CN1857739A - 肿瘤模型与方法 - Google Patents

Abstract

本发明名称为：肿瘤模型与方法，涉及生命科学领域、及医药领域。提供了一个能够揭示人类实体恶性肿瘤与机体组织或器官微环境演进转化－改变综合分子肿瘤生物调控机制、综合分子肿瘤生物应答机制、综合分子肿瘤生物预防治疗机制方法及药物的，肿瘤模型与方法，综合人类肿瘤模型科学研究实验平台。能够揭示检测、监测人类小原位癌细胞组织的，人类相关分子肿瘤蛋白质组表达谱靶标；揭示拮抗－抑制人类肿瘤细胞组织生长增殖的，人类相关分子肿瘤蛋白质组表达谱靶标、肿瘤相关人类基因表达谱靶标。

Description

肿瘤模型与方法

技术领域

本发明涉及了一种能够揭示人类实体恶性肿瘤与机体组织或器官微环境演进转化-改变综合分子肿瘤生物调控机制、综合分子肿瘤生物应答机制、综合分子肿瘤生物预防治疗机制方法及药物的，肿瘤模型与方法，综合人类肿瘤模型科学研究实验平台。能够揭示检测、监测人类小原位癌细胞组织的，人类相关分子肿瘤蛋白质组表达谱靶标；揭示拮抗-抑制人类肿瘤细胞组织生长增殖的，人类相关分子肿瘤蛋白质组表达谱靶标、肿瘤相关人类基因表达谱靶标。它涉及生命科学领域、及医药领域。

背景技术

现代医学科学针对在人类群体中临床自然发病率最高的致死性实体恶性肿瘤，如肺癌、胃癌、乳腺癌、大肠癌、肝癌……，实施的各个科学研究层面的肿瘤科学研究，已经超过一个世纪；迄今在有效预防癌症发生、在针对已经发生肿瘤转移的中晚期致死性实体恶性肿瘤的有效根治或长期有效缓解治疗方面，没有取得解决实质问题的科学研究突破。需要拥有能够实施现代医学、分子生物学、生物化学、遗传学、免疫学、病理生理学、实验动物学等多个不同相关生物科学研究领域——各个相关科学学科协同的综合科学研究，揭示人类实体恶性肿瘤与机体组织或器官微环境演进转化-改变综合分子肿瘤生物调控机制、综合分子肿瘤生物应答机制、综合分子肿瘤生物预防治疗机制方法及药物的，肿瘤模型与方法，综合人类肿瘤模型科学研究实验平台。能够揭示检测、监测人类小原位癌细胞组织的，人类相关分子肿瘤蛋白质组表达谱靶标；揭示拮抗-抑制人类肿瘤细胞组织生长增殖的，人类相关分子肿瘤蛋白质组表达谱靶标、肿瘤相关人类基因表达谱靶标。

发明内容

本发明公开了一种能够揭示人类实体恶性肿瘤与机体组织或器官微环境演进转化-改变综合分子肿瘤生物调控机制、综合分子肿瘤生物应答机制、综合分子肿瘤生物预防治疗机制方法及药物的，肿瘤模型与方法，综合人类肿瘤模型科学研究实验平台。能够揭示检测、监测人类小原位癌细胞组织的，人类相关分子肿瘤蛋白质组表达谱靶标；揭示拮抗-抑制人类肿瘤细胞组织生长增殖的，人类相关分子肿瘤蛋白质组表达谱靶标、肿瘤相关人类基因表达谱靶标。

人类与脊椎动物机体发生占位实体恶性肿瘤，最初由于细胞基因变异在人类与脊椎动物机体中转化产生的原始肿瘤细胞种子，没有适合其传代增殖的机体组织或器官微环境土壤，肿瘤细胞传代增殖受到机体组织或器官微环境土壤抑制，是弱势生长肿瘤细胞克隆种子；至少需要长达几年以上甚至是一、二十年时间，才有可能会极缓慢逐渐增殖出极微小的、传代增殖小于10⁶~10⁷肿瘤细胞、不会对机体组织或器官造成生物损伤的小原位癌细胞组织种子；并且会诱导淋巴免疫系统针对基因变异肿瘤细胞的免疫耐受机制。人类与脊椎动物机体中发生存在的10⁶~10⁷肿瘤细胞的小原位癌细胞组织种子、与机体组织或器官微环境土壤相互之间，逐渐-逐步发生多重复杂的相互诱导、相互调控转化-改变，是能够驱使其向致死性占位实体恶性肿瘤转化的，肿瘤-微环境演进转化-改变生物调控机制：1.受抑制的弱势生长肿瘤细胞克隆小原位癌细胞组织生物代谢机制，逐渐发生适应机体组织或器官微环境的转化。2.主要是由非肿瘤因素、及肿瘤因素逐步造成机体组织或器官微环境演进转化-改变，例如慢性乙型肝炎病人的靶器官肝脏、致癌物质诱发动物肿瘤模型的靶器官，发生靶器官细胞组织受到损伤可以被修复的病理损伤变化、进一步发生靶器官细胞组织受到损伤不可以被修复的病理损伤转化-改变；机体组织或器官微环境演进转化-改变，诱导-调控小原位癌细胞组织生物代谢机制，促使其发生适应机体组织或器官微环境的转化-改变。3.机体组织或器官微环境演进转化-改变，逐步选择在小原位癌细胞组织中逐步发生不同基因变异的、适合在演进转化-改变微环境中传代增殖、具有生长增殖优势的异质肿瘤细胞克隆。4.具有生长增殖优势的异质肿瘤细胞克隆小原位癌细胞组织生命代谢物质，诱导-调控改变机体组织或器官微环境。5.机体组织或器官微环境演进转化-改变，诱导-调控具有生长增殖优势的，异质肿瘤细胞克隆生物代谢机制与传代增殖生物调控机制，使其进一步转化成为抵抗可能存在的免疫生物损伤、受损肿瘤细胞代偿增殖速度快、能够对机体组织或器官造成致死性生物损伤的恶性肿瘤组织。6.人类与脊椎动物机体发生存在的，具有生长增殖优势的异质小原位癌细胞组织种子，与机体组织或器官微环境土壤，仍需经历较长的相互诱导、相互调控转化-改变——肿瘤-微环境演进转化-改变生物调控/生物应答；才能够被相互转化-改变成为：对机体组织或器官造成致死性生物损伤的恶性肿瘤组织种子、与适合恶性肿瘤组织种子传代增殖的机体组织或器官微环境土壤；继而会在人类与脊椎动物机体发生出，对机体组织或器官造成致死性生物损伤的占位实体恶性肿瘤组织。因而在人类与脊椎动物机体发生存在的，具有生长增殖优势肿瘤细胞克隆的异质小原位癌细胞组织，在被逐渐演进转化-改变成为致死性生物损伤占位实体恶性肿瘤的生物发生进程中，存在难以被当今常规医疗肿瘤监测-检测发现的致死性占位实体恶性肿瘤成瘤潜伏期。7.在人类与脊椎动物机体发生存在的，大多数具有不同肿瘤生物分化异质占位实体恶性肿瘤组织，是由于机体发生：最初机体微环境土壤适合高分化良性肿瘤细胞克隆种子传代增殖、抑制低分化恶性肿瘤细胞克隆种子传代增殖，逐渐趋向演进转化-改变为适合低分化恶性肿瘤细胞克隆种子传代增殖、抑制高分化良性肿瘤细胞克隆种子传代增殖，异质占位实体肿瘤与微环境发生多重复杂相互诱导、相互调控转化-改变——肿瘤-微环境演进转化-改变生物调控、生物应答；人类与脊椎动物机体组织或器官才能够逐渐-逐步发生，最初主要由高分化肿瘤细胞为优势生长良性细胞克隆构成的异质占位实体肿瘤组织、逐渐-逐步过渡到主要由低分化肿瘤细胞为优势生长恶性细胞克隆构成的异质占位实体肿瘤组织。例如被揭示、得到公认的，大肠癌分子肿瘤病理演进转化-改变生物发生机制：正常分化肠上皮细胞生物基因APC变异→异常病理分化非典型增殖细胞组织生物基因DNA低甲基化→肿瘤病理高分化早期腺瘤组织生物基因K-ras丢失→肿瘤病理中分化中期腺瘤组织生物基因Dcc丢失→肿瘤病理低分化晚期腺瘤组织生物基因P⁵³变异→肿瘤病理分化原位腺癌组织→直至生成肿瘤病理分化致死性占位实体恶性腺癌组织。8.现代肿瘤实验科学研究，将能够通过建立本发明提供的，能够揭示人类实体恶性肿瘤与机体组织或器官微环境演进转化-改变综合分子肿瘤生物调控机制、综合分子肿瘤生物应答机制、综合分子肿瘤生物预防治疗机制方法及药物的，肿瘤模型与方法，综合人类肿瘤模型科学研究实验平台，获得综合科学研究实验结果，为上述人类与脊椎动物机体发生占位实体恶性肿瘤，种子-土壤多重复杂相互诱导、相互调控转化-改变——肿瘤-微环境演进转化-改变生物调控、生物应答科学假说，提供全面的令人信服的科学实验结果证据。

现代肿瘤实验科学研究的重要科学研究手段，建立可移植性动物肿瘤模型，把动物自发性动物肿瘤、或致癌物质诱发的动物肿瘤、或通过临床手术获取的人体肿瘤的，约10⁶~10⁸肿瘤细胞或肿瘤小块组织种子，移植到一个新的同种动物、或异种动物宿主机体土壤传代增殖，研究揭示肿瘤的某些生物发生机制、生物性质。几乎所有自发性原发于动物机体、原发于人类机体、或肿瘤移植动物机体，具有生长增殖优势、传代生长增殖速度快、能够对机体组织或器官造成致死性生物损伤的、可移植性肿瘤细胞或肿瘤小块组织种子，被移植到一个新动物宿主机体土壤；肿瘤细胞种子传代生长增殖会受到新宿主机体微环境土壤的明显抑制；必须经历种子-土壤多重复杂相互诱导、相互调控转化-改变——肿瘤-微环境演进转化-改变生物调控、生物应答，被移植肿瘤细胞、或肿瘤小块组织在新宿主机体的移植占位肿胀目测观察消失的成瘤潜伏期；而后受到新宿主机体微环境土壤明显抑制的、可移植性肿瘤细胞种子，才能够被移植新宿主机体微环境土壤演进转化-改变，再次被转化成为具有生长增殖优势、传代生长增殖速度快、能够对机体组织或器官造成致死性生物损伤的、可移植性肿瘤细胞组织种子，继而会传代生长增殖成为对机体组织或器官造成致死性生物损伤占位实体恶性肿瘤。能够为上述人类与脊椎动物机体发生占位实体恶性肿瘤，种子-土壤多重复杂相互诱导、相互调控转化-改变——肿瘤-微环境演进转化-改变生物调控、生物应答科学假说，提供令人信服的现代肿瘤实验科学研究结果证据。

本发明的目的是，提供一种能够揭示人类实体恶性肿瘤与机体组织或器官微环境演进转化-改变综合分子肿瘤生物调控机制、综合分子肿瘤生物应答机制、综合分子肿瘤生物预防治疗机制方法及药物的，肿瘤模型与方法，综合人类肿瘤模型科学研究实验平台。能够揭示检测、监测人类小原位癌细胞组织的，人类相关分子肿瘤蛋白质组表达谱靶标；揭示拮抗-抑制人类肿瘤细胞组织生长增殖的，人类相关分子肿瘤蛋白质组表达谱靶标、肿瘤相关人类基因表达谱靶标。

1.把取自临床手术获取的肺癌、胃癌、乳腺癌、大肠癌、肝癌……等人类肿瘤、或人类肿瘤细胞系，约10⁶~10⁸肿瘤细胞或肿瘤小块组织，原位移植、或皮下移植到免疫机制有缺陷动物如裸小鼠的相应器官、或皮下；建立能够被应用于模拟在人类机体发生的小原位癌，研究揭示人类肿瘤的某些生物发生机制、生物性质的那种人类肿瘤裸小鼠移植瘤模型——瘤株。

2.取那种人类肿瘤裸小鼠移植瘤模型的，机体接种移植瘤株传代增殖量达到10⁹肿瘤细胞——1g肿瘤组织的荷瘤裸小鼠的血；制取血清。应用荷瘤裸小鼠20％血清加培养基，体外培养那种人类肿瘤裸小鼠移植瘤株，建立那种人类肿瘤应用荷瘤裸小鼠血清体外培养的异质人类肿瘤细胞系；继而再分离出的肿瘤生物分化表达性状不同的肿瘤细胞克隆，

3.分别建立那种人类肿瘤不同细胞克隆裸小鼠移植瘤模型、异质混合细胞裸小鼠移植瘤模型。

4.分别取那种人类肿瘤不同细胞克隆、异质混合细胞裸小鼠移植瘤模型的，接种移植瘤株0d、7d、14d、21d、28d、35d荷瘤裸小鼠的血；分别制取血清。分别应用接种移植瘤株0d、7d、14d、21d、28d、35d荷瘤裸小鼠的20％血清加培养基，模拟接种移植那种人类肿瘤株的裸小鼠不同生命时间发生进程0d、7d、14d、21d、28d、35d机体微环境土壤演进转化-改变，在体外培养那种人类肿瘤细胞系，模拟那种人类肿瘤小原位癌细胞组织种子与接种移植那肿瘤株荷瘤裸小鼠机体微环境土壤，在不同生命时间发生进程0d、7d、14d、21d、28d、35d发生多重复杂相互诱导、相互调控转化-改变：由最初接种移植人类肿瘤株种子生长增殖受到机体微环境土壤抑制成瘤潜伏期、到机体微环境土壤促进移植人类肿瘤株种子增殖成瘤生长期、继而会发生出致死性占位实体恶性肿瘤组织——肿瘤-微环境演进转化-改变生物调控、生物应答。建立能够综合模拟表达：在人类与脊椎动物机体发生存在的，具有生长增殖优势肿瘤细胞克隆的小原位癌细胞组织种子——那种人类可移植性肿瘤细胞或肿瘤小块组织种子，被移植到一个新动物宿主机体土壤；肿瘤细胞种子传代生长增殖会受到新宿主机体微环境土壤的明显抑制；必须经历种子-土壤多重复杂相互诱导、相互调控转化-改变——肿瘤-微环境演进转化-改变生物调控、生物应答，被移植肿瘤细胞或肿瘤小块组织在新宿主机体的移植占位肿胀目测观察消失的成瘤潜伏期；而后受到新宿主机体微环境土壤明显抑制的、那种人类可移植性肿瘤细胞种子，才能够被移植新宿主机体微环境土壤演进转化-改变，再次被转化成为具有生长增殖优势、传代生长增殖速度快、能够对机体组织或器官造成致死性生物损伤的、那种人类可移植性肿瘤细胞组织种子，继而会传代生长增殖成为对机体组织或器官造成致死性生物损伤的占位实体恶性肿瘤；肿瘤组织内存在可以分辨的异质肿瘤细胞克隆种子与宿主机体微环境土壤，经历种子-土壤多重复杂相互诱导、相互调控转化-改变——肿瘤-微环境演进转化-改变生物调控、生物应答，能够表达出可以被科学实验结果证实、分辨的异质多样肿瘤-微环境演进转化-改变生物调控、生物应答性质的：肿瘤模型与方法，综合人类肿瘤模型科学研究实验平台。为现代肿瘤实验科学研究，能够综合模拟分析揭示在人类群体中临床自然发病率最高的，那种人类实体恶性肿瘤异质小原位癌细胞组织种子，在人类机体转化为致死性占位实体恶性肿瘤与机体组织或器官微环境演进转化-改变综合分子肿瘤生物调控机制、综合分子肿瘤生物应答机制、综合分子肿瘤生物预防治疗机制方法及药物，提供切实可以实施的综合生物医学科学研究实验方法。能够揭示检测、监测人类小原位癌细胞组织的，人类相关分子肿瘤蛋白质组表达谱靶标；揭示拮抗-抑制人类肿瘤细胞组织生长增殖的，人类相关分子肿瘤蛋白质组表达谱靶标、肿瘤相关人类基因表达谱靶标。

具体实施方式

为达到上述目的，实施本发明采用的方案：

1.制备生物实验材料

1.1.1复旦大学肝癌研究所建立的人肝癌MHCC97-L细胞系、人肝癌MHCC97-H细胞系；根源于临床手术取自于一个肝细胞肝癌病人肿瘤组织，建立的异质人肝癌MHCC97细胞系、继而再分离出的肿瘤生物分化表达性状不同的两个肿瘤细胞克隆，主要肿瘤生物表达性状：人肝癌MHCC97-L细胞系肿瘤生物分化表达性状、为高分化肿瘤细胞克隆，人肝癌MHCC97-H细胞系肿瘤生物分化表达性状、为低分化肿瘤细胞克隆；人肝癌MHCC97-L细胞平均直径50±5μm、细胞核内通常有2~3个大核仁，人肝癌MHCC97-H细胞平均直径43±2μm、细胞核内通常有3~7个小核仁；体外培养于含有10％人AB血清的高糖DMEM培养基中稳定传代生长增殖；体外培养人肝癌MHCC97细胞倍增时间43h，体外培养人肝癌MHCC97-L细胞倍增时间60h，体外培养人肝癌MHCC97-H细胞倍增时间34.2h；5×10⁶细胞/0.2ml/每只剂量接种于裸小鼠皮下，人肝癌MHCC97成瘤潜伏期为15~20d、人肝癌MHCC97-L成瘤潜伏期为21.3±2.5d、人肝癌MHCC97-H成瘤潜伏期为6.4±2.2d。

1.1.2人肝癌MHCC97-L细胞裸小鼠移植瘤模型：把体外培养人肝癌MHCC97-L细胞，按照5×10⁶细胞/0.2ml/每只剂量，分别注射接种于6只裸小鼠腋下。接种移植瘤株30d~32d，乙醚麻醉荷瘤裸小鼠，手术剥离取出肿瘤组织，称重；选取其中1个肿瘤细胞组织生长性状最好、没有发生组织坏死、肿瘤重量大于0.6g的肿瘤。采用常规机械法把肿瘤组织制成2.5×10⁷细胞/ml单细胞悬液，按照5×10⁶细胞/0.2ml/每只剂量，分别注射接种于80只裸小鼠腋下；按照1.5法，分别于接种移植瘤株不同时间0d乙醚麻醉采血处死20只裸小鼠，7d、14d、21d、28d、30d、35d各自乙醚麻醉采血处死10只裸小鼠，制取血清备用。分别手术剥离取出在各自动物机体发生的不同成瘤生长时间肿瘤组织，用卡尺测量肿瘤组织的长、短径，称重，记录；置于2％多聚甲醛、0.5％戊二醛、0.2％苦味酸、0.1mol/L磷酸缓冲液的固定液中固定；制作组织切片Giemsa染色、400×肿瘤细胞组织光镜形态学观察数码照相图片资料储存备用。选取另1个肿瘤细胞组织生长性状最好、没有发生组织坏死、肿瘤重量大于0.5g的肿瘤。用常规机械法把肿瘤组织制成2.5×10⁷细胞/ml单细胞悬液，按照5×10⁶细胞/0.2ml/每只剂量，分别注射接种于30只裸小鼠皮下，实施下述：2.模拟人类小原位癌—肿瘤与机体微环境演进转化-改变生物调控、生物应答动物模型实验。

1.1.3人肝癌MHCC97-H细胞裸小鼠移植瘤模型：把体外培养人肝癌MHCC97-H细胞，按照5×10⁶细胞/0.2ml/每只剂量，注射接种于6只裸小鼠腋下。接种移植瘤株28d~30d，乙醚麻醉荷瘤裸小鼠，手术剥离取出肿瘤组织，称重；选取其中1个肿瘤细胞组织生长性状最好、没有发生组织坏死、肿瘤重量大于0.6g的肿瘤。采用常规机械法把肿瘤组织制成2.5×10⁷细胞/ml单细胞悬液，按照5×10⁶细胞/0.2ml/每只剂量，分别注射接种于60只裸小鼠腋下；按照1.1.5法，分别于接种移植瘤株不同时间0d、7d、14d、21d、28d、35d各自乙醚麻醉采血处死10只裸小鼠，制取血清备用。分别手术剥离取出在各自动物机体发生的不同成瘤生长时间肿瘤组织，用卡尺测量肿瘤组织的长、短径，称重，记录；置于固定液中固定；制作组织切片Giemsa染色、400×肿瘤细胞组织光镜形态学观察数码照相图片资料储存备用。按照5×10⁶细胞/0.2ml/每只剂量，分别注射接种于10只裸小鼠皮下，实施下述：2.模拟人类小原位癌—肿瘤与机体微环境演进转化-改变生物调控、生物应答动物模型实验。

1.1.4人肝癌MHCC97-LH异质混合细胞裸小鼠移植瘤模型：分别把人肝癌MHCC97-L肿瘤组织/人肝癌MHCC97-H肿瘤组织制成，人肝癌MHCC97-L细胞的2.5×10⁷细胞/ml单细胞悬液、人肝癌MHCC97-H细胞的2.5×10⁷细胞/ml单细胞悬液，1∶1相互混合均匀，按照5×10⁶异质混合细胞/0.2ml/每只剂量，分别注射接种于60只裸小鼠腋下；按照1.1.5法，分别于接种移植瘤株不同时间0d、7d、14d、21d、28d、35d各自乙醚麻醉采血处死10只裸小鼠，制取血清备用。分别手术剥离取出在各自动物机体发生的不同成瘤生长时间肿瘤组织，用卡尺测量肿瘤组织的长、短径，称重，记录；置于固定液中固定；制作组织切片Giemsa染色、400×肿瘤细胞组织光镜形态学观察数码照相图片资料储存备用。按照5×10⁶异质混合细胞/0.2ml/每只剂量，分别注射接种于10只裸小鼠皮下，实施下述：2.模拟人类小原位癌—肿瘤与机体微环境演进转化-改变生物调控、生物应答动物模型实验。

1.1.5分别制取接种不同人肝癌MHCC97-L/H/LH移植瘤株，0d、7d、14d、21d、28d、35d不同荷瘤时间采血的裸小鼠的血清：分别乙醚麻醉接种L/H/LH不同移植瘤株/不同荷瘤时间采血的裸小鼠，把动物仰卧固定。正中切口入腹。把肠子用纱布保护好放置在腹腔外左侧。通过尾静脉用5号针注射0.4ml林格氏液，注射速度0.05ml/s~0.1ml/s，注射完毕后先用丝线结扎注射前端止血，再抽出注射针。轻轻分开脊柱前的脂肪，暴露腹主动脉；在腹主动脉远心端用丝线打一个节，再用拉线阻断腹主动脉近心端，然后在其间平行刺入，并松开近心端阻断拉线，立即采血。当动物呼吸减弱时，挤压动物胸腔辅助呼吸同时不断挤出心脏残余血液。或实施动物心脏穿刺采血。分别把接种L/H/LH不同移植瘤株/不同荷瘤时间采血的裸小鼠的血，集中注入各自的4℃低温保存离心管内收集完成后，以2000g离心10min，离心后4℃低温静置60min；然后用血管钳挤压血凝块，挤出内含的血清；弃去血凝块，再以5~10000g离心60min。把取自于接种L/H/LH不同移植瘤株/不同荷瘤时间采血的裸小鼠的血清编号——Ln/Hn/LHn，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d；各自分别用一系列一次性注射器式过滤器进行过滤，最后用0.1μm孔径无菌过滤器进行过滤后；分别把编号血清Ln/Hn/LHn，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d，各自分置于多个小无菌高密度聚丙烯容器，放置-70℃冰箱保存备用。

1.1.6配制DMEM葡萄糖4.5g/l培养基，-D。分别应用接种不同人肝癌MHCC97-L/H/LH移植瘤株0d、7d、14、21、28d、35d不同时间采血的裸小鼠的编号血清Ln/Hn/LHn，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d，按照裸小鼠血清/DMEM葡萄糖4.5g/l＝1/4，分别配制综合模拟接种不同人肝癌MHCC97-L/H/LH移植瘤株的裸小鼠不同生命时间进程0d、7d、14d、21d、28d、35d机体微环境(土壤)演进转化-改变的编号培养基，Ln-D/Hn-D/LHn-D，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d。分别应用编号Ln-D，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d的6种培养基，各自配制L细胞2×10⁵/ml的6种细胞悬浮液；分别应用编号Hn-D，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d的6种培养基，各自配制H细胞2×10⁵/ml的6种细胞悬浮液；分别应用编号LHn-D，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d的6种培养基，各自配制L细胞＝H细胞2×10⁵/ml的6种细胞悬浮液。分别应用含有10％AB血清DMEM葡萄糖4.5g/l培养基配制：L细胞2×10⁵/ml细胞悬浮液，H细胞2×10⁵/ml细胞悬浮液，L细胞＝H细胞2×10⁵/ml细胞悬浮液。

实施下述：3.模拟人类小原位癌—肿瘤与机体微环境演进转化-改变生物调控、生物应答体外培养人类肿瘤细胞模型实验。

2.模拟人类小原位癌—肿瘤与机体微环境演进转化-改变生物调控、生物应答动物模型实验

2.1模型生物机制特点

2.1.1现代肿瘤实验科学研究，把具有生长增殖优势、传代生长增殖速度快、能够对机体组织或器官造成致死性生物损伤的、人类肿瘤可移植瘤株10⁶~10⁸肿瘤细胞或肿瘤小块组织种子，接种到免疫有缺陷的裸小鼠机体微环境土壤，建立人类肿瘤异种动物可移植瘤模型；可以被应用于模拟在人类机体发生的小原位癌，研究揭示人类肿瘤的某些生物发生机制、生物性质。存在移植瘤株种子受到裸小鼠机体微环境土壤抑制的成瘤潜伏期，可以被认为是：能够模拟表达在人类脊椎动物机体发生存在的，具有生长增殖优势小原位癌细胞组织种子，需要与机体组织或器官微环境土壤，经历多重复杂相互诱导、相互调控转化-改变——肿瘤-微环境演进转化-改变生物调控/生物应答发生进程；才能够被相互转化-改变成为，对机体组织或器官造成致死性生物损伤的恶性肿瘤组织种子、与适合恶性肿瘤组织种子传代增殖的机体组织或器官微环境土壤；继而会在人类与脊椎动物机体发生出，对机体组织或器官造成致死性生物损伤的占位实体恶性肿瘤组织的，人类肿瘤生物发生机制的实验动物模型。

2.2实验动物模型及分组及实验实施方法

2.2.1接种人肝癌MHCC97-LH异质混合细胞裸小鼠移植瘤模型组：按照1.1.4法，把人肝癌MHCC97-L肿瘤组织、人肝癌MHCC97-H肿瘤组织制成，1∶1混合细胞悬液，按照MHCC97-L细胞2.5×10⁶细胞+MHCC97-H细胞2.5×10⁶细胞/0.2ml/每只剂量，分别注射接种10只裸小鼠便于实验观察的、胸肋弧中央处皮下。

2.2.2接种人肝癌MHCC97-H细胞裸小鼠移植瘤模型对照组：按照1.1.3法，把人肝癌MHCC97-H肿瘤组织制成的单细胞悬液，按照5×10⁶细胞/0.2ml/每只剂量，注射接种10只裸小鼠便于实验观察的、胸肋弧中央处皮下。

2.2.3接种人肝癌MHCC97-L细胞裸小鼠移植瘤模型对照组：按照1.1.2法，把人肝癌MHCC97-L肿瘤组织制成的单细胞悬液，按照5×10⁶细胞/0.2ml/每只剂量，注射接种10只裸小鼠便于实验观察的、胸肋弧中央处皮下。

2.2.4接种人肝癌MHCC97-L细胞裸小鼠移植瘤模型，注射接种瘤株30d成瘤生长期动物血清，调控移植人肝癌瘤株成瘤潜伏期、肿瘤生长速度组：按照1.1.2法，把人肝癌MHCC97-L肿瘤组织制成的单细胞悬液，按照5×10⁶细胞/0.2ml/每只剂量，注射接种10只裸小鼠便于实验观察的、胸肋弧中央处皮下。在接种瘤株后，每24h一次，距离接种瘤株边缘外5mm处，皮下注射50μl取自接种MHCC97-L瘤株30d成瘤生长期裸小鼠的血清；分别轮换在不同位置处，共皮下注射8次。

2.2.5接种人肝癌MHCC97-L细胞裸小鼠移植瘤模型，注射接种瘤株0d成瘤潜伏期动物血清对照组：按照1.1.2法，把人肝癌MHCC97-L肿瘤组织制成的单细胞悬液，按照5×10⁶细胞/0.2ml/每只剂量，注射接种10只裸小鼠便于实验观察的、胸肋弧中央处皮下。在接种瘤株后，每24h一次，距离接种瘤株边缘外5mm处，皮下注射50μl取自接种MHCC97-L瘤株0d成瘤潜伏期裸小鼠的血清；分别轮换在不同位置处，共皮下注射8次。

2.3实验观察/检测/目的评定

目测观察移植瘤株在每一只实验动物机体上出现的移植占位肿胀，移植占位肿胀消失、到肿瘤占位再次出现的成瘤潜伏期；目测观察实验动物机体上再次出现肿瘤占位，每2d一次用卡尺测量肿瘤占位的长、短径；接种瘤株28d，实施颈椎脱臼法处死荷瘤裸小鼠，手术剥离取出肿瘤组织，用卡尺测量肿瘤组织的长、短径，称重。作记录。

2.3.1应用体外细胞培养传代生长增殖速度快、肿瘤病理低分化的人肝癌MHCC97-H细胞，与体外细胞培养传代生长增殖速度慢、肿瘤病理高分化的人肝癌MHCC97-L细胞异质混合，模拟在人类机体发生的异质小原位癌，接种到免疫有缺陷的裸小鼠机体微环境土壤，建立人类肿瘤异种动物可移植瘤模型。

2.1.1接种人肝癌MHCC97-LH异质混合细胞裸小鼠移植瘤模型组的成瘤潜伏期，明显长于2.1.2接种人肝癌MHCC97-H细胞裸小鼠对照组的成瘤潜伏期，短于2.1.3接种人肝癌MHCC97-L细胞裸小鼠移植瘤模型对照组的成瘤潜伏期；人肝癌MHCC97-LH异质混合细胞裸小鼠移植瘤模型组的成瘤生长速度，慢于人肝癌MHCC97-H细胞裸小鼠对照组的成瘤生长速度，快于肝癌MHCC97-L细胞裸小鼠移植瘤模型对照组的成瘤生长速度。裸小鼠机体组织或器官微环境土壤演进转化-改变，能够使肿瘤病理低分化的人肝癌MHCC97-H细胞种子，明显延长成瘤潜伏期，失去低分化肿瘤细胞生长增殖优势；能够使肿瘤病理高分化的人肝癌MHCC97-L细胞种子，成为具有生长增殖优势、主导肿瘤组织生长的异质肿瘤细胞克隆。表明：人类与脊椎动物机体组织或器官微环境演进转化-改变，选择小原位癌细胞组织中逐步发生不同基因变异、适合在逐步发生转化-改变微环境中传代增殖、具有生长增殖优势的异质肿瘤细胞克隆；决定其是否能够在机体组织或器官微环境中转化-改变成为具有生长增殖优势、主导肿瘤组织生长的异质肿瘤细胞克隆。应用上述3种人类肿瘤异种动物可移植瘤模型，综合表达人类肿瘤生物表达性状能够被机体微环境演进转化-改变调控，可信服的科学实验结果，证实：人类与脊椎动物机体组织或器官微环境演进转化-改变，使最初发生、受到机体组织或器官微环境抑制的异质人类小原位癌细胞组织，转化-改变成为适合在演进转化-改变微环境中传代增殖、具有生长增殖优势的异质人类小原位癌细胞组织；异质人类小原位癌细胞组织，与异质人类肿瘤细胞克隆肿瘤病理分化的高低、体外细胞培养传代增殖速度的快慢，不是决定异质人类小原位癌细胞组织、异质人类肿瘤细胞克隆能够在机体微环境中，转化-改变成为具有生长增殖优势人类肿瘤细胞克隆、构成主导肿瘤组织生长的异质人类肿瘤组织的，主要人类肿瘤发生因素；而是主要取决于机体组织或器官微环境演进转化-改变，对异质人类小原位癌细胞组织、异质人类肿瘤细胞克隆的选择，调控异质人类肿瘤细胞克隆生物表达性状、与异质人类肿瘤组织生长；继而会在人类与脊椎动物机体发生出，对机体组织或器官造成致死性生物损伤的占位实体恶性肿瘤组织。是人类肿瘤主要生物发生机制。

2.3.2给人肝癌MHCC97-L细胞裸小鼠移植瘤模型，在移植瘤株处附近皮下、多次注射取自接种MHCC97-L瘤株30d成瘤生长期裸小鼠的血清，使成瘤潜伏期移植瘤株接种处局部微环境、发生成瘤生长期的转化-改变，缩短人肝癌MHCC97-L移植瘤株在裸小鼠机体受到抑制的成瘤潜伏期。应用上述人类肿瘤异种动物可移植瘤模型，实施机体微环境演进转化-改变调控人类肿瘤生物表达性状实验，可信服的科学实验结果，进一步证实：人类肿瘤生物表达性状能够被机体微环境演进转化-改变调控；人类与脊椎动物机体组织或器官微环境演进转化-改变，使最初发生、受到机体组织或器官微环境抑制的人类小原位癌细胞组织，转化-改变成为适合在演进转化-改变微环境中传代增殖、具有生长增殖优势的人类肿瘤细胞克隆小原位癌细胞组织；决定其是否能够在机体组织或器官微环境中，转化-改变成为具有生长增殖优势人类肿瘤细胞克隆、构成主导肿瘤组织生长的人类肿瘤组织；调控人类肿瘤细胞克隆的生物表达性状、与人类肿瘤组织生长；继而会在人类与脊椎动物机体发生出，对机体组织或器官造成致死性生物损伤的占位实体恶性肿瘤组织。是人类肿瘤主要生物发生机制。

2.3.3调出1.制备生物实验材料，创造人肝癌MHCC97-L细胞裸小鼠移植瘤模型、人肝癌MHCC97-H细胞裸小鼠移植瘤模型、人肝癌MHCC97-LH异质混合细胞裸小鼠移植瘤模型，各自动物机体发生的不同成瘤生长时间肿瘤细胞组织的、光镜形态学观察数码照相图片资料；对比分析异质人肝癌MHCC97-L细胞克隆移植瘤株、人肝癌MHCC97-H细胞克隆移植瘤株、人肝癌MHCC97-LH异质混合细胞移植瘤株，分别在裸小鼠机体微环境成瘤生长的肿瘤细胞组织形态。人肝癌MHCC97-LH异质混合细胞裸小鼠移植瘤模型，在裸小鼠机体微环境成瘤生长的异质混合细胞肿瘤组织，L肿瘤细胞与H肿瘤细胞的比例，不同成瘤生长时间的比例存在渐进变化差异，肿瘤病理高分化、体外细胞培养传代增殖速度慢的人肝癌MHCC97-L细胞种子，成为具有生长增殖优势、主导肿瘤组织生长的异质肿瘤细胞克隆；L肿瘤细胞形态、与人肝癌MHCC97-L细胞裸小鼠移植瘤模型的L肿瘤细胞形态存在差异，H肿瘤细胞形态、与人肝癌MHCC97-H细胞裸小鼠移植瘤模型的H肿瘤细胞形态存在差异；不同成瘤生长时间的肿瘤细胞形态存在差异。应用上述3种人类肿瘤异种动物可移植瘤模型表达的，可信服的肿瘤细胞组织形态学对比分析科学实验结果，进一步从不同的科学研究层面证实：人类肿瘤生物表达性状能够被机体微环境演进转化-改变调控；在人类机体发生的异质小原位癌细胞组织，与异质肿瘤细胞克隆肿瘤病理分化的高低、体外细胞培养传代增殖速度的快慢，不是决定异质人类小原位癌细胞组织、异质人类肿瘤细胞克隆能够在机体微环境中，转化-改变成为具有生长增殖优势人类肿瘤细胞克隆、构成主导肿瘤组织生长的人类肿瘤组织的，主要人类肿瘤发生因素；而是主要取决于机体组织或器官微环境演进转化-改变，对异质人类小原位癌细胞组织、异质人类肿瘤细胞克隆的选择，调控异质人类肿瘤细胞克隆生物表达性状、与异质人类肿瘤组织生长；继而会在人类与脊椎动物机体发生出，对机体组织或器官造成致死性生物损伤的占位实体恶性肿瘤组织。是人类肿瘤主要生物发生机制。

3.模拟人类小原位癌—肿瘤与机体微环境演进转化-改变生物调控、生物应答体外培养人类肿瘤细胞模型实验

3.1模型生物机制特点

3.1.1人肝癌MHCC97-L细胞裸小鼠移植瘤模型、人肝癌MHCC97-H细胞裸小鼠移植瘤模型、人肝癌MHCC97-LH异质混合细胞裸小鼠移植瘤模型，机体血液循环血清分子生物物质成分生物质谱——蛋白质组表达谱，在接种瘤株后不同生命时间进程发生的演进转化-改变，表达各自裸小鼠移植瘤模型的肿瘤-微环境演进转化-改变生物调控/生物应答，机体微环境演进转化-改变的重要综合分子肿瘤生物调控机制。分别检测、综合分析人肝癌MHCC97-L细胞裸小鼠移植瘤模型、人肝癌MHCC97-H细胞裸小鼠移植瘤模型、人肝癌MHCC97-LH异质混合细胞裸小鼠移植瘤模型，接种移植瘤株0d、7d、14、21、28d、35d不同时间采血的裸小鼠的编号血清Ln/Hn/LHn，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d，分子生物物质成分生物质谱——蛋白质组表达谱演进转化-改变：能够被应用于模凝分析揭示人类与脊椎动物机体组织或器官微环境演进转化-改变，使最初发生、受到机体组织或器官微环境抑制的人类小原位癌细胞组织转化-改变成为，适合在演进转化-改变微环境中传代增殖、具有生长增殖优势的人类肿瘤细胞克隆小原位癌细胞组织；决定其是否能够在机体组织或器官微环境中转化-改变成为，具有生长增殖优势人类肿瘤细胞克隆构成、主导肿瘤组织生长的人类肿瘤组织；调控人类肿瘤细胞克隆的生物表达性状、与人类肿瘤组织生长的，由人类与脊椎动物机体微环境演进转化-改变的 血清相 关分子肿瘤生物物质成分生物质谱——蛋白质组表达谱表达的，重要综合分子肿瘤生物调控机制。分别应用人肝癌MHCC97-L细胞裸小鼠移植瘤模型、人肝癌MHCC97-H细胞裸小鼠移植瘤模型、人肝癌MHCC97-LH异质混合细胞裸小鼠移植瘤模型，各自不同生命时间发生进程的编号血清Ln/Hn/LHn，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d，分别配制能够模凝接种不同人肝癌MHCC97-L/H/LH移植瘤株的裸小鼠不同生命时间进程0d、7d、14d、21d、28d、35d机体微环境土壤演进转化-改变的编号培养基Ln-D/Hn-D/LHn-D，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d，体外培养各自肿瘤细胞：能够被应用于模凝分析揭示最初发生、受到机体组织或器官微环境抑制的人类小原位癌细胞组织转化-改变成为，适合在演进转化-改变微环境中传代增殖、具有生长增殖优势的人类肿瘤细胞克隆小原位癌细胞组织；能够在机体组织或器官微环境中转化-改变成为，具有生长增殖优势人类肿瘤细胞克隆、构成主导肿瘤组织生长的人类肿瘤组织；机体微环境演进转化-改变，调控人类肿瘤细胞克隆的生物表达性状、与人类肿瘤组织生长，由人类(脊椎动物)机体微环境演进转化-改变的 血清相关分 子肿瘤生物物质成分生物质谱——蛋白质组表达谱调控的，演进转化-改变的肿瘤相关人类基因表达谱，重要综合分子肿瘤生物应答机制。

3.2实验分组及实验实施方法

3.2.1按照1.1.6法，分别应用模拟接种人肝癌MHCC97-L细胞瘤株0d、7d、14d、21d、28d、35d裸小鼠机体微环境演进转化-改变的6种编号培养基Ln-D，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d，各自配制L细胞2×10⁵/ml细胞悬浮液；应用含有10％AB人血清DMEM葡萄糖4.5g/l培养基配制，L细胞2×10⁵/ml细胞悬浮液。在一块24孔板上，分别实施6种编号培养基Ln-D，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d，体外培养人肝癌MHCC97-L细胞。每种编号培养基各3孔，每孔灌注1ml应用各自编号培养基Ln-D，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d配制L细胞2×10⁵/ml细胞悬浮液；在有一定湿度，5％CO2的37℃温箱中培养；培养72h时各自换1次各自编号培养基Ln-D。培养144h，停止培养；同时在24孔板上加一组人肝癌MHCC97-L细胞培养0h对照组，设置3孔，每孔灌注1ml应用高糖DMEM培养基配制L细胞2×10⁵/ml细胞悬浮液。分别收集各种培养基各自3个培养孔培养肿瘤细胞，分别做：制备涂片Giemsa染色、400×培养肿瘤细胞光镜形态学观察数码照相图片资料储存备用；培养肿瘤细胞生长周期与生长曲线测定；置于液氮冷冻保存，准备做培养肿瘤细胞人类基因表达谱检测。

3.2.2按照1.1.6法，分别应用模拟接种人肝癌MHCC97-H细胞瘤株0d、7d、14d、21d、28d、35d裸小鼠机体微环境演进转化-改变的6种编号培养基Hn-D，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d，各自配制H细胞2×10⁵/ml细胞悬浮液；应用含有10％AB人血清DMEM葡萄糖4.5g/l培养基配制，H细胞2×10⁵/ml细胞悬浮液。在一块24孔板上，分别实施6种编号培养基Hn-D，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d，体外培养人肝癌MHCC97-H细胞。每种编号培养基各3孔，每孔灌注1ml应用各自编号培养基Hn-D，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d配制H细胞2×10⁵/ml细胞悬浮液；在有一定湿度，5％CO2的37℃温箱中培养；培养72h时各自换1次各自编号培养基Hn-D。培养144h，停止培养；同时在24孔板上加一组人肝癌MHCC97-H细胞培养0h对照组，设置3孔，每孔灌注1ml应用高糖DMEM培养基配制H细胞2×10⁵/ml细胞悬浮液。分别收集各种培养基各自3个培养孔培养肿瘤细胞，分别做：制备涂片Giemsa染色、400×培养肿瘤细胞光镜形态学观察数码照相图片资料储存备用；培养肿瘤细胞生长周期与生长曲线测定；置于液氮冷冻保存，准备做培养肿瘤细胞人类基因表达谱检测。

3.2.3按照1.1.6法，分别应用模拟接种人肝癌MHCC97-LH异质混合细胞瘤株0d、7d、14d、21d、28d、35d裸小鼠机体微环境演进转化-改变的6种编号培养基LHn-D，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d，各自配制L细胞＝H细胞2×10⁵/ml混合细胞悬浮液；应用含有10％AB人血清DMEM葡萄糖4.5g/l培养基配制L细胞＝H细胞2×10⁵/ml混合细胞悬浮液。在一块24孔板上，分别实施6种编号培养基LHn-D，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d，体外培养人肝癌MHCC97-LH异质混合细胞。每种编号培养基各3孔，每孔灌注1ml应用各自编号培养基LHn-D，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d配制L细胞＝H细胞2×10⁵/ml细胞悬浮液；在有一定湿度，5％CO2的37℃温箱中培养；培养72h时各自换1次各自编号培养基LHn-D。培养144h，停止培养；同时在24孔板上加一组人肝癌MHCC97-LH异质混合细胞培养0h对照组，设置3孔，每孔灌注1ml应用高糖DMEM培养基配制LH异质混合细胞2×10⁵/ml细胞悬浮液。分别收集各种培养基各自3个培养孔培养肿瘤细胞，分别做：制备涂片Giemsa染色、400×培养肿瘤细胞光镜形态学观察数码照相图片资料储存备用；培养肿瘤细胞生长周期与生长曲线测定；置于液氮冷冻保存，准备做培养肿瘤细胞人类基因表达谱检测。

3.2.4按照1.1.6法，应用L_0d-D培养基，配制L细胞2×10⁵/ml细胞悬浮液4ml，分置于2个10号培养瓶；应用H_0d-D培养基，配制H细胞2×10⁵/ml细胞悬浮液4ml，分置于2个10号培养瓶；应用LH_0d-D培养基，配制L细胞＝H细胞2×10⁵/ml混合细胞悬浮液4ml，分置于2个10号培养瓶；在有一定湿度，5％CO2的37℃温箱中培养。各个养瓶培养3d时各自换1次各自编号n＝0d培养基；各个养瓶培养6d时取出50％~80％培养肿瘤细胞备用，换1次各自编号n＝7d培养基；各个培养瓶培养9d时各自换1次各自编号n＝7d培养基；各个培养瓶培养12d时取出50％~80％培养肿瘤细胞备用，换1次各自编号n＝14d培养基；各个培养瓶培养15d时各自换1次各自编号n＝14d培养基；各个培养瓶培养18d时取出50％~80％培养肿瘤细胞备用，换1次各自编号n＝21d培养基；各个培养瓶培养21d时各自换1次各自编号n＝21d培养基；各个培养瓶培养24d时取出50％~80％培养肿瘤细胞备用，换1次各自编号n＝28d培养基；各个培养瓶培养27d时各自换1次各自编号n＝28d培养基；各个培养瓶培养30d时取出50％~80％培养肿瘤细胞备用，换1次各自编号n＝35d培养基；各个培养瓶培养33d时各自换1次各自编号n＝35d培养基；各个培养瓶培养36d时结束连续培养，取出培养肿瘤细胞备用。分别对应用Ln-D培养基连续培养L细胞、Hn-D培养基连续培养H细胞、LHn-D培养基连续培养LH混合细胞，各自分别培养6d、12d、18d、24d、27d、30、36d取出的培养肿瘤细胞，分别做：制备涂片Giemsa染色、400×培养肿瘤细胞光镜形态学观察数码照相图片资料储存备用；培养肿瘤细胞生长周期与生长曲线测定；置于液氮冷冻保存，准备做培养肿瘤细胞人类基因表达谱检测。

3.3实验检测/目的评定

3.3.1通过P3级生物质谱——蛋白质组表达谱检测分析实验室，分别检测1.制备生物实验材料，人肝癌MHCC97-L细胞裸小鼠移植瘤模型、人肝癌MHCC97-H细胞裸小鼠移植瘤模型、人肝癌MHCC97-LH异质混合细胞裸小鼠移植瘤模型，分别接种移植瘤株0d、7d、14、21、28d、35d不同时间采血的裸小鼠的编号血清Ln/Hn/LHn，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d，各自血清分子生物物质成分生物质谱——蛋白质组表达谱。综合对比分析：人肝癌MHCC97-L细胞裸小鼠移植瘤模型的编号血清Ln，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d，由成瘤潜伏期抑制人小原位癌肿瘤细胞生长增殖、到成瘤生长期促进人小原位癌肿瘤细胞生长增殖、到发生致死性肿瘤，血清分子生物物质成分生物质谱——蛋白质组表达谱演进转化-改变；人肝癌MHCC97-H细胞裸小鼠移植瘤模型的编号血清Hn，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d，由成瘤潜伏期抑制人小原位癌肿瘤细胞生长增殖、到成瘤生长期促进人小原位癌肿瘤细胞生长增殖、到发生致死性肿瘤，血清分子生物物质成分生物质谱——蛋白质组表达谱演进转化-改变；人肝癌MHCC97-LH异质混合细胞裸小鼠移植瘤模型的编号血清LHn，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d，由成瘤潜伏期抑制人小原位癌肿瘤细胞生长增殖、到成瘤生长期促进人小原位癌肿瘤细胞生长增殖、到发生致死性肿瘤，血清分子生物物质成分生物质谱——蛋白质组表达谱演进转化-改变。模拟分析揭示人类与脊椎动物机体组织或器官微环境演进转化-改变，使最初发生、受到机体组织或器官微环境抑制的人类小原位癌细胞组织转化-改变成为，适合在演进转化-改变微环境中传代增殖、具有生长增殖优势的人类肿瘤细胞克隆小原位癌细胞组织；决定其是否能够在机体组织或器官微环境中转化-改变成为，具有生长增殖优势人类肿瘤细胞克隆构成、主导肿瘤组织生长的人类肿瘤组织；调控人类肿瘤细胞克隆的生物表达性状、与人类肿瘤组织生长，由人类与脊椎动物机体微环境演进转化-改变的 血清相关分子肿瘤 生物物质成分生物质谱——蛋白质组表达谱表达的，重要综合分子肿瘤生物调控机制。

3.3.2通过P3级细胞基因表达谱生物芯片检测分析实验室，应用人类基因表达检测生物芯片分别检测：3.2.1/3.2.2/3.2.3/3.2.4，分别应用模拟人肝癌MHCC97-L细胞裸小鼠移植瘤模型、人肝癌MHCC97-H细胞裸小鼠移植瘤模型、人肝癌MHCC97-LH异质混合细胞裸小鼠移植瘤模型，不同生命时间进程0d、7d、14d、21d、28d、35d机体微环境土壤演进转化-改变的编号培养基Ln-D/Hn-D/LHn-D，n＝0d、7d、14d、21d、28d、35d，分别不连续体外培养各自的人肝癌肿瘤细胞、分别连续体外培养各自的人肝癌肿瘤细胞的，与 血 清相关分子肿瘤生物物质成分生物质谱——蛋白质组表达谱调控相关的人类基因表达谱。综合对比分析：模拟人肝癌MHCC97-L细胞裸小鼠移植瘤模型发生肿瘤，由成瘤潜伏期抑制人小原位癌肿瘤细胞生长增殖、到成瘤生长期促进人小原位癌肿瘤细胞生长增殖、到发生致死性肿瘤不同生命时间进程6种体外培养人肝癌肿瘤细胞的，与演进转化-改变的 血清相关分子肿瘤生物物质 成分生物质谱——蛋白质组表达谱调控相关的，演进转化-改变的 肿瘤相关人 类基因表达谱；模拟人肝癌MHCC97-H细胞裸小鼠移植瘤模型发生肿瘤，由成瘤潜伏期抑制人小原位癌肿瘤细胞生长增殖、到成瘤生长期促进人小原位癌肿瘤细胞生长增殖、到发生致死性肿瘤不同生命时间进程6种体外培养人肝癌肿瘤细胞的，与演进转化-改变的 血清相关分子肿瘤生物物质成分生物质谱 ——蛋白质组表达谱调控相关的，演进转化-改变的 肿瘤相关人类基因表达 谱；模拟人肝癌MHCC97-LH异质混合细胞裸小鼠移植瘤模型发生肿瘤，由成瘤潜伏期抑制人小原位癌肿瘤细胞生长增殖、到成瘤生长期促进人小原位癌肿瘤细胞生长增殖、到发生致死性肿瘤不同生命时间进程6种体外培养人肝癌肿瘤细胞的，与演进转化-改变的 血清相关分子肿瘤生物物质成分生物质谱 ——蛋白质组表达谱调控相关的，演进转化-改变的肿瘤相关人类基因表达谱。模拟分析揭示人类與脊椎动物机体组织或器官微环境演进转化-改变，使最初发生、受到机体组织或器官微环境抑制的人类小原位癌细胞组织转化-改变成为，适合在演进转化-改变微环境中传代增殖、具有生长增殖优势的人类肿瘤细胞克隆小原位癌细胞组织；决定其是否能够在机体组织或器官微环境中转化-改变成为，具有生长增殖优势人类肿瘤细胞克隆构成、主导肿瘤组织生长的人类肿瘤组织；调控人类肿瘤细胞克隆的生物表达性状、与人类肿瘤组织生长，由人类与脊椎动物机体微环境演进转化-改变的 血清相关分子肿瘤 生物物质成分生物质谱——蛋白质组表达谱调控的，演进转化-改变的 肿瘤相 关人类基因表达谱，重要综合分子肿瘤生物应答机制。

4.相似动物肿瘤模型与方法

采用中国科学院实验生物学研究所1974年建立的大鼠肝细胞癌BERH-2细胞系，能够应用免疫机制正常的动物Wistar大鼠实施，与上述1.2.3.相似的各项动物肝细胞癌肿瘤模型、动物肿瘤细胞体外培养实验；实验实施方法与上述1.2.3.相同。不再作赘述。能够在相关动物肿瘤实验方法证实：动物肿瘤生物表达性状，能够被免疫机制正常的动物机体微环境演进转化-改变调控；调控动物肿瘤细胞克隆生物表达性状、与动物肿瘤组织生长；继而会在动物机体发生出，对机体组织或器官造成致死性生物损伤的占位实体恶性肿瘤组织。是动物肿瘤生物发生机制。能够用免疫机制正常的动物，通过实施3.相似的实验揭示：动物机体微环境演进转化-改变的 血清相关分子肿瘤生物 物质成分生物质谱——蛋白质组表达谱表达的，重要综合分子肿瘤生物调控机制；由动物机体微环境演进转化-改变的 血清相关分子肿瘤生物物质成分生 物质谱——蛋白质组表达谱调控的，演进转化-改变的肿瘤相关动物基因表达谱，重要综合分子肿瘤生物应答机制。

5.综合科学研究讨论

5.1.1通过实施2.模拟人类小原位癌—肿瘤与机体微环境演进转化-改变生物调控、生物应答动物模型实验，与4.相似动物肿瘤模型实验，用可信服的科学实验结果，从不同的科学研究层面证实：人类与脊椎动物肿瘤生物表达性状能够被机体微环境演进转化-改变调控；在人类与脊椎动物机体发生的异质小原位癌细胞组织，与异质肿瘤细胞克隆肿瘤病理分化的高低、体外细胞培养传代增殖速度的快慢，不是决定异质人类与脊椎动物小原位癌细胞组织、异质人类与脊椎动物肿瘤细胞克隆能够在机体微环境中，转化-改变成为具有生长增殖优势人类与脊椎动物肿瘤细胞克隆、构成主导肿瘤组织生长的人类与脊椎动物肿瘤组织的，主要人类与脊椎动物肿瘤发生因素；而是主要取决于机体组织或器官微环境演进转化-改变，对异质人类与脊椎动物小原位癌细胞组织、异质人类与脊椎动物肿瘤细胞克隆的选择，调控异质人类肿瘤细胞克隆生物表达性状、与异质人类肿瘤组织生长；继而会在人类与脊椎动物机体发生出，对机体组织或器官造成致死性生物损伤的占位实体恶性肿瘤组织。是人类与脊椎动物肿瘤主要生物发生机制。通过实施3.模拟人类小原位癌—肿瘤与机体微环境演进转化-改变生物调控、生物应答体外培养人类肿瘤细胞模型实验，与4.相似体外培养动物肿瘤细胞模型实验：模拟分析揭示人类与脊椎动物机体组织或器官微环境演进转化-改变，使最初发生、受到机体组织或器官微环境抑制的人类与脊椎动物小原位癌细胞组织转化-改变成为，适合在演进转化-改变微环境中传代增殖、具有生长增殖优势的人类与脊椎动物肿瘤细胞克隆小原位癌细胞组织；决定其是否能够在机体组织或器官微环境中转化-改变成为，具有生长增殖优势人类与脊椎动物肿瘤细胞克隆构成、主导肿瘤组织生长的人类与脊椎动物肿瘤组织；调控人类与脊椎动物肿瘤细胞克隆的生物表达性状、人类与脊椎动物肿瘤组织生长，由人类与脊椎动物机体微环境演进转化-改变的 血清相关分子肿瘤生物物质成分生物质谱——蛋白 质组表达谱表达的，重要综合分子肿瘤生物调控机制；由人类与脊椎动物机体微环境演进转化-改变的 血清相关分子肿瘤生物物质成分生物质谱——蛋 白质组表达谱调控的，演进转化-改变的 肿瘤相关人类与脊椎动物基因表达 谱，重要综合分子肿瘤生物应答机制。创造揭示某些种人类与脊椎动物实体恶性肿瘤与机体微环境演进转化-改变综合分子肿瘤生物调控机制、综合分子肿瘤生物应答机制、综合分子肿瘤生物预防治疗机制方法及药物的，人类、脊椎动物肿瘤模型与方法，综合人类、脊椎动物肿瘤模型科学研究实验平台，在理论与科学研究方法上，不存在不可实施的现代生物科学技术难点。

5.1.2能够为现代分子肿瘤生物检测科学技术，今后可以有效检测出在当今人类群体中临床自然发病率最高的肺癌、胃癌、大肠癌、乳腺癌、肝癌……等，某些种传代增殖10⁶~10⁷肿瘤细胞、尚不能对肿瘤发生位置做出精确定位的小原位癌细胞组织，监测小原位癌细胞组织是否能够转化成为致死性占位实体恶性肿瘤；提供有效检测、监测小原位癌细胞组织的 相关分子肿瘤生物 物质成分生物质谱——蛋白质组表达谱靶标；设计制造能够有效检测、监测小原位癌细胞组织的相应靶标的生物芯片，应用于人类群体可能发生的小原位癌细胞组织的分子肿瘤生物检测、监测。能够为现代医学今后可能有效预防在当今人类群体中临床自然发病率最高的肺癌、胃癌、大肠癌、乳腺癌、肝癌……等，某些种传代增殖10⁶~10⁷肿瘤细胞、尚不能对肿瘤发生位置做出精确定位的小原位癌细胞组织，转化成为致死性占位实体恶性肿瘤；今后可能有效长期缓解治疗某些种已经发生肿瘤转移的中/晚期致死性实体恶性肿瘤；提供能够拮抗-抑制肿瘤细胞组织生长增殖的 相关分子肿瘤生物物质成分 生物质谱——蛋白质组表达谱靶标、 肿瘤相关人类基因表达谱靶标；依照相应的靶标，设计制造能够有效拮抗-抑制肿瘤细胞组织生长增殖的药物，应用于临床生物预防癌症、临床生物抗肿瘤治疗。在肿瘤基础医学科学研究方面、临床医学科学研究方面、医药学科学研究方面，提供综合科学研究研究方法。

Claims (12)

1.一种肿瘤模型与方法，其特征在于：制取机体生长出动物肿瘤(1)动物(2)血液制品(3)、机体没有生长动物肿瘤(1)同种动物(2)血液制品(4)，分别配制含有血液制品(3)细胞培养基(5)、含有血液制品(4)细胞培养基(5)分别培养动物肿瘤(1)细胞。

2.一种肿瘤模型与方法，其特征在于：制取机体生长出动物肿瘤(1)动物(2)血液制品(3)、机体没有生长动物肿瘤(1)同种动物(2)血液制品(4)，分别配制含有血液制品(3)细胞培养基(5)、含有血液制品(4)细胞培养基(5)分别培养动物肿瘤(1)细胞，通过分别对血液制品(3)、血液制品(4)。培养动物肿瘤(1)细胞实施人类基因表达检测(6)对比分析，揭示人类肿瘤发生机制、治疗机制、方法及药物。

3.一种肿瘤模型与方法，其特征在于：制取机体生长出动物肿瘤(1)动物(2)的血液制品(3)、机体没有生长动物肿瘤(1)同种动物(2)血液制品(4)，通过分别对血液制品(3)、血液制品(4)实施生物质谱检测(7)对比分析，揭示人类肿瘤发生机制、治疗机制、方法及药物。

4.根据权利要求1至3中所述的肿瘤模型与方法，其特征在于：动物(2)是免疫机制有缺陷的动物(8)。

5.根据权利要求1至4中所述的肿瘤模型与方法，其特征在于：动物(2)是免疫机制有缺陷的动物裸小鼠(9)。

6.根据权利要求1至5中所述的肿瘤模型与方法，其特征在于：动物(2)血液制品(3)、动物(2)血液制品(4)是动物血清(10)。

7.根据权利要求1至6中所述的肿瘤模型与方法，其特征在于：动物肿瘤(1)是人类肿瘤(11)、培养动物肿瘤(1)细胞是培养人类肿瘤(11)细胞。

8.根据权利要求1至6中所述的肿瘤模型与方法，其特征在于：动物肿瘤(1)是人类肺癌(12)、培养动物肿瘤(1)细胞是培养人类肺癌(12)细胞。

9.根据权利要求1至6中所述的肿瘤模型与方法，其特征在于：动物肿瘤(1)是人类胃癌(13)、培养动物肿瘤(1)细胞是培养人类胃癌(13)细胞。

10.根据权利要求1至6中所述的肿瘤模型与方法，其特征在于：动物肿瘤(1)是人类乳腺癌(14)、培养动物肿瘤(1)细胞是培养人类乳腺癌(14)细胞。

11.根据权利要求1至6中所述的肿瘤模型与方法，其特征在于：动物肿瘤(1)是人类前列腺癌(15)、培养动物肿瘤(1)细胞是培养人类前列腺癌(15)细胞。

12.根据权利要求1至6中所述的肿瘤模型与方法，其特征在于：动物肿瘤(1)是人类大肠癌(16)、培养动物肿瘤(1)细胞是培养人类大肠癌(16)细胞。