マーカーｍＲＮＡ発現量を検出し、Ｗｎｔ／Ｎｏｔｃｈ／Ｍｅｋの共同抑制経路で４日間後、腸上皮細胞、杯状細胞及び内分泌細胞のｍＲＮＡ発現量はすべて、大幅に増加し、それぞれ１３．２倍、８．４倍、２８．８倍増加したが、パネート細胞及び腸管乾細胞のｍＲＮＡ発現量は、大幅に低下した（図４Ａ）ことが分かり、ｑＲＴ－ＰＣＲにより腸内分泌細胞の成熟マーク遺伝子を検出したと、Ｗｎｔ／Ｎｏｔｃｈ／Ｍｅｋの共同抑制経路で４日間後、ｉｓｌ１遺伝子の発現量は、ｎｅｕｒｏｇ３遺伝子の発現量より顕著に増加したことが分かり（図４Ｂ）、ｑＲＴ－ＰＣＲにより小腸の一般的な内分泌細胞サブ型の標識したホルモンｍＲＮＡ発現量を検出したと、Ｗｎｔ／Ｎｏｔｃｈ／Ｍｅｋの共同抑制経路で４日間後、ＣＣＫ（Ｉ細胞）、ＧＬＰ－１（Ｌ細胞）、Ｇｈｒｅｌｉｎ（Ａ細胞）、Ｓｅｃｒｔｉｎ（Ｓ細胞）、ＧＩＰ（Ｋ細胞）及びＳｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ（Ｄ細胞）等の、小腸の一般的な内分泌細胞サブ型の標識したホルモンｍＲＮＡ発現量はすべて、大幅に増加したことが分かり、ＥＮＲ組に比べて差異が顕著（図４Ｃ）であり、それにより、ＭＥＫ、Ｗｎｔ、Ｎｏｔｃｈ阻害剤（３ｉ）で共同にマウスの小腸オルガノイドを処理すると、成熟腸内分泌細胞への指向性分化を可能にすることができると結論付けることができる。
実施例８
実施例７と異なることは、ステップ（８）の継代比率が１：５であり、残りのステップは変更されていなかった。
実施例９
実施例７と異なることは、ステップ（８）の継代比率が１：３であり、残りのステップは変更されていなかった。
上記は本発明の好ましい実施形態に過ぎず、当業者にとって、本発明の原理から逸脱しないという前提の下で、いくつかの改善と修飾を行うことができ、これらの改善と修飾も本発明の保護範囲に属すべきであることを指摘する必要がある。

Claims (8)

  1. マウス小腸組織からマウス小腸陰窩幹細胞を得るマウス小腸陰窩幹細胞分離ステップと、
    前記マウス小腸陰窩幹細胞分離ステップにて得たマウス小腸陰窩幹細胞をＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ培地１０～１５ｍｌ、Ｇｌｕｔａｍａｘ １００～１５０μＬ、Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆｅｒ １００～１５０μＬ、Ｎ－２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １００～１５０μＬ、Ｂ－２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １００～１５０μＬ、マイシリン １００～１５０μＬ、Ｎｏｇｇｉｎ ８０～１２０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ－ｓｐｏｎｄｉｎ１ ４００～６００ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ ３０～８０ｎｇ／ｍｌを含む培地であるＥＮＲ培地を用いて継代培養を行い、マウス小腸オルガノイドを得る継代培養ステップと、
    前記継代培養ステップにて３回継代培養をしたのち、前記ＥＮＲ培地１０～１５ｍＬ、Ｍｅｋ阻害剤ＰＤ０３２５９０１ ０．５～２μＭ、Ｗｎｔ阻害剤ＩＷＰ－２ ３～８μＭ及びＮｏｔｃｈ阻害剤ＤＡＰＴ ８～１５μＭを含む誘導培地を用いて前記マウス小腸オルガノイドを培養する誘導培地培養ステップと
    からなるマウス小腸オルガノイドを腸内分泌細胞に指向性分化するように誘導する誘導方法。
  2. 請求項１に記載の誘導方法であって、
    前記マウス小腸陰窩幹細胞分離ステップは、
    マウス小腸組織をＥＤＴＡで消化処理した後、外部の機械的力の作用の下で分離する
    ことを特徴とする誘導方法。
  3. 前記誘導培地培養ステップにおける培養の条件は３５～３７℃、５％ＣＯ２であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 前記誘導培地培養ステップで、
    マウスの小腸オルガノイドの分化が開始してから２日ごとに培地を更新し、４日間分化した後、培養液を吸引して取り除き、ＰＢＳ緩衝液を追加して吹き付け、遠心分離し、上澄み液を捨て、４℃Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭにおいて、再懸濁し、遠心分離し、上澄み液を捨て、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ及びＭａｔｒｉｇｅｌマトリゲルに再懸濁することを特徴とする請求項１に記載の誘導方法。
  5. 前記遠心分離の条件は、０～４℃で、２８０～２９０ｇを２～８ｍｉｎ遠心分離することであることを特徴とする請求項４に記載の誘導方法。
  6. 前記マウス小腸オルガノイドは、
    前記継代培養ステップにて、
    マウス小腸陰窩幹細胞を前記ＥＮＲ培地において、５～７日間培養した後に継代培養して得られたものであることを特徴とする請求項１に記載の誘導方法。
  7. 前記継代培養の継代比率は１：３～１：５であることを特徴とする請求項６に記載の誘導方法。
  8. 請求項１に記載の誘導方法を用いて、マウス腸内分泌細胞オルガノイドモデルの構築を行う方法。
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