CN102168063A

CN102168063A - 一种鱼类肠道粘膜细胞分离和原代培养方法

Info

Publication number: CN102168063A
Application number: CN 201010620104
Authority: CN
Inventors: 叶元土; 蔡春芳; 张宝彤; 周志刚; 姚仕彬; 秦杰
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2010-12-31
Publication date: 2011-08-31
Anticipated expiration: 2030-12-31
Also published as: CN102168063B

Abstract

本发明属于动物肠道粘膜细胞分离和培养领域，具体涉及一种鱼类肠道粘膜细胞分离和原代培养方法，包括取材和培养两个步骤：按照常规方法取出鱼的肠道，清除肠道外脂肪，然后采用下述两种方法中的任一种消化分离鱼类肠道粘膜细胞，得到含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液：将所得含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，离心得到粘膜细胞和细胞团的混合物，作为原代培养的接种材料细胞；所述培养步骤中，以鱼皮胶原蛋白作为培养支持载体，以改良的DMEM液作为培养基，以改良的D-Hanks液作为平衡盐溶液，在培养温度26～28℃下，pH7.2-7.4条件下进行原代培养24小时以上即可贴壁生长。采用本发明所得鱼类肠道粘膜细胞生长良好，结构和功能性标志性指标体系完善。

Description

一种鱼类肠道粘膜细胞分离和原代培养方法

技术领域

本发明属于动物肠道粘膜细胞分离和培养领域，具体涉及一种鱼类肠道粘膜细胞分离和原代培养方法。

背景技术

细胞是动物的结构和功能的基本组成单位，利用培养的细胞作为实验材料在细胞结构、功能损伤作用机理等基础理论研究、新型药物筛选、新型饲料添加剂研究等众多研究领域得到广泛性的使用，与活体动物（鱼类）相比较，具有研究周期短、实验条件容易控制、可以实现批量化的规模性实验、实验结果重复性好等优点，且使用原代培养细胞较使用细胞系进行实验的技术难度降低、实验成本降低，也更接近于鱼体自身生理条件。

鱼类是生活于水域环境的变温动物，与陆生恒温动物在许多方面有显著性的差异。现代基础科学研究和水产药物、水产动物营养产业发展需要建立鱼类细胞实验模型和研究的实验平台，这是推动鱼类基础研究和相关产业技术研究发展的重要关键性领域。鱼类肠道粘膜细胞是研究鱼类消化和吸收生理机制、饲料非营养物质对肠道损伤与修复机制、筛选防治肠道粘膜细胞损伤的药物或饲料添加剂的重要基础性实验模型和实验平台，具有重要的意义。

但是，现有技术中，鱼类肠道粘膜细胞研究领域目前还没有成熟的细胞系，因此只能利用肠道粘膜原代细胞作为细胞材料。利用从健康鱼体肠道分离肠道粘膜细胞并进行原代培养，以原代培养的粘膜细胞作为不同实验研究材料仍然面临下列难题：

⑴利用胶原蛋白酶分离肠道粘膜细胞是动物肠道粘膜细胞分离主要的技术，但传统方法主要适合陆生恒温动物如小白鼠、大鼠、家禽等，对于水生的变温动物不完全适用，具体地，首先，现有技术中适用于陆生恒温动物肠道粘膜细胞分离的胶原蛋白酶种类、酶浓度不适用于鱼类肠道粘膜细胞分离；其次，传统的方法是将肠道剪碎后进行胶原蛋白酶的消化处理，但得到的细胞、组织块、死细胞等混杂，是细胞的分离难度很大，同时，破碎的细胞、组织是细胞内溶酶体释放出很多水解酶类，对分离的细胞产生较大的影响。因此，需要研究一种适用于鱼类的肠道粘膜细胞的消化分离方法，要求得到纯净的、生理功能性完整的粘膜细胞、细胞团；

⑵现有技术中，通常采用鼠尾胶原作为细胞培养和生长的细胞支持载体，但是效果不理想，因此需要筛选适用于鱼类细胞培养、生长的细胞支持载体。我们利用鱼皮胶原蛋白作为鱼类肠道粘膜细胞培养的支持载体，细胞生长效果、细胞功能性显著优于利用鼠尾胶原的效果；

⑶需要调整鱼类肠道粘膜细胞接种的细胞、细胞团浓度，含有一定量的粘膜细胞团更有利于鱼类肠道粘膜细胞的生长，尤其是新生培养细胞的凝聚效果更好；

⑷现有技术中，适用于陆生恒温动物的细胞原代培养的条件不适用于鱼类，因为，例如：鱼类是长期生活在水域环境中的变温水生动物，其肠道粘膜细胞的培养条件如温度等与陆生恒温动物有很大的差异；鱼类是生活在水域环境中，鱼类细胞生长需要的参透压与陆生动物有差异，鱼类细胞培养液要做适当的调整。

发明内容

本发明目的是提供一种鱼类肠道粘膜细胞分离和原代培养方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种鱼类肠道粘膜细胞的分离和原代培养方法，包括取材和培养两个步骤，其中，所述取材步骤包括消化和分离、步骤，具体为：

1、消化：按照常规方法取出鱼的肠道，清除肠道外脂肪，然后采用下述两种方法中的任一种消化分离鱼类肠道粘膜细胞，得到含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液：

方法一：使用含抗生素的D-Hanks液冲洗肠道粘膜表面，去除肠道粘膜表面的黏液与杂物，然后结扎肠道的一端，向肠道内灌注体积为50%~70%肠道内容积的混合消化液，结扎剩余的肠道一端；然后在25~30℃水浴中消化20～40min，再向肠道加入含质量分数5~6%新生牛血清的DMEM，用镊子提起肠道的两端，反复振荡5～8次，终止消化；放出含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，备用；

方法二：将肠道完全翻转，黏膜面朝外，肠壁朝内，使用含抗生素的D-Hanks液冲洗肠道粘膜表面，，去除肠道粘膜表面的黏液与杂物，然后结扎肠道的两端，将肠道浸没在混合消化液中，在25~30℃水浴中消化20～40min，再向混合消化液中加入含质量分数5~6%新生牛血清的DMEM，反复振荡5～8次，终止消化；取出肠道，得到含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，备用；

2、分离：取步骤1所得含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，在300r/min～500r/min的转速下离心3～5min，得到粘膜细胞和细胞团的混合物，以所得粘膜细胞和细胞团的混合物作为原代培养的接种材料细胞；

所述培养步骤中，以鱼皮胶原蛋白作为培养支持载体，以改良的DMEM液作为培养基，以改良的D-Hanks液作为平衡盐溶液，按照2.3×10⁴个/cm²～4.7×10⁴个/cm²的粘膜细胞和细胞团浓度，将粘膜细胞和细胞团的混合物加入到培养基中，在培养温度26～28℃下，pH7.2-7.4条件下进行原代培养24小时以上即可贴壁生长。

上述技术方案中，消化步骤中，所述含抗生素的D-Hanks的配置方法为：使用前临时在D-Hanks液中加入抗生素青霉素、庆大霉素、链霉素，并且青霉素浓度为20万U/L、庆大霉素浓度为20万U/L、链霉素浓度为200mg/L；所述混合消化液含胶原酶Ⅰ 0.15～0.3mg/ml、胶原酶Ⅳ0.15～0.3mg/ml，混合消化液的使用量为：体重100g/尾左右的鱼体大约需要3～8ml，DMEM的使用量为：体重100g/尾左右的鱼体大约需要3～8ml。

上述技术方案中，分离步骤所得粘膜细胞和细胞团的混合物中，细胞和细胞团的数量比为2.5～5比1。

上述技术方案中，所述培养支持载体鱼皮胶原蛋的制备方法、鱼皮胶原蛋白包被培养板的方法可参照申请号为201010288301.0的中国发明专利申请，具体地，一种鱼皮胶原蛋白的制备方法，包括原料处理、提取、盐析、纯化透析干燥步骤，其中，所述原料处理、提取步骤具体包括：⑴原料处理：清除鱼鳞，将鱼皮剪成碎粒，按照固液比为1︰15~25，将氢氧化钠（NaOH）水溶液加入鱼皮碎粒，1~5℃下浸泡3~5h，用20目筛卷网过滤得鱼皮滤渣，风干；以鱼皮滤渣的体积份为1份，用3~5份的无水乙醚于35~40℃回流3~4h，除去鱼皮的脂肪，然后风干，得到除脂后的鱼皮渣；其中，所述鱼皮碎粒的尺寸约为2mm×2mm×2mm；所述氢氧化钠水溶液的浓度为0.04M~0.05M；⑵提取：按照固液比为1︰50~70，将0.5~0.6M乙酸加入除脂后的鱼皮渣中，浸提60~80h，40目筛卷网过滤得到含鱼皮胶原蛋白的滤液；重复进行一次；所述原料选自：草鱼、斑点叉尾鮰或罗非鱼的鱼皮，鱼皮可以是干燥的也可以是新鲜的；所述盐析步骤为：经终浓度为2.5M 氯化钠（NaCl）盐析得到胶原蛋白沉淀；所述纯化透析干燥步骤为：将步骤⑶所得胶原蛋白沉淀溶解于0.5M乙酸，然后先以0.5M乙酸为透析外液进行透析3~5次、再以双蒸水作为透析外液进行透析，直至透析外液检测不到氯离子，以保留分子量100kDa以上的胶原蛋白；收集透析后的胶原蛋白液体，采用冷冻干燥方法进行干燥，得到鱼皮胶原蛋白。鱼皮胶原蛋白包被培养板的方法具体为：在24或96孔培养板中加入鱼皮胶原蛋白1～3ml到每孔中，静置5min，吸出多余的胶原；把培养板放入一干燥器中，另用一培养皿盛1～2ml氨水，盖好干燥器；20min后取出培养板，放入4℃冰箱中存放；使用前用无菌D-Hanks清洗液清洗培养板3～5次，以10min内保持血红色作为清晰完毕的标志。

上述技术方案中，培养步骤中，所述改良的DMEM液中包含：2μg/ml 重组人表皮生长因子，2.5mg/ml胰岛素，8%（质量分数）新生牛血清，0.85～1.15mg/ml的谷氨酰胺，20万U/L青霉素、20万U/L庆大霉素、200mg/L链霉素；使用时需要用水稀释1.4～1.5倍体积；所述改良的D-Hanks液的配置方法为：按照常规方法配制D-Hanks液，并通过改变NaCl的浓度，调节渗透压到225mmol/kg，成为改良的D-Hanks液，4℃下贮存，使用前用0.22μm过滤除菌；具体配置方法可以参考文献：吴康等，鲤血管内皮细胞的分离培养及初步鉴定，2001。

上述技术方案中，所述鱼优选为体重90～110g/尾的健康鱼，在取出肠道前该鱼已被处死。

由于上述技术方案的采用，与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、由于本发明创造性的优化了适合鱼类肠道粘膜细胞的消化分离方法（消化方式、消化液、消化条件）和原代培养方式（接种材料为细胞和细胞团的混合物、改良的D-Hanks液、改良的DMEM液），结合传统的动物细胞分离、原代培养技术，建立鱼类肠道粘膜细胞分离、原代培养的系统化技术，采用本发明所得鱼类肠道粘膜细胞生长良好，结构和功能性标志性指标体系完善，可以作为基础研究、药物筛选、饲料添加剂筛选等的试验模型和试验平台。

2、本发明中鱼类肠道粘膜细胞消化分离效果好：与传统的剪碎肠道分离肠道粘膜细胞的方法向比较，本发明选用组合的胶原蛋白酶对肠囊、翻转肠囊进行粘膜细胞的消化分离，粘膜细胞可以成多个细胞团、或单个细胞从粘膜上分离出来，有效控制肠道其他组织中的杂细胞被分离、混杂在粘膜细胞中，得到的粘膜细胞纯度很好，可以得到较多的粘膜细胞；同时，可以得到一定比例的细胞团，以单个细胞一起作为原代培养的细胞种子，有利于肠道粘膜细胞的培养和生长。

3、本发明中以细胞和细胞团混合作为原代培养的材料效果好：使用细胞和细胞团一起作为原代培养的接种材料细胞，更有利于细胞的离体培养生长，也有效减少了在消化分离时过度消化对细胞的损伤，从实际效果分析，采用本发明，将肠囊、翻转肠囊消化液在300r/min～500r/min的转速下离心3～5min，得到的细胞：细胞团的比例为1：4左右，按照2.3×10⁴个/cm²～4.7×10⁴个/cm²的细胞和细胞团浓度加入到培养液中，粘膜细胞修复时间缩短，很快就进入生长时期，且细胞贴壁生长效果好，细胞主要功能性指标达到要求。

4、本发明对D-Hanks液、鱼类细胞DMEM培养液进行改良：在参透压、酸碱度、有效成分组成与剂量浓度等方面，研究得到了适合鱼类肠道粘膜原代培养的D-Hanks液和DMEM培养液，可以对鱼类肠道粘膜细胞进行批量处理、批量培养，且不同批次试验的重复性非常好。

5、利用本发明所述鱼类肠道粘膜细胞可以成功建立基础研究、药物筛选、饲料添加剂筛选的细胞试验模型、试验平台的系统化技术，可以使这类试验模型和试验平台的建设实现规范化、标准化。

说明书附图

图1a、1b为实施例一中经过肠囊、翻转肠囊消化得到的细胞、细胞团进行显微光镜分析结果图；

图2原代培养48h后生长良好的草鱼肠道粘膜细胞形态图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：

一种鱼类肠道粘膜细胞分离和原代培养方法，包括以下步骤：

⑴选用经过强化肠道粘膜细胞生长的饲料培育2～3周后的试验材料鱼肠道为材料，所述材料鱼的体重在90～110g/尾，平均体重为100g/尾；实验鱼经过酒精消毒后，在无菌室用剪刀捣碎鱼体脑部，快速剖开鱼腹，取出肠道，清除肠道外脂肪；

⑵将肠道制成肠囊或翻转肠囊然后进行消化，有效分离肠道粘膜细胞；然后在300r/min～500r/min的转速下离心3～5min得到肠道粘膜细胞团：粘膜细胞比例达到1：2.5～5的混合细胞悬浮液，能满足后续试验的接种浓度要求。

所述将肠道制成肠囊然后进行消化的过程为：用注射器吸取D-Hanks液（临时加入抗生素，浓度为20万U/L青霉素、20万U/L庆大霉素、200mg/L链霉素）灌注、冲洗肠道数次，冲出肠道中黏液与杂物。用细线结扎肠道一端。用注射器加入含胶原酶Ⅰ 0.15～0.3mg/ml、胶原酶Ⅳ0.15～0.3mg/ml的混合消化液60%充满肠道（对于体重100g尾左右的鱼体大约需要3～8ml）。结扎剩余的肠道一端。在28℃水浴消化20～40min。用注射器加入含5%新生牛血清的DMEM 3～8ml，用椰子提起肠道的两端，反复振荡5～8次，终止消化。剪开肠囊一端，放出含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液供下一步试验。

所述将肠道制成翻转肠囊然后进行消化的过程为：右手拿住细竹签或细铁丝接触到肠道一端的外壁，左手食指轻扶肠道外壁轻轻向细竹签或细铁丝方向推进，使肠道套住细竹签或细铁丝将肠道完全翻转，黏膜面朝外，肠壁朝内。用吸管吸取D-Hanks液（临时加入抗生素，浓度为20万U/L青霉素、20万U/L庆大霉素、200mg/L链霉素）反复冲洗肠道粘膜表面。用细线系结扎肠道的两端，使消化液不能进入空腔内。将翻转肠囊放入加入含胶原酶Ⅰ0.15～0.3mg/ml、胶原酶Ⅳ0.15～0.3mg/ml的混合消化液中（对于体重100g尾左右的鱼体大约需要3～8ml）。在28℃水浴消化20～40min。加入含5～6%新生牛血清的DMEM 3～8ml，反复振荡5～8次，终止消化。得到含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液供下一步试验。

对经过肠囊、翻转肠囊消化得到的细胞、细胞团进行显微光镜分析，得图1a、1b，可知经过肠囊、翻转肠囊消化得到的细胞、细胞团较为纯净，杂质很少，细胞的功能装填也非常好。活细胞（团）比例越多、杂质越少、细胞团Ⅱ与细胞团Ⅲ的总浓度越大，则相应处理条件为最优。不同消化时间所对应的消化结果如表1所示，经过不同消化时间的试验确定其最佳消化时间为20～40min。

表1：不同消化时间细胞、细胞团的比例%

消化时间（min）	单细胞	细胞团
			20	88.55	11.45
40	87.55	12.45
			60	89.81	10.19
80	87.69	12.31

不同离心转速可以得到不同浓度的细胞或细胞团浓度的混合物，结果见表2，细胞团Ⅱ与细胞团Ⅲ的总浓度越大，细胞越容易贴壁生长形成集落，则相应处理条件为最优。取肠囊或翻转肠囊消化液，在300r/min～500r/min的转速下离心3～5min，得到的单个细胞、细胞团浓度能满足后续试验的接种浓度要求。在700r/min以上的沉淀物中细胞内颗粒化的情况比500转/min与300转/min的显著增多，在0.4%的台盼蓝观察到的死细胞数也增加。

表2：不同离心转速下得到草鱼肠道粘膜细胞、细胞团浓度

。

⑶采用鱼皮胶原蛋白为肠道粘膜细胞培养支持载体：称取0.1337g胶原，溶于100ml 0.1M醋酸中，在4℃冰箱中放置2天，转入50ml离心管中，封口膜密封，在1000r/min离心，吸取上清液于10ml已高压灭菌的小瓶中。4℃冰箱中贮存。鱼皮胶原蛋白包被培养板的方法为：在24或96孔培养板中加入鱼皮胶原蛋白1～3ml到每孔中，静置5min，吸出多余的胶原。把培养板放入一干燥器中，另用一培养皿盛1～2ml氨水，盖好干燥器。20min后取出培养板，放入4℃冰箱中存放。使用前用无菌D-Hanks清洗液清洗培养板3～5次，以10min内保持血红色作为清晰完毕的标志。

⑷按照细胞、细胞团的比例为2.5～5：1，按照细胞和细胞团浓度为2.3×10⁴个/cm²～4.7×10⁴个/cm²的接种浓度，将肠道粘膜细胞和细胞团混合物加入改良的DMEM液培养基，以改良的D-Hanks液为平衡盐溶液，进行原代培养，结果发现细胞生长曲线在72 h内处于细胞增殖对数生长时期，连续培养288h细胞生长良好；对培养48h后的细胞进行显微光镜分析，得图2，可见生长良好。

其中，改良D-Hanks液的制备：在常规的D-Hanks液配方基础上，调整其中氯化钠浓度为5～6g/L，使D-Hanks改良液的渗透压到225～250mmol/kg，更有利于鱼类细胞的生长。

改良DMEM培养液的组成：2μg/ml 重组人表皮生长因子，2.5mg/ml胰岛素，8%新生牛血清，0.85～1.15mg/ml的谷氨酰胺，20万U/L青霉素、20万U/L庆大霉素、200mg/L链霉素；pH7.2-7.4；培养液用0.22μm过滤除菌，4℃冰箱贮存。

⑸本实施例中原代培养细胞生长效果、功能评价指标包括

1、生长状态：细胞能够贴壁生长，形成生长的细胞团群落；不同生长群落分布较为均匀。培养细胞的生长效果见图2。

2、生长细胞数量与生长曲线：MTT吸光值测定方法，MTT吸光值越大，则说明细胞生长越旺盛。

3、细胞结果和功能完整性：采用测定细胞培养液中谷丙转氨酶（ALT）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）活力鉴定方法，这3种酶为细胞内代谢，细胞结构和功能完整性好的细胞其培养液（细胞外）的美活力就很低，采用原代培养细胞培养液中谷丙转氨酶（ALT）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）活力与相应的细胞浓度比值大小的评价方法，ALT活力 /MTT-OD、LDH活力/MTT-OD、CK活力/MTT-OD的比值越小则相应的处理条件为最优。

4、肠道细胞分化程度：碱性磷酸酶（AKP或ALP），细胞AKP活力/MTT OD，比值越大越表明细胞分化程度高，相对应的处理组的处理条件为最优。

⑹根据上述指标，本实施例可以得到满足上述要求的肠道粘膜原代培养细胞，培养细胞的效果见图2.

实施例二：

步骤一：材料鱼表面用质量分数75%的酒精消毒。

步骤二：常规解剖取出鱼体肠道，剔除肠道外脂肪。

步骤三：向肠道内用注射器灌注鱼用生理盐水冲洗3～4次，将肠道内容物冲洗干净。

步骤四：将肠道完全翻转，黏膜面朝外，肠壁朝内。使用含抗生素的D-Hanks液冲洗肠道粘膜表面，去除肠道粘膜表面的黏液与杂物，然后结扎肠道的两端。含抗生素的D-Hanks液为青霉素20万U/L、庆大霉20万U/L素、链霉素200mg/L的D-Hanks液。

步骤五：将翻转肠囊浸没在混合消化液中，在25~30℃水浴中消化20～40min，再向混合消化液中加入含5~6%新生牛血清的DMEM，反复振荡5～8次，终止消化；取出肠道，得到含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，备用。混合消化液的组成何操作方法为：含胶原酶Ⅰ0.15～0.3mg/ml、胶原酶Ⅳ0.15～0.3mg/ml的混合消化液中（对于体重100g尾左右的鱼体大约需要3～8ml）。在28℃水浴消化20～40min。加入含5～6%新生牛血清的DMEM 3～8ml，反复振荡5～8次，终止消化。得到含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液供下一步试验。

步骤六：将上述消化液在300r/min～500r/min的转速下离心3～5min，得到粘膜细胞和细胞团的混合物沉淀，用D-Hanks液稀释混合物沉淀，D-Hanks液的用量按照培养板中粘膜细胞和细胞团为2.3×10⁴个/cm²～4.7×10⁴个/cm²的浓度确定用量。细胞和细胞团数量确定采用荧光倒置显微镜下计数的方法。

步骤七：包被细胞培养板，具体操作为：称取0.1337g胶原，溶于100ml 0.1M醋酸中，在4℃冰箱中放置2天，转入50ml离心管中，封口膜密封，在1000r/min离心，吸取上清液于10ml已高压灭菌的小瓶中。4℃冰箱中贮存。鱼皮胶原蛋白包被培养板的方法为在24或96孔培养板中加入鱼皮胶原蛋白1～3ml到每孔中，静置5min，吸出多余的胶原。把培养板放入一干燥器中，另用一培养皿盛1～2ml氨水，盖好干燥器。20min后取出培养板，放入4℃冰箱中存放。使用前用无菌D-Hanks清洗液清洗培养板3～5次，以10min内保持血红色作为清晰完毕的标志。

步骤八：使用步骤七制备的细胞培养板，将步骤六得到的细胞和细胞团稀释液接种到细胞培养板的培养孔之中，接种量以10%容积内装满稀释液为准。

步骤九：在步骤八的培养孔中加入DMEM液，加液量为每个培养孔容积的80%装满培养液为准。DMEM液的组成为：2μg/ml 重组人表皮生长因子，2.5mg/ml胰岛素，8%（质量分数）新生牛血清，0.85～1.15mg/ml的谷氨酰胺，20万U/L青霉素、20万U/L庆大霉素、200mg/L链霉素；使用时需要用水稀释1.4～1.5倍体积；pH7.2-7.4。

步骤十：将接种好的培养板放置于二氧化碳培养箱中，设置二氧化碳培养箱中二氧化碳浓度为5%（体积浓度），设置培养温度为26～28℃的培养的温度，培养24h。

步骤十一：培养24h后更换一次DMEM液。方法为用吸管洗出培养孔中的培养液，再添加DMEM液至培养孔容积的80%。继续按照步骤十的方法进行培养。以后每24h.更换一次培养基。按照本方法连续培养288h细胞生长良好。

步骤十二：根据实验需要，不同时间在荧光倒置显微镜下对培养细胞的生长情况进行观察和照相，并根据不同实验需要利用培养的细胞进行试验。

Claims

1.一种鱼类肠道粘膜细胞的分离和原代培养方法，包括取材和培养两个步骤，所述取材步骤包括消化和分离、步骤，其特征在于，

1）消化步骤具体为：按照常规方法取出鱼的肠道，清除肠道外脂肪，然后采用下述两种方法中的任一种消化分离鱼类肠道粘膜细胞，得到含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液：

方法一：使用含抗生素的D-Hanks液冲洗肠道粘膜表面，去除肠道粘膜表面的黏液与杂物，然后结扎肠道的一端，向肠道内灌注体积为50%～70%肠道内容积的混合消化液，结扎剩余的肠道一端；然后在25～30℃水浴中消化20～40min，再向肠道加入含质量分数5～6%新生牛血清的DMEM，用镊子提起肠道的两端，反复振荡5～8次，终止消化；放出含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，备用；

方法二：将肠道完全翻转，黏膜面朝外，肠壁朝内，使用含抗生素的D-Hanks液冲洗肠道粘膜表面，去除肠道粘膜表面的黏液与杂物，然后结扎肠道的两端，将肠道浸没在混合消化液中，在25～30℃水浴中消化20～40min，再向混合消化液中加入含质量分数5～6%新生牛血清的DMEM，反复振荡5～8次，终止消化；取出肠道，得到含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，备用；

2）分离步骤具体为：取步骤1）所得含有游离粘膜细胞、细胞团的消化液，在300r/min～500r/min的转速下离心3～5min，得到粘膜细胞和细胞团的混合物，以所得粘膜细胞和细胞团的混合物作为原代培养的接种材料细胞；

所述培养步骤中，以鱼皮胶原蛋白作为培养支持载体，以改良的DMEM液作为培养基，以改良的D-Hanks液作为平衡盐溶液，按照2.3×10⁴个/cm²～4.7×10⁴个/cm²的粘膜细胞和细胞团浓度，将粘膜细胞和细胞团的混合物加入到培养基中，在26～28℃培养的温度下，pH7.2-7.4条件下进行原代培养，24小时以上即可贴壁生长。

2. 根据权利要求1所述鱼类肠道粘膜细胞的分离和原代培养方法，其特征在于，消化步骤中，所述含抗生素的D-Hanks的配置方法为：使用前临时在D-Hanks液中加入抗生素青霉素、庆大霉素、链霉素，并且青霉素浓度为20万U/L、庆大霉素浓度为20万U/L、链霉素浓度为200mg/L。

3.根据权利要求1所述鱼类肠道粘膜细胞的分离和原代培养方法，其特征在于，所述混合消化液含胶原酶Ⅰ 0.15～0.3mg/ml、胶原酶Ⅳ0.15～0.3mg/ml，消化步骤中，混合消化液的使用量为：体重100g/尾左右的鱼体需要3～8ml混合消化液。

4.根据权利要求1所述鱼类肠道粘膜细胞的分离和原代培养方法，其特征在于，消化步骤中，DMEM的使用量为：体重100g/尾左右的鱼体需要3～8ml的DMEM。

5.根据权利要求1所述鱼类肠道粘膜细胞的分离和原代培养方法，其特征在于，分离步骤所得粘膜细胞和细胞团的混合物中，细胞和细胞团的数量比为2.5～5比1。

6.根据权利要求1所述鱼类肠道粘膜细胞的分离和原代培养方法，其特征在于，培养步骤中，所述改良的DMEM液中包含：2μg/ml 重组人表皮生长因子，2.5mg/ml胰岛素，质量分数8%的新生牛血清，0.85～1.15mg/ml的谷氨酰胺，20万U/L青霉素、20万U/L庆大霉素、200mg/L链霉素；使用时用水稀释1.4～1.5倍体积。

7.根据权利要求1所述鱼类肠道粘膜细胞的分离和原代培养方法，其特征在于，培养步骤中，所述改良的D-Hanks液的配置方法为：按照常规方法配制D-Hanks液，并通过改变NaCl的浓度，调节渗透压到225mmol/kg，成为改良的D-Hanks液，4℃下贮存，使用前用0.22μm过滤除菌。

8.根据权利要求1所述鱼类肠道粘膜细胞的分离和原代培养方法，其特征在于，所述鱼的体重为90～110g/尾。