CN112126618B - 一种人胆囊干细胞的获取和长期体外培养的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域技术领域，提供了一种人胆囊干细胞的获取和长期体外培养的方法，包括人胆囊干细胞的获取方法以及人胆囊干细胞的长期体外培养方法，分别提供了一种化学成分明确的原代培养基以及细胞扩增培养基。本发明采用该两种培养基实现了从人胆囊组织中选择性扩增胆囊干细胞，该细胞可在此条件下体外连续培养超过100天，并维持稳定的肝干细胞相关分子表型；诱导分化后细胞具有部分肝脏功能，包括摄取低密度脂蛋白、合成脂肪以及贮存糖原。因此，本发明获得的胆囊源干细胞可用作肝衰竭疾病细胞治疗的种子细胞、药物筛选、组织工程肝脏和人工肝的制备。

Description

一种人胆囊干细胞的获取和长期体外培养的方法
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域，涉及一种人胆囊干细胞的长期体外培养和扩增方法，包括一种化学成份明确的原代培养基，用于人胆囊干细胞的原代体外培养；以及一种化学成份明确的扩增培养基，用于人胆囊干细胞长期扩增培养。
背景技术
胆囊干细胞是指位于胆管系统上一群具有增殖和分化能力的细胞。大量研究表明胆囊干细胞分布于肝脏内的小胆管(Hering’s管)和肝外胆管组织中，包括胆囊、胆总管和肝管等(Cardinale V,Wang Y,Carpino G,Mendel G,Alpini G,Gaudio E,Reid LM,AlvaroD,The biliary tree—a reservoir ofmultipotent stem cells.Nat RevGastroenterol Hepatol.2012 Feb 28；9(4):231-40.)。胆囊干细胞在体外合适的培养条件下具有较强的增殖能力，可稳定扩增。通过改变培养条件，可诱导胆囊干细胞分化为肝细胞样细胞和胆管细胞。目前常用的胆囊干细胞培养方法都依赖于胎牛血清，含有胎牛血清的培养基具有成分不明确、动物蛋白丰富等缺陷，因此需要建立化学成分明确的胆囊干细胞培养体系用来扩增目的细胞。
人来源胆囊干细胞的分离获取和扩增培养对于转化应用具有重要意义。我国每年约有30万人死于各种因素导致的肝脏衰竭。肝移植是目前治疗相关疾病最有效的手段，但是可移植肝脏供体的严重匮乏限制了该治疗方法的应用，多数肝病患者在等待过程中失去生命。相关临床研究表明，如果使用成熟肝细胞或者干细胞移植到患者体内，可延长患者存活时间(可等到合适移植供体)，甚至有些细胞移植可挽救患者生命而不再需要肝移植。因而，如有合适且充足的细胞作为肝病治疗用候选供体将是重要突破。
目前可用的候选供体细胞主要包括诱导多能干细胞分化而来的肝样细胞、重编程直接获得的肝样细胞等。这些类型的细胞有些通过基因改造获得，有些具有免疫原性等未知风险，因此并未尝试临床上细胞移植的应用(Wang J,Sun M,Liu W,Li Y,Li M，StemCell-Based Therapies for Liver Diseases:An Overview and Update.Tissue EngRegen Med.2019Feb 21；16(2):107-118；Zhu T,Li Y,Guo Y,Zhu C,The Development ofStem Cell-Based Treatment for Liver Failure.Curr Stem Cell Res Ther.2017；12(7):554-563.)。
综合来看，获得数量充足、未经修饰、具有治疗潜能的细胞将是肝脏疾病细胞治疗领域的重要突破。
发明内容
本发明是为解决上述问题而进行的，针对现有技术中胆囊干细胞体外培养过程中的缺陷，提供了一种人胆囊干细胞的获取和长期体外培养的方法。
本发明的第一方面，提供了一种人胆囊干细胞的获取方法，通过该方法能够从人胆囊组织中快速分离获取目的细胞。分离方法如下：
A、获取胆囊内壁黏膜层细胞；
B、获取胆囊内壁黏膜层细胞单细胞
吸取含有胆囊内壁黏膜层细胞的液体基础培养基至离心管，300g离心5～7分钟后弃上清，加入Accutase消化酶，轻轻吹打沉淀，重悬细胞，置于37℃孵育20～30分钟，期间每隔5分钟震荡一次，消化成单细胞；
C、胆囊干细胞筛选
向步骤B中加入液体基础培养基混匀，离心去上清后采用Matrigel基质胶重悬，吹打均匀后接种于24孔细胞培养板中，并置于细胞培养箱中37℃培养，待液滴凝固后在每孔加入原代培养基，覆盖液滴后放入培养箱中进行培养，生成的圆形透明细胞克隆即为胆囊干细胞克隆，随着培养天数的增加，细胞克隆逐渐长大。
优选的，步骤A中获取胆囊内壁黏膜层细胞的方法如下：
将获得的人胆囊组织4℃置于液体基础培养基中保存，然后在无菌环境中取出组织，并沿着组织纵向剪开并充分展开组织；用无菌PBS反复清洗组织至溶液颜色澄清无血色，然后将组织转移至装有预冷液体基础培养基的培养皿中；用无菌一次性性手术刀片刮取下胆囊内壁黏膜层细胞，并用基础培养基冲洗胆囊内壁，弃掉胆囊组织，获得胆囊内壁黏膜层细。
优选的，步骤C中胆囊干细胞筛选的具体流程如下：
向步骤B中加入液体基础培养基混匀，400g离心5～7分钟后弃上清；根据细胞量，用Matrigel基质胶重悬细胞沉淀，吹打均匀；将含有细胞的基质胶按照每孔50μL的体积量接种于24孔细胞培养板中央，使其形成圆形液滴；将培养板置于37℃细胞培养箱中15-30分钟，待其凝固后在每孔加入原代培养基，覆盖液滴，放入培养箱；培养第二天观察到有圆形透明的胆囊干细胞细胞克隆生成，并随着培养天数的增加，细胞克隆逐渐长大。
上述步骤A～C中所使用的液体基础培养基的配方为Advanced DMEM/F12细胞培养基，终浓度为2mM谷氨酰胺以及终浓度为1mM HEPES缓冲液。
在本发明所提供的人胆囊干细胞的获取方法中，关键工作在于提供了一种化学成分明确的原代培养基，该原代培养基包含如下组分：液体基础培养基、1×B27添加剂、1×N2添加剂、1×青链霉素、0.1-50mM N-乙酰半胱氨酸、0.1-100ng/mL R-spondin、1-1000mM尼克酰胺、0.1-100ng/mL重组人表皮生长因子、0.1-100ng/mL重组人成纤维生长因子、0.1-100ng/mL重组人肝细胞生长因子、0.1-50μM cAMP环化酶激活剂、0.1-100μM TGFβ抑制剂、1nM-10μM的糖原合成激酶3β抑制剂、0.1-10％人血清白蛋白、0.1-100ng/mL重组人Noggin蛋白、0.1-100μM Rock抑制剂。
优选包括：液体基础培养基、1×B27添加剂、1×N2添加剂、1×青链霉素、1～3mMN-乙酰半胱氨酸、25～50ng/mL R-spondin、5～15mM尼克酰胺、25～50ng/mL重组人表皮生长因子、50～100ng/mL重组人成纤维生长因子、25～50ng/mL重组人肝细胞生长因子、5～20μM cAMP环化酶激活剂、5～10μM TGFβ抑制剂、5～10μM的糖原合成激酶3β抑制剂、8～10％人血清白蛋白、50～100ng/mL重组人Noggin蛋白、10～20μM Rock抑制剂。
本发明的第二方面，提供了一种人胆囊干细胞的长期体外培养方法，包括如下步骤：
A、待胆囊干细胞克隆长满，弃上清，加入预冷的液体基础培养基，并吹打均匀；
B、将每几孔细胞悬液为一组吸取至离心管中，补足液体基础培养基并吹打混匀细胞悬液后400g离心，弃去上清，加入TrypLE消化液，置于37℃水浴锅中消化10～15分钟，期间震荡1至两次，完成细胞消化；
C、消化完成后加入液体基础培养基混匀，离心弃上清，沉淀重复清洗后弃尽上清，采用Matrigel基质胶重悬，吹打均匀后接种于24孔细胞培养板中，并置于细胞培养箱中37℃培养，待液滴凝固后在每孔加入细胞扩增培养基，覆盖液滴后放入37℃培养箱中进行培养，细胞连续传代并大量扩增。
优选的，步骤B中，将每三孔细胞悬液为一组，吸取至15mL离心管中，补足液体至14mL，使用25mL移液器吹打混匀细胞悬液，而后400g离心5分钟，弃去上清；步骤C中，消化完成后加入液体基础培养基至14mL，混匀，400g离心5分钟，弃上清，重复清洗两遍，最后一遍弃尽上清，然后采用Matrigel基质胶重悬细胞沉淀，吹打均匀。
上述步骤A～C中所使用的液体基础培养基的配方为Advanced DMEM/F12细胞培养基，终浓度为2mM谷氨酰胺以及终浓度为1mM HEPES缓冲液。
在本发明所提供的人胆囊干细胞的长期体外培养方法中，关键工作也在于提供了一种化学成分明确的细胞扩增培养基，该细胞扩增培养基包括液体基础培养基、1×B27添加剂、1×N2添加剂、1×青链霉素、0.1-50mM N-乙酰半胱氨酸、0.1-100ng/mL R-spondin、1-1000mM尼克酰胺、0.1-100ng/mL重组人表皮生长因子、0.1-100ng/mL重组人成纤维生长因子、0.1-100ng/mL重组人肝细胞生长因子、0.1-50μM cAMP环化酶激活剂、0.1-100μM TGFβ抑制剂、1nM-10μM的糖原合成激酶3β抑制剂。
优选包括：液体基础培养基、1×B27添加剂、1×N2添加剂、1×青链霉素、1～3mMN-乙酰半胱氨酸、25～50ng/mL R-spondin、5～15mM尼克酰胺、25～50ng/mL重组人表皮生长因子、50～100ng/mL重组人成纤维生长因子、25～50ng/mL重组人肝细胞生长因子、5～20μM cAMP环化酶激活剂、5～10μM TGFβ抑制剂、5～10μM的糖原合成激酶3β抑制剂。
该培养基与原代培养基对比，缺少了人血清白蛋白、重组人Noggin蛋白、Rock抑制剂三种组分。
通过验证，上述两种培养基能够辅助从人胆囊组织中快速分离出目的细胞，并在体外进行长期、稳定和大量的细胞扩增，获得数量充足且表型稳定的细胞。
因此，本发明的第三方面提供了一种通过上述人胆囊干细胞的获取方法以及长期体外培养方法制备得到的胆囊干细胞。
通过RT-PCR检测以及免疫荧光染色分析，根据本发明的方法培养得到的胆囊干细胞表达CK19、SOX9以及EPCAM等典型肝干细胞标志物；通过染色体分析，其染色体为46条；通过流式细胞术分析，细胞纯度高达95％以上。表明本发明建立的培养体系可以从人胆囊组织中扩增干细胞，并可以在体外维持人胆囊干细胞的长期稳定增殖。
本发明的第四方面提供了该胆囊干细胞在制备肝脏疾病的治疗细胞、肝脏组织工程、肝脏疾病体外药物筛选中的用途。
通过实施例3可知，本发明的人胆囊干细胞能够被诱导分化为具有成熟肝细胞功能的细胞，用于上述用途。
本发明的有益保障及效果如下：
使用本发明提供的细胞分离和培养方法，可实现从人胆囊组织快速分离出细胞并选择性扩增胆囊上皮干细胞，胆囊干细胞可在此培养条件下连续传代生长超过100天，并且维持稳定的肝干细胞相关表型。
此外，本发明的方法无需使用磁珠或者流式分选等高成本细胞纯化手段，细胞纯度可达95％以上，大大降低了胆囊干细胞的制备成本。通过诱导分化，细胞具有摄取低密度脂蛋白、合成脂肪以及贮存糖原等成熟肝细胞的功能，为临床干细胞提供进行了有益探索。
附图说明
图1为人胆囊干细胞生长形态图。
其中：A为相差显微镜拍摄的原代细胞生长图片，分别拍摄于培养后的第一天、第三天、第五天以及第七天(标为Day 1,Day 3,Day 5,Day 7)，图中标尺为100μm；B为相差显微镜拍摄的P6代细胞在第一百天时的形态图片，图中标尺为500μm。
图2为人胆囊干细胞具有典型的肝干细胞分子表型。
通过RT-PCR检测，细胞表达A1AT，GGT，HNF4a，CD133，CK17，EPCAM，SOX9，HNF1β，LGR5，FOXA2，CFTR以及CK19。其中hGB-1和hGB-2为P1代细胞的两个独立样本，hGB-1P6表示第六代细胞，阴性对照为水(H2O)。
图3为人胆囊干细胞表达肝干细胞标志物。
免疫荧光染色显示，细胞表达CK19，EPCAM，SOX9以及HNF4a(绿色)，细胞核为DAPI染色(蓝色)，图中标尺为100μm。
图4为人胆囊干细胞染色体众数分析。
A：培养第100天细胞的典型染色体分布，染色体为吉姆萨染色，在100倍油镜下拍摄，图示为典型的细胞分裂中期染色体型态，计数为46条，图中标尺为50μm；B：不同培养天数细胞的染色体数目统计。
图5为人胆囊干细胞纯度鉴定。
流式细胞术分析结果显示，P3代的细胞(A)和P6代的细胞(B)都表达EPCAM和LGR5，并且细胞阳性率为95％以上。
图6为分化的人胆囊干细胞具有典型的成熟肝细胞功能。
A：细胞可摄入低密度脂蛋白(绿色荧光染料标记)，细胞核为DAPI染色(蓝色)；B：糖原染色显示部分细胞呈紫红色强阳性，表明细胞可贮存糖原，细胞核为苏木素染色；C：油红染色显示部分细胞为阳性(红色油滴状沉淀)，表明细胞可合成脂肪，细胞核为苏木素染色。图中标尺均为100μm。
具体实施方式
现结合实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按体积计算。
实施例1.人胆囊干细胞的快速分离
A、获取胆囊内壁黏膜层细胞
获取人胆囊组织后(医院手术摘除)，置于液体基础培养基中保存，运输至实验室；在无菌环境中取出组织，沿着组织纵向剪开并充分展开组织，用无菌PBS反复清洗组织至溶液颜色澄清无血色；将组织转移至装有预冷基础培养基的10cm培养皿中，用无菌一次性性手术刀片刮取下胆囊内壁黏膜层细胞，用基础培养基冲洗胆囊内壁，弃掉胆囊组织。
B、获取胆囊内壁黏膜层细胞单细胞
吸取含有细胞的培养基至50ml离心管，300g离心5分钟，弃上清，加入Accutase消化酶，轻轻吹打沉淀，重悬细胞，置于37℃孵育20分钟，期间每隔5分钟震荡一次，消化成单细胞。
C、胆囊干细胞筛选
向步骤B中加入液体基础培养基混匀，400g离心5～7分钟后弃上清；根据细胞量，用Matrigel基质胶重悬细胞沉淀，吹打均匀；将含有细胞的基质胶按照每孔50μL的体积量接种于24孔细胞培养板中央，使其形成圆形液滴；将培养板置于37℃细胞培养箱中15-30分钟，待其凝固后在每孔加入原代培养基，覆盖液滴，放入培养箱；培养第二天观察到有圆形透明的胆囊干细胞细胞克隆生成，并随着培养天数的增加，细胞克隆逐渐长大，如图1A所示。
上述步骤A～C中所使用的液体基础培养基的配方为Advanced DMEM/F12细胞培养基，终浓度为2mM谷氨酰胺以及终浓度为1mM HEPES缓冲液。
该原代培养基包含如下组分：液体基础培养基、1×B27添加剂、1×N2添加剂、1×青链霉素、0.1-50mM N-乙酰半胱氨酸、0.1-100ng/mL R-spondin、1-1000mM尼克酰胺、0.1-100ng/mL重组人表皮生长因子、0.1-100ng/mL重组人成纤维生长因子、0.1-100ng/mL重组人肝细胞生长因子、0.1-50μM cAMP环化酶激活剂、0.1-100μM TGFβ抑制剂、1nM-10μM的糖原合成激酶3β抑制剂、0.1-10％人血清白蛋白、0.1-100ng/mL重组人Noggin蛋白、0.1-100μM Rock抑制剂。
优选包括：液体基础培养基、1×B27添加剂、1×N2添加剂、1×青链霉素、1～3mMN-乙酰半胱氨酸、25～50ng/mL R-spondin、5～15mM尼克酰胺、25～50ng/mL重组人表皮生长因子、50～100ng/mL重组人成纤维生长因子、25～50ng/mL重组人肝细胞生长因子、5～20μM cAMP环化酶激活剂、5～10μM TGFβ抑制剂、5～10μM的糖原合成激酶3β抑制剂、8～10％人血清白蛋白、50～100ng/mL重组人Noggin蛋白、10～20μM Rock抑制剂。
实施例2.人胆囊干细胞的扩增培养
1、细胞的扩增
待细胞克隆长满(7-10天)，可进行消化传代。具体步骤为，(A)吸取上清并弃掉，加入预冷的液体基础培养基，用1ml移液枪吸取含有细胞的基质胶，反复吹打至胶体破碎，使团块均匀的分布于液体中。(B)将每三孔细胞悬液吸取至15ml离心管中，补足液体至14ml，使用25ml移液器吹打混匀细胞悬液。400g离心5分钟，尽量弃去上清。加入TrypLE消化液，置于37℃水浴锅中消化10分钟，期间适量震荡。(C)消化完成后加入液体基础培养基至14ml，混匀，400g离心5分钟，弃上清，重复清洗2遍，最后一遍弃尽上清。采用Matrigel基质胶重悬，吹打均匀后接种于24孔细胞培养板中，并置于细胞培养箱中37℃培养，待液滴凝固后在每孔加入细胞扩增培养基，覆盖液滴后放入37℃培养箱中进行培养，细胞连续传代并大量扩增(图1B)。
本部分中所采用的细胞扩增培养基比原代培养基缺少了人血清白蛋白、重组人Noggin蛋白以及Rock抑制剂三种组分，其他组分和含量相同。
2、细胞分子表型鉴定
选择不同代数的细胞，PBS清洗、离心收取沉淀，加入TRIzol试剂裂解细胞，使用RNA抽提试剂盒(Thermo公司，具体步骤见说明书)抽提细胞RNA，使用反转录试剂盒(Thermo公司，具体步骤见说明书)获得细胞cDNA。使用肝干细胞相关引物对细胞进行PCR鉴定(为常规步骤，不作具体描述)。如图2所示，细胞表达CK19、SOX9、LGR5以及EPCAM等典型肝干细胞标志物。
3、细胞免疫荧光染色
弃去细胞培养上清，加入4％PFA溶液中室温条件下固定18-24h后，换成75％酒精室温保存，常规步骤包埋、切片。切片复水、抗原修复、封闭后，一抗4℃孵育过夜，PBST清洗三遍，荧光二抗37℃孵育半小时。清洗后DAPI封片，镜检观察。如图3所示，细胞表达CK19、SOX9、HNF4a以及EPCAM等典型肝干细胞标志物(图3)。
4、细胞的染色体制备
选择不同代数分裂旺盛处于对数生长期的细胞，加入终浓度为0.2ug/ml的秋水仙素，处理4-6h；离心收集细胞(4℃，400g/5min)，PBS清洗三遍去除基质胶，注意防止细胞丢失；加入适量TrypLE酶消化5-10min，消化成单细胞后，加入PBS终止消化；收集单细胞(400g/8min)，缓慢并边摇晃边加入8ml 37℃预热的低渗0.4M KCL溶液，37℃低渗处理25min。
轻缓加入500微升固定液(甲醇：冰醋酸＝3:1)，混匀，预固定5min；离心400g/8min,去除上清，沿壁加入5ml新鲜的固定液，室温条件下固定20min，而后离心400g/8min，去除上清，必要时可重复固定1次。加入50ul新鲜固定液轻轻重悬沉淀，80-100cm高度将悬液滴加到冰玻片上，酒精灯上微烤，晾干。新鲜配制吉姆萨染液(吉姆萨原液：稀释液＝1:10)染色5-10min，流水洗掉多余染液，晾干，镜检。图4为P6代细胞典型染色体形态，计数为46条。
5、细胞流式分析检测
按照上述方法消化细胞成单细胞悬液，流式抗体孵育后使用流式细胞仪分析检测(BD FACS，常规操作)。结果显示，细胞表达LGR5和EPCAM，且纯度高达95％以上(图5)。以上结果表明本发明建立的培养体系可以从人胆囊组织中扩增干细胞，并可以在体外维持人胆囊干细胞的长期稳定增殖。
实施例3.诱导人胆囊干细胞分化为具有成熟肝细胞功能的细胞
在细胞生长密度为50％左右时，更换为肝向分化培养基。该分化培养基包括N-乙酰半胱氨酸、R-spondin、尼克酰胺、重组人表皮生长因子、重组人肝细胞生长因子、TGFβ抑制剂、地塞米松以及抑瘤素M等成熟肝细胞诱导所需的组分。
经过两周的培养，分化后的细胞可以分化具有摄取低密度脂蛋白的能力，可以贮存糖原并且合成脂肪(图6)。
以上结果表明本发明建立的肝向分化体系可以将人胆囊干细胞诱导分化为具有成熟肝细胞功能的细胞。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (8)

1.一种人胆囊干细胞的获取方法，快速从人胆囊实体组织分离得到胆囊干细胞，其特征在于，包括如下步骤：
A、获取胆囊内壁黏膜层细胞；
B、获取胆囊内壁黏膜层细胞单细胞
吸取含有胆囊内壁黏膜层细胞的液体基础培养基至离心管，300g离心5～7分钟后弃上清，加入Accutase消化酶，轻轻吹打沉淀，重悬细胞，置于37℃孵育20～30分钟，期间每隔5分钟震荡一次，消化成单细胞；
C、胆囊干细胞筛选
向步骤B中加入液体基础培养基混匀，离心去上清后采用Matrigel基质胶重悬，吹打均匀后接种于24孔细胞培养板中，并置于细胞培养箱中37℃培养，待液滴凝固后在每孔加入原代培养基，覆盖液滴后放入培养箱中进行培养，生成的圆形透明细胞克隆即为胆囊干细胞克隆，随着培养天数的增加，细胞克隆逐渐长大，
其中，所述原代培养基包含如下组分：液体基础培养基、1×B27添加剂、1×N2添加剂、1×青链霉素、0.1-50mM N-乙酰半胱氨酸、0.1-100ng/mL R-spondin、1-1000mM尼克酰胺、0.1-100ng/mL重组人表皮生长因子、0.1-100ng/mL重组人成纤维生长因子、0.1-100ng/mL重组人肝细胞生长因子、0.1-50μM cAMP环化酶激活剂、0.1-100μM TGFβ抑制剂、1nM-10μM的糖原合成激酶3β抑制剂、0.1-10％人血清白蛋白、0.1-100ng/mL重组人Noggin蛋白、0.1-100μM Rock抑制剂。
2.根据权利要求1所述的人胆囊干细胞的获取方法，其特征在于：
其中，步骤A中获取胆囊内壁黏膜层细胞的方法如下：
将获得的人胆囊组织4℃置于液体基础培养基中保存，然后在无菌环境中取出组织，并沿着组织纵向剪开并充分展开组织；用无菌PBS反复清洗组织至溶液颜色澄清无血色，然后将组织转移至装有预冷液体基础培养基的培养皿中；用无菌一次性手术刀片刮取下胆囊内壁黏膜层细胞，并用基础培养基冲洗胆囊内壁，弃掉胆囊组织，获得胆囊内壁黏膜层细胞，
步骤C中胆囊干细胞筛选的具体流程如下：
向步骤B中加入液体基础培养基混匀，400g离心5～7分钟后弃上清；根据细胞量，用Matrigel基质胶重悬细胞沉淀，吹打均匀；将含有细胞的基质胶按照每孔50μL的体积量接种于24孔细胞培养板中央，使其形成圆形液滴；将培养板置于37℃细胞培养箱中15-30分钟，待其凝固后在每孔加入原代培养基，覆盖液滴，放入培养箱；培养第二天观察到有圆形透明的胆囊干细胞细胞克隆生成，并随着培养天数的增加，细胞克隆逐渐长大。
3.根据权利要求1所述的人胆囊干细胞的获取方法，其特征在于：
其中，所述原代培养基包含如下组分：液体基础培养基、1×B27添加剂、1×N2添加剂、1×青链霉素、1～3mM N-乙酰半胱氨酸、25～50ng/mLR-spondin、5～15mM尼克酰胺、25～50ng/mL重组人表皮生长因子、50～100ng/mL重组人成纤维生长因子、25～50ng/mL重组人肝细胞生长因子、5～20μM cAMP环化酶激活剂、5～10μM TGFβ抑制剂、5～10μM的糖原合成激酶3β抑制剂、8～10％人血清白蛋白、50-100ng/mL重组人Noggin蛋白、10-20μM Rock抑制剂。
4.根据权利要求1～3任一项所述的人胆囊干细胞的获取方法，其特征在于：
其中，所述液体基础培养基的配方为Advanced DMEM/F12细胞培养基，终浓度为2mM谷氨酰胺以及终浓度为1mM HEPES缓冲液。
5.权利要求1所述的人胆囊干细胞的长期体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、待胆囊干细胞克隆长满，弃上清，加入预冷的液体基础培养基，并吹打均匀；
B、将每几孔细胞悬液为一组吸取至离心管中，补足液体基础培养基并吹打混匀细胞悬液后400g离心，弃去上清，加入TrypLE消化液，置于37℃水浴锅中消化10～15分钟，期间震荡1至两次，完成细胞消化；
C、消化完成后加入液体基础培养基混匀，离心弃上清，沉淀重复清洗后弃尽上清，采用Matrigel基质胶重悬，吹打均匀后接种于24孔细胞培养板中，并置于细胞培养箱中37℃培养，待液滴凝固后在每孔加入细胞扩增培养基，覆盖液滴后放入37℃培养箱中进行培养，细胞连续传代并大量扩增，
其中，所述细胞扩增培养基包括液体基础培养基、1×B27添加剂、1×N2添加剂、1×青链霉素、0.1-50mM N-乙酰半胱氨酸、0.1-100ng/mL R-spondin、1-1000mM尼克酰胺、0.1-100ng/mL重组人表皮生长因子、0.1-100ng/mL重组人成纤维生长因子、0.1-100ng/mL重组人肝细胞生长因子、0.1-50μM cAMP环化酶激活剂、0.1-100μM TGFβ抑制剂、1nM-10μM的糖原合成激酶3β抑制剂。
6.根据权利要求5所述的人胆囊干细胞的长期体外培养方法，其特征在于：
其中，步骤B中，将每三孔细胞悬液为一组，吸取至15mL离心管中，补足液体至14mL，使用25mL移液器吹打混匀细胞悬液，而后400g离心5分钟，弃去上清，
步骤C中，消化完成后加入液体基础培养基至14mL，混匀，400g离心5分钟，弃上清，重复清洗两遍，最后一遍弃尽上清，然后采用Matrigel基质胶重悬细胞沉淀，吹打均匀。
7.根据权利要求5所述的人胆囊干细胞的长期体外培养方法，其特征在于：
其中，所述细胞扩增培养基包括液体基础培养基、1×B27添加剂、1×N2添加剂、1×青链霉素、1～3mM N-乙酰半胱氨酸、25～50ng/mL R-spondin、5～15mM尼克酰胺、25～50ng/mL重组人表皮生长因子、50～100ng/mL重组人成纤维生长因子、25～50ng/mL重组人肝细胞生长因子、5～20μM cAMP环化酶激活剂、5～10μM TGFβ抑制剂、5～10μM的糖原合成激酶3β抑制剂。
8.根据权利要求5～7任一项所述的人胆囊干细胞的获取方法，其特征在于：
其中，所述液体基础培养基的配方为Advanced DMEM/F12细胞培养基，终浓度为2mM谷氨酰胺以及终浓度为1mM HEPES缓冲液。
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