CN115992090A - 一种肾前体细胞来源的分泌组及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞生物技术领域，具体涉及一种肾前体细胞来源的分泌组及其制备方法和应用，包括：S1：细胞复苏：将肾前体细胞复苏接种于铺有基底胶的第一培养皿中进行培养；S2：细胞传代：待肾前体细胞生长至60‑100％汇合度时，传代接种于铺有基底胶的第二培养皿中继续培养；S3：上清收集：待肾前体细胞生长至60‑100％汇合度时，弃去上清液并清洗肾前体细胞，将肾前体细胞加入DMEM培养基继续培养，随后收集肾前体细胞上清液；S4：预处理：将肾前体细胞上清液离心后，得到肾前体细胞来源的分泌组。与现有技术相比，本发明解决现有技术中缺少无创、可重复且低成本的细胞来源的问题。
Description
技术领域
本发明涉及属于细胞生物技术领域，具体涉及一种肾前体细胞来源的分泌组及其制备方法和应用。
背景技术
目前，传统的肾病治疗手段，包括药物干预、血液透析和腹膜透析，只能延缓肾病的病程进展。异体肾脏移植作为根治终末期肾病的唯一途径，却受限于有限的供体来源和强烈的异体免疫排斥反应。因此，以干细胞治疗为核心的再生医学，旨在通过干细胞移植，实现部分肾单位的原位再生或借助旁分泌效应，修复损伤的肾单位。然而，尽管基于干细胞本身的治疗策略具有良好的临床效果，其临床应用仍然面临着诸多挑战，包括长期的体外细胞培养过程中容易发生转化，细胞体内回输治疗有成瘤和免疫等安全风险，临床级细胞产品的质量控制严苛，以及存在规模化生产、存储和运输成本高昂等问题。
干细胞/祖细胞分泌的各种分子和生物因子的集合统称为分泌组，它的成分包括各种血清蛋白、生长因子、趋化因子、细胞因子、蛋白酶及细胞外囊泡。这些生物活性物质具有抗纤维化、促进血管生成、抗氧化、促进有丝分裂和抗凋亡的作用。多种急慢性临床前动物模型研究表明，干细胞/祖细胞来源的分泌组治疗可以预防或逆转各种肾脏疾病，包括提高动物的生存率、改善尿蛋白和血肌酐等生化指标、减轻肾小球和肾小管的病理损伤等。
尿液是肾脏干细胞的一种来源，分离出的尿源性肾祖细胞能够分化为肾脏中存在的多种细胞类型，包括近端、远端小管和足细胞。相比于目前常用于临床试验中治疗肾损伤的分泌组来源的间充质干细胞(MSCs)，尿源肾干细胞/祖细胞有望提供一种无创、可重复且低成本的细胞来源方式，以解决供体细胞的来源问题，更有利于分泌组治疗肾脏疾病的临床转化和商业化生产。
为此，提出一种尿源性肾干细胞/祖细胞来源的分泌组以及其在肾损伤疾病治疗中的应用很有必要。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题至少其一而提供一种肾前体细胞来源的分泌组及其制备方法和应用，以解决现有技术中缺少无创、可重复且低成本的细胞来源的问题，提供了一种具有短治疗周期、优治疗疗效的肾损伤疾病的治疗可能。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明第一方面公开了一种肾前体细胞来源的分泌组的制备方法，包括如下步骤：
S1：细胞复苏：将肾前体细胞复苏接种于铺有基质胶的第一培养皿中进行培养；
S2：细胞传代：待步骤S1中肾前体细胞生长至60-100％汇合度时，传代接种于铺有基质胶的第二培养皿中继续培养；
S3：上清收集：待步骤S2中肾前体细胞生长至60-100％汇合度时，弃去上清液并清洗肾前体细胞，将肾前体细胞加入DMEM培养基继续培养，随后收集肾前体细胞上清液；
S4：预处理：将步骤S3收集的肾前体细胞上清液离心后，得到肾前体细胞来源的分泌组。
优选地，步骤S1中，所述的肾前体细胞为由尿液中分离得到的肾干细胞或肾祖细胞。
优选地，所述的肾前体细胞优选为人源肾前体细胞，但可以不限于人源。
优选地，步骤S2中，所述的传代接种按1：3-1：6的传代比进行。
优选地，步骤S1与步骤S2中，所述的基底胶为蛋白浓度不低于1mg/mL的MatrigelMatrix。
优选地，步骤S3中，所述的清洗为采用PBS缓冲液清洗肾前体细胞至少3次。
优选地，步骤S3中，肾前体细胞加入DMEM培养基后继续培养12-48h。
优选地，步骤S2与步骤S3中，肾前体细胞生长的汇合度优选为80-90％。
优选地，步骤S4中，所述的离心为于800-1000g的离心力下离心10-20min，以去除上清液中包含的细胞碎片等多余物质。
优选地，步骤S4得到的肾前体细胞来源的分泌组，用BCA蛋白定量试剂盒检测分泌组的总蛋白量，置于-80℃分装保存。
本发明第二方面公开了一种肾前体细胞来源的分泌组，由如上任一所述的方法制备得到。
本发明第三方面公开了一种如上所述的肾前体细胞来源的分泌组在配置用于治疗肾损伤的药物中的应用。
优选地，所述的肾损伤包括急性肾损伤和慢性肾病，具体涉及肾脏肾单位的多结构病变，肾小管病变及肾小球病变。
优选地，肾损伤动物模型的动物种属包括但不限于免疫缺陷小鼠。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明制备了一种肾前体细胞来源的分泌组替代干细胞对肾脏疾病进行治疗，利用干细胞/祖细胞来源的分泌组替代干细胞，能够在保留细胞治疗益处的同时，避免出现与细胞治疗相关的致瘤性、免疫反应性和分化不良等问题。此外，由于干细胞/祖细胞分泌组成分的复合性和复杂性，也决定了其治疗效果比成分单一的化学药物更加显著。并且分泌组相对于干细胞更易于保存，能够有效降低成本。
2、本发明的肾前体细胞来源的分泌组来源于通过无创、可重复采集途径获得，如尿源性的肾前体细胞，相比于MSCs来源的分泌组更容易获取且技术成熟，易实现量产。
3、本发明的肾前体细胞来源的分泌组的提取过程相比外泌体更简单，整体步骤少，操作简便，材料来源广泛，质量和成本更容易控制。
4、本发明的肾前体细胞来源的分泌组应用时可采用皮下注射的给药方式治疗肾脏相关疾病，其比常用的静脉注射和腹腔注射更具有生物安全性，不易出现过敏现象；而且，本发明采用的肾前体细胞来源的分泌组治疗肾脏疾病的治疗周期通常为6-10天，比MSCs至少两周的治疗周期更短，且疗效更佳。
附图说明
图1为实施例1中肾脏上皮细胞的增殖能力检测结果图；
图2为实施例2中3组小鼠左肾最大横截面的H&E局部染色图；
图3为实施例2中小鼠组织切片中肾损伤标志物(Kim1)、成熟肾小管上皮标志物(ATP1A1)和细胞核(DAPI)的免疫荧光染色图；
图4为实施例2中小鼠组织切片中肾脏内源性干细胞标志物(SOX9)和细胞核(DAPI)的免疫荧光染色图；
图5为实施例2中小鼠组织切片中ATP1A1、Kim1和SOX9阳性细胞比例统计结果图；
图6为实施例2中3组小鼠血清样本中蛋白质的主成分分析图；
图7为实施例2中3组小鼠血清样本中蛋白质的分组和聚类图；
图8为实施例2中3组小鼠血清样本中群组I蛋白质的GO功能富集分析图；
图9为实施例2中3组小鼠血清样本中S100A9和HP的蛋白质相对表达量统计图；
图10为实施例3中3组小鼠左肾最大横截面的H&E局部染色图；
图11为实施例3中3组小鼠损伤的肾小球数量的半定量分析结果图；
图12为实施例3中小鼠组织切片中肾纤维化标志物(FN1)和细胞核(DAPI)的免疫荧光染色图；
图13为实施例3中小鼠组织切片中FN1阳性比例统计结果图；
图14为实施例3中小鼠组织切片中肾小球足细胞标志物(SYNPO)和细胞核(DAPI)的免疫荧光染色图；
图15为实施例3中小鼠组织切片中SYNPO阳性细胞比例统计结果图；
图16为实施例3中3组小鼠血清肌酐水平检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
如下实施例中所使用的试剂以及操作步骤，若未做特别说明，则采用本领域技术人员常规购得的市售产品以及本领域中的常规手段。
实施例1
本实施例提供一种肾前体细胞来源的分泌组的制备技术，包括如下步骤：
1)细胞复苏：将肾前体细胞复苏接种于铺有3mg/mL的Matrigel Matrix的培养皿中进行培养；
2)细胞传代：肾前体细胞生长至85％汇合时进行传代，细胞按1：4接种于铺有3mg/mL的Matrigel Matrix的培养皿中继续培养；
3)上清收集：待肾前体细胞生长到85％汇合时，弃掉原有培养基，采用DPBS清洗细胞3遍，加入DMEM培养基，培养24小时后，收集全部的细胞上清液；
4)预处理：肾前体细胞上清液于1000g离心15min去除细胞碎片等物质后，上清液转移至新的储液瓶中。
所述肾前体细胞是人尿液来源的干细胞/祖细胞。
将经过预处理的肾前体细胞上清液用于病人肾脏来源的上皮细胞(实验组)的培养。如图1所示，与对照组相比，实验组细胞的增殖能力显著增加。这表明，肾前体细胞上清液中含有可促进肾脏上皮细胞增殖的生物活性物质，其可用于损伤肾组织的再生与修复。
实施例2
本实施例提供一种肾前体细胞来源的分泌组在治疗急性肾损伤中的应用。
所述肾前体细胞来源的分泌组的制备方法参考实施例1中所述。
所述肾前体细胞来源的分泌组在治疗急性肾损伤中的应用，具体包括如下步骤：
将8周龄的NOD SCID小鼠分为三组，每组3只，分别为损伤组、治疗组和对照组。其中，损伤组小鼠通过将左侧肾动脉阻塞40分钟后释放肾动脉，进行单侧缺血再灌注损伤(UIRI)模型构建，损伤24小时后，取DMEM培养基进行皮下注射治疗；治疗组小鼠进行UIRI模型构建24小时后，取分装的肾前体细胞上清液进行解冻，并对小鼠进行皮下注射治疗；对照组小鼠进行假手术24小时后，取DMEM培养基进行皮下注射治疗。治疗后第七天，所有小鼠执行安乐死。
所述各组的给药剂量和疗程分别为200μL/每只；间隔48小时注射1次，共注射3次。
对每只小鼠的左侧肾脏进行石蜡包埋、切片及H&E染色，结果如图2所示。损伤组可见明显的肾小管上皮坏死、细胞碎片堆积和肾小管扩张；经过肾前体细胞来源的分泌组的治疗，上述病理特征均有所缓解。
通过免疫荧光染色，对肾损伤标志物(Kim1)、肾脏内源性干细胞标志物(SOX9)及成熟肾小管上皮标志物(ATP1A1)进行鉴定和分析，结果如图3、图4和图5所示。与损伤组相比，治疗组肾损伤面积减少约50％(通过采用免疫荧光染色技术对代表肾损伤的标志物Kim1+进行定量分析所得结果)，同时，大量SOX9+肾干细胞被激活(约5％)，从而促进了肾小管上皮的修复和再生(ATP1A1+)。
进一步使用基于串联标签的质谱技术，对肾前体细胞来源的分泌组治疗前后的UIRI小鼠(实施例2)血清样本中的蛋白质进行定量分析。在三组小鼠血清样本中共检测到682个蛋白质，主成分分析(PCA)结果如图6所示，损伤组和对照组的总蛋白质分布差异较大，分泌组治疗后缩小了由于损伤造成的蛋白质分布差异。采用基于Ward最小方差法的分级聚类热图，将3组中具有相似变化趋势的蛋白质进行分组和聚类，共得到4个群组(图7)。其中，群组Ⅰ的蛋白质在分泌组治疗后表达上调。将群组Ⅰ的169个蛋白质进行GO功能富集分析，发现其富集在与损伤后修复相关的功能条目，如调节活性氧的代谢、促进细胞增殖和伤口的愈合(图8)。值得注意的是，与对照组相比，治疗后群组Ⅰ的S100A9和HP两个可溶性蛋白质的表达水平上调2.2倍左右，蛋白S100A9和HP可能是肾干细胞分泌组发挥作用的有效成分(图9)。
实施例3
本实施例提供一种肾前体细胞来源的分泌组在治疗慢性肾病中的应用。
所述肾前体细胞来源的分泌组的制备方法参考实施例1中所述。
所述肾前体细胞来源的分泌组在治疗慢性肾病中的应用，具体包括如下步骤：
将8周龄的Balb/c小鼠分为三组，每组3只，分别为损伤组、治疗组和对照组。其中，损伤组小鼠通过尾静脉注射阿霉素(10.5mg/kg)进行阿霉素肾炎模型的构建，损伤两周后，取DMEM培养基进行皮下注射；治疗组小鼠构建阿霉素肾炎模型两周后，取分装的肾前体细胞上清液进行解冻，并对小鼠进行皮下注射治疗；对照组小鼠进行假手术两周后，取0.7％生理盐水进行皮下注射。治疗第七天，所有小鼠执行安乐死。
所述各组的给药剂量和疗程为500μL/每只；连续注射6天。
对每只小鼠的肾脏进行石蜡包埋、切片及H&E染色，结果如图10所示。损伤组可见明显的局部肾小球和肾小囊粘连，肾小球毛细血管堵塞，肾小球局部塌陷，肾小管管腔扩张；经过肾前体细胞来源的分泌组的治疗，上述病理特征均有所缓解。使用Image J对损伤的肾小球数量进行半定量，如图11所示，损伤组损伤肾小球为50％左右，分泌组治疗后损伤的肾小球数量显著减少。
通过免疫荧光染色对肾小球系膜基质增生和肾小管的纤维化水平(FN1+)进行评估，结果如图12和图13所示。与对照组相比，阿霉素损伤组小鼠的肾小球和肾小管纤维化的面积百分比显著增加至6％；采用肾前体细胞来源的分泌组治疗后，肾纤维化水平降低至4％左右。同时，阿霉素注射会导致肾小球足细胞的损伤，使SYNPO+面积显著降低至1％，肾前体细胞来源的分泌组治疗后，显著促进了损伤足细胞的修复和再生(图14和图15)。此外，除了显著改善肾脏的病理结构损伤，肾前体细胞来源的分泌组治疗还降低了血清肌酐水平(图16)。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种肾前体细胞来源的分泌组的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：细胞复苏：将肾前体细胞复苏接种于铺有基底胶的第一培养皿中进行培养；
S2：细胞传代：待步骤S1中肾前体细胞生长至60-100％汇合度时，传代接种于铺有基底胶的第二培养皿中继续培养；
S3：上清收集：待步骤S2中肾前体细胞生长至60-100％汇合度时，弃去上清液并清洗肾前体细胞，将肾前体细胞加入DMEM培养基继续培养，随后收集肾前体细胞上清液；
S4：预处理：将步骤S3收集的肾前体细胞上清液离心后，得到肾前体细胞来源的分泌组。
2.根据权利要求1所述的一种肾前体细胞来源的分泌组的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述的肾前体细胞为由尿液中分离得到的肾干细胞或肾祖细胞；所述的基底胶为蛋白浓度不低于1mg/mL的Matrigel Matrix。
3.根据权利要求2所述的一种肾前体细胞来源的分泌组的制备方法，其特征在于，所述的肾前体细胞为人源肾前体细胞。
4.根据权利要求1所述的一种肾前体细胞来源的分泌组的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述的传代接种按1：3-1：6的传代比进行；所述的基底胶为蛋白浓度不低于1mg/mL的Matrigel Matrix。
5.根据权利要求1所述的一种肾前体细胞来源的分泌组的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述的清洗为采用PBS缓冲液清洗肾前体细胞至少3次。
6.根据权利要求1所述的一种肾前体细胞来源的分泌组的制备方法，其特征在于，步骤S3中，肾前体细胞加入DMEM培养基后继续培养12-48小时。
7.根据权利要求1所述的一种肾前体细胞来源的分泌组的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述的离心为于800-1000g的离心力下离心10-20min。
8.根据权利要求1所述的一种肾前体细胞来源的分泌组的制备方法，其特征在于，步骤S4得到的肾前体细胞来源的分泌组置于-80℃分装保存。
9.一种肾前体细胞来源的分泌组，其特征在于，由如权利要求1-8任一所述的方法制备得到。
10.一种如权利要求9所述的肾前体细胞来源的分泌组在配置用于治疗肾损伤的药物中的应用。
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111961640A (zh) * | 2020-04-27 | 2020-11-20 | 同济大学 | 一种尿源性肾干细胞三维分化模型的构建方法及培养体系 |
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| CN111961640A (zh) * | 2020-04-27 | 2020-11-20 | 同济大学 | 一种尿源性肾干细胞三维分化模型的构建方法及培养体系 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023217121A1 (zh) * | 2022-05-10 | 2023-11-16 | 上海赛立维生物科技有限公司 | 含肾前体样细胞的生物制剂及其制备方法和应用 |
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