CN108669071A - 新型肿瘤组织保存液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术，尤其是公开了一种新型肿瘤组织保存液及其应用，包含RPMI1640培养基、人血清、小鼠血清。本发明能够保持从人体取出的活体肿瘤组织的生物活性，提高肿瘤组织移植到小鼠体内成功率。

Description

新型肿瘤组织保存液及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种新型肿瘤组织保存液及其应用。

背景技术

人源肿瘤移植瘤(Patient-Derived Xenograft,PDX)模型，是把患者的新鲜肿瘤组织(穿刺样本或者手术样本)直接移植到免疫缺陷小鼠体内，从而生长出来的肿瘤模型。PDX模型与传统的细胞系模型相比更能反映患者肿瘤的生物学特征，PDX模型不仅保留了与患者肿瘤组织相似的增殖和组织病理学特征，而且在生物学行为上，包括肿瘤的基因，蛋白质等分子特征与患者肿瘤组织具有高度的一致性。

PDX模型的构建需要新鲜的人活体肿瘤组织样本，因此为确保移植的成功率，在肿瘤组织移植过程中，需要用保存液来维持运输过程中营养供给，保持肿瘤组织的生物活性。

目前常见的肿瘤组织体外保存液为磷酸盐缓冲液、基础培养基以及在现有基础培养基中添加胎牛血清等。其中，磷酸盐缓冲液的主要成分包括磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠和氯化钾等，具有盐平衡，有助于保持组织恒定的pH值，稳定的渗透压和离子浓度；基础培养基的主要成分包括碳酸氢钠缓冲系统，还原剂谷胱甘肽和高浓度的维生素，适用于培养各种哺乳动物细胞，可用来维持细胞活性；而胎牛血清的主要成分是包括蛋白质、多肽、生长因子、激素等组成的混合物，含有丰富的细胞生长必须的营养成分，对细胞的体外培养具有重要作用。

在长期的实验和研发过程中发现，PBS缓冲液成分简单，功能局限，不能很好地保持体外肿瘤组织的生物活性；基础培养基不含蛋白质、脂质或生长因子，不能作为肿瘤组织体外保存的最佳选择。目前已有的一些方法，在缓冲液及基础培养基中添加胎牛血清，营造一个生物微环境，增加体外肿瘤细胞生长所需的营养成分，维持细胞的活力。

现有的提高肿瘤组织在体外活性的方法，大多都是在缓冲液或基础培养基中添加胎牛血清，但是牛源血清与人源肿瘤组织和鼠源受体均不一致，该差异可能会影响肿瘤组织移植到小鼠体内的生长。本方法对现有技术的不足做了调整及优化，充分考虑到异种移植人体内环境与小鼠环境的差异，用人血清-小鼠血清混合物替代牛源血清，在维持肿瘤生长的前提下，让肿瘤组织提前适应小鼠体内新环境。

发明内容

本发明为了克服现有技术的不足，提供一种保持从人体取出的活体肿瘤组织的生物活性，提高肿瘤组织移植到小鼠体内成功率的新型肿瘤组织保存液及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种新型肿瘤组织保存液，包含RPMI1640培养基、人血清、小鼠血清。本发明是在肿瘤组织运输过程中，保存液中添加人血清-小鼠血清混合物，血清中含有多种蛋白、多肽、生长因子等保持肿瘤组织的生物活性，给肿瘤组织营造一个蛋白保护的微环境，主要让离体的人肿瘤组织从全人环境到运输过程中的人-鼠过渡环境以及最终移植到小鼠体内时的鼠体环境有一个缓慢适应的过程，从而提高肿瘤组织移植的成功率。

进一步地，所述RPMI1640培养基70％，人血清15％、小鼠血清15％。

另外，本发明还提供了一种所述的新型肿瘤组织保存液在人活体肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠上的应用。

加入小鼠血清是为了给离体的人组织提供一个类似体内的环境，提前适应小鼠体内微环境，此外小鼠血清中也包含了小鼠激素和生长因子,可以维持细胞生物学活性以保护细胞。主要作用有：

1、提供基本营养物质或基础培养基所缺乏的营养物质：如氨基酸、无机物、脂类物质、核酸衍生物等；

2、提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子；

3、对离体的细胞起到某些保护作用：有一些细胞如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，小鼠血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用，使细胞免受蛋白酶的损伤；

4、小鼠血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用；

综上所述，本发明不仅能够保持从人体取出的活体肿瘤组织的生物活性，同时也能让活体肿瘤组织经历从全人环境到人鼠环境以及最后到鼠环境的缓慢过渡，从而提高肿瘤组织移植到小鼠体内成功率。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

实施例1

一种新型肿瘤组织保存液，包括RPMI1640培养基70％、人血清 15％、小鼠血清15％。

所述小鼠血清取自小鼠眼球或者心脏。而所述人血清为AB型血清。

实施例2

一种制备实施例1所述新型肿瘤组织保存液的方法，包括下述步骤：

(1)小鼠心脏或者眼球取血置于离心管中；将离心管置于4℃环境下静置1-5小时；最好将离心管置于4℃环境下静置2小时。平衡后进行离心处理，取上清液；将该上清液继续进行离心处理，再次取上清，此次吸取的上清液即为小鼠血清，将该小鼠血清置于 -15℃--25℃的环境下保存；

步骤(1)中离心的速度可根据需要设置但是，最好是所述平衡后以3000rpm速度离心10min，取上清液；将该上清液继续以 3000rpm的速度离心处理10min，再次取上清于-15℃--25℃的环境下保存。

(2)用移液枪吸取70份RPMI1640培养基至离心管中；

(3)然后再用移液枪吸取15份人血清和15份小鼠血清至离心管中，混合均匀，制成新型肿瘤组织保存液。

为了保证保存液制备的环境为无菌，于是所述步骤(2)具体为：在生物安全柜内，用移液枪吸取70份RPMI1640培养基至离心管中。为了方便肿瘤组织保存液的保存和使用，将制成的新型肿瘤组织保存液放置于4℃的冰箱内备用，而且最好是将新型肿瘤组织保存液分装于2ml离心管中，再放置4℃冰箱备用。

实施例3

一种实施例1所制备的新型肿瘤组织保存液的运用，包括下述步骤：

肿瘤组织取材操作环境需清洁环境及以上，防止组织污染。取肿瘤组织位置最好肿瘤生长活跃、状态良好、结缔组织比较少的地方。取得标本大小至少0.5cm*0.5cm*0.5cm。取下后的标本必须马上放入装有特定培养基的无菌管中并置于4℃冷链运输盒中保存，注意放置方式，确保不结冰。

实施例4

本实施例是将实施例1中新型肿瘤组织保存液在人活体肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠上的应用结果。

实验操作及结果如下：

为了显示本新型肿瘤组织保存液的实际使用效果，申请人进行对比试验：

而在新的保存液和基础培养液用于不同肿瘤的实验结果(其中对照组为基础培养液)：

1、按成瘤数量比较：

10例模型新保存液效果优于对照组

5例模型对照组实验结果优于新保存液

2、按成瘤与否比较

有4例模型新保存液成模，对照组未成模，1例对照组成模，新保存液未成模

3、按肿瘤类型比较

10例肠癌模型中，5例模型新保存液效果优于对照组，3例对照组效果优于新保存液，其余2例效果相近。

由上可知，用于不同肿瘤组织移植时，新的保存液相对于旧的保存液明显提高了肿瘤组织移植到小鼠体内的成功率。

显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

Claims (3)

1.一种新型肿瘤组织保存液，其特征在于：包含RPMI1640培养基、人血清、小鼠血清。

2.根据权利要求1所述的新型肿瘤组织保存液，其特征在于：所述RPMI1640培养基70%，人血清15%、小鼠血清15%。

3.根据权利要求1或2所述的新型肿瘤组织保存液在人活体肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠上的应用。