CN101429492B - 一种猪卵母细胞体外培养成熟方法 - Google Patents
一种猪卵母细胞体外培养成熟方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种猪卵母细胞体外培养方法，包括采集卵巢步骤，从卵巢中采集卵母细胞步骤，卵母细胞筛选步骤和成熟培养步骤，其特征在于，在卵母细胞采集步骤之前，将在屠宰场取到的卵巢存放于盛装有生理盐水的容器内保存，且容器内温度保持在32～34℃；卵母细胞的筛选步骤采用的洗卵液中含有1～10μg/mL的两性霉素B，2％～20％v/v的血清；卵母细胞成熟培养步骤采用的成熟培养液中含有50～90％v/v的TCM-1991X基础液，5～25IU/mL的hCG和5～20IU/mL的PMSG。采用本方法能解决目前猪卵母细胞体外成熟技术周期长，不利于大规模生产，培养后成熟率低的问题。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，特别涉及一种猪卵母细胞体外培养成熟方法。
背景技术
目前，猪胚胎工程已极大地推进了畜牧业和医学的进程，通过它可以改良品种、培育抗病猪种、提高肉质、生产转基因猪或基因组修饰猪、制备人类疾病模型、进行器官移植、生产药物蛋白、研究发育机理等。
猪的克隆和转基因生产等都需要大量成熟的，具有发育潜力的卵母细胞。至今为止，猪卵母细胞的体外成熟率不够理想。
目前，现有猪卵母细胞体外培养成熟方法一般包括采集卵巢步骤，从卵巢中采集卵母细胞步骤，卵母细胞筛选步骤以及卵母细胞成熟培养步骤。在卵母细胞采集步骤之前，采集的卵巢存放于盛装有抗生素(青、链霉素)的生理盐水中，在30～35℃温度下保存。但是添加双抗后，会使卵泡表面脆性增加，且双抗具有一定粘性，使用真空泵负压吸卵会产生大量气泡。另外经验证明此步添加抗生素会影响核质成熟。
卵母细胞的筛选步骤中使用的洗卵液(ASP)的主要成分为TCM-199或赫佩斯(Hepes)液，其中添加的抗生素为青霉素或双抗，且不添加血清。不添加血清虽可以节省少量成本，但是大大降低了成熟效率。
卵母细胞成熟培养步骤中，需先将卵母细胞放入含有激素FSH(促卵泡素)和hMG(人绝经期促性腺激素)的成熟培养液(IVM)：无血清的TCM-199基础液+10％猪卵泡液(PFF)+10ng/mL表皮生长因子(EGF)+0.1％mg/mL半胱氨酸(cysteine)的玻璃平皿中，放置在38.5℃，5％的CO2和最大饱和湿度的培养箱中22～24h后，再放入不含激素的成熟培养液中成熟培养22～24h。成熟培养48h之后，观察极体(PB1)排出率，并以此计算卵母细胞的体外成熟率。
此方法进行猪卵母细胞体外成熟需44～48h，培养周期长，且培养后极体率一般只能达到60％～70％。而且，培养过程中间须更换培养液，增加了工作量，增加了细胞污染的频率，不能满足大规模产业化克隆生产的需求。另外，国内屠宰场都是在凌晨屠宰，而屠宰场又是卵巢的最主要来源，这样取得的猪卵如果用上述方法成熟培养，后续的所有实验都必将在夜间进行。这将耗费更多的人力，不利于大量生产性克隆操作的进行。
发明内容
本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供一种猪卵母细胞体外培养方法，用以解决目前猪卵母细胞体外成熟技术周期长，不利于大规模生产，培养后成熟率低的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种猪卵母细胞体外培养方法，包括采集卵巢步骤，从卵巢中采集卵母细胞步骤，卵母细胞筛选步骤和成熟培养步骤，其特征在于，在卵母细胞采集步骤之前，将在屠宰场取到的卵巢存放于盛装有生理盐水的容器内保存，且容器内温度保持在32～34℃；卵母细胞筛选步骤采用的洗卵液中含有1～10μg/mL的两性霉素B，2％～20％v/v的血清；卵母细胞成熟培养步骤采用的成熟培养液中含有50～90％v/v的TCM-199 1X基础液，5～25IU/mL的hCG(人绒毛膜促性腺激素)和5～20IU/mL的PMSG(孕马血清促性腺激素)。
与现有技术相比，上述技术方案由于在卵母细胞采集步骤之前，采集的卵巢存放于盛装有未添加抗生素的生理盐水的容器内保存，且容器内温度保持在32～34℃，是卵巢采集运输的最佳温度，又由于筛选卵母细胞的洗卵液中含有一定量的两性霉素B和血清，保证从卵巢采集、运输到卵母细胞采集、培养全过程都处于最佳条件；卵母细胞培养步骤采用的成熟培养液中以一定量的TCM-199 1X为基础液，另外添加了一定量的hCG和PMSG，在整个卵母细胞培养过程中不仅无须更换培养液，操作简单，而且具有成熟效率高的特点，经36h成熟培养后极体率可稳定在80％以上。另外，针对国内屠宰场都是在凌晨屠宰的情况，从屠宰场取得的猪卵如果用上述方法成熟培养，后续的所有实验无须都在夜间进行。这将节省人力的耗费，有利于大量生产性克隆操作的进行。
上述洗卵液中还包括：
碳酸氢钠 0.10～0.17mg/mL
丙酮酸盐(Sodium pyruvate) 0.20～0.30mg/mL
赫佩斯钠盐(HEPES sodium salt) 3.00～5.00mg/mL
赫佩斯酸(HEPES acid) 2.00～3.00mg/mL，
TCM-199 10x 5～20％v/v
谷氨酰胺(L-Glutamine) 0.05～0.30mg/mL
肝素(Heparin) 10～40IU/mL；
所述成熟培养液中还包括：
谷氨酰胺(L-Glutamine) 0.05～0.20mg/mL
庆大霉素(Gentamicin) 0.02～0.10mg/mL
猪卵泡液(PFF) 2～20％v/v
血清 2～20％v/v
作为本发明的一个优选实施方式，上述洗卵液中两性霉素B浓度为2～5μg/mL，血清浓度为2％～10％；所述成熟培养液中，TCM-199 1X基础液的浓度为70～90％v/v，hCG浓度为10～20IU/mL，PMSG浓度为5～15IU/mL。洗卵液中还包括：
碳酸氢钠 0.10～0.20mg/mL
丙酮酸盐 0.15～0.30mg/mL
赫佩斯钠盐 2.00～5.00mg/mL
赫佩斯酸 1.50～3.00mg/mL，
TCM-199 10x 5～15％v/v
谷氨酰胺 0.10～0.30mg/mL
肝素 20～35IU/mL；
所述成熟培养液中还包括：
谷氨酰胺 0.08～0.15mg/mL
庆大霉素 0.02～0.10mg/mL
猪卵泡液 8～15％v/v
血清 5～15％v/v
作为本发明进一步优选实施方式，卵母细胞的采集步骤中采用真空泵提供压力源，负压抽取卵子。这样，可以提高卵母细胞的采集效率，减少人力，满足大规模生产实验需求。
本发明实施例所要解决的另一技术问题在于，提供一种猪卵母细胞体外培养用洗卵液，含有的组分及其含量如下：
碳酸氢钠 0.10～0.17mg/mL
丙酮酸盐 0.20～0.30mg/mL
赫佩斯钠盐 3.00～5.00mg/mL
赫佩斯酸 2.00～3.00mg/mL，
TCM-199 10x 5～20％v/v
谷氨酰胺 0.05～0.30mg/mL
两性霉素B 1.00～10.00μg/mL
肝素 10～40IU/mL
血清 2～20％v/v。
作为上述洗卵液的一个优选实施方式，含有的组分及其含量如下：
碳酸氢钠 0.10～0.20mg/mL
丙酮酸盐 0.15～0.30mg/mL
赫佩斯钠盐 2.00～5.00mg/mL
赫佩斯酸 1.50～3.00mg/mL，
TCM-199 10x 5～15％v/v
谷氨酰胺 0.10～0.30mg/mL
两性霉素B 2.00～5.00μg/mL
肝素 20～35IU/mL
血清 2～10％v/v 。
本发明实施例所要解决的再一技术问题在于，提供一种猪卵母细胞体外培养用成熟培养液，含有的组分及其含量如下：
TCM-199 1x 50～90％v/v
hCG 5～25IU/mL
PMSG 5～20IU/mL
谷氨酰胺 0.05～0.20mg/mL
庆大霉素 0.02～0.10mg/mL
猪卵泡液 2～20％v/v
血清 2～20％v/v
作为上述成熟培养液的一个优选实施方式，含有的组分及其含量如下：
TCM-199 1X 70～90％v/v
hCG 10～20IU/mL
PMSG 5～15IU/mL
谷氨酰胺 0.08～0.15mg/mL
庆大霉素 0.02～0.10mg/mL
猪卵泡液 8～15％v/v
血清 5～15％v/v
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1.试剂及培养液的准备
(1)洗卵液(ASP)预热：
洗卵液组分及含量为：
碳酸氢钠 0.17mg/mL
丙酮酸盐 0.22mg/mL
赫佩斯钠盐 3.60mg/mL
赫佩斯酸 2.63mg/mL
TCM-199 10x 10％v/v
谷氨酰胺 0.20mg/mL
两性霉素B 3.00μg/mL
肝素 30IU/mL
血清 2％v/v
将洗卵液预热至约38.5℃，供卵子采集时使用。
(2)平衡卵母细胞体外培养液(IVM液)：
IVM液组分及含量为：
TCM-199 1X 80％v/v
hCG 15IU/mL
PMSG 10IU/mL
谷氨酰胺 0.10mg/mL
庆大霉素 0.05mg/mL
猪卵泡液 10％
血清 10％
四孔板中每孔分别加入400μL IVM液，使其铺满底部，再于液体表面覆盖400μL矿物油(mineral oil)，置于5％CO2培养箱，至少平衡6小时；
2、卵巢的采集
收集卵巢时所需液体的准备：将加热棒固定于保温箱底部，注入自来水，加热棒温度调至33℃；再将盛有预热后生理盐水的塑料盒置入，塑料盒用于存放采集到的卵巢；将在屠宰场取到的卵巢，置于上述塑料盒中，尽快(一般在2h之内，越快越好)带回实验室。
3、卵母细胞的采集
吸卵时，先将真空泵与缓冲瓶(大的抽滤瓶即可)。每个操作人员需要两根硅胶管。其中一根硅胶管用于连接缓冲瓶及采血管，另一根硅胶管用于连接采血管及抽吸卵巢表面卵泡的针头。抽取卵子时，手握注射器针头，选取3～6mm的卵泡，平行进针，在皮质层中采集卵子，而须避免插入髓质层，以免抽取过多组织碎片，造成捡卵的困难，拖延捡卵的时间。
4、卵母细胞的筛选
(1)取2～3mL预热的洗卵液分别加入到2个35mm的培养皿里；
(2)静置后的卵泡吸取物可见形成沉淀，使用巴氏滴管吸去上清液，再缓慢地加入洗卵液轻轻吸打混匀，将其铺于预先做好标记的10cm培养皿里，在显微镜下挑选颗粒细胞层较多(大于三层)且致密，胞质均匀的卵母细胞，将其移至上述预热的洗卵液中，循环此操作，直至捡出盘中所有的优质卵母细胞；
(3)进一步筛选卵母细胞，吸取35mm培养皿里经进一步确认为优质的卵母细胞转移入另一个35mm培养皿中，清洗掉多余细胞的碎片。
5、卵母细胞的成熟培养
将上述筛选出来的卵母细胞，平均40-50个卵母细胞一个孔，移至四孔板中，38.5℃，5％CO2成熟培养36小时后进行克隆操作。
结果：经成熟培养36小时后，极体率83％～87％
实施例2
本实施例与实施例1步骤基本相同，不同的是：
洗卵液组分及含量为：
碳酸氢钠 0.17mg/mL
丙酮酸盐 0.22mg/mL
赫佩斯钠盐 3.60mg/mL
赫佩斯酸 2.63mg/mL
TCM-199 10x 5％v/v
谷氨酰胺 0.10mg/mL
两性霉素B 1.00μg/mL
肝素 10IU/mL
血清 2％v/v
IVM液组分及含量为：
TCM-199 1X 70％v/v
hCG 5IU/mL
PMSG 6IU/mL
谷氨酰胺 0.05mg/mL
庆大霉素 0.05mg/mL
猪卵泡液 20％
血清 5％
结果：经成熟培养36小时后，培养后极体率为80％～81％。
实施例3
本实施例与实施例1步骤基本相同，不同的是：
洗卵液组分及含量为：
碳酸氢钠 0.17mg/mL
丙酮酸盐 0.25mg/mL
赫佩斯钠盐 3.6mg/mL
赫佩斯酸 2.63mg/mL
TCM-199 10x 15％v/v
谷氨酰胺 0.30mg/mL
两性霉素B 5.00μg/mL
肝素 30IU/mL
血清 10％v/v
IVM液组分及含量为：
TCM-199 1X 70％v/v
hCG 15IU/mL
PMSG 10IU/mL
谷氨酰胺 0.10mg/mL
庆大霉素 0.05mg/mL
猪卵泡液 12％
血清 18％
结果：经成熟培养36小时后，培养后极体率为85％以上。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种猪卵母细胞体外培养方法，包括采集卵巢步骤，从卵巢中采集卵母细胞步骤，卵母细胞的筛选步骤和成熟培养步骤，其特征在于，在卵母细胞采集步骤之前，将在屠宰场取到的卵巢存放于盛装有生理盐水的容器内保存，且容器内温度保持在32～34℃；卵母细胞筛选步骤采用的洗卵液中含有1～10μg/mL的两性霉素B，2％～20％v/v的血清；卵母细胞成熟培养步骤采用的成熟培养液中含有50～90％v/v的TCM-199 1X基础液，5～25IU/mL的hCG和5～20IU/mL的PMSG。
2.如权利要求1所述的猪卵母细胞体外培养方法，其特征在于，所述洗卵液中还包括：
碳酸氢钠 0.10～0.17mg/mL
丙酮酸盐 0.20～0.30mg/mL
赫佩斯钠盐 3.00～5.00mg/mL
赫佩斯酸 2.00～3.00mg/mL，
TCM-199 10x 5～20％v/v
谷氨酰胺 0.05～0.30mg/mL
肝素 10～40IU/mL；
所述成熟培养液中还包括：
谷氨酰胺 0.05～0.20mg/mL
庆大霉素 0.02～0.10mg/mL
猪卵泡液 2～20％v/v
血清 2～20％v/v。
3.如权利要求1所述的猪卵母细胞体外培养方法，其特征在于，所述洗卵液中两性霉素B浓度为2～5μg/mL，血清浓度为2％～10％；所述成熟培养液中，TCM-199 1X基础液的浓度为70～90％v/v，hCG浓度为10～20IU/mL，PMSG浓度为5～15IU/mL。
4.如权利要求3所述的猪卵母细胞体外培养方法，其特征在于，所述洗卵液中还包括：
碳酸氢钠 0.10～0.20mg/mL
丙酮酸盐 0.15～0.30mg/mL
赫佩斯钠盐 2.00～5.00mg/mL
赫佩斯酸 1.50～3.00mg/mL，
TCM-199 10x 5～15％v/v
谷氨酰胺 0.10～0.30mg/mL
肝素 20～35IU/mL；
所述成熟培养液中还包括：
谷氨酰胺 0.08～0.15mg/mL
庆大霉素 0.02～0.10mg/mL
猪卵泡液 8～15％v/v
血清 5～15％v/v。
5.如权利要求1～4任一项所述的猪卵母细胞体外培养方法，其特征在于，所述卵母细胞的采集步骤中采用真空泵提供压力源，负压抽取卵子。
6.一种猪卵母细胞体外培养用洗卵液，含有的组分及其含量如下：
碳酸氢钠 0.10～0.17mg/mL
丙酮酸盐 0.20～0.30mg/mL
赫佩斯钠盐 3.00～5.00mg/mL
赫佩斯酸 2.00～3.00mg/mL
TCM-199 10x 5～20％v/v
谷氨酰胺 0.05～0.30mg/mL
两性霉素B 1.00～10.00μg/mL
肝素 10～40IU/mL
血清 2～20％v/v。
7.如权利要求6所述洗卵液，含有的组分及其含量如下：
碳酸氢钠 0.10～0.20mg/mL
丙酮酸盐 0.15～0.30mg/mL
赫佩斯钠盐 2.00～5.00mg/mL
赫佩斯酸 1.50～3.00mg/mL
TCM-199 10x 5～15％v/v
谷氨酰胺 0.10～0.30mg/mL
两性霉素B 2.00～5.00μg/mL
肝素 20～35IU/mL
血清 2～10％v/v。
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