EP1956896A1 - Kryokonservierung von hepatocyten - Google Patents

Kryokonservierung von hepatocyten

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EP1956896A1
EP1956896A1 EP06818357A EP06818357A EP1956896A1 EP 1956896 A1 EP1956896 A1 EP 1956896A1 EP 06818357 A EP06818357 A EP 06818357A EP 06818357 A EP06818357 A EP 06818357A EP 1956896 A1 EP1956896 A1 EP 1956896A1
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EP
European Patent Office
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matrix
cells
cell
occupied
medium
Prior art date
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EP06818357A
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English (en)
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EP1956896B1 (de
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Lubomir Arseniev
Krassimira Alexandrova
Marc Barthold
Sabine Kafert-Kasting
Britta Laube
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Cytonet GmbH and Co KG
Original Assignee
Cytonet GmbH and Co KG
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Publication date
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Priority to PL06818357T priority patent/PL1956896T3/pl
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Application granted granted Critical
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/0231—Chemically defined matrices, e.g. alginate gels, for immobilising, holding or storing cells, tissue or organs for preservation purposes; Chemically altering or fixing cells, tissue or organs, e.g. by cross-linking, for preservation purposes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • the present application relates to the technical field of cryopreservation and more particularly to methods of preparing liver cells for cryopreservation, to methods of cryopreserving isolated liver cells, and to methods of producing a sandwich culture of cryopreserved isolated liver cells.
  • Hepatic cells isolated from the trade association are mainly used in the form of primary cell cultures for testing the physiological effect of drug candidates.
  • freshly prepared human primary hepatocytes are the "gold standard" for screening drug candidates in vitro assays, drug metabolism studies, or enzyme induction studies
  • freshly isolated human hepatocytes are not regularly and readily available There is therefore a need for methods whereby isolated hepatocytes can be stored for a certain period of time, while the physiological function of the cells, that is to say above all their metabolic or enzymatic competence, should be retained as completely as possible.
  • hepatocytes are stored cryopreserved. As a rule, hepatocytes are cryopreserved in suspension. In addition to the hepatocytes, the suspension also contains a freezing medium which causes damage to the cells by freezing and thawing should prevent. For storage, the suspension is usually frozen to temperatures below -80 0 C. For use after storage, the frozen cell suspension is thawed and the cells are plated on culture plates or in culture dishes. For recultivation of the constructed cells, the culture vessels are usually coated with matrix material, whereupon the cells can adhere. Successful adhesion is essential for recultivation and subsequent investigations. In most cases, however, only a small proportion of the originally frozen cells can be maintained in a viable state and recultivated.
  • the disadvantage of this procedure is, above all, that it can not be predicted whether or to what extent the thawed cells from the suspension adhere to the culture plate.
  • the proportion of adherent cells in the batch depends on the individual batch.
  • the thawed cryopreserved cells accumulate regularly on the culture plate only in a small number of batches.
  • Another known method of cryopreservation is to plate freshly isolated cells in culture vessels to subsequently freeze the plated cells together with the culture vessels. Again, the culture vessels are coated prior to plating with a matrix on which the cells can adhere. As is known, collagen gels are preferably used. In a known method, hepatocytes are seeded on collagen type I coated culture plates and allowed to attach to the collagen matrix for about 4 hours. The resulting monolayer
  • hepatocytes are frozen in sandwich configuration, that is in double gel arrangement.
  • a hepatocyte suspension is first seeded on cell culture plates coated with gelatin gel. After 24 hours of culturing the cells, a second layer of collagen gel is poured onto the seeded cells. Subsequently, the sandwich culture thus obtained is frozen in freezing at -7O 0 C and stored (Koebe et al, 1990; Cryobiology 27:. 576-584).
  • the cells are mechanically stabilized, thereby increasing the survival rate.
  • the rate of attachment to the attachment of cryopreserved cells frozen in suspension and thawed is markedly increased. Nevertheless, even after thawing large parts of unattached or non-vital cells occur here.
  • the ideal state a confluent culture of vital hepatocytes is not reached. It also shows that cells frozen in suspension usually lose their metabolic competence within a few hours after thawing. They are then unsuitable for a variety of in-vitro tests. Furthermore, cells isolated from human organs are usually less robust than cells taken from animal models.
  • An improved cryopreservation method should above all be able to successfully cryopreserve isolated human hepatocytes. It should be ensured that the thawed cells can be recultured to a large extent, if possible as a confluent monolayer (continuous single layer) on the cultivation matrix. Furthermore, the method should be suitable for being able to produce improved sandwich cultures of isolated liver cells which contain a high proportion of vital cells. Furthermore, it should be ensured that the recultured cells thawed after cryoconservation maintain their metabolic or enzymatic competence for as long as possible, so that they can be used for a large number of in vitro tests. task
  • the technical problem underlying the present invention is to provide improved methods for the cryopreservation of isolated liver cells, in particular human liver cells, so that cryopreserved liver cells can eventually be recultured as an improved sandwich culture.
  • a method for the preparation of liver cells for cryopreservation which comprises the following steps:
  • a matrix in particular a collagen matrix, preferably a collagen gel, is provided.
  • the matrix is preferably initially introduced in a cell culture vessel, for example a 6-well plate.
  • the culture vessel is coated with matrix material.
  • step (b) isolated liver cells, in particular isolated from tissue, are provided.
  • the isolated liver cells are seeded on the matrix.
  • the density of the liver cells on the matrix is from 2 to 4 ⁇ 10 3 cells per mm 2 matrix area.
  • the preferred cell density is 2.6 to 3.2 x 10 3 mm "2. That is, in a culture vessel with a surface area of 9.6 cm 2, for example, the bottom surface of a well in a 6-well plate, the number of seeded cells from 2.5 to 3 x 10 6 per well.
  • the cells are allowed to rest on the matrix (resting phase, attachment phase).
  • the matrix occupied with cells is left alone for a period of 10 to 180 minutes, preferably for 30 to 90 minutes, more preferably for about 1 hour, so that the cells seeded on the matrix can adhere to the matrix.
  • the suspension is preferably carried out in a culture cabinet (incubator), in particular under standard conditions at a temperature of 37 ° C, a proportion of 5% CO 2 and at 95% relative humidity. Successful adhesion can be additionally verified by microscopic control.
  • step (e) After resting in step (d), the non-matrix adherent cells in step (e) are washed off the cell-occupied matrix, particularly gently (wash step).
  • the washing off is preferably carried out by covering the matrix occupied with cells with culture medium, and then aspirating the liquid residue from culture medium and non-adherent cells. Preferably, this step is repeated at least once.
  • the washed-off, cell-lined matrix is left to rest again (second resting phase). Resting takes place for a maximum of 180 minutes, especially from 30 to 180 minutes, more preferably for about 1 hour.
  • the rest is preferably carried out in a culture cabinet, in particular under standard conditions at a temperature of 37 ° C, a proportion of 5% CO 2 and at 95% relative humidity.
  • the matrix occupied with cells is frozen in a freezing medium in step (g) (freezing step).
  • the matrix occupied with cells is preferably washed off again, above all to remove residual, non-adherent cells (washing step).
  • the procedure preferably corresponds to step (e).
  • the method according to the invention therefore provides for sowing out isolated liver cells in a specific density on a matrix and, after a certain sequence of resting phases and washing away non-adherent cells, freezing in freezing medium.
  • a matrix occupied by cells, in particular collagen matrix, on which the cells adhere and are present especially in a monolayer is frozen.
  • the measures according to the invention give a culture of intact cells which can be frozen particularly well, that is to say can be cryopreserved.
  • the cultures prepared and cryopreserved according to the invention after thawing are particularly viable (vital) and have a high number of cells adhering to the matrix.
  • the thawed cells can advantageously be recultured in a confluent monolayer.
  • the process according to the invention is particularly gentle on the cell line and therefore also suitable for less robust cells, such as the hepatocytes isolated from human organs.
  • the cells prepared and cryopreserved according to the invention when over-thawed after thawing with a second matrix, retain their full metabolic activity or metabolic competence for several days, especially more than 3 days.
  • the freezing in step (g) is carried out with freezing medium, which is added in an amount of about 0.5 ml per mm 2 base area of the culture vessel.
  • the matrix occupied with cells is overcoated with the freezing medium for this purpose.
  • the freezing medium contains 10% fetal calf serum (FCS) and 10% dimethylsulfoxide (DMSO).
  • a freezing medium in step (g) after the addition of cooled in a controlled, that is, frozen, preferably to temperatures from -80 0 C or less. 2O 0 C per minute used - preferably for cooling the cooling rate of -0.5 to.
  • the phase transition is compensated; This is preferably done by heating briefly with heating rates of preferably from +1 to + 3 ° C / minute.
  • the matrix occupied with cells is stored frozen in the context of cryopreservation.
  • the temperature during storage is -8O 0 C or less, more preferably -150 0 C or less.
  • the storage is carried out in a freezer or in the vapor phase of liquid air, or liquid nitrogen.
  • all other known methods for the low-temperature storage of cells are suitable. The person skilled in the art will select the bearing methods according to their field of application and according to their suitability.
  • the present invention accordingly also relates to a method for the cryopreservation of isolated liver cells which comprises the above-characterized steps (a) to (g), wherein in a further step (h) the frozen, cell-occupied matrix, over an indefinite period of time, which is selected depending on the field of application and purpose is stored.
  • the frozen, cell-coated matrix is thawed again.
  • This is preferably done by overlaying the frozen, cell-loaded matrix with warm culture medium.
  • the frozen, cell-loaded matrix is present in a culture vessel, for example a 6-well plate.
  • the culture vessel is removed from the freezer or the nitrogen tank and, in particular immediately after, incubated for about 5 minutes in a culture cabinet under standard conditions (37 ° C, 5% CO 2 , 95% relative humidity).
  • a thawing medium medium 1
  • medium 1 is placed on an area of about 9.6 cm 2 (6-well plate).
  • the temperature of the medium is preferably about 37 ° C.
  • the process is repeated for each cell culture vessel.
  • a maximum of three 6-well plates are used, so that in a maximum of 18 wells, the matrix covered with cells is covered with warm medium.
  • each cell culture vessel or well is covered with the same amount of medium 1 (1 ml per 9.6 cm 2 ) in the same way, preferably slowly and dropwise.
  • medium 1 is a serum-containing frothing medium, which preferably contains 10% fetal calf serum (FCS).
  • step (j) in particular non-adherent cells or detached, non-vital cells washed off by the cells are washed away, so that a matrix free of non-adherent cells is obtained.
  • the supernatant obtained by the addition of medium 1 in step (i) is first aspirated as completely as possible over the matrix occupied by cells.
  • the supernatant contains essentially thawed, non-vital and non-adherent cells.
  • a further medium that is to say medium 2, preferably dropwise, is then added to the extracted, cell-occupied matrix.
  • Medium 2 preferably has a temperature of about 37 ° C.
  • step (i) When medium 2 is added, the two-step procedure shown in step (i) is preferably selected; First, the first half of the medium is distributed in each cell culture vessels and then distributed the second half accordingly.
  • the amounts of medium 2 added correspond to the amounts of medium 1 in step (i).
  • Medium 2 preferably has a composition differing from the thawing medium (medium 1).
  • Medium 2 is preferably serum-containing and preferably contains 10% FCS.
  • the matrices overlaid with medium 2 are then incubated for about 30 minutes in the culture cabinet under standard conditions (resting phase, incubation).
  • the supernatant is then removed from the cell-occupied matrix Cell culture vessel, as completely as possible, aspirated. As a result, a matrix substantially free of non-adherent and non-vital cells is obtained.
  • the thawed, washed-off matrix coated with cells is covered with a second matrix, preferably a collagen matrix, particularly preferably a collagen gel, or the gel is poured on.
  • a second matrix preferably a collagen matrix, particularly preferably a collagen gel, or the gel is poured on.
  • the preferably infused gel cures within a few minutes to 1 hour.
  • the composition of the first, lower matrix and the second, upper matrix applied after thawing are substantially the same, preferably identical.
  • the second upper matrix is poured as a gel onto the liver cells grown on the lower matrix monolayer. According to the invention, a sandwich culture is obtained in which isolated liver cells are embedded between two matrices, in particular two collagen gels.
  • a concluding step (I) the cells embedded between the matrices are recultivated and, depending on the field of application and purpose, used as intended or immediately after a suitably selected culture period, ie preferably in vitro tests.
  • the inventively prepared and cryopreserved, thawed and recultured isolated liver cells have a particularly high rate of vitality. They show their metabolic competence for a particularly long time after thawing.
  • the procedure according to the invention makes it possible to cryokonser isolated, less robust hepatocytes, more particularly from human organs. and thaw successfully so that they can subsequently be used over a long period of time in appropriate in vitro Jess.
  • a cell culture is obtained in which the cells can essentially be recultivated as a confluent monolayer and in which the proportion of non-vital or non-adherent cells is very low.
  • the invention also relates to a method for producing a sandwich culture of cryopreserved isolated liver cells, wherein at least steps (a) to (I) of the methods according to the invention are carried out and a sandwich culture of cells embedded between an upper and a lower matrix is obtained.
  • the present application also relates to a method for producing a sandwich culture of isolated liver cells, wherein first liver tissue of an animal or human organism is provided and then the liver cells are isolated from the tissue and at least the method steps (a) to (I) according to the invention are carried out become.
  • the person skilled in the art will select, depending on the field of application and expediency, known methods for isolating liver cells from tissues.
  • the present invention also relates to a sandwich culture which can be produced by the abovementioned method and which is preferably produced by the method.
  • a sandwich culture according to the invention has all the aforementioned advantages and represents an improved culture of isolated liver cells compared to the prior art. embodiments
  • Figure 1 Microscopic images of cultured hepatocytes
  • FIG. 1A freshly isolated human hepatocytes
  • FIG. 1B cryopreserved human hepatocytes
  • FIG. 2 number of vital hepatocytes as a function of the cultivation time
  • FIG. 3 Formation of 6 ⁇ -OH and 16 ⁇ -OHT after enzyme induction with rifampicin.
  • Example 1 Preparation of human hepatocytes for cryopreservation
  • Hepatocytes from human donors were isolated in a manner known per se from tissue parts which had already been surgically removed and which were removed with the consent of the donor. For this purpose, the tissues were perfused, whereby the hepatocytes detached from the tissue and could be obtained from the perfusion solution. The viability of harvested hepatocytes was determined with a Trypan Blue Assay. For the further experiments, only cell preparations were used which showed more than 70% trypan blue exclusion.
  • 6-well plates type 657 160, Greiner Bio-One
  • the plates were coated with native collagen gel, preferably isolated from rat tails.
  • precoated multiwell plates 6-well plates (type 657 950 CELLCOAT, Greiner Bio-One) were used with type 1 collagen.
  • the 6-well plates had a bottom area of 9.6 cm 2 per well.
  • the isolated hepatocytes were seeded in the multiwell plates.
  • a suspension of the isolated hepatocytes was prepared, which contained from 2.5 to 3 million vital hepatocytes per 2 ml suspension. 2 ml of this cell suspension were pipetted in each well of the 6-well plate. The cell density was thus from 260 to 320 vital hepatocytes per 1 mm 2 area of the cell culture vessel.
  • the plates were allowed to stand for about 1 hour.
  • the plates were placed in a culture cabinet in which standard conditions (37 ° C, 5% CO 2 , 95% relative humidity) prevailed.
  • the resting period allowed the cells from the suspension to adhere to the collagen gel. Successful adhesion could be assessed by microscopic control.
  • the supernatant of the cell suspension which had substantially non-adherent cells, was aspirated.
  • Medium 1 is derived from a standard hepatocyte cell culture medium and contains 10% fetal calf serum (FCS).
  • the freezing medium is essentially based on medium 1 and contains 10% fetal calf serum (FCS) and 10% dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • FCS fetal calf serum
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the freezing program a compensation of Phasenüber- against gangs and reached a target temperature of -100 0 C.
  • Example 2 Thawing of cryopreserved hepatocytes
  • Patocytenkulturen were prepared according to Example 1 frozen and stored at -151 0 C He- for further use in in vitro tests after a storage period of up to 4 weeks thawed and re-cultured.
  • the 6-well plates were first placed in a culture cabinet operated immediately after removal from the freezer or nitrogen tank for 5 minutes, which was operated under standard conditions (see Example 1). Subsequently, 1 ml of the preheated to 37 ° C medium 1 (see Example 1) per well was added slowly and dropwise in each well. This process was repeated for a maximum of three simultaneously thawing 6-well plates, that is for a maximum of 18 wells.
  • Medium 2 is a standard medium for long-term hepatocyte culture and contains 10% fetal calf serum (FCS).
  • FCS fetal calf serum
  • the number of viable (vital) cells was determined in cultures of freshly isolated hepatocytes as well as in cultures of cryoconserved hepatocytes according to the invention by counting the morphologically intact cells. Photographs of comparison areas of 0.259 mm 2 were counted. From the number of intact cells found in the control area, the number of intact cells in the whole cell culture vessel was determined (for the used 6-well plates with an area of 9.6 cm 2 per well, a correction factor of 3700 results).
  • Figure 1 shows the morphology of freshly isolated human hepatocytes seeded on a collagen gel layer ( Figure 1A) and the morphology of cryopreserved, thawed and recultured isolated human hepatocytes for seven days ( Figure 1B).
  • the recultured cryopreserved cells can hardly be differentiated morphologically from freshly isolated cells.
  • Hepatocytes as a function of the recultivation period after thawing the hepatocytes.
  • the comparison curve shows the number of live human hepatocytes culturing fresh isolated cells over the same time period. Initially, 3 million cells were sown for cryopreservation and 1.5 million cells for the fresh preparation.
  • a good marker for the metabolic or enzymatic competence of liver cells is the inducibility of the enzy- matic hydroxylation of testosterone.
  • OHT hydroxytestosterone
  • cryopreserved human hepatocytes were thawed according to the invention and recultured for two days and then incubated for a further 24 hours in rifampicin.
  • Rifampicin induces testosterone hydroxylation at positions 6 ⁇ , 16 ⁇ and 2 ⁇ .
  • Testosterone hydroxylation at position 6 ⁇ is not stimulated by rifampicin.
  • the measurement of 6 ⁇ -hydroxylated testosterone was therefore the comparative measurement of that for the enzyme induction by rifampicin.
  • rifampicin was unable to induce the formation of 6 ⁇ -hydroxytestosterone (6 ⁇ -OHT) in either the cryopreserved and recultured hepatocytes or in the freshly cultured hepatocytes.
  • Figure 3 shows the absolute concentration of hydroxytestosterone formed (exemplified for 6 ⁇ -OH and 16 ⁇ -OHT) before and after induction of testosterone hydroxylation with rifampicin.
  • the left part of the picture shows the results for the freshly cultured hepatocytes, the right part shows the results for the cryopreserved and recultured hepatocytes according to the invention.
  • Figure 3A shows the formation of 6 ⁇ -OHT
  • Figure 3B shows the formation of 16 ⁇ -OHT.
  • the box-and-whisker blots indicate the quartiles. Displays the significance level p ⁇ 0.05 (t-test).
  • cryopreservation greatly reduces the basal metabolic rate in testosterone hydroxylation compared to freshly prepared heptocytes.
  • the basic activity of the recultured hepatocytes also decreased in the monolayer of cryopreserved liver cells compared to the fresh culture. However, it was still well detectable 24 and 72 hours after thawing.
  • cryopreserved hepatocytes had a clear inducibility for testosterone hydroxylation at 72 hours after thawing and after a previous 24-hour incubation with rifampicin.
  • the basic activity obtained over at least three days together with the unimpaired inducibility are essential indications that the cryopreserved human hepatocytes according to the invention can be used successfully for a large number of in vitro tests.

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Description

Kryokonservierung von Hepatocvten
Beschreibung
Die vorliegende Anmeldung betrifft das technische Gebiet der Kryo- konservierung und im Einzelnen Verfahren zur Präparation von Leberzellen für die Kryokonservierung, Verfahren zur Kryokonservierung isolierter Leberzellen und Verfahren zur Herstellung einer Sandwichkultur kryokonservierter isolierter Leberzellen.
Stand der Technik
Aus dem Gewerbeverband isolierte Leberzellen, speziell Hepatocy- ten, werden vor allem in Form von Primärzellkulturen zum Testen der physiologischen Wirkung von Arzneimittelkandidaten eingesetzt. Vor allem frisch präparierte primäre Hepatocyten aus Menschen stellen den „Goldstandard" dar, um in in wfro-Testreihen Wirkstoffkandi- daten zu ermitteln oder Untersuchungen zum Metabolismus der Wirkstoffe oder zur Enzyminduktion durchzuführen. Nachteiligerweise sind frisch isolierte menschliche Hepatocyten nicht regelmäßig und jederzeit verfügbar. Es besteht daher der Bedarf an Verfahren, wodurch isolierte Hepatocyten für eine gewisse Zeit gelagert werden können. Die physiologische Funktion der Zellen, das heißt vor allem ihre metabolische beziehungsweise enzymatische Kompetenz, soll dabei möglichst vollständig erhalten bleiben.
Bekanntermaßen werden Hepatocyten kryokonserviert gelagert. In der Regel werden Hepatocyten in Suspension kryokonserviert. Die Suspension enthält neben den Hepatocyten noch ein Einfriermedium, das eine Schädigung der Zellen durch Einfrieren und Auftauen verhindern soll. Zur Lagerung wird die Suspension meist auf Temperaturen unterhalb von -800C eingefroren. Zur Verwendung nach der Lagerung wird die gefrorene Zellsuspension aufgetaut, und die Zellen werden auf Kulturplatten oder in Kulturgefäße ausplattiert. Zur Rekultivierung der aufgebauten Zellen sind die Kulturgefäße in der Regel mit Matrixmaterial beschichtet, worauf die Zellen anhaften können. Eine erfolgreiche Anhaftung ist für die Rekultivierung und die nachfolgenden Untersuchungen essenziell. Meist lässt sich aber nur ein geringer Anteil der ursprünglich eingefrorenen Zellen in vita- lern Zustand erhalten und rekultivieren. Der Nachteil dieses Vorgehens besteht vor allem darin, dass nicht vorhergesehen werden kann, ob oder zu welchem Anteil die aufgetauten Zellen aus der Suspension auf der Kulturplatte anhaften. Der Anteil der anhaftenden Zellen im Batch ist abhängig vom individuellen Batch. Regelmä- ßig heftet nur in einer geringen Zahl der Batches die aufgetauten kryokonservierten Zellen ausreichend an der Kulturplatte an.
Ein weiteres bekanntes Verfahren zur Kryokonservierung besteht darin, frisch isolierte Zellen in Kulturgefäßen auszuplattieren, um die ausplattierten Zellen anschließend zusammen mit den Kulturgefäßen einzufrieren. Auch hier werden die Kulturgefäße vor dem Ausplattieren mit einer Matrix, worauf die Zellen anhaften können, beschichtet. Bekanntermaßen werden bevorzugt Kollagengele eingesetzt. In einem bekannten Verfahren werden Hepatocyten auf mit Kollagen Typ I beschichteten Kulturplatten ausgesät und für cirka 4 Stunden auf der Kollagenmatrix anheften lassen. Die entstehende Monolayer-
Kultur (Einschichtzellkultur) wird dann ungefähr 20 Stunden kultiviert. Anschließend werden nicht anhaftende Zellen abgewaschen. Nach weiteren 6 Stunden wird die Kultur mit Einfriermedium überschichtet, auf -700C abgekühlt und gelagert (Watts und Grant, 1998; Human & Experimental Toxicology 15:30-37). Zur anschließenden Verwendung werden die Monolayerkulturen aufgetaut und rekultiviert. Die aufgetauten Kulturen weisen aber einen hohen Anteil nicht anhaftender und nicht vitaler Zellen sowie Zelltrümmer auf. Zwar sind meist große Teile der Matrix mit Zellen bedeckt, ein konfluenter, zusammenhängender Zellverband stellt sich jedoch nicht ein.
In einem anderen bekannten Verfahren werden Hepatocyten in Sandwichkonfiguration, das heißt in Doppelgel-Anordnung, eingefroren. Dazu wird eine Hepatocytensuspension zunächst auf mit KoIIa- gengel beschichtete Zellkulturplatten ausgesät. Nach 24 Stunden Kultivierung der Zellen wird eine zweite Schicht aus Kollagengel auf die ausgesäten Zellen aufgegossen. Anschließend wird die so erhaltene Sandwichkultur in Einfriermedium auf -7O0C eingefroren und gelagert (Koebe et al., 1990; Cryobiology 27:576-584).
Durch das Immobilisieren der Leberzellen auf einer Matrix oder zwischen zwei Matrices vor dem Einfrieren werden die Zellen mechanisch stabilisiert und dadurch die Überlebensrate erhöht. Dadurch, dass die Zellen in frisch isoliertem, hochvitalem Stadium anheften können, ist die Anheftungsrate gegenüber der Anheftung von in Suspension eingefrorener und aufgetauter kryokonservierter Zellen deutlich erhöht. Trotzdem treten auch hier nach dem Auftauen große Anteile nicht angehefteter beziehungsweise nicht vitaler Zellen auf. Der Idealzustand, eine konfluente Kultur vitaler Hepatocyten wird nicht erreicht. Außerdem zeigt sich, dass die in Suspension eingefro- renen Zellen in der Regel innerhalb weniger Stunden nach dem Auftauen ihre metabolische Kompetenz verlieren. Sie sind dann für eine Vielzahl von in wϊro-Tests ungeeignet. Weiter sind aus menschlichen Organen isolierte Zellen meist weniger robust als aus Tiermodellen entnommene Zellen. Dies ist vor allem darauf zurückzuführen, dass menschliche Zellen aus Spenderorganen in der Regel unter weniger günstigen Bedingungen ge- wonnen werden können als Zellen aus Tieren, die meist eigens für diesen Zweck gezüchtet und dann euthanasiert werden (zum Beispiel Ratten, Mäuse oder Schweine). Daher erfordern humane Zellen weitaus schonendere Kultivierungsbedingungen. Bisher ist kein Kry- okonservierungsverfahren bekannt, womit humane Hepatocyten er- folgreich kryokonserviert werden können, um damit anschließend über einen längeren Zeitraum in wYro-Studien durchführen zu können.
Es besteht daher der Bedarf an verbesserten Verfahren zur Kryokonservierung von Leberzellen, die eine schonende Kryokonservie- rung, das heißt vor allem ein schonendes Auftauen mit hoher Überlebensrate ermöglichen. Ein verbessertes Kryokonservierungsver- fahren soll vor allem geeignet sein, isolierte humane Hepatocyten erfolgreich zu kryokonservieren. Dabei sollte gewährleistet sein, dass die aufgetauten Zellen zu einem großen Anteil, möglichst als kon- fluenter Monolayer (zusammenhängende Einzelschicht), auf der Kultivierungsmatrix rekultiviert werden können. Weiter soll das Verfahren geeignet sein, verbesserte Sandwichkulturen isolierter Leberzellen herstellen zu können, die einen hohen Anteil vitaler Zellen enthalten. Weiter soll gewährleistet werden, dass die nach der Kryokon- servierung aufgetauten, rekultivierten Zellen über einen möglichst langen Zeitraum ihre metabolische beziehungsweise enzymatische Kompetenz aufrechterhalten, sodass sie für eine Vielzahl von in wYro-Tests eingesetzt werden können. Aufgabenstellung
Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht demgemäß in der Bereitstellung von verbesserten Verfahren zur Kryokonservierung von isolierten Leberzellen, insbeson- dere humanen Leberzellen, sodass kryokonservierte Leberzellen schließlich als verbesserte Sandwichkultur rekultiviert werden können.
Das zugrundeliegende technische Problem wird gelöst durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1 , insbesondere ein Verfahren zur Präparation von Leberzellen für die Kryokonservierung, welches folgende Schritte enthält:
In Schritt (a) wird eine Matrix, insbesondere eine Kollagenmatrix, bevorzugt ein Kollagengel bereitgestellt. Die Matrix ist bevorzugt vorgelegt in einem Zellkulturgefäß, beispielsweise eine 6-well-PIatte. Bevorzugt wird das Kulturgefäß mit Matrixmaterial beschichtet.
In Schritt (b) werden isolierte Leberzellen, insbesondere isoliert aus Gewebe, bereitgestellt.
Im nachfolgenden Schritt (c) werden die isolierten Leberzellen auf der Matrix ausgesät. Die Dichte der Leberzellen auf der Matrix be- trägt dabei von 2 bis 4 x 103 Zellen pro mm2 Matrixfläche. Die bevorzugte Zelldichte beträgt von 2,6 bis 3,2 x 103 mm"2. Das heißt bei einem Kulturgefäß mit einer Grundfläche von 9,6 cm2, beispielsweise die Bodenfläche eines Wells in einer 6-well-Platte, beträgt die Zahl der ausgesäten Zellen von 2,5 bis 3 x 106 pro Well. Im weiteren, vorzugsweise unmittelbar anschließenden, Schritt (d) werden die Zellen auf der Matrix ruhen gelassen (Ruhephase, An- heftungsphase). Dazu wird die mit Zellen belegte Matrix für einen Zeitraum von 10 bis 180 Minuten, bevorzugt von 30 bis 90 Minuten, besonders bevorzugt für etwa 1 Stunde, in Ruhe gelassen, sodass sich die auf der Matrix ausgesäten Zellen an die Matrix anheften können. Das Ruhen erfolgt vorzugsweise im Kulturschrank (Brutschrank), insbesondere bei Standardbedingungen bei einer Temperatur von 37°C, einem Anteil von 5 % CO2 und bei 95 % relativer Luftfeuchtigkeit. Die erfolgreiche Anhaftung kann durch mikroskopische Kontrolle zusätzlich verifiziert werden.
Nach dem Ruhen in Schritt (d) werden die nicht an der Matrix anhaftenden Zellen in Schritt (e) von der mit Zellen belegten Matrix, insbesondere vorsichtig, abgewaschen (Waschschritt). Das Abwaschen erfolgt vorzugsweise dadurch, dass die mit Zellen belegte Matrix mit Kulturmedium überschichtet wird, und anschließend der flüssige Ll- berstand aus Kulturmedium und nicht anhaftenden Zellen abgesaugt wird. Vorzugsweise wird dieser Schritt mindestens einmal wiederholt.
In einem weiteren Schritt (f) wird die abgewaschene, mit Zellen be- legte Matrix erneut ruhen gelassen (zweite Ruhephase). Das Ruhen erfolgt für einen Zeitraum von maximal 180 Minuten, besonders von 30 bis 180 Minuten, besonders bevorzugt für etwa 1 Stunde. Das Ruhen erfolgt vorzugsweise im Kulturschrank, insbesondere bei Standardbedingungen bei einer Temperatur von 37°C, einem Anteil von 5 % CO2 und bei 95 % relativer Luftfeuchtigkeit.
Nach der zweiten Ruhephase wird die mit Zellen belegte Matrix in Schritt (g) in einem Einfriermedium eingefroren (Einfrierschritt). Vor dem Einfrieren und nach der zweiten Ruhephase wird die mit Zellen belegte Matrix vorzugsweise erneut abgewaschen, vor allem um restliche, nicht anhaftende Zellen zu entfernen (Waschschritt). Das Vorgehen entspricht vorzugsweise Schritt (e).
Das erfindungsgemäße Verfahren sieht also vor, isolierte Leberzellen in einer bestimmten Dichte auf einer Matrix auszusäen und nach einer bestimmten Abfolge von Ruhephasen und Abwaschen nicht anhaftender Zellen in Einfriermedium einzufrieren. Es wird also eine mit Zellen belegte Matrix, insbesondere Kollagenmatrix, worauf die Zellen anhaften und besonders in einem Monolayer vorliegen, eingefroren. Durch die erfindungsgemäßen Maßnahmen wird überraschenderweise eine Kultur intakter Zellen erhalten, die besonders gut eingefroren, das heißt kryokonserviert werden kann. Es stellt sich dabei heraus, dass die erfindungsgemäß präparierten und kryokon- servierten Kulturen nach dem Auftauen besonders lebensfähig (vital) sind und eine hohe Zahl von an der Matrix anhaftender Zellen aufweisen. Die aufgetauten Zellen können dabei vorteilhafterweise in einem konfluenten Monolayer rekultiviert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist überraschenderweise beson- ders zeilschonend und daher auch für weniger robuste Zellen, wie die aus menschlichen Organen isolierten Hepatocyten geeignet. Vor allem zeigt sich, dass die erfindungsgemäß präparierten und kryo- konservierten Zellen, wenn sie nach dem Auftauen mit einer zweiten Matrix überschichtet werden, über mehrere Tage, besonders mehr als 3 Tage, ihre volle metabolische Aktivität beziehungsweise metabolische Kompetenz behalten. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das Einfrieren in Schritt (g) mit Einfriermedium, das in einer Menge von etwa 0,5 ml pro mm2 Grundfläche des Kulturgefäßes zugegeben wird. Vorzugsweise wird dazu die mit Zellen belegte Matrix mit dem Einfriermedium überschichtet. Vorzugsweise enthält das Einfriermedium 10 % fötales Kälberserum (FCS) sowie 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt (g) nach Zugabe eines Einfriermediums kontrolliert abgekühlt, das heißt eingefroren, vorzugsweise auf Temperaturen von -800C oder weniger. Vorzugsweise werden zum Abkühlen Kühlraten von -0,5 bis - 2O0C pro Minute eingesetzt. In einer bevorzugten Variante wird dabei der Phasenübergang kompensiert; dies erfolgt vorzugsweise durch kurzzeitiges Erwärmen mit Heizraten von vorzugsweise von +1 bis +3°C/Minute.
Nach dem erfindungsgemäßen Präparieren und Einfrieren der isolierten Leberzellen auf einer Matrix wird die mit Zellen belegte Matrix im Rahmen der Kryokonservierung in gefrorenem Zustand gelagert. Vorzugsweise beträgt die Temperatur bei der Lagerung -8O0C oder weniger, besonders bevorzugt -1500C oder weniger. Zweckmäßigerweise erfolgt die Lagerung in einem Gefrierschrank oder in der Dampfphase von flüssiger Luft, beziehungsweise flüssigem Stickstoff. Selbstverständlich sind auch alle weiteren bekannten Verfahren zur Tieftemperaturlagerung von Zellen geeignet. Der Fachmann wird die Lagerverfahren entsprechend seinem Anwendungsgebiet und entsprechend ihrer Zweckmäßigkeit wählen. Die vorliegende Erfindung betrifft demgemäß auch ein Verfahren zur Kryokonservierung isolierter Leberzellen, das die vorstehend charakterisierten Schritte (a) bis (g) enthält, wobei in einem weiteren Schritt (h) die gefrorene, mit Zellen belegte Matrix, über einen unbestimm- ten Zeitraum, der je nach Anwendungsgebiet und -zweck gewählt wird, gelagert wird.
In einem nachfolgenden weiteren Schritt (i) wird, je nach Anwendungsgebiet und -zweck, vorzugsweise unmittelbar vor der Verwendung oder zu einem anderen geeigneten Zeitpunkt, die gefrorene, mit Zellen belegte Matrix wieder aufgetaut. Dies erfolgt vorzugsweise durch Überschichten der gefrorenen, mit Zellen belegten Matrix mit warmen Kulturmedium. Vorzugsweise liegt die gefrorene, mit Zellen belegte Matrix in einem Kulturgefäß, beispielsweise einer 6-well- Platte, vor. Vorzugsweise wird das Kulturgefäß aus der Gefriertruhe beziehungsweise dem Stickstofftank entnommen und, insbesondere sofort danach, für etwa 5 Minuten im Kulturschrank unter Standardbedingungen (37°C, 5 % CO2, 95 % relative Luftfeuchtigkeit) inkubiert. Danach wird vorzugsweise ein Auftaumedium (Medium 1), bevorzugt langsam und tropfenweise, auf die mit Zellen belegte Matrix pipettiert. Als Anhaltspunkt werden auf eine Fläche von etwa 9,6 cm2 (6-well-Platte) cirka 1 ml Medium 1 gegeben. Die Temperatur des Mediums beträgt vorzugsweise etwa 37°C. Der Vorgang wird für jedes Zellkulturgefäß wiederholt. Als Anhaltspunkt werden maximal drei 6-well-Platten eingesetzt, sodass in maximal 18 Wells die mit Zellen belegte Matrix mit warmen Medium überschichtet wird. Anschließend wird vorzugsweise jedes Zellkulturgefäß beziehungsweise Well mit derselben Menge Medium 1 (1 ml pro 9,6 cm2) in derselben Weise, vorzugsweise langsam und tropfenweise, überschichtet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist Medium 1 ein serumhalti- ges Auftaumedium, das bevorzugt 10 % fötales Kälberserum (FCS) enthält.
In einem weiteren Verfahrensschritt (j) werden so vor allem nicht anhaftende Zellen oder abgelöste, nicht vitale von der mit Zellen beleg- ten Matrix abgewaschen, sodass eine von nicht anhaftenden Zellen freie Matrix erhalten wird. Dazu wird zunächst der durch die Zugabe von Medium 1 in Schritt (i) erhaltene Überstand über der mit Zellen belegten Matrix möglichst vollständig abgesaugt. Der Überstand enthält im Wesentlichen aufgetaute, nicht vitale und nicht adhärierte Zellen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird danach auf die abgesaugte, mit Zellen belegte Matrix ein weiteres Medium, das heißt Medium 2, vorzugsweise tropfenweise, gegeben. Medium 2 hat vorzugsweise eine Temperatur von etwa 37°C. Bei der Zugabe von Medium 2 wird vorzugsweise das in Schritt (i) dargestell- te zweischrittige Vorgehen gewählt; zunächst wird die erste Hälfte des Mediums in jeweils alle Zellkulturgefäße verteilt und anschließend die zweite Hälfte entsprechend verteilt. Die zugegebenen Mengen an Medium 2 entsprechen den Mengen an Medium 1 in Schritt (i). Medium 2 hat vorzugsweise eine vom Auftaumedium (Me- dium 1) abweichende Zusammensetzung. Medium 2 ist vorzugsweise serumhaltig und enthält bevorzugt 10 % FCS.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die mit Medium 2 überschichteten, mit Zellen belegten Matrices danach für etwa 30 Minuten im Kulturschrank unter Standardbedingungen inku- biert (Ruhephase, Inkubation).
Zum Entfernen nicht anhaftender und nicht vitaler Zellen wird danach der Überstand über der mit Zellen belegten Matrix aus dem Zellkulturgefäß, möglichst vollständig, abgesaugt. Dadurch wird eine im Wesentlichen von nicht anhaftenden und nicht vitalen Zellen befreite mit Zellen belegte Matrix erhalten.
In einem weiteren Schritt (k) wird die aufgetaute, abgewaschene, mit Zellen belegte Matrix mit einer zweiten Matrix, vorzugsweise einer Kollagenmatrix, besonders bevorzugt einem Kollagengel, überschichtet beziehungsweise das Gel aufgegossen. Bevorzugt härtet das vorzugsweise aufgegossene Gel innerhalb weniger Minuten bis 1 Stunde aus. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zusam- mensetzung der ersten, unteren Matrix und der nach dem Auftauen aufgebrachten zweiten, oberen Matrix im Wesentlichen gleich, vorzugsweise identisch. Vorzugsweise wird die zweite obere Matrix als Gel auf den auf der unteren Matrix anhaftenden Monolayer aufgetauter Leberzellen aufgegossen. Erfindungsgemäß wird so eine Sand- wichkultur erhalten, worin isolierte Leberzellen zwischen zwei Matri- ces, insbesondere zwei Kollagengelen, eingebettet sind.
In einem abschließenden Schritt (I) werden die zwischen den Matri- ces eingebetteten Zellen rekultiviert und, je nach Anwendungsgebiet und -zweck, sofort oder nach einer zweckmäßig gewählten Kultivie- rungsdauer bestimmungsgemäß, das heißt bevorzugt in in vitro- Tests verwendet.
Die erfindungsgemäß präparierten und kryokonservierten, aufgetauten und rekultivierten isolierten Leberzellen weisen eine besonders hohe Vitalitätsrate auf. Sie zeigen besonders lange nach dem Auf- tauen ihre metabolische Kompetenz. Vorteilhafterweise lassen sich durch das erfindungsgemäße Vorgehen vor allem auch aus menschlichen Organen isolierte, weniger robuste Hepatocyten kryokonser- vieren und erfolgreich auftauen, sodass sie nachfolgend über eine große Zeitspanne in entsprechenden in vitro-Jes\s verwendet werden können. Überraschenderweise wird eine Zellkultur erhalten, worin die Zellen im Wesentlichen als konfluenter Monolayer rekultiviert werden können und worin der Anteil an nicht vitalen beziehungsweise nicht anhaftenden Zellen sehr gering ist.
Die Erfindung betrifft demgemäß auch ein Verfahren zur Herstellung einer Sandwichkultur kryokonservierter isolierter Leberzellen, wobei zumindest die Schritte (a) bis (I) der erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt werden und eine Sandwichkultur von zwischen einer oberen und einer unteren Matrix eingebetteten Zellen erhalten wird.
Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist schließlich auch ein Verfahren zur Herstellung einer Sandwichkultur isolierter Leberzellen, wobei zunächst Lebergewebe eines tierischen oder menschli- chen Organismus bereitgestellt wird und anschließend die Leberzellen aus dem Gewebe isoliert werden und zumindest die erfindungsgemäßen Verfahrensschritte (a) bis (I) durchgeführt werden. Der Fachmann wird, je nach Anwendungsgebiet und Zweckmäßigkeit, bekannte Verfahren zur Isolation von Leberzellen aus Geweben wählen.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Sandwichkultur, die mit dem vorgenannten Verfahren herstellbar ist und bevorzugt mit dem Verfahren hergestellt wird. Eine erfindungsgemäße Sandwichkultur weist alle vorgenannten Vorteile auf und stellt eine gegenüber dem Stand der Technik verbesserte Kultur isolierter Leberzellen dar. Ausführungsbeispiele
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen und Figuren näher erläutert. Die Beispiele sind nicht beschränkend zu verstehen, vielmehr soll damit der der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Erfindungsgedanke näher erläutert und die Vorteile der Erfindung anhand konkreter Beispiele illustriert werden.
Die Figuren zeigen:
Figur 1 : Mikroskopische Aufnahmen kultivierter Hepatocyten
(Maßstab ca. 150fach); Figur 1A: frisch isolierte menschliche Hepatocyten; Figur 1 B: kryokonservierte menschliche Hepatocyten;
Figur 2: Zahl vitaler Hepatocyten in Abhängigkeit von der Kultivierungsdauer;
Figur 3: Bildung von 6ß -OHT und 16α -OHT nach Enzyminduk- tion mit Rifampicin.
Beispiel 1 : Präparation humaner Hepatocvten für die Kryokonservierung
1.1 Isolierung humaner Hepatocyten
Hepatocyten aus menschlichen Spendern wurden in an sich bekann- ter Weise aus chirurgisch ohnehin entfernten Gewebeteilen, die mit Einverständnis des Spenders entnommen wurden, isoliert. Dazu wurden die Gewebe perfundiert, wobei sich die Hepatocyten aus dem Gewebeverband lösten und aus der Perfusionslösung gewonnen werden konnten. Die Lebensfähigkeit der geernteten Hepatocy- ten wurde mittein Trypan Blau-Assay bestimmt. Für die weiteren Experimente wurden nur Zellpräparationen verwendet, die mehr als 70 % Trypan Blau-Ausschluss zeigten.
1.2 Bereitstellen einer Matrix
In den folgenden Experimenten wurden Zellkulturgefäße in Form von Multiwellplatten, 6-well-Platten (Typ 657 160, Firma Greiner Bio-One) verwendet. Die Platten wurden mit nativem Kollagengel, das vorzugsweise aus Rattenschwänzen isoliert wurde, beschichtet. Alternativ wurden mit Kollagen Typ 1 vorbeschichtete Multiwellplatten, 6- well-Platten (Typ 657 950 CELLCOAT, Firma Greiner Bio-One) verwendet. Die 6-well-Platten hatten eine Bodenfläche von 9,6 cm2 pro Well.
1.3 Aussäen der Zellen
Die isolierten Hepatocyten wurden in die Multiwellplatten ausgesät. Dazu wurde eine Suspension der isolierten Hepatocyten hergestellt, welche von 2,5 bis 3 Mio. vitale Hepatocyten pro 2 ml Suspension enthielt. Pro Well der 6-well-Platte wurden 2 ml dieser Zellsuspension einpipettiert. Die Zelldichte betrug somit von 260 bis 320 vitale Hepatocyten pro 1mm2 Fläche des Zellkulturgefäßes.
Nach dem Aussäen wurden die Platten für etwa 1 Stunde stehen gelassen. Dazu wurden die Platten in einen Kulturschrank verbracht, worin Standardbedingungen (37°C, 5 % CO2, 95 % relative Luftfeuchtigkeit) herrschten. Die Ruhephase erlaubte, dass die Zellen aus der Suspension am Kollagengel anhafteten. Die erfolgreiche Anhaftung konnte durch mikroskopische Kontrolle beurteilt werden. Nach der Anheftungs-/Ruhephase wurde der Überstand der Zellsuspension, der im Wesentlichen nicht anhaftende Zellen aufwies, abgesaugt.
1.3 Einfrieren der mit Zellen belegten Matrix
Nach dem Absaugen des Überstandes wurde etwa 1 ml 37°C warmes Medium 1 pro Well zugegeben. Danach ruhten die Zellen für etwa eine weitere Stunde erneut im Brutschrank unter Standardbedingungen. Danach wurde der Überstand, der im Wesentlichen nicht anhaftende Zellen enthielt, gründlich abgesaugt.
Medium 1 ist von einem Standardzellkulturmedium für Hepatocyten abgeleitet und enthält 10 % fötales Kälberserum (FCS).
Zum Einfrieren wurden 0,5 ml Einfriermedium pro Well zugegeben. Die Zugabe des Einfriermediums erfolgte zügig. Nach Zugabe des Einfriermediums wurden die Platten sofort in die auf O0C vorgekühlte Einfriermaschine gestellt und das Einfrierprogramm gestaltet.
Das Einfriermedium basiert im Wesentlichen auf Medium 1 und en- hält 10 % fötales Kälberserum (FCS) und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO).
Das Einfrierprogramm sah eine Kompensation des Phasenüber- gangs vor und erreichte eine Zieltemperatur von -1000C.
Die eingefrorenen Zellkulturplatten wurden anschließend bei -1510C in einer Gefriertruhe beziehungsweise in der Gasphase im Stickstofftank gelagert. Beispiel 2: Auftauen kryokonservierter Hepatocvten
Die gemäß Beispiel 1 eingefrorenen und bei -1510C gelagerten He- patocytenkulturen wurden für die weitere Verwendung in in vitro- Tests nach einer Lagerdauer von bis zu 4 Wochen aufgetaut und rekultiviert.
Zum Auftauen der kryokonservierten Hepatocytenkulturen wurden die 6-well-Platten zunächst unmittelbar nach Entnahme aus dem Gefrierschrank beziehungsweise Stickstofftank für 5 Minuten in einen Kulturschrank verbracht, der mit Standardbedingungen betrie- ben wurde (siehe Beispiel 1). Anschließend wurde pro Well 1 ml des auf 37°C vorgewärmten Mediums 1 (siehe Beispiel 1) langsam und tropfenweise in jedes Well zugegeben. Dieser Vorgang wurde für maximal drei gleichzeitig aufzutauende 6-well-Platten, das heißt für maximal 18 Wells, wiederholt.
Anschließend wurde der Vorgang wiederholt, wobei erneut pro Well jeweils 1 ml Medium 1 langsam zugefügt wurde. Danach wurde der Überstand mit einer Pasteurpipette abgesaugt. Der Überstand enthielt im Wesentlichen aufgetaute nicht vitale und nicht adhärierte Zellen.
Zum weiteren Abwaschen wurde in gleicher Weise jeweils zweimal 1 ml 37°C warmes Medium 2 zugefügt. Dabei wurde Medium 2 wie vorstehend für Medium 1 beschrieben in zwei Durchgängen ä 1 ml in jedes Well zugegeben. Danach wurden die Platten für etwa 30 Minuten im Kulturschrank unter Standardbedingungen inkubiert. Nach der Inkubation wurde der komplette Überstand, der weitere, nicht vitale und nicht adhärierte Zellen enthielt, mit einer Pasteurpipette abgesaugt. Der so erhaltene Monolayer aus adhärierten Hepatocyten wurde mit einer weiteren Schicht aus Kollagengel überschichtet, um eine Sandwichkonfiguration zu erhalten. Das Kollagengel härtete nach dem Aufgießen nach etwa 30 Minuten aus. Es hatte eine Zusam- mensetzung, die im Wesentlichen der Zusammensetzung des unteren Kollagengels, das in den Kulturgefäßen vorgelegt war, entsprach.
Medium 2 ist ein Standardmedium für die Langzeitkultivierung von Hepatocyten und enthält 10 % fötales Kälberserum (FCS).
Die weitere Rekultivierung der erhaltenen Sandwichkultur erfolgte im Medium 2, welches etwa alle 24 Stunden durch frisches Medium ersetzt wurde.
Beispiel 3: Bestimmung der Zahl der lebensfähigen Zellen
Die Zahl der lebensfähigen (vitalen) Zellen wurde in Kulturen frisch isolierter Hepatocyten sowie in Kulturen erfindungsgemäß kryokon- servierter Hepatocyten durch Auszählen der morphologisch intakten Zellen bestimmt. Dabei wurden Fotografien von Vergleichsflächen einer Größe von 0,259 mm2 ausgezählt. Aus der Zahl der in der Vergleichsfläche aufgefundenen intakten Zellen wurde auf die Zahl in- takter Zellen im gesamten Zellkulturgefäß geschlossen (für die verwendeten 6-well-Platten mit einer Fläche von 9,6 cm2 pro Well ergab sich ein Korrekturfaktor von 3700).
Vor dem Einfrieren und zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Auftauen nach Kryokonservierung wurde die Morphologie der rekul- tivierten Hepatocyten fotografisch dokumentiert und mit Kulturen frisch isolierter und kultivierter Hepatocyten verglichen. Ergebnisse:
Figur 1 zeigt die Morphologie frisch isolierter und auf einer Kollagengelschicht ausgesäter menschlicher Hepatocyten (Figur 1A) sowie die Morphologie kryokonservierter, aufgetauter und für sieben Tage rekultivierter isolierter menschlicher Hepatocyten (Figur 1 B). Die rekultivierten kryokonservierten Zellen lassen sich morphologisch kaum von frisch isolierten Zellen unterscheiden.
Der Anteil an lebenden Zellen in der Kultur war gegenüber dem Anteil lebender Zellen in Kulturen frisch isolierter Hepatocyten nur ge- ring vermindert. Figur 2 zeigt die Zahl lebender (vitaler) humaner
Hepatocyten in Abhängigkeit von der Rekultivierungsdauer nach Auftauen der Hepatocyten. Die Vergleichskurve zeigt die Zahl lebender humaner Hepatocyten bei Kultivierung frischer isolierter Zellen über denselben Zeitraum. Initial wurden für die Kryokonservierung 3 Mio. Zellen, für die Frischpräparation 1 ,5 Mio. Zellen ausgesät.
Es zeigt sich, dass die aufgetauten rekultivierten humanen Hepatocyten konfluent wachsen und dass sich die Zahl lebender anhaftender Zellen nicht wesentlich von der Zahl lebender Zellen in vergleichbaren Frischkulturen unterscheidet. Bemerkenswert ist dabei, dass auch nach längerer Kultivierungsdauer die Zahl lebender Zellen in den kryokonservierten aufgetauten Präparaten nahezu konstant bleibt.
Beispiel 4: Enzvmaktivität krvokonservierter Hepatocvten
Ein guter Marker für die metabolische beziehungsweise enzymati- sehe Kompetenz von Leberzellen ist die Induzierfähigkeit der enzy- matischen Hydroxylierung von Testosteron. In intakten Leberzellen besteht ein Grundumsatz „basal level" dieser Reaktion, dabei wird Hydroxytestosteron (OHT) gebildet. Die Bildungsrate lässt sich bei intakten Zellen durch Enzyminduktion steigern. Der Nachweis der Bildung von OHT in kultivierten Hepatocyten lässt daher Schlüsse auf die enzymatische Kompetenz und physiologische Funktion der kultivierten Hepatocyten zu.
Analyse und Quantifizierung der regio- beziehungsweise stereoselektiven Testosteronhydroxylierung wurde in an sich bekannter Wei- se, beispielsweise publiziert in Friedrich et al., 2003 (J. Chromatogr. B. 784:49-61), durchgeführt.
Für diese Untersuchung wurden erfindungsgemäß kryokonservierte menschliche Hepatocyten aufgetaut und für zwei Tage rekultiviert und anschließend für weitere 24 Stunden in Rifampicin inkubiert. Rifampicin induziert die Testosteronhydroxylierung an den Positionen 6ß , 16α und 2ß . Die Testosteronhydroxylierung an Position 6α wird durch Rifampicin nicht stimuliert. Die Messung von 6α hydroxi- liertem Testosteron diente daher der Vergleichsmessung der für die Enzyminduktion durch Rifampicin.
Als Kontrolle wurden frisch isolierte Kulturen ebenfalls für 24 Stunden in Rifampicin inkubiert, nachdem sie für zwei Tage kultiviert wurden. Die Kultivierungsbedingungen wurden analog den erfindungsgemäßen Verfahren gewählt.
Neben der Enzyminduzierbarkeit wurde der Testosterongrundumsatz in den kryokonservierten und rekultivierten Zellen sowie in den frisch präparierten und kultivierten Zellen bestimmt. Ergebnisse:
Erfindungsgemäß kryokonservierte, rekultivierte Hepatocyten und frisch präparierte kultivierte Hepatocyten zeigten vergleichbare En- zyminduzierbarkeit. Die Mittelwerte für die Induktion der Testoste- ronhydroxylierung ist in der nachfolgenden Tabelle dargestellt:
Wie erwartet, konnte Rifampicin weder in den kryokonservierten und rekultivierten Hepatocyten noch in den frisch kultivierten Hepatocy- ten die Bildung von 6α -Hydroxytestosteron (6α -OHT) induzieren.
Figur 3 zeigt die absolute Konzentration an gebildetem Hydroxytestosteron (beispielhaft gezeigt für 6ß -OHT und 16α -OHT) vor und nach Induktion der Testosteronhydroxylierung mit Rifampicin. Im linken Bildteil sind die Ergebnisse für die frisch kultivierten Hepatocy- ten, im rechten Bildteil die Ergebnisse für die erfindungsgemäß kryokonservierten und rekultivierten Hepatocyten aufgezeigt. Figur 3A zeigt die Bildung von 6ß -OHT, Figur 3B zeigt die Bildung von 16α - OHT. Die Box-and-Whisker-Blots zeigen die Quartilen an. Zeigt das Signifikanzniveau p<0,05 (t-Test) an. Aus Erfahrungen mit in Suspension kryokonservierten Leberzellen ist bekannt, dass Kryokonservierung den Grundumsatz bei der Testosteronhydroxylierung gegenüber frisch präparierten Heaptocy- ten stark vermindert. Wie erwartet nahm auch bei den im Monolayer kryokonservierten Leberzellen die Grundaktivität der rekultivierten Hepatozyten im Vergleich zur Frischkultur ab. Sie war jedoch 24 und 72 Stunden nach Auftauen noch gut detektierbar.
Besonders zeigt sich, dass die kryokonservierten Hepatozyten zu einem Zeitpunkt 72 Stunden nach Auftauen und nach vorangegan- gener 24stündiger Inkubation mit Rifampicin eine deutliche Induzier- barkeit der Testosteronhydroxylierung aufwiesen.
Die über mindestens drei Tage erhaltene Grundaktivität zusammen mit der unverminderten Induzierbarkeit sind wesentliche Hinweise dafür, dass die erfindungsgemäß kryokonservierten menschlichen Hepatozyten erfolgreich für eine Vielzahl von in vitro-Tests eingesetzt werden können.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Präparation von Leberzellen für die Kryokonservierung, enthaltend die Schritte:
(a) Bereitstellen einer Matrix,
(b) Bereitstellen isolierter Leberzellen,
(c) Aussäen der Leberzellen auf der Matrix in einer Dichte von 2 bis 4 x103 mm'2,
(d) Ruhen lassen der mit Zellen belegten Matrix für 10 bis 180 min, so dass Zellen an der Matrix anhaften können,
(e) Abwaschen nicht anhaftender Zellen von der mit Zellen belegten Matrix,
(f) Ruhen lassen der mit Zellen belegten Matrix bis maximal 180 min, und
(g) Einfrieren der mit Zellen belegten Matrix in einem Einfriermedium.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Matrix eine Kollagenmatrix ist.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt (d) das Ruhen für 30 bis 90 min erfolgt.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt (e) mit Kulturmedium überschichtet wird und anschließend der flüssige Überstand über der mit Zellen belegten Matrix abgesaugt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt (f) das Ruhen für 30 bis 180 min erfolgt.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt (g) Einfriermedium in einer Menge von 0,5 μl mm"2 zugegeben wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Einfriermedium 10% fötales Kälberserum (FCS) und 10% DMSO enthält
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt (g) das Einfrieren erfolgt durch Überschichten der mit Zellen belegten Matrix mit Einfriermedium und kontrolliertes Abkühlen bis - 800C oder weniger mit Kühlraten von 0,5 bis 200C min'1, gegebenenfalls mit Kompensation des Phasenübergangs.
9. Verfahren zur Kryokonservierung von isolierten Leberzellen, enthaltend die Schritte:
(a) bis (g) des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
(h) Lagern der gefrorenen, mit Zellen belegten Matrix,
(i) Auftauen der gefrorenen, mit Zellen belegten Matrix,
(j) Abwaschen nicht anhaftender Zellen von der mit Zellen belegten Matrix, (k) Überschichten der aufgetauten, mit Zellen belegten Matrix mit einer zweiten Matrix, und
(I) Rekultivieren der zwischen den Matrices eingebetteten Zellen.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei in Schritt (h) die
Lagerung bei -1500C erfolgt.
1 1. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei in Schritt (i) die mit Zellen belegte Matrix mit warmem Kulturmedium überschichtet wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11 , wobei in
Schritt (j) die mit Zellen belegte Matrix mit Kulturmedium überschichtet wird und anschließend der flüssige Überstand über der mit Zellen belegten Matrix abgesaugt wird.
13. Verfahren zur Herstellung einer Sandwichkultur kryokonservierter isolierter Leberzellen, enthaltend die Schritte (a) bis (I) des Verfahrens nach einem der Ansprüche 9 bis 12.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei Schritt (a) die Schritte enthält:
(a1) Bereitstellen von Lebergewebe aus einem tierischen oder menschlichen Organismus und
(a2) Isolieren von Leberzellen aus dem Gewebe.
15. Sandwichkultur kryokonservierter Leberzellen, herstellbar nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14.
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