CN101312648B - 肝实质细胞的冷冻保存 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于制备适于冷冻保存的肝细胞的方法，用于冷冻保存分离的肝细胞的方法和用于制备冷冻保存的分离的肝细胞的培养物的方法。

Description

肝实质细胞的冷冻保存

技术领域

本申请涉及冷冻保存技术领域，特别涉及用于制备适于冷冻保存的肝细胞的方法，用于冷冻保存分离的肝细胞的方法和用于制备冷冻保存的分离的肝细胞的夹心培养物的方法。 

背景技术

从组织复合体中分离出的肝细胞(liver cells)，特别是肝实质细胞(hepatocytes)，以原代细胞培养物的形式特别用于测试候选药物的生理作用。从人体新鲜制备的原代肝实质细胞特别代表用于在体外系列试验中确定候选活性物质或进行活性物质代谢或酶促研究的“金标准”。不利的是，新鲜分离的人肝实质细胞不能常规和任何时间得到。因此，需要能将分离的肝实质细胞储存一定时间的方法。在这里，细胞的生理功能，尤其是它们的代谢或酶能力，应尽可能完全予以保留。 

众所周知，肝实质细胞都以冷冻保存方式储存。一般而言，肝实质细胞是在悬浮液中冷冻保存的。除了肝实质细胞，悬浮液还含有冷冻剂，用于防止冻融时损害细胞。为了储存，悬浮液通常冻结在低于-80℃的温度。为了储存后的使用，冻结的细胞悬浮液解冻，细胞涂布在培养板上或培养器皿中。为了再培养解冻的细胞，培养器皿一般包被基质材料，细胞可粘附其上。成功的粘附对于再培养和随后的研究来说是至关重要的。不过，通常只有小部分原先冻结的细胞可以以活的状态保存下来并进行再培养。这种方法的不利之处特别在于这样的事实：不能预见来自悬浮液的解冻的细胞是否或以什么比例粘附到培养板上。在一个批次中粘附细胞的比例是依赖于该个体批次的。有规律的，仅少量批次的解冻的冷冻保存的细胞充分粘附到培养板上。 

用于冷冻保存的已知的更进一步的方法在于在培养器皿中涂布新鲜分离的细胞以便随后冻结连带培养器皿的涂布的细胞。在涂布前，这里的培养器皿也包被可粘附细胞的基质。众所周知，最好采用胶原凝胶。在一个已知的方法中，肝实质细胞接种到包被I型胶原的培养板上并允许约4个小时粘附到胶原基质上。然后由此产生的单层培养物(单层细胞培养物)培养大约20小时。随后，洗掉不粘附的细胞。再经过6小时，培养物上覆盖一层冻结剂，冷却到-70℃并储存(Watts and Grant，1998；Human & Experimental Toxicology 15： 30-37)。为了随后的使用，单层培养物解冻并再培养。但是，该解冻的培养物含有高比例的不粘附的和无生命的细胞和细胞碎片。虽然通常大部份基质覆盖了细胞，并没有形成融合连续的细胞区域。 

在另一已知的方法中，肝实质细胞被冻结在夹心结构中，即是在双重凝胶设置中。为此，肝实质细胞悬浮液首先接种在包被胶原凝胶的细胞培养板上。细胞培养24小时后，第二层胶原凝胶倒在接种细胞上。随后，由此获得的夹心培养物在冷冻剂中于-70℃冻结并储存(Koebe et al.，1990；Cryobiology 27：576-584)。 

通过冻结前肝细胞固定在一基质上或两基质之间，机械稳定细胞，存活率由此提高。由于细胞在新鲜分离、高活力状态时能够粘附这样的事实，与在悬浮液中冻融的冷冻保存的细胞的粘附相比，粘附率显著增加。尽管这样，解冻后出现了过大比例的不粘附的或无生命的细胞。没有实现有活力的肝实质细胞的融合培养物的理想状态。而且，看到冷冻在悬浮液中的细胞通常在解冻后几个小时内丧失它们的代谢能力。因而它们不适合用于大量的体外试验。 

此外，从人体器官分离出的细胞通常没有从动物模型分离的细胞强壮。这一点尤其要归因于这样的事实，即与来自动物的细胞相比，来自供体器官的人体细胞通常在不太有利的条件下能得到，因为动物是通常专门饲养用于这个目的，然后安乐死的(比如大鼠、小鼠或猪)。因此，到目前为止，人体细胞需要更温和的培养条件。到现在为止，没有已知的冷冻保存方法，采用这些方法人肝实质细胞能够被成功冷冻保存，以便从而后来能够进行较长时间的体外研究。 

因此，需要用于肝细胞冷冻保存的改进的方法，使温和的冷冻保存成为可能，尤其是具有高存活率的温和解冻。一种改进的冷冻保存的方法应该特别适合于成功冷冻保存分离的人肝实质细胞。在这里应保证解冻的细胞可以在培养基质上大比例再培养，可能的话，作为一融合单层(连续单层)。该方法应该进一步适合于能够制备分离的肝细胞的改进的夹心培养物，其中含有高比例的活细胞。此外，应保证该冷冻保存解冻后再培养的细胞尽可能长时间维持其代谢和/或酶能力，这样它们能被用于大量体外试验。 

发明内容

因而本发明的技术问题在于提供改进的方法，用于冷冻保存分离的肝细胞，尤其是人类肝细胞，以便冷冻保存的肝细胞能够最终作为改进的夹心培养物再培养。 

该技术问题通过一种如权利要求1提出的方法来解决，特别是一种用于制备适于冷冻保存的肝细胞的方法，包括下述步骤： 

在步骤(a)中，制备一种基质，尤其是胶原基质，较佳地是胶原凝胶。基质较佳地引入到细胞培养器皿中，例如6孔板。培养器皿较佳地包被基质材料。 

在步骤(b)中，制备分离的肝细胞，尤其是从组织分离的。 

在随后的步骤(c)中，分离的肝细胞接种在基质上。在基质上肝细胞的密度在这里是从2～4×10³cells/mm²基质表面。较佳的细胞密度是从2.6～3.2×10³mm^-2。也就是说，在一具有9.6cm²底面积的培养器皿中，例如6孔板的一个孔的底部表面，接种细胞的数目是2.5～3×10⁶每孔。 

在更进一步的，最好是立即随后的，步骤(d)中，使细胞静置在基质上(静置阶段、粘附阶段)。为此，允许包被细胞的基质静置一段时间，约10～180分钟，较佳地30～90分钟，特别优选地大约1小时，以便使接种在基质上的细胞能够粘附到所述基质。静置较佳地发生在培养柜(培养箱)中，特别是在温度37℃、5％的CO₂和95％相对湿度的标准条件下。此外，成功的粘附能够通过显微镜检查核实。 

在步骤(d)中的静置后，没有粘附到基质的细胞在步骤(e)中从包被细胞的基质上洗涤掉(洗涤步骤)，要特别仔细。洗涤较佳地是这样进行的：通过在包被细胞的基质上覆盖一层培养基，随后吸掉包括培养基和不粘附的细胞的上清液。这一步骤较佳地至少重复一次。 

在进一步的步骤(f)中，使洗涤过的包被细胞的基质再次静置(第二静置阶段)。静置至多180分钟的时间，尤其30至180分钟，特别优选地大约1小时。静置较佳地发生在培养柜中，特别是在温度37℃、5％的CO₂和95％相对湿度的标准条件下。 

第二静置阶段后，包被细胞的基质在步骤(g)中在一冻结剂中进行冻结(冻结步骤)。冻结前，第二静置阶段后，较佳地再次洗涤包被细胞的基质，尤其是以消除残留的不粘附的细胞(洗涤步骤)。过程较佳地对应于步骤(e)。 

根据本发明的方法也提议在基质上以一定密度接种分离的肝细胞，经过某种静置阶段和洗涤的顺序后，在冷冻剂中冻结不粘附的细胞。从而，冻结包被细胞的基质，尤其是胶原基质，细胞粘附其上，尤其以单层形式呈现。通过根据本发明的手段，令人惊讶的，获得了完整细胞的培养物，其可以被特别好地冻结，即冷冻保存。在这里强调根据本发明制备和冷冻保存的培养物，在解冻后是特别活的(有活力的)，并含有高数量的粘附到基质的细胞。这里，该解冻的细胞可以方便地以融合单层进行再培养。 

根据本发明的方法对于细胞出奇地特别温和，因此也适合不太强壮的细胞，如从人类器官分离的肝实质细胞。特别地，似乎，根据本发明制备和冷冻保存的细胞，如果在解冻 后覆盖一层第二基质，保留它们全部的代谢活性和/或代谢能力许多天，尤其是3天以上。 

在根据本发明的一优选实施例中，步骤(g)的冻结是与冷冻剂一起进行的，每mm² 培养器皿底面积加入约0.5ml冷冻剂。为此，包被细胞的基质较佳地覆盖一层冷冻剂。优选的，冷冻剂含有10％胎牛血清(fetal calf serum，FCS)和10％的二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)。 

在一特别优选的实施例中，在步骤(g)中控制冷却，即冻结，是在加入冷冻剂后进行，较佳地至温度-80℃或更低。优选的，采用每分钟-0.5到-20℃的冷却速度来冷却。在一优选的变化实施例中，相变在这里得到补偿；这较佳地通过简短加热来实现，优选升温速率1～3℃/分钟。 

在基质上的分离的肝细胞根据本发明制备和冻结后，在冷冻保存期间包被细胞的基质是在冻结状态下储存的。较佳地，储存期间的温度是-80℃或更低，特别优选-150℃或更低。方便地，储存在冷冻机或在液态空气或液氮的气相中进行。当然，所有其他已知的用于低温保存细胞的方法也是适用的。本领域技术人员将根据他的应用领域和它们的适宜性选择储存方法。 

因此本发明也涉及一种用于冷冻保存分离的肝细胞的方法，包括上述描述的步骤(a)至(g)，接着在一更进一步的步骤(h)中，冻结的包被细胞的基质储存一段不确定的时间，这是取决于应用领域和预期用途来选择的。 

在随后的一更进一步的步骤(i)中，取决于应用领域和预期用途，较佳地在使用前立即或在另一合适的时间点，冻结的包被细胞的基质再次解冻。这优选地通过在冻结的包被细胞的基质上覆盖一层温培养基来实现。优选的，冻结的包被细胞的基质是在培养器皿中的，例如6孔板。优选的，培养器皿是从冷冻机或氮罐中取出，特别是此后立即，在培养柜中在标准条件下(37℃、5％的CO₂、95％相对湿度)孵育大约5分钟。优选的，然后吸取解冻液(溶液1)到包被细胞的基质上，最好是慢慢滴加。作为参考，约1毫升溶液1添加到约9.6cm²的面积(6孔板)上。溶液的温度较佳地约37℃。对每个细胞培养器皿重复该方法。作为参考，最多采用3块6孔板，以便在最多18个孔内在包被细胞的基质上覆盖一层温溶液。随后，每个细胞培养器皿或孔较佳地以同样的方式覆盖一层等量的温溶液1(1ml每9.6cm²)，最好是慢慢滴加。在一优选实施例中，溶液1是一种含有血清的解冻液，较佳地含有10％胎牛血清(FCS)。 

在一更进一步的步骤(j)中，尤其不粘附的细胞或脱离的，无生命的细胞从而从包被细胞的基质上洗涤掉，以便获得没有不粘附细胞的基质。为此，首先尽可能完全吸掉通过 步骤(i)加入的溶液1得到的包被细胞的基质上的上清液。上清液基本上包含解冻的，无生命的和不粘附的细胞。在一特别优选的实施例中，经过这一步后，另一溶液，即溶液2，加至吸掉上清液的包被细胞的基质，最好是滴加。溶液2较佳地具有温度约37℃。在溶液2加入的情况下，较佳地选择步骤(i)中的两步程序；每次，起先溶液的一半分布在所有细胞培养器皿中，然后剩下的一半相应分布。加入的溶液2的量对应在步骤(i)中溶液1的量。溶液2较佳地具有不同于解冻液(溶液1)的组成。溶液2较佳地含有血清，优选含有10％FCS。 

在一特别优选的实施例中，包被细胞的、覆盖一层溶液2的基质然后在标准条件(静置阶段，孵育)在培养柜中孵育约30分钟。 

为去掉不粘附的和无生命的细胞，于是尽可能从培养器皿完全吸掉包被细胞的基质上的上清液。从而获得基本没有不粘附的和无生命的细胞的包被细胞的基质。 

在一更进一步的步骤(k)中，解冻的、洗涤过的包被细胞的基质覆盖一层第二基质，较佳地是胶原基质，特别优选地是胶原凝胶，或凝胶是倒上去的。较佳地，最好倒上去的凝胶在几分钟至1小时的时间内变硬。在一优选的具体实施例中，第一、较下的基质的组成和解冻后涂布的第二、上部的基质的组成基本上是相同的，最好完全一致。较佳地，第二上部基质是像凝胶一样倒在粘附到较下的基质的单层解冻的肝细胞上的。根据本发明，由此获得了夹心培养物，其中分离的肝细胞是埋在两基质之间的，特别是两胶原凝胶之间。 

在最后的步骤(l)中，埋在基质之间的细胞进行再培养，根据应用领域和预期用途，立即或经过适当选择的培养期后，像预期那样使用，即较佳地用于体外试验。 

根据本发明制备和冷冻保存的该解冻的并再培养的分离的肝细胞具有特别高的活力。它们在解冻后特别长的时间内显示出它们的代谢能力。有利地，通过根据本发明的程序，从人体器官分离出的不太强壮的肝实质细胞也能特别地进行冷冻保存，并成功解冻，因此它们能随后长时间用于合适的体外试验。令人惊奇的是，获得了一细胞培养物，其中细胞能基本上作为融合单层进行再培养，且其中无生命的和/或不粘附的细胞的比例是很低的。 

因此，本发明也涉及一种用于制备冷冻保存的分离的肝细胞的夹心培养物的方法，其中至少进行根据本发明的方法的步骤(a)至(l)，从而获得一种夹心培养物，其中细胞埋在上部基质和较下基质之间。 

最后，本发明也涉及一种用于制备分离的肝细胞的夹心培养物的方法，其中首先制备动物或人体的肝组织，然后从组织中分离肝细胞，并至少进行根据本发明的方法步骤(a)至(l)。本领域技术人员将根据应用领域和适用性选择已知的用于从组织中分离肝细胞的方法。 

最后，本发明还涉及夹心培养物，其可以通过上述方法制备，并最好由该方法制备。根据本发明的夹心培养物表现出所有上述优点，与现有技术相比，代表一种改进的分离的肝细胞的培养物。 

附图说明

下面的例子和附图更详细地说明了本发明。这些例子不是被理解为限制性的，正相反，本发明的发明思想因此被更详细地加以解释，本发明的优点通过具体例子的方式加以阐述。 

图表示： 

图1：培养的肝实质细胞的显微照片(比例约150倍)；图1A：新鲜分离的人肝实质细胞；图1B：冷冻保存的人肝实质细胞； 

图2：随着培养时间的作用，活的肝实质细胞的数目； 

图3：用利福平进行酶诱导后6β-OHT和16α-OHT的形成。 

具体实施方式

实施例1：用于冷冻保存的人肝实质细胞的制备

1.1人肝实质细胞的分离 

来自人类供体的肝实质细胞用一种本身已知的方式分离自用任何方式手术移除的组织部分，这需要得到捐助者的同意。为此，灌注组织，肝实质细胞脱离组织复合体，肝实质细胞能从灌注溶液得到。收获的肝实质细胞的活力通过台盼蓝染色法确定。为进一步实验，只使用显示70％以上台盼蓝拒染率的细胞制剂。 

1.2基质的制备 

在下面的实验中，使用了多孔板形式的细胞培养器皿，6孔板(类型657 160，GreinerBio-One)。培养板用天然胶原凝胶包被，最好从大鼠尾巴分离。可选择的，使用了多孔板-用I型胶原预包被的6孔板(类型657 950 CELLCOAT，Greiner Bio-One)。6孔板每孔底面积9.6cm²。 

1.3接种细胞 

分离的肝实质细胞接种到多孔板中。为此，制备了分离的肝实质细胞的悬浮液，每2ml悬浮液含有2.5～3百万活的肝实质细胞。吸取2ml该细胞悬浮液到6孔板的每个孔中。因此，细胞密度是2600～3200活的肝悬浮细胞每mm²细胞培养器皿面积。 

接种后，培养板放置约1小时。为此，转移培养板至培养柜中，其中主要是标准条件(37℃、5％的CO₂、95％的相对湿度)。静置阶段使得来自悬浮液的细胞粘附到胶原凝胶。通过显微镜检查评估成功的粘附，这是可能的。粘附/静置阶段后，吸掉细胞悬浮液的上清液，其中基本上含有不粘附的细胞。 

1.4冻结包被细胞的基质 

吸掉上清液后，每孔加入约1ml的37℃的温溶液1。然后细胞在培养柜中在标准条件下又静置约1小时。然后彻底吸出上清液，其基本上含有不粘附的细胞。 

溶液1是来自一用于肝实质细胞的标准细胞培养基，其含有10％的胎牛血清(FCS)。 

为了冻结，每孔加入0.5ml冻结剂。冻结剂的加入轻快地进行。冻结剂加入后，培养板立即放置在预冷到0℃的冷冻机中，并配置冻结程序。 

冻结剂基本上基于溶液1，含有10％的胎牛血清(FCS)和10％的二甲基亚砜(DMSO)。 

冻结程序提供相变的补偿，并达到-100℃的目标温度。 

冻结的细胞培养板随后在冷冻机或在氮罐的气相中在-151℃进行储存。 

实施例2：冷冻保存的肝实质细胞的解冻

根据实施例1冻结并储存在-151℃的肝实质细胞培养物在长达4周的储存期后被解冻并再培养，用于在体外实验的进一步使用。 

为了冷冻保存的肝实质细胞培养物的解冻，从冷冻机或氮罐(见实施例1)中取出后，6孔板首先立即转移至使用标准条件进行操作的培养柜5分钟。随后，每孔缓慢滴加1ml预热到37℃(见实施例1)的溶液1。重复该方法用于至多3块同时解冻的6孔板，即最多18孔。 

随后，重复该过程，再在每孔中缓慢加入1ml溶液1。然后，用巴斯德移液管吸取上清液。上清液基本上含有解冻的无生命的和不粘附的细胞。 

为了进一步的洗涤，在每例中，以同样方式，加入2次1ml 37℃的温溶液2。这里，溶液2，如上对溶液1所描述的那样，以两次1ml的方式加入到每个孔中。然后，培养板在培养柜中在标准条件下孵育约30分钟。孵育后，巴斯德吸液管吸取掉全部上清液，其含有另外的无生命的和不粘附的细胞。 

这样获得的粘附的肝实质细胞的单层用另一层胶原凝胶覆盖，从而获得夹心结构。倾倒后大约30分钟后，胶原凝胶硬化。它具有一组成，其基本上对应于引入培养器皿中的较下的胶原凝胶的组成。 

溶液2是一用于长期培养肝实质细胞的标准培养基，含有10％的胎牛血清(FCS)。 

获得的夹心培养物的进一步再培养是在溶液2中进行的，大约每24小时用新鲜培养基 进行替换。 

实施例3：活细胞数的测定

通过形态完整细胞计数方法测定了在新鲜分离的肝实质细胞的培养物中和在根据本发明的冷冻保存的肝实质细胞的培养物中能活的(有生命的)细胞的数目。在这里，对0.259mm²大小的对照区的照片进行了计数。从对照区找到的完整细胞的数目，推断了整个细胞培养器皿中的完整细胞的数目(对于所使用的具有每孔9.6cm²面积的6孔板，修正系数为3700)。 

在冻结前及在冷冻保存解冻后的不同时间点，再培养的肝实质细胞的形态用照片记录下来，并与新鲜分离和培养的肝实质细胞的培养物比较。 

结果： 

图1显示新鲜分离和接种于胶原凝胶层的人肝实质细胞的形态(图1A)及分离的被冷冻保存、解冻和再培养7天的人肝实质细胞的形态(图1B)。从形态上几乎不能将该再培养的冷冻保存的细胞与新鲜分离的细胞区分开来。 

与新鲜分离的肝实质细胞的培养物中的活细胞的比例相比，在培养物中的活细胞的比例只是略有下降。图2显示肝实质细胞解冻后随着再培养期变化的活的(有生命的)人肝实质细胞的数目。对照曲线显示新鲜分离的细胞经过同样时间培养的活的人肝实质细胞的数目。最初，对于冷冻保存的，接种了3百万细胞，对于新鲜制备的，接种了1.5百万。 

看到，解冻的再培养的人肝实质细胞融合生长，活的粘附细胞的数目与在可比较的新鲜培养物中活细胞的数目并没有显着差异。值得注意的是，在这里，即使经过较长的培养期，在冷冻保存解冻后的制备物中活细胞的数目几乎保持不变。 

实施例4：冷冻保存的肝实质细胞的酶活性

肝细胞的代谢和/或酶能力的一个良好标志物是睾酮的酶催化羟化的可诱导性。在完整肝细胞中，存在该反应的基础水平；羟睾酮(hydroxytestosterone，OHT)在这里形成。在完整细胞中形成速率通过酶诱导可以增加。在培养的肝实质细胞中的OHT形成的检测因此可以用于推断培养的肝实质细胞的酶能力和生理功能。 

区域和/或立体选择性睾酮羟基化的分析和定量以一种本身已知的方式进行，例如，出版的Friedrich et al.，2003(J.Chromatogr.B.784：49-61)。 

为了这项研究，根据本发明冷冻保存的人肝实质细胞进行解冻并再培养两天，随后用利福平孵育24小时。利福平在6β、16α和2β位置诱导睾酮羟基化。在6α位置的睾酮羟基 化不是由利福平刺激的。因此，6α-羟基化睾酮(6α-hydroxylated testosterone)的测定作为利福平实现的酶诱导的对比测量。 

作为对照，新鲜分离的培养物培养两天后同样孵育在利福平中24小时。选择的培养条件与根据本发明的方法类似。 

在酶诱导外，还确定了在冷冻保存再培养的细胞中和在新鲜制备并培养的细胞中的睾酮基础水平。 

结果： 

根据本发明的冷冻保存的、再培养的肝实质细胞和新鲜制备并培养的肝实质细胞表现出可比的酶诱导。睾酮羟基化诱导的均值如下表所示： 

	冷冻保存的、再培养的肝实质细胞  (根据本发明)	新鲜分离的肝实质细胞  (比较例)
			6β-羟基化	2.8倍	2.3倍
16α-羟基化	2.4倍	1.6倍
			2β-羟基化	2.3倍	2.4倍

一如所料，无论是在冷冻保存和再培养的肝实质细胞中还是在新鲜培养的肝实质细胞中，利福平不能诱导6α-羟睾酮(6α-hydroxytestosterone，6α-OHT)的形成。 

图3显示用利福平诱导睾酮羟基化之前和之后形成的羟睾酮的绝对浓度(以例如6β-OHT和16α-OHT的方式显示)。在图的左边部分，显示了新鲜培养的肝实质细胞的结果，在右边部分，显示了根据发明的冷冻保存和再培养的肝实质细胞的结果。图3A表示6β-OHT的形成，图3B表示16α-OHT的形成。盒须点指四分位数。显著水平指p＜0.05(t测验)。 

从与冷冻保存在悬浮液中的肝细胞的经验，知道冷冻保存与新鲜制备的肝实质细胞相比大大降低了在睾酮羟基化期间的基础水平。正如所料，与新鲜培养物相比，再培养的肝实质细胞的基本活性在冻存在单层中的肝实质细胞中也减少了。但是，解冻后24和72小时仍然是可以检测到的。 

特别看到，在解冻后72小时的时间点和与利福平孵育24小时后，冷冻保存的肝实质细胞表现出睾酮羟基化的显著诱导。 

获得超过至少三天的基本活性，且诱导未减少，这是根据本发明的冷冻保存的人肝实质细胞可以成功用于大量体外试验的事实的重要暗示。 

Claims (13)

1.用于制备适于冷冻保存的肝细胞的方法，包括步骤：

（a）制备基质，所述基质是胶原基质，

（b）制备分离的肝细胞，

（c）以2～4×10³mm^-2的密度在基质上接种肝细胞，

（d）包被细胞的基质静置10~180分钟，以便细胞能粘附到基质，

（e）从包被细胞的基质上洗涤掉不粘附的细胞，

（f）包被细胞的基质静置≤180分钟，和

（g）在冷冻剂中以每分钟-0.5～-20℃的冷却速率冻结包被细胞的基质，并控制冷却至－80℃或-80℃以下进行冻结，可选择地进行相变的补偿，所述冷冻剂含有10％胎牛血清和10％的二甲基亚砜。

2.如权利要求1所述的方法，在步骤（d）中，静置进行30～90分钟。

3.如权利要求1所述的方法，在步骤（e）中，进行一层培养基的覆盖和随后吸掉在包被细胞的基质上的上清液。

4.如权利要求1所述的方法，在步骤（f）中，静置进行30～180分钟。

5.如权利要求1所述的方法，在步骤（g）中，加入0.5μl mm^-2的冷冻剂。

6.如权利要求1所述的方法，在步骤（g）中，用冷冻剂覆盖包被细胞的基质。

7.用于冷冻保存分离的肝细胞的方法，包括步骤：

如权利要求1～6任一所述的方法的（a）至（g），

（h）储存冻结的包被细胞的基质，

（i）将冻结的包被细胞的基质置于标准条件下培养5分钟，然后滴加预热到37℃的用于肝实质细胞的培养基解冻冻结的包被细胞的基质，

（j）从包被细胞的基质上洗涤掉不粘附的细胞，

（k）用一层第二基质覆盖解冻的包被细胞的基质，和

（l）再培养埋在基质之间的细胞。

8.如权利要求7所述的方法，在步骤（h）中，储存发生在－150℃。

9.如权利要求7或8所述的方法，在步骤（i）中，所述培养基含有10％胎牛血清。

10.如权利要求7所述的方法，在步骤（j）中，包被细胞的基质用一层培养基覆盖，随后吸出包被细胞的基质上的上清液。

11.用于制备冷冻保存的分离的肝细胞的夹心培养物的方法，包括根据权利要求7～10任一所述的方法的步骤（a）至（l）。

12.如权利要求11所述的方法，步骤（a）包括步骤：

（a1）从动物或人体制备肝组织和

（a2）从组织分离肝细胞。

13.冷冻保存的肝细胞的夹心培养物，其可以通过如权利要求11或12所述的方法制备。

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