KR20220148184A - 에리트로포이에틴 산생능이 항진된 섬유 아세포 - Google Patents

에리트로포이에틴 산생능이 항진된 섬유 아세포 Download PDF

Info

Publication number
KR20220148184A
KR20220148184A KR1020227030017A KR20227030017A KR20220148184A KR 20220148184 A KR20220148184 A KR 20220148184A KR 1020227030017 A KR1020227030017 A KR 1020227030017A KR 20227030017 A KR20227030017 A KR 20227030017A KR 20220148184 A KR20220148184 A KR 20220148184A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fibroblasts
epo
cells
cell
positive
Prior art date
Application number
KR1020227030017A
Other languages
English (en)
Inventor
타카히로 이와미야
Original Assignee
가부시키가이샤 메토세라
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가부시키가이샤 메토세라 filed Critical 가부시키가이샤 메토세라
Publication of KR20220148184A publication Critical patent/KR20220148184A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/33—Fibroblasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2304—Interleukin-4 (IL-4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

TNF-α와 IL-4를 첨가한 배지를 이용하여 인간 섬유 아세포를 배양함으로써, 해당 섬유 아세포에서 EPO 산생능이 향상하는 것을 밝힌 결과, EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포를 발견하고, 또한, 해당 세포를 이용한 EPO 산생능 저하 상태를 개선하는 수단이나 신장병이나 신성빈혈을 치료하는 수단을 발견하였다.

Description

에리트로포이에틴 산생능이 항진된 섬유 아세포
본 발명은, 에리트로포이에틴(Erythropoietin, 이하, EPO라고도 함) 산생능이 항진된 섬유 아세포에 관한 것이다. 또한, 해당 세포의 제조 방법이나, 해당 세포를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.
EPO는 적혈구의 산생 촉진에 기여하는 호르몬이다. EPO는 대부분이 신장에서 생성되며, 그 후, 골수 내의 적아구계 전구 세포 상에 작용하여, 적혈구의 산생(분화 및 증식)을 촉진하는 역할이 있다.
최근, EPO가 갖는 적혈구 산생 촉진능이 주목받아, 신성빈혈 등의 신장 질환에 유효한 것으로 밝혀졌으며(비특허문헌 1), 실제로 의료 현장에서 EPO 제제는 신성빈혈 치료제로서 널리 사용되고 있다.
EPO는 다양한 조직에서, 항염증, 항산화, 항아포토시스, 혈관 신생 촉진 작용을 갖는다고도 알려져 있으며, EPO는 신장병(급성 신장병(AKI), 만성 신장병(CKD), 당뇨병성 신증 등)이 있는 대상에게 투여함으로써, 신장병에서 기인한 신장 기능 저하로부터 신장을 보호하는, 신장 보호 기능을 초래한다고도 보고되었다(비특허문헌 2 및 3).
또한, 발명자들은 지금까지 Vascular　cell　adhesion　molecule-1(VCAM-1, CD106) 발현 섬유 아세포가 심장 세포 배양 재료로서 유용한 것(특허문헌 1), VCAM-1 발현 심장 섬유 아세포가 심장 질환을 치료하기 위한 주사용 조성물로서 유용한 것(특허문헌 2)을 밝혔다. 그러나, VCAM-1 발현 섬유 아세포의 심장 세포 배양 재료 이외의 유용성이나, VCAM-1 발현 섬유 아세포를 포함하는 주사용 조성물의 심장 질환 이외의 질환에서의 유용성에 대해서는 아직 밝혀지지 않았다.
국제공개공보 2016/006262호 국제공개공보 2018/155651호
Nephron, 1997; 77(2): 176-185 Proc Natl Acad Sci., 2004; 101(41): 14907-14912 J Renal Inj Prev., 2013; 2(1): 29-30
본 발명은, EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포를 제공하는 것, 그리고 해당 세포를 이용한 EPO 산생능 저하 상태를 개선하는 수단을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하고자 검토를 진행하여, TNF-α와 IL-4를 첨가한 배지를 이용하여 인간 섬유 아세포를 배양함으로써, EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포를 얻을 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하의 제1 측면(발명 A)을 포함한다.
(A1) EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포.
(A2) CD106 양성인, (A1)에 기재된 섬유 아세포.
(A3) 상기 섬유 아세포가 신장 섬유 아세포인, (A1) 또는 (A2)에 기재된 세포.
(A4) EPO의 산생량이, 대조가 되는 섬유 아세포와 비교하여, 1.65배 이상 높은 것인, (A1)∼(A3) 중 어느 하나에 기재된 세포.
(A5) (A1)∼(A4) 중 어느 하나에 기재된 세포를 포함하는, 섬유 아세포 집단.
(A6) 상기 CD106 양성 섬유 아세포의 비율(세포수 기준)이, 상기 세포 집단 내에 포함되는 전체 섬유 아세포에 대해서 4.7% 이상인, (A5)에 기재된 세포 집단.
또한, 본 발명은 이하의 제2 측면(발명 B)을 포함한다.
(B1) EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포의 제조 방법으로서,
섬유 아세포에 TNF-α 및 IL-4를 접촉시키는 것, 상기 접촉시킨 섬유 아세포를 EPO 산생능이 항진될 수 있는 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
(B2) 상기 EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포가 CD106 양성인, (B1)에 기재된 방법.
(B3) 항CD106 항체를 이용하여, CD106 양성인 섬유 아세포를 선택 또는 농축시키는 것을 추가로 포함하는, (B2)에 기재된 방법.
(B4) 상기 섬유 아세포가 신장 섬유 아세포인, (B1)∼(B3) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(B5) (B1)∼(B4) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법에 따라 얻을 수 있는, EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포.
(B6) (B5)에 기재된 세포를 포함하는, 섬유 아세포 집단.
또한, 본 발명은 이하의 제3 측면(발명 C)을 포함한다.
(C1) (A1)∼(A4) 및 (B5) 중 어느 하나에 기재된 세포, 또는 (A5), (A6) 및 (B6) 중 어느 하나에 기재된 세포 집단을 포함하는, 의약 조성물.
(C2) EPO 산생능이 저하되어 있는 상태를 개선하기 위한, (C1)에 기재된 의약 조성물.
(C3) 신장병이 있는 환자에게 투여하기 위한, (C1)에 기재된 의약 조성물.
(C4) 상기 신장병이 만성 신장병(CKD)인, (C3)에 기재된 의약 조성물.
(C5) 신성빈혈이 있는 환자에게 투여하기 위한, (C1)에 기재된 의약 조성물.
(C6) 주사용 조성물인, (C1)∼(C5) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
(C7) 상기 세포 집단이 평면형 또는 입체형 세포 조직으로서 구축된 것인, (C1)∼(C5) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
또한, 본 발명은 이하의 제4 측면(발명 D)을 포함한다.
(D1) 대상에 있어서, 에리트로포이에틴 산생능이 저하되어 있는 상태를 개선하는 방법으로서, (A1)∼(A4) 및 (B5) 중 어느 하나에 기재된 세포, (A5), (A6) 및 (B6) 중 어느 하나에 기재된 세포 집단, 또는 (C1)에 기재된 조성물을 해당 대상에게 투여 또는 이식하는 것을 포함하는, 방법.
(D2) 대상에 있어서, 신장병을 치료하는 방법으로서, (A1)∼(A4) 및 (B5) 중 어느 하나에 기재된 세포, (A5), (A6) 및 (B6) 중 어느 하나에 기재된 세포 집단, 또는 (C1)에 기재된 조성물을 해당 대상에게 투여 또는 이식하는 것을 포함하는, 방법.
(D3) 대상에 있어서, 만성 신장병(CKD)을 치료하는 방법으로서, (A1)∼(A4) 및 (B5) 중 어느 하나에 기재된 세포, (A5), (A6) 및 (B6) 중 어느 하나에 기재된 세포 집단, 또는 (C1)에 기재된 조성물을 해당 대상에게 투여 또는 이식하는 것을 포함하는, 방법.
(D4) 대상에 있어서, 신성빈혈을 치료하는 방법으로서, (A1)∼(A4) 및 (B5) 중 어느 하나에 기재된 세포, (A5), (A6) 및 (B6) 중 어느 하나에 기재된 세포 집단, 또는 (C1)에 기재된 조성물을 해당 대상에게 투여 또는 이식하는 것을 포함하는, 방법.
(D5) 대상에게 EPO를 투여하는 방법으로서, EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포를 해당 대상에게 투여 또는 이식하는 것을 포함하는, 방법.
또한, 본 발명은 이하의 제5 측면(발명 E)을 포함한다.
(E1) (A1)∼(A4) 및 (B5) 중 어느 하나에 기재된 세포, (A5), (A6) 및 (B6) 중 어느 하나에 기재된 세포 집단, 또는 (C1)에 기재된 조성물의 신장 조직 또는 그 주변 영역에 투여하기 위한 주사제로서의 사용.
(E2) (A1)∼(A4) 및 (B5) 중 어느 하나에 기재된 세포, (A5), (A6) 및 (B6) 중 어느 하나에 기재된 세포 집단, 또는 (C1)에 기재된 조성물의 신장 조직 또는 그 주변 영역에 이식하기 위한 이식 재료로서의 사용.
본 발명에 의해, EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포를 제공할 수 있으며, 또한, 해당 세포를 이용한 EPO 산생능 저하 상태를 개선하는 수단이나 신장병이나 신성빈혈을 치료하는 수단을 제공할 수 있었다.
도 1a는 신장 섬유 아세포의 특징을 도시하는 도면이다. A는 배양한 신장 섬유 아세포의 현미경 사진도이다(스케일 바: 500㎛).
도 1b는 신장 섬유 아세포의 특징을 도시하는 도면이다. B는 actin　alpha 2, smooth　muscle(α-SMA), CD106 및 EPO의 발현을 나타내는 플로우 사이토메트리의 해석도이다. 무처치(Non　Treatment(NT)) 세포 또는 TNF-α 및 IL-4 첨가(＋TNF-a and　IL-4(UP)) 세포에서 CD106 양성 영역을 각각 게이팅하고, 게이팅 후의 세포를 각각 CD106 양성 NT(CD106-positive　in　NT) 세포 또는 CD106 양성 UP(CD106-positive　in　UP) 세포로 하였다. 회색 히스토그램은 네거티브 컨트롤로서의 아이소타이프 컨트롤 항체에 의한 형광 강도를 나타내고, 흑색 히스토그램은 α-SMA, CD106 또는 EPO에 대한 표지 항체에 의한 형광 강도를 나타낸다.
도 2는 무처치(Non　Treatment(NT)) 세포 또는 TNF-α 및 IL-4 첨가(＋TNF-a and　IL-4(UP)) 세포에 있어서, EPO 포지티브 영역을 게이팅하고, 게이팅 후의 세포에서 CD106 양성율을 조사한 플로우 사이토메트리의 해석도이다. 회색 히스토그램은 네거티브 컨트롤로서의 아이소타이프 컨트롤 항체에 의한 형광 강도를 나타내고, 흑색 히스토그램은 CD106 또는 EPO에 대한 표지 항체에 의한 형광 강도를 나타낸다.
도 3은 각종 섬유 아세포 배양 상청액 중의 EPO 함유량의 상대 비교를 도시하는 도면이다. A는 무처치(Non　Treatment(NT)) 세포에서 EPO 산생량을 1로 하여, TNF-α 및 IL-4 첨가(UP) 세포에서 EPO 산생량을 상대치로 나타냈다. B는 각종 섬유 아세포 배양 상청액 중의 EPO 함유량을 나타낸다(평균 광학 농도 Average　OD). C는 검량선(calibration　curve)을 나타낸다. D는 각종 섬유 아세포 배양 상청액 중의 EPO 함유량을 나타낸다(mIU/㎖).
이하, 본 발명에 대해서 구체적 실시형태를 이용하여 상세하게 설명하겠지만, 본 발명은 도시된 구체적 실시형태에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시형태는 EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포이다.
본 실시형태의 섬유 아세포는 바람직하게는 CD106 양성이다. CD106는 VCAM-1이라고도 부르며, 혈관 내피 세포 등에 발현되는 세포 접착 분자로서 기지의 단백질이다.
섬유 아세포의 유래에 제한은 없으며, 배성간세포(ES 세포), 인공 다능성 간세포(iPS 세포) 및 Muse 세포 등의 다능성 간세포나, 간엽계 간세포 등의 성체 간세포를 분화시켜서 사용해도 된다. 또한, 동물(인간을 포함함)에게서 채취한 프라이머리 세포를 사용해도 되고, 주화 세포를 사용해도 된다. 섬유 아세포는 신장 유래인 것이 바람직하다.
인간 유래 섬유 아세포에 있어서, CD106 양성 섬유 아세포의 비율은 낮아, 천연 상태에서, 신장 유래 섬유 아세포의 경우, 많더라도 4.7%(세포수 기준) 정도이다.
따라서, 후술하는 제조 방법으로 인간 유래 CD106 양성 섬유 아세포의 비율을 향상시킨 인간 유래 섬유 아세포 집단에 대해서도, 본 실시형태에 포함될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 다른 형태로서, 전체 인간 유래 섬유 아세포에서 차지하는 인간 유래 CD106 양성 섬유 아세포의 비율(세포수 기준)이 4.7% 이상인, 인간 유래 섬유 아세포 집단일 수 있다. 또한, 본 실시형태의 인간 유래 섬유 아세포 집단 중, 전체 섬유 아세포에서 차지하는 CD106 양성 섬유 아세포의 비율(세포수 기준)은 5% 이상일 수 있고, 10% 이상일 수 있고, 15% 이상일 수 있고, 20% 이상일 수 있고, 25% 이상일 수 있고, 30% 이상일 수 있고, 40% 이상일 수 있고, 50% 이상일 수 있고, 60% 이상일 수 있고, 70% 이상일 수 있고, 80% 이상일 수 있고, 90% 이상일 수 있고, 100%일 수 있다. 또한, CD106 양성인 것으로 알려진 세포를 선택함으로써, 세포 선별 처리를 생략할 수 있다.
또한, 인간 유래 섬유 아세포는 천연 상태에서, EPO 포지티브(이하, EPO＋라고도 함) 세포의 비율은 낮아, 신장 유래 섬유 아세포의 경우, 많더라도 40.7%(세포수 기준) 정도이다. 또한, EPO는 조혈 호르몬이지, 세포막 발현형 단백질은 아니기 때문에, EPO를 지표로 하여 세포를 선택 또는 농축시키는 것은 곤란하다.
그 때문에, 예를 들면, 후술하는 섬유 아세포의 제조 방법에 따라 인간 유래 CD106 양성 섬유 아세포를 선택 또는 농축시킴으로써, 섬유 아세포 집단에서 EPO＋ 섬유 아세포의 비율을 증가시킬 수 있다. 또 다른 방법으로 섬유 아세포 집단에서 EPO＋ 섬유 아세포의 비율을 증가시켜도 된다. 본 실시형태의 인간 유래 섬유 아세포 집단 중, 전체 섬유 아세포에서 차지하는 EPO＋ 섬유 아세포의 비율(세포수 기준)은 40.7% 이상일 수 있고, 45% 이상일 수 있고, 50% 이상일 수 있고, 60% 이상일 수 있고, 70% 이상일 수 있고, 80% 이상일 수 있고, 90% 이상일 수 있고, 100%일 수 있다.
EPO 산생능의 항진이란, 예를 들면, 대조가 되는 섬유 아세포에서 EPO 산생량과 비교하여, EPO 산생량이 증가하는 것을 말한다. 대조가 되는 섬유 아세포는 특별히 한정되지 않지만, 천연 신장 섬유 아세포로 할 수 있다. EPO 산생량을 비교하기 위한 측정 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 당업자에게 기지의 방법인 플로우 사이토메트리에 의해 EPO 포지티브 세포 비율을 측정해도 되고, ELISA법으로 산생된 EPO의 농도를 측정해도 된다.
플로우 사이토메트리를 이용한 경우에는, 예를 들면, 본 실시형태의 인간 유래 섬유 아세포 집단 중, 전체 섬유 아세포에서 차지하는 EPO＋ 섬유 아세포의 비율(세포수 기준)이 40.7% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 100%일 때, EPO 산생능이 항진되었다고 판단 가능하다.
ELISA법을 이용한 경우에는, 예를 들면, 본 실시형태의 인간 유래 섬유 아세포 집단의 배양 상청에 포함되는 EPO량이 동일 조건에서 배양한 대조가 되는 섬유 아세포와 비교하여, 1.65배 이상, 2.0배 이상, 3.0배 이상, 5.0배 이상, 또는 10.0배 이상 증가하였을 때에 EPO 산생능이 항진되었다고 판단 가능하다.
또한, 예를 들면, 섬유 아세포 9.2×105cells을 5일간 배양하여 배양 상청을 3㎖ 회수한 후, Amicon-Ultra-2 등으로 100배 농축한 배양 상청 농축액 중에서 EPO의 농도가 5.08mIU/㎖ 초과일 때, EPO 산생능이 항진되었다고 판단해도 되고, 5.10mIU/㎖ 이상, 6.00mIU/㎖ 이상, 7.00mIU/㎖ 이상, 8.00mIU/㎖ 이상, 8.39mIU/㎖ 이상, 10.0mIU/㎖ 이상, 20.0mIU/㎖ 이상, 50.0mIU/㎖ 이상, 100.0mIU/㎖ 이상일 때, EPO 산생능이 항진되었다고 판단해도 된다.
또한, 예를 들면, 섬유 아세포 9.2×105cells을 5일간 배양하여 배양 상청을 3㎖ 회수한 후의 미농축 배양 상청 중에서 EPO의 농도가 5.08E-02mIU/㎖ 초과일 때, EPO 산생능이 항진되었다고 판단해도 되고, 5.10E-02mIU/㎖ 이상, 6.00E-02mIU/㎖ 이상, 7.00E-02mIU/㎖ 이상, 8.00E-02mIU/㎖ 이상, 8.39E-02mIU/㎖ 이상, 10.0E-02mIU/㎖ 이상, 20.0E-02mIU/㎖ 이상, 50.0E-02mIU/㎖ 이상, 100.0E-02mIU/㎖ 이상일 때, EPO 산생능이 항진되었다고 판단해도 된다.
또한, 예를 들면, 섬유 아세포 9.2×105cells을 5일간 배양하여 배양 상청을 3㎖ 회수한 후의 미농축 배양 상청 중에서 EPO량이 1dish(3㎖)당 1.52E-01mIU 초과일 때, EPO 산생능이 항진되었다고 판단해도 되고, 1.60E-01mIU 이상, 2.00E-01mIU 이상, 2.52E-01mIU 이상, 3.00E-01mIU 이상, 4.00E-01mIU 이상, 5.00E-01mIU 이상, 10.0E-01mIU 이상, 20.0E-01mIU 이상, 50.0E-01mIU 이상일 때, EPO 산생능이 항진되었다고 판단해도 된다.
또한, 예를 들면, 섬유 아세포 9.2×105cells을 5일간 배양하여 배양 상청을 3㎖ 회수한 후의 미농축 배양 상청 중에서, 1세포당 EPO 산생량이 1.66E-07mIU 초과일 때, EPO 산생능이 항진되었다고 판단해도 되고, 1.70E-07mIU 이상, 1.80E-07mIU 이상, 1.90E-07mIU 이상, 2.00E-07mIU 이상, 2.74E-07mIU 이상, 3.00E-07mIU 이상, 5.00E-07mIU 이상, 10.0E-07mIU 이상, 20.0E-07mIU 이상일 때, EPO 산생능이 항진되었다고 판단해도 된다.
본 실시형태는, EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포를 포함하는, 섬유 아세포 집단일 수 있다. 해당 섬유 아세포는 바람직하게는 CD106 양성이다.
본 실시형태의 세포 집단은 CD106 양성 섬유 아세포 이외에, 다른 섬유 아세포나 다른 성분을 포함해도 되고, 다른 섬유 아세포를 포함할 경우, 세포 집단 내의 세포 전량에 대하여, CD106 양성 섬유 아세포의 비율은 세포수 기준으로 0.03% 이상일 수 있고, 0.1% 이상일 수 있고, 1% 이상일 수 있고, 2% 이상일 수 있고, 4% 이상일 수 있고, 5% 이상일 수 있고, 10% 이상일 수 있고, 20% 이상일 수 있고, 30% 이상일 수 있고, 40% 이상일 수 있고, 50% 이상일 수 있고, 60% 이상일 수 있고, 70% 이상일 수 있고, 80% 이상일 수 있고, 90% 이상일 수 있고, 95% 이상일 수 있고, 98% 이상일 수 있고, 99% 이상일 수 있다.
섬유 아세포의 제조 방법을 설명한다. 섬유 아세포 제조에 관해서는, 본 발명자들의 기존 정보(특허문헌 1)를 참조하여, 이것을 따라도 된다.
(섬유 아세포 준비)
섬유 아세포 준비에 있어서, 섬유 아세포의 유래는 특별히 한정되지는 않으며, 이미 서술한 바와 같다. 한편, 자기 유래 세포일 수 있으며, 예를 들면, 신장 질환을 앓고 있는 환자의 신장 조직으로부터 단리한 신장 섬유 아세포나, 환자의 성체(체성) 간세포를 분화시켜 단리한 신장 섬유 아세포를 준비한다. 또한, 자기 세포 유래 iPS 세포 등의 다능성 간세포를 분화시켜서, 회수한 섬유 아세포일 수 있다. 더불어, 자기 이외의 세포일 수 있으며, 예를 들면, 신장 세포를 제공하는 도너 유래 신장 조직이나, 동물 등을 이용하여 제작한 신장 조직으로부터 단리한 신장 섬유 아세포나, 도너의 성체(체성) 간세포를 분화시켜 단리한 신장 섬유 아세포를 준비한다. 또한, 도너 유래 iPS 세포나 ES 세포 등의 다능성 간세포를 분화시켜서, 회수한 섬유 아세포일 수 있다.
(섬유 아세포 분리)
준비된 섬유 아세포는 전형적으로는 디스파제, 콜라게나아제와 같은 효소에 의해 처리됨으로써 분리될 수 있다. 분리는 디스파제, 콜라게나아제와 같은 효소에 의해 실시되는 것 외에, 필요시되는 분리가 가능하다면, 기타 처리, 예를 들면, 기계적 처리일 수 있다.
(CD106 양성 섬유 아세포의 선택 또는 농축)
섬유 아세포가 CD106 양성인 경우, 섬유 아세포는 CD106 양성 섬유 아세포의 선택 또는 농축에 제공해도 된다. 선택 또는 농축을 거치지 않고서도 CD106 양성 섬유 아세포를 입수 가능한 경우에는, 선택 또는 농축은 생략할 수 있다. CD106 양성 섬유 아세포의 선택 또는 농축에는, 항CD106 항체(항VCAM-1 항체)를 이용한 플로우 사이토메트리법, 자기(磁氣) 비즈법, 친화 컬럼(affinity column)법, 또는 패닝법 등의 방법이 예시된다. 구체적으로는, 자기 세포 분리법(MACS)이나 형광 표지 세포 분리법(FACS) 등을 이용할 수 있다. 항CD106 항체는 시판하는 것을 사용해도 되고, 또한, 기지의 방법으로 제작한 것을 사용해도 된다. 또한, 단클론 항체 또는 다클론 항체 중 어느 것도 사용해도 되지만, 특이성 관점에서, 단클론 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 나아가서는, 약제 내성 유전자를 도입하여, CD106 음성 섬유 아세포를 제외함으로써, CD106 양성 섬유 아세포를 얻어도 된다. 또한, 형광 단백질 코드 유전자를 도입하여, 형광 단백질 포지티브 세포를, FACS 등을 이용하여 단리해도 된다. 또한, 리얼 타임 PCR, 차세대 시퀸서 및 in　situ 부합법(In Situ Hybridization) 등의 수법을 이용하여, 세포에서 CD106 유전자의 발현을 확인하여, CD106 유전자의 발현군을 단리해도 된다.
(섬유 아세포 배양)
섬유 아세포는, 원하는 세포수가 될 때까지, 및/또는 원하는 기능이 구비될 때까지 등의 목적으로 배양에 제공되어도 된다. 배양 조건에 제한은 없으며, 기지의 세포 배양 방법으로 실시해도 된다.
배양에 사용되는 배지는 배양하는 세포의 종류 등에 따라 적절히 설정 가능하지만, 예를 들면, DMEM, α-MEM, RPMI-1640, HFDM-1(＋) 등이 사용 가능하다. 해당 배지에 FCS나 FBS 등의 영양 물질이나 증식 인자, 사이토카인, 항생 물질 등을 첨가해도 된다. 또한, TNF-α 및/또는 IL-4를 포함하는 배지에서 배양해도 된다.
배양 기간은, 배양한 세포가 원하는 세포수가 될 때까지, 및/또는 배양한 세포가 원하는 기능이 구비될 때까지 등의 목적에 따라 일수를 적절히 설정 가능하다. 예를 들면, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월 등의 기간을 들 수 있다.
배양 온도는 배양하는 세포의 종류에 맞춰서 적절히 설정 가능하지만, 예를 들면, 10℃ 이상, 15℃ 이상, 20℃ 이상, 25℃ 이상, 30℃ 이상일 수 있고, 또한, 60℃ 이하, 55℃ 이하, 50℃ 이하, 45℃ 이하, 40℃ 이하일 수 있다.
배양은 여러 번 실시해도 된다. 예를 들면, 선택 또는 농축에 의해 원하는 섬유 아세포의 순도를 향상시켜, 그때마다 배양을 실시할 수 있다.
(섬유 아세포 회수)
배양한 섬유 아세포의 회수는, 트립신 등의 프로테아제에 의해 세포를 박리하여 회수해도 되지만, 온도 응답성 배양 접시를 사용하여, 온도 변화로 세포를 박리시켜, 회수해도 되고, 셀 스크레퍼 등의 기구를 사용하여 세포를 박리시켜, 회수해도 된다.
본 발명의 다른 형태는 EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포의 제조 방법으로서, 섬유 아세포에 TNF-α 및 IL-4를 접촉시키는 것, 상기 접촉시킨 섬유 아세포를, EPO 산생능이 항진될 수 있는 조건하에서 배양하는 것을 포함하는, EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포의 제조 방법이다.
해당 섬유 아세포는 바람직하게는 CD106 양성이며, 이 경우, 본 실시형태의 제조 방법은 항CD106 항체를 이용하여, CD106 양성 섬유 아세포를 선택 또는 농축하는 것을 포함해도 된다.
섬유 아세포와, TNF-α 및 IL-4의 접촉 방법은 EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포의 유도, 또는 EPO 산생이 항진된 CD106 양성 섬유 아세포의 유도를 현저하게 해치지 않는 한, 특별히 한정되지 않으며, 전형적으로는 섬유 아세포를 포함하는 배지에 TNF-α 및 IL-4를 첨가하는 것이지만, 이것에 한정되지 않는다. TNF-α 및 IL-4는 각각 별개로 섬유 아세포와 접촉시켜도 되고, 동시에 접촉시켜도 된다. TNF-α 및 IL-4를 동시에 접촉시키는 방법으로서는, TNF-α 및 IL-4를 혼합한 후에 섬유 아세포에 첨가해도 된다. 예를 들면, TNF-α 및 IL-4를 물, 배지, 혈청, 또는 디메틸설폭시드(DMSO)에 용해시킨 후에, 배지에 첨가해도 된다.
본 실시형태에서는, TNF-α 및 IL-4를 첨가한 배지에서 섬유 아세포를 배양할 수 있기 때문에, 섬유 아세포에서 CD106의 발현 레벨을 유지한 채로 섬유 아세포를 배양 가능하다. 그 때문에, 높은 CD106 발현 레벨을 갖는 섬유 아세포를 제조할 수 있다.
TNF-α 및 IL-4를 배지(㎖)에 첨가할 경우, TNF-α의 첨가량은 특별히 한정되지 않지만, 통상 0.1ng/㎖ 이상이며, 0.5ng/㎖ 이상일 수 있고, 1ng/㎖ 이상일 수 있고, 10ng/㎖ 이상일 수 있고, 50ng/㎖ 이상일 수 있다. 상한은 특별히 한정되지 않으며, 통상 500ng/㎖ 이하이고, 100ng/㎖ 이하일 수 있다.
또한, IL-4의 첨가량은 특별히 한정되지 않지만, 통상 0.1ng/㎖ 이상이며, 0.5ng/㎖ 이상일 수 있고, 1ng/㎖ 이상일 수 있고, 2ng/㎖ 이상일 수 있다. 상한은 특별히 한정되지 않으며, 통상 10ng/㎖ 이하이고, 5ng/㎖ 이하일 수 있고, 1ng/㎖ 이하일 수 있다.
첨가하는 TNF-α와 IL-4의 비(중량비)는 TNF-α:IL-4에서 통상 10000:1∼1:1이고, 50000:1∼10:1일 수 있다. 또한, 1:1∼1:10000이고, 1:10∼1:50000일 수 있다.
TNF-α 및 IL-4를 접촉시킨 섬유 아세포를 추가 배양함으로써, EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포를 제조할 수 있다.
섬유 아세포의 배양은 섬유 아세포가 EPO 산생능이 항진될 수 있는 조건하라면, 특별히 한정되지 않으며, 기지의 세포 배양 방법으로 실시해도 된다. 또한, CD106 양성이 될 수 있는 조건하인 것이 바람직하다. 상기 섬유 아세포의 제조 방법에서의 (섬유 아세포 배양) 항에 기재되는 방법이 예시된다.
배양한 섬유 아세포의 회수는 상기 섬유 아세포의 제조 방법에서의 (섬유 아세포 회수) 항에 기재되는 방법이 예시된다.
섬유 아세포가 CD106 양성인 경우, CD106 양성 섬유 아세포의 선택 또는 농축은 항CD106 항체를 이용하는 방법으로 실시할 수 있다. 선택 또는 농축은 어느 타이밍에 실시해도 된다. TNF-α 및 IL-4의 접촉 전이어도 되고, TNF-α 및 IL-4의 접촉 후, 배양 전일 수 있고, 배양 후일 수 있다.
상기 섬유 아세포의 제조 방법에서의 (CD106 양성 섬유 아세포의 선택 및 농축) 항에 기재되는 방법이 예시된다.
항CD106 항체를 이용하여 선택 또는 농축함으로써, 섬유 아세포에서 CD106 양성 섬유 아세포의 비율을 증가시켜, 질환 치료 효과가 높은 EPO 산생능이 항진된 CD106 양성 섬유 아세포를 포함하는 세포 집단을 얻을 수 있다.
본 실시형태의 EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포의 제조 방법으로, EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포를 얻을 수 있으며, 해당 섬유 아세포 및 해당 세포를 포함하는 섬유 아세포 집단이 본 발명의 다른 실시형태이다. 섬유 아세포, 특히, 신장 섬유 아세포는 TNF-α 및 IL-4에 의해 자극받음으로써, CD106 발현 세포 비율(세포수 기준)이 높아지고, EPO 발현 세포 비율(세포수 기준)이 높아지기 때문에, EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포는 EPO 산생응이 저하되는 질환에 대한 치료용 조성물로서 적합하게 사용 가능하다.
본 발명의 다른 형태는, 상기 EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포 또는 그 세포 집단을 포함하는, 의약 조성물이다. 해당 섬유 아세포는 바람직하게는 CD106 양성이다.
본 실시형태의 의약 조성물을 생체 내에 투여 또는 이식함으로써, 생체 내에서 EPO를 고효율로 산생시킬 수 있다. 그 때문에, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 신장 조직의 장해, 결손, 기능 부전에서 기인한 EPO 산생능이 저하되어 있는 상태를 개선할 수 있다. 또한, 신장병이나 신성빈혈이 있는 환자에게 투여할 수 있는 것일 수 있고, 이로써, 신장병이나 신성빈혈을 치료할 수 있는 것일 수 있다. 신장병으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 급성 신장병(AKI), 만성 신장병(CKD), 당뇨병성 신증, 급성 사구체신염(급성 신염), 만성 사구체신염(만성 신염), 급성 진행성 사구체신염, 신증후군, 급성 신부전, 만성 신부전을 들 수 있다. 바람직하게는, 신장병은 만성 신장병(CKD)이다. 더욱 바람직하게는, 신장병은 만성 신부전이다. 또한, 신부전이란, 신장의 기능이 정상 시와 비교하여 저하된 상태이고, 본 실시형태에서 특히, 신장의 기능이 정상 시와 비교하여 30% 이하로 저하된 상태를 말한다.
본 실시형태의 의약 조성물을 생체에 투여 또는 이식하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 주사로 투여 가능하다. 의약 조성물의 투여 부위는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 의약 조성물을 신장 조직 및/또는 그 주변 영역(예를 들면, 신피막하 등)에 직접 투여 또는 이식함으로써, 상기 질환 상태의 개선이나 신성빈혈의 치료가 가능해진다. 또한, 의약 조성물은 정맥, 동맥, 림프절, 림프관, 골수, 피하, 음경 해면체, 복강 내에 투여해도 된다. 정맥, 동맥, 림프관에 대한 투여는 맥관 내에 대한 주사에 의한 것이어도 되고, 카테터에 의해 주입되는 것이어도 되며, 기타 기지의 수법을 이용해도 된다.
주사 방법은 특별히 한정되지 않으며, 유침 주사, 무침 주사 등, 기지의 주사 수법을 적용할 수 있고, 주입에 사용하는 카테터의 방법도 기지의 방법을 적용할 수 있으며, 특별히 한정되지 않는다.
또한, 본 실시형태의 의약 조성물은 특별히 한정되지 않지만, 인공 장기 재료로서 생체에 적용되는 것이어도 되며, 예를 들면, 그 인공 장기 재료는 세포 집단이 평면형 또는 입체형 세포 조직으로서 구축된 것이어도 된다. 이 평면형 또는 입체형 세포 조직은 섬유 아세포 집단을 단독으로 배양한 것이어도 되며, 또는 섬유 아세포 집단과 다른 세포, 예를 들면, 신장 세포를 공배양한 뒤에 평면형 또는 입체형 세포 조직으로 한 것이어도 된다. 평면형 또는 입체형 세포 조직으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 세포 시트나 셀 파이버, 3D 프린터로 형성된 조직 등이 예시된다.
본 실시형태에 있어서, 평면형 또는 입체형 세포 조직의 크기나 형상은 괴사된 신조직 및/또는 그 주변 영역에 적용 가능한 한, 특별히 한정되지 않는다. 또한, 평면형이란, 단층 또는 복수 층 중 어느 것이어도 된다.
또한, 세포 배양에서 배지 조성, 온도, 습도와 같은 조건은 EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포를 배양할 수 있으며, 또한, 평면형 또는 입체형 세포 조직을 구축 가능한 한, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 상기 섬유 아세포의 제조 방법에서의 (섬유 아세포 배양) 및/또는 (섬유 아세포 회수) 항에 기재한 배양 조건에 준한 것이 예시 가능하다.
이러한 평면형 또는 입체형 세포 조직을 괴사된 신장 조직 및/또는 그 주변 영역에 적용함으로써, 또는 인공 장기로서 괴사된 신장 조직 및/또는 그 주변 영역과 교환함으로써, 신장병이나 신성빈혈을 치료할 수 있다.
의약 조성물에 포함되는 EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포의 비율은, 환자에 대한 투여 또는 이식 양태 등에 근거하여 적절히 설정되며, 유효 성분으로서 치료상 유효량의 EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포가 포함되어 있으면 된다.
의약 조성물 중에 다른 섬유 아세포를 포함할 경우, 의약 조성물에 포함되는 섬유 아세포 전량에 대해서, EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포의 비율은 세포수 기준으로 0.03% 이상일 수 있고, 0.1% 이상일 수 있고, 1% 이상일 수 있고, 2% 이상일 수 있고, 4% 이상일 수 있고, 5% 이상일 수 있고, 10% 이상일 수 있고, 20% 이상일 수 있고, 30% 이상일 수 있고, 40% 이상일 수 있고, 50% 이상일 수 있고, 60% 이상일 수 있고, 70% 이상일 수 있고, 80% 이상일 수 있고, 90% 이상일 수 있고, 95% 이상일 수 있고, 98% 이상일 수 있고, 99% 이상일 수 있다.
또한, 의약 조성물에 포함되는 EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포의 수는 예를 들면, 1.0×102cells/㎖ 이상, 1.0×103cells/㎖ 이상, 1.0×104cells/㎖ 이상, 1.0×105cells/㎖ 이상, 1.0×106cells/㎖ 이상, 5.0×106cells/㎖ 이상, 1.0×107cells/㎖ 이상으로 할 수 있다. 주사용 조성물에 포함되는 EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포의 수는, 질환의 정도에 따라 더욱 증감시켜도 된다.
의약 조성물에 의한 상기 치료 및/또는 상기 개선 효과의 확인 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 조성물 투여 또는 이식 전과 비교하여 조성물 투여 또는 이식 후의 혈중 EPO 농도가 증가하는 것이나, 조성물 투여 또는 이식 전과 비교하여 조성물 투여 또는 이식 후의 적혈구량이 증가하는 것이 예시된다.
의약 조성물에 의한 상기 치료 및/또는 상기 개선 효과의 확인 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 조성물 투여 또는 이식 전과 비교하여 조성물 투여 또는 이식 후의 혈중 크레아티닌(Cr) 값이 감소하는 것이나, 조성물 투여 또는 이식 전과 비교하여 조성물 투여 또는 이식 후의 요소 질소(BUN) 값이 감소하는 것이 예시된다.
의약 조성물에 의한 상기 치료 및/또는 상기 개선 효과의 확인 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 조성물 투여 또는 이식 전과 비교하여 조성물 투여 또는 이식 후의 혈중 크레아티닌·클리어런스(CCr) 값이 상승하는 것이나, 조성물 투여 또는 이식 전과 비교하여 사구체 여과량(GFR) 값이 상승하는 것이 예시된다.
의약 조성물에 의한 상기 치료 및/또는 상기 개선 효과의 확인 방법은 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 조성물 투여 또는 이식 전과 비교하여 조성물 투여 또는 이식 후 오줌 내 요단백이 감소하는 것이나, 조성물 투여 또는 이식 전과 비교하여 요잠혈이 감소하는 것이 예시된다.
의약 조성물은 의약 조성물로서 생리학적으로 허용되는 다른 성분을 함유해도 된다. 이러한 다른 성분으로서는, 생리 식염수, 세포 보존액, 세포 배양액, 하이드로 겔, 세포 외 매트릭스, 동결 보존액 등을 들 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태로서는, 상기 EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포, 그 세포 집단 또는 이것들을 포함하는 의약 조성물을, EPO 산생능이 저하되어 있는 상태를 갖는 대상에게 투여 또는 이식함으로써 EPO 산생능이 저하되어 있는 상태를 개선하는 방법일 수 있다. 본 실시형태의 섬유 아세포는 바람직하게는 CD106 양성이다.
또한, 본 발명의 다른 실시형태로서는, 상기 EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포, 그 세포 집단 또는 이것들을 포함하는 의약 조성물을, 신장병이 있는 대상에게 투여 또는 이식함으로써, 신장병을 치료하거나 또는 신장을 보호하는 방법일 수 있다. 본 실시형태의 섬유 아세포는 바람직하게는 CD106 양성이다.
또한, 본 발명의 다른 실시형태로서는, 상기 EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포, 그 세포 집단 또는 이들을 포함하는 의약 조성물을, 신성빈혈이 있는 대상에게 투여 또는 이식함으로써 신성빈혈을 치료하는 방법일 수 있다. 본 실시형태의 섬유 아세포는 바람직하게는 CD106 양성이다.
또한, 본 발명의 다른 실시형태로서는, 상기 EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포, 그 세포 집단 또는 이들을 포함하는 조성물의 신장 조직 및/또는 그 주변 영역에 투여 또는 이식하기 위한 주사제 또는 이식 재료로서의 사용일 수 있다. 본 실시형태의 섬유 아세포는 바람직하게는 CD106 양성이다.
[실시예]
이하 실시예에 의해, 본 발명을 보다 상세하게 설명하겠지만, 본 발명의 범위가 실시예에만 한정되지 않는 것은 말할 필요도 없다.
<인간 성인 신장 섬유 아세포의 배양>
인간 성인 신장 섬유 아세포를 Innoprot로부터 구입하였다. 이 세포를 1% 신생아 소 혈청(newborn　calf　serum(NBCS, Hyclone))을 첨가한 재조합 인간 상피 세포 성장 인자(rh-EGF) 함유 섬유 아세포용 무혈청 배양액(HFDM-1(＋), Cell Science　＆　Technology)으로 배양하였다. 3∼5회의 계대(繼代) 후, 섬유 아세포를 50ng/㎖의 TNF-α(Pepro　tech) 및 2ng/㎖의 IL-4(Wako)로 처치하였다.
<플로우 사이토메트리 해석>
플로우 사이토메트리 해석에서 사용한 항체 및 시약을 표 1에 표시한다. 세포를 4% 파라포름알데하이드(Wako)로 고정시켜, PBS(Wako) 중에 정치하였다. 0.1% 사포닌으로 투과 처리를 하여, 각종 항체와 30분간씩 반응시켰다. 플로우 사이토메트리 해석은 제조 회사의 지시서대로 MACSQuant　Analyzer10에 의한 해석을 실시하였다(Miltenyi Biotec).
[표 1]
표 1. 플로우 사이토메트리 해석에 사용한 항체 및 시약
Figure pct00001
<에리트로포이에틴 산생능 평가>
미처리한 인간 신장 섬유 아세포(NT) 및 TNF-α(50ng/㎖)와 IL-4(2ng/㎖)에서 3일간 처리한 인간 신장 섬유 아세포(UP)를 9.2×105cells/dish의 농도로 60mmφ 배양 접시(Corning, Corning, NY)에 파종하고, 5일간 무혈청 DMEM 배지에서 배양한 후에, 각각의 섬유 아세포의 배양 상청액을 3㎖ 회수하였다. 상청액은 Amicon-Ultra-2(Merck, Darmstadt, Germany)와 Human　Erythropoietin　ELISA Kit(Proteintech, Rosemont, IL)를 이용하여, 메이커 추천 프로토콜에 따라 샘플 조정하였다. 측정은 Spectra Max　M2(San　Jose, CA)로 실시하였다. Amicon-Ultra-2에 의한 농축 전 EPO 산생량(mIU)은 제품의 데이터 시트에 기재된 농축 최소 용량(15㎕)을 기준으로 계산하였다. 구체적으로는, 농축 후의 EPO 산생량(mIU/㎖)을, 상기 최소 용량으로부터 산출한 농축율(100배, 충전 용량 1.5㎖에 대해서 15㎕로 농축하였을 때의 농축율이라 가정)로 나누고, Dish당 배지 총량(3㎖)을 곱함으로써 EPO 산생량(mIU)을 산출하였다. 1세포당 EPO 산생량(mIU/cell)은 EPO 산생량(mIU)을 파종 세포수(9.2×105cells)로 나눔으로써 산출하였다.
<실시예 1: TNF-α 및 IL-4를 조합하여 사용함으로써, CD106(VCAM-1) 양성 신장 섬유 아세포에서 EPO 발현이 증강됨>
인간 성인 신장 섬유 아세포를 세포 배양 접시에서 배양하였다. 인간 성인 신장 섬유 아세포는 평평한 방추형 형상으로, 전형적인 섬유 아세포의 형상이었다(도 1A).
신장 섬유 아세포를 50ng/㎖의 TNF-α 및 2ng/㎖의 IL-4에서 3일간 처치한 후, FACS를 사용하여 그 세포의 특징을 해석하였다. 사용한 항체는 α-SMA, CD106 또는 EPO에 대한 항체이다. 세포질에 국재하는 단백질의 염색은 0.1%의 사포닌으로 세포막 투과 처리를 한 후에 실시하였다.
무처치 신장 섬유 아세포는 섬유 아세포 마커인 α-SMA가 66.54%의 세포로 발현되었다. 한편, 신장 섬유 아세포는 CD106 양성 세포의 비율이 적고(세포수 기준으로 4.70%), EPO＋ 세포의 비율도 적었다(세포수 기준으로 40.68%)(도 1B). CD106 양성 세포를 게이팅하여 해석하면, α-SMA와 EPO의 발현 세포의 비율(세포수 기준)은 각각 97.94%과 87.92%였다. 즉, CD106 양성 신장 섬유 아세포는 α-SMA 및 EPO의 발현 비율(세포수 기준)이 높은 것으로 나타났다. 이 결과, 천연 상태에서는, EPO＋ 세포에 대해서, 항CD106 항체를 이용한 기지의 방법에 따라 효율적으로 선택 또는 농축하는 것은 곤란한 것으로 나타났다(도 1B).
또한, 신장 섬유 아세포를 TNF-α 및 IL-4에서 3일간 처치함으로써, CD106 양성 세포의 비율이 47.50%(세포수 기준)로 증가하고, α-SMA＋ 세포 비율이 78.71%(세포수 기준)로 증가하였다. 처치 후의 신장 섬유 아세포에서 EPO＋ 세포의 비율은 41.15%(세포수 기준)였으나, CD106 양성 세포에서는, EPO＋ 세포의 비율은 81.82%였다(도 1B). 즉, CD106 양성 신장 섬유 아세포는 TNF-α 및 IL-4에 의한 처치에 의해 CD106의 발현을 유발한 후에도, α-SMA 및 EPO의 발현 비율(세포수 기준)이 높아지는 것으로 나타났다.
<실시예 2: TNF-α 및 IL-4를 조합하여 사용함으로써, EPO 발현 신장 섬유 아세포에서 CD106 양성율이 증가함>
인간 성인 신장 섬유 아세포를 세포 배양 접시에서 배양하였다. 신장 섬유 아세포를 50ng/㎖의 TNF-α 및 2ng/㎖의 IL-4에서 3일간 처치한 후, FACS를 사용하여 그 세포의 특징을 해석하였다. 사용한 항체는 CD106 또는 EPO에 대한 항체이다.
무처치 신장 섬유 아세포는 EPO＋ 세포의 비율이 세포수 기준으로 37.24%이었고, 이 중 CD106 양성 세포율은 47.78%였다. 한편, TNF-α 및 IL-4에서 3일간 처치한 신장 섬유 아세포는 EPO＋ 세포 비율이 세포수 기준으로 35.13%이었고, 이 중 CD106 양성 세포율은 82.86%로, 매우 높은 CD106 양성 세포율이었다.
즉, 신장 섬유 아세포를 항CD106 항체를 이용한 기지의 방법에 따라 정제함으로써, 고순도의 EPO 산생능이 항진된 CD106 양성 섬유 아세포를 효율적으로 얻을 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 결과로부터, TNF-α 및 IL-4를 사용함으로써, EPO를 산생하는 신장 섬유 아세포를 선택적으로 CD106에 양성으로 함으로써, EPO 산생능이 항진된 CD106 양성 섬유 아세포의 선택 또는 농축을 효율적으로 실시 가능해지는 것이 시사되었다.
<실시예 3: 각종 섬유 아세포의 에리트로포이에틴 산생능 평가>
미처리한 인간 신장 섬유 아세포(NT) 및 TNF-α(50ng/㎖)와 IL-4(2ng/㎖)에서 3일간 처리한 인간 신장 섬유 아세포(UP)의 에리트로포이에틴 산생능을 평가하기 위하여, ELISA로 각종 섬유 아세포의 배양 상청액 중에 포함되는 에리트로포이에틴 함유량을 평가하였다(도 3). 그 결과, UP의 배양 상청액에는 NT의 배양 상청액과 비교하여 1.65배 많은 EPO가 포함되어 있는 것으로 나타났다(도 3의 a). 또한, UP의 배양 상청액의 평균 광학 농도(Average. OD)는 0.21로서, 8.39mIU/㎖ 농도의 EPO가 포함되어 있으며, 한편, NT의 배양 상청액의 Average. OD는 0.14로, 5.08mIU/㎖의 EPO(농축 후)를 함유하는 것으로 나타났다(도 3의 B 및 D). 또한, 농축 전 UP의 배양 상청액에는 8.39E-02mIU/㎖, 2.52E-01mIU, 2.74E-07mIU/cell 농도의 EPO가 포함되어 있으며, 한편, 농축 전 NT의 배양 상청액에는 5.08E-02mIU/㎖, 1.52E-01mIU, 1.66E-07mIU/cell 농도의 EPO가 포함되어 있었다.
본 결과로부터, TNF-α와 IL-4를 처리하여 제작한 신장 섬유 아세포는 EPO의 발현이 증강될 뿐만 아니라, 산생능도 향상하는 것으로 밝혀졌으며, TNF-α와 IL-4를 사용함으로써, EPO를 산생하는 신장 섬유 아세포를 선택적으로 CD106 양성으로 함으로써, EPO 산생능이 항진된 CD106 양성 섬유 아세포의 선택 또는 농축을 효율적으로 실시 가능해지는 것이 시사되었다.
EPO는 적혈구의 산생 촉진에 기여하는 호르몬인 것은 이미 알려져 있다. EPO는 대부분이 신장에서 생성되며, 그 후, 골수 내의 적아구계 전구 세포 상에 작용하여, 적혈구의 산생(분화 및 증식)을 촉진하는 역할이 있는 동시에, 최근, EPO가 갖는 적혈구 산생 촉진능이 주목받아, 신성빈혈 등의 신장 질환에 유효한 것으로 밝혀졌다(비특허문헌 1). 실제로 의료 현장에서 EPO 제제는 신성빈혈 치료제로서 널리 사용되고 있다. 또한, EPO는 다양한 조직에서, 항염증, 항산화, 항아포토시스, 혈관 신생 촉진 작용을 갖는 것으로 알려져 있으며, EPO는 신장병(급성 신장병(AKI), 만성 신장병(CKD), 당뇨병성 신증 등)이 있는 대상에게 투여함으로써, 신장병에서 기인한 신장 기능 저하로부터 신장을 보호하는, 신장 보호 기능을 초래한다고도 보고되었다(비특허문헌 2 및 3). 즉, 이러한 선행 연구에 의해 이미 알려져 있는 EPO의 역할을 감안하면, 본 발명에 의해 인공적으로 제작한 EPO 산생능이 항진된 CD106 양성 섬유 아세포의 투여는 신장병에 유효하다는 것이 시사된다.

Claims (19)

  1. 에리트로포이에틴(EPO) 산생능이 항진된, 섬유 아세포.
  2. 제1항에 있어서,
    CD106 양성인, 섬유 아세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 섬유 아세포가 신장 섬유 아세포인, 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    EPO의 산생량이, 대조가 되는 섬유 아세포와 비교하여, 1.65배 이상 높은 것인, 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 세포를 포함하는, 섬유 아세포 집단.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 CD106 양성 섬유 아세포의 비율(세포수 기준)이, 상기 세포 집단 내에 포함되는 전체 섬유 아세포에 대하여 4.7% 이상인, 세포 집단.
  7. EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포의 제조 방법으로서,
    섬유 아세포에 TNF-α 및 IL-4를 접촉시키는 것,
    상기 접촉시킨 섬유 아세포를, EPO 산생능이 항진될 수 있는 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포가 CD106 양성인, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    항CD106 항체를 이용하여, CD106 양성인 섬유 아세포를 선택 또는 농축하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 섬유 아세포가 신장 섬유 아세포인, 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 따라 얻을 수 있는, EPO 산생능이 항진된 섬유 아세포.
  12. 제11항에 기재된 세포를 포함하는, 섬유 아세포 집단.
  13. 제1항 내지 제4항 및 제11항 중 어느 한 항에 기재된 세포, 또는 제5항, 제6항 및 제12항 중 어느 한 항에 기재된 세포 집단을 포함하는, 의약 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    EPO 산생능이 저하되어 있는 상태를 개선하기 위한, 의약 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    신장병이 있는 환자에게 투여하기 위한, 의약 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 신장병이 만성 신장병인, 의약 조성물.
  17. 제13항에 있어서,
    신성빈혈이 있는 환자에게 투여하기 위한, 의약 조성물.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    주사용 조성물인, 의약 조성물.
  19. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 집단이, 평면 또는 입체 형상의 세포 조직으로서 구축된 것인, 의약 조성물.
KR1020227030017A 2020-03-04 2021-03-04 에리트로포이에틴 산생능이 항진된 섬유 아세포 KR20220148184A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2020-036421 2020-03-04
JP2020036421 2020-03-04
PCT/JP2021/008325 WO2021177387A1 (ja) 2020-03-04 2021-03-04 エリスロポエチン産生能が亢進された線維芽細胞

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220148184A true KR20220148184A (ko) 2022-11-04

Family

ID=77614075

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227030017A KR20220148184A (ko) 2020-03-04 2021-03-04 에리트로포이에틴 산생능이 항진된 섬유 아세포

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20220411761A1 (ko)
EP (1) EP4116412A4 (ko)
JP (2) JP7229618B2 (ko)
KR (1) KR20220148184A (ko)
CN (1) CN115210361A (ko)
AU (1) AU2021230209A1 (ko)
CA (1) CA3174551A1 (ko)
IL (1) IL296125A (ko)
WO (1) WO2021177387A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3226199A1 (en) * 2021-09-08 2023-03-16 Metcela Inc. Fibroblast-containing pharmaceutical composition for treating kidney disease

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016006262A1 (ja) 2014-07-11 2016-01-14 貴紘 岩宮 心臓細胞培養材料
WO2018155651A1 (ja) 2017-02-24 2018-08-30 株式会社メトセラ 線維芽細胞を含む心臓疾患を治療するための注射用組成物、及び治療用線維芽細胞の製造方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ245015A (en) * 1991-11-05 1995-12-21 Transkaryotic Therapies Inc Delivery of human growth hormone through the administration of transfected cell lines encoding human growth hormone, which are physically protected from host immune response; the transfected cells and their production
US6946246B1 (en) * 1997-04-08 2005-09-20 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Production of functional proteins: balance of shear stress and gravity
JP2004516820A (ja) * 2000-08-25 2004-06-10 キュラジェン コーポレイション 新規タンパク質およびそれらのタンパク質をコードする核酸
JP5404951B2 (ja) * 2008-04-22 2014-02-05 キヤノン株式会社 制御装置
EP2358375B1 (en) * 2008-11-12 2013-07-24 Tengion, Inc. Isolated renal cells and uses thereof
ES2906750T3 (es) * 2010-05-12 2022-04-20 Prokidney Células renales bioactivas
WO2020045547A1 (ja) * 2018-08-29 2020-03-05 株式会社メトセラ 線維芽細胞の製造方法及びｇ－ｃｓｆ陽性線維芽細胞集団

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016006262A1 (ja) 2014-07-11 2016-01-14 貴紘 岩宮 心臓細胞培養材料
WO2018155651A1 (ja) 2017-02-24 2018-08-30 株式会社メトセラ 線維芽細胞を含む心臓疾患を治療するための注射用組成物、及び治療用線維芽細胞の製造方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J Renal Inj Prev., 2013; 2(1): 29-30
Nephron, 1997; 77(2): 176-185
Proc Natl Acad Sci., 2004; 101(41): 14907-14912

Also Published As

Publication number Publication date
EP4116412A4 (en) 2024-04-03
JP2023053044A (ja) 2023-04-12
WO2021177387A1 (ja) 2021-09-10
EP4116412A1 (en) 2023-01-11
JPWO2021177387A1 (ko) 2021-09-10
CN115210361A (zh) 2022-10-18
IL296125A (en) 2022-11-01
CA3174551A1 (en) 2021-09-10
US20220411761A1 (en) 2022-12-29
JP7229618B2 (ja) 2023-02-28
AU2021230209A1 (en) 2022-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Amin et al. Modified multipotent stromal cells with epidermal growth factor restore vasculogenesis and blood flow in ischemic hind-limb of type II diabetic mice
Yano et al. Intracardiac fibroblasts, but not bone marrow derived cells, are the origin of myofibroblasts in myocardial infarct repair
JP6921249B2 (ja) 向上された臍帯由来付着型幹細胞、その製造方法及びその用途
JPWO2006041088A1 (ja) 脳移行性骨髄前駆細胞
TW201130977A (en) Mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from mobilized peripheral blood
US20200009193A1 (en) Perinatal tissue derived mesenchymal stem cells: method of preparation and uses thereof
CN106794223A (zh) 利用mfg‑e8的用于预防或者治疗组织纤维化的组合物
JP6883904B2 (ja) 線維芽細胞の製造方法及びｇ−ｃｓｆ陽性線維芽細胞集団
CN105769910B (zh) 一种人羊膜间充质干细胞的应用
KR20080042761A (ko) 렙틴을 이용한 줄기세포 증식방법
JP2023053044A (ja) エリスロポエチン産生能が亢進された線維芽細胞
JP2018530992A (ja) 間葉系幹細胞、そのクローン原性増殖方法、分離方法及び用途
JP2018530992A6 (ja) 間葉系幹細胞、そのクローン原性増殖方法、分離方法及び用途
CN111417718B (zh) 由cd31阳性cd45阴性cd200阳性的哺乳动物细胞组成的细胞群及其应用
CN113559125A (zh) 一种治疗糖尿病的干细胞药物
TW201432048A (zh) 生長因子製劑及其生產方法
US20130244948A1 (en) Compositions of cells, media, and methods thereof
RU2742034C2 (ru) Бесклеточные терапевтические средства для регенеративной медицины и способы их получения
RU2800644C2 (ru) Способ получения фибробластов и г-ксф-положительная фибробластная масса
JP7506905B2 (ja) 添加剤
CN117919400B (zh) iPS诱导定向分化的成内皮祖细胞和抗体联合治疗心脑血管疾病
WO2021045190A1 (ja) 心筋炎の治療剤
JP7473207B2 (ja) 末梢血流障害の治療剤
KR102526447B1 (ko) 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지를 포함하는 간질환 예방 또는 치료용 조성물
Deng et al. Fundamental concepts and features of mesenchymal stem cells: proliferation, differentiation, migration and immunomodulatory characteristics