BRPI0618988B1

BRPI0618988B1 - Criopreservação de hepatócitos

Info

Publication number: BRPI0618988B1
Application number: BRPI0618988-1A
Authority: BR
Inventors: Arseniev Lubomir; Alexandrova Krassimira; Barthold Marc; Kafert-Kasting Sabine; Laube Britta
Original assignee: Promethera Biosciences Sa
Priority date: 2005-11-25
Filing date: 2006-11-03
Publication date: 2018-03-20
Also published as: DE102005057106A1; EP1956896B1; ES2369414T3; JP2009517007A; WO2007059855A1; SI1956896T1; AU2006317162B2; DK1956896T3; PL1956896T3; CY1112746T1; CN101312648B; EP1956896A1; JP4927089B2; ATE519364T1; HK1118422A1; CA2632247C; NZ568555A; RU2432395C2; US20080280357A1; CN101312648A

Abstract

criopreservação de hepatócitos. a presente invenção refere-se a um processo para a preparação de células hepáticas para a criopreservação, a um processo para a criopreservação de células hepáticas isoladas e a um processo para a preparação de uma cultura de células hepáticas isoladas criopreservadas.

Description

(54) Título: CRIOPRESERVAÇÃO DE HEPATÓCITOS (51) Int.CI.: A01N 1/02; C12N 5/071 (52) CPC: A01N 1/0284,C12N 5/0602 (30) Prioridade Unionista: 25/11/2005 DE 10 2005 057 106.9 (73) Titular(es): PROMETHERA BIOSCIENCES SA (72) Inventor(es): LUBOMIR ARSENIEV; KRASSIMIRA ALEXANDROVA; MARC BARTHOLD; SABINE KAFERT-KASTING; BRITTA LAUBE

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para:

CRIOPRESERVAÇÃO DE HEPATÓCITOS.

Relatório Descritivo

A presente invenção refere-se à área técnica da 5 criopreservação, mais detalhadamente, a processos para a preparação de células hepáticas para a criopreservação, a processos para a criopreservação de células hepáticas isoladas e a processos para a preparação de uma cultura em sanduíche de células hepáticas isoladas criopreservadas.

O estado da técnica

Células hepáticas isoladas do conjunto de tecido, especialmente os hepatócitos, são usadas principalmente na forma de culturas de células primárias para testar a ação fisiológica de candidatos a medicamentos. Sobretudo hepatócitos primários recentemente preparados de humanos representam o padrão de ouro para determinar candidatos a substâncias ativas em séries de testes in vitro ou para realizar exames para o metabolismo das substâncias ativas ou para a indução de enzimas. A desvantagem é que hepatócitos humanos recentemente isolados nem sempre e nem regularmente estão disponíveis. Portanto, há a demanda de processos com os quais os hepatócitos isolados podem ser armazenados durante certo tempo. A função fisiológica das células, que é especificamente sua competência metabólica

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2/27 ou enzimática, precisa ser mantida o mais completamente possível.

Conforme é conhecido, os hepatócitos são armazenados sob a forma criopreservada. Geralmente, os hepatócitos são criopreservados em suspensão. A suspensão contém, além dos hepatócitos, ainda um meio de congelamento destinado a impedir uma danificação das células através do congelamento e descongelamento. Para o armazenamento, a suspensão na maioria das vezes é congelada em temperaturas abaixo de

80°C negativos. Para ser usada depois do armazenamento, a suspensão de células congelada é descongelada e as células são semeadas em placas de cultura ou em recipientes de cultura. Para a recultivação das células descongeladas, os recipientes de cultura, geralmente, são revestidos com material de matriz, na qual as células podem aderir. Uma aderência perfeita é essencial para a recultivação e os exames seguintes. Na maioria das vezes, entretanto, apenas uma pequena parte das células originalmente congeladas pode ser mantida em estado vital ou ser recultivada. A desvantagem desse procedimento consiste principalmente no fato de que não se pode prever, se ou em que percentagem as células descongeladas da suspensão aderem à placa para cultura. A percentagem dãs células aderentes por lote depende de cada lote individual. Regularmente, as células

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3/27 criopreservadas descongeladas somente aderem adequadamente à placa para cultura em um pequeno número de lotes.

Outro método conhecido para a criopreservação consiste no fato de que células recentemente isoladas são esfregadas em recipientes de cultura, a fim de congelar em seguida as células esfregadas junto com os recipientes de cultura. Também nesse caso, os recipientes de cultura são revestidos antes colocando uma matriz na qual as células podem aderir. Conforme é conhecido, géis de colágeno são preferencialmente utilizados. Em um processo conhecido, os hepatócitos são inoculados em placas de cultura revestidas com colágeno tipo I e, durante cerca de quatro horas, aderem à matriz de colágeno. A cultura de monocamada resultante (cultura celular de uma única camada) é então cultivada durante cerca de 20 horas. Em seguida, as células que não aderiram são retiradas por meio de lavagem. Depois de mais seis horas, a cultura é coberta com uma camada do meio de congelamento, esfriada até 70°C negativos e armazenada (Watts e Grant, 1998; Human & Experimental

Toxicology 15: 30-37). Para o uso seguinte, as culturas de monocamada são descongeladas e recultivadas. Porém, as culturas descongeladas apresentam uma grande percentagem de células não aderentes e não vitais e destroços de células. Embora grandes partes da matriz estejam cobertas de

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4/27 células, um conjunto da celulas confluente s coeso nao se forma.

Em outro método conhecido, os hepatócitos são congelados em configuração de sanduíche, isto é, em disposição de gel dupla. Para tal, uma suspensão de hepatócitos primeiro é inoculada sobre placas de cultura de células revestidas com gel de colágeno. Depois de 24 horas de cultivo das células, uma segunda camada de gel de colágeno é vertida sobre as células inoculadas. Em seguida, a cultura de sanduíche assim obtida é congelada em um meio de congelamento até 70°C negativos e armazenada (Koebe et.

al., 1990; Cryobiology 27: 576-584).

Devido à imobilização das células hepáticas em uma matriz ou entre duas matrizes antes do congelamento, as células são mecanicamente estabilizadas e assim, a taxa de sobrevivência é aumentada. Em virtude do fato de que as células podem aderir em um estágio altamente vital, recentemente isoladas, a taxa de aderência é marcadamente aumentada em comparação com a aderência de células 20 congeladas criopreservadas em suspensão e descongeladas.

Apesar disso, também nesse caso aparecem depois do descongelamento grandes percentagens de células não aderentes ou não vitais. O estado ideal, uma cultura confluente de hepatócitos vitais não ê alcançada. Além

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5/27 disso, fica evidente que as células congeladas em suspensão, geralmente perdem sua competência metabólica dentro de poucas horas depois do descongelamento. Elas então não são apropriadas para um grande número de testes in vitro.

Além disso, células isoladas de órgãos humanos freqüentemente são menos robustas do que células retiradas de modelos animais. Isto se deve, sobretudo, ao fato de que células humanas de órgãos de doação geralmente podem ser obtidas sob condições menos favoráveis do que as células de animais que na maioria das vezes são criados e eutanasiados especialmente para este propósito (por exemplo, ratos, camundongos ou suínos). Portanto, células humanas exigem condições de cultivo muito mais poupadoras. Até a presente data não é conhecido nenhum processo de criopreservação com o qual hepatócitos humanos podem ser criopreservados com sucesso, desta forma a fim de estarem aptos a, subsequentemente, serem utilizados em estudos in vitro durante um período mais longo de tempo.

Dessa forma há a demanda por processos aperfeiçoados para a criopreservação de células hepáticas que permitam uma criopreservação poupadora, isto é, principalmente um descongelamento poupador com uma alta taxa de sobrevivência. Um processo aprimorado de criopreservação

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6/27 precisa ser apropriado principalmente para a criopreservação bem sucedida de hepatócitos humanos isolados. Nisso, precisa ser garantido que as células descongeladas possam ser recultivadas em uma grande percentagem na matriz de cultura, se possível como uma monocamada confluente (única camada coesa). Além disso, o processo precisa ser apropriado para poder produzir culturas de sanduíche melhoradas de células hepáticas isoladas que contêm uma grande percentagem de células vitais. Também precisa ser garantido que as células recultivadas, descongeladas depois de uma criopreservação, mantenham durante o maior período possível sua competência metabólica ou enzimática, de modo que elas possam ser usadas para um grande número de testes in vitro.

Objetivo.

O problema técnico subjacente à presente invenção consiste no fornecimento de processos aprimorados para a criopreservação de células hepáticas isoladas, especialmente de células hepáticas humanas, de modo que células hepáticas criopreservadas possam ser recultivadas como cultura de sanduíche melhorada.

O problema técnico é solucionado com a ajuda de um processo de acordo com a reivindicação 1, especialmente um

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7/27 processo para a preparação de células hepáticas para a criopreservação que contém as seguintes etapas:

Na etapa (a) é preparada uma matriz, especialmente uma matriz de colágeno, de preferência, um gel de colágeno. De preferência, a matriz é introduzida em um recipiente para a cultura de células, por exemplo, uma placa de 6 poços. Preferencialmente, o recipiente de cultura é revestido com material de matriz.

Na etapa (b) são preparadas células hepáticas 10 isoladas, preferencialmente isoladas de tecido.

Na etapa (c) seguinte, as células hepáticas isoladas são inoculadas na matriz. A densidade das células hepáticas na matriz é de 2 a 4 x 10³ células por mm² de superfície de matriz. A densidade de células preferida é de 2,6 a 3,2 x

10³ mm'². Isto significa, em um recipiente de cultura com uma área de base de 9,6 cm², por exemplo, a superfície de fundo de um poço em uma placa de 6 poços, o número de células inoculadas é de 2,5 a 3 x 10⁶ por poço.

Na próxima, de preferência imediatamente subseqüente, etapa (d) , as células repousam sobre a matriz (fase de repouso, fase de aderência). Para tal, a matriz coberta de células repousa por um período de 10 a 180 minutos, de preferência, de 30 a 90 minutos, de preferência particular, por aproximadamente uma hora, de modo que as células

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8/27 inoculadas na matriz possam aderir à matriz. O repouso ocorre preferencialmente no armário de cultura (estufa), especialmente em condições padrao a uma temperatura de 37 °C, uma percentagem de 5% de C0₂ e a 95% de umidade relativa do ar. A aderência bem sucedida pode ser verificada adicionalmente por meio de um controle microscópico.

Após o repouso na etapa (d), as células não aderidas à matriz, na etapa (e), são cuidadosamente removidas por meio de lavagem da matriz coberta por células (etapa de lavagem). A lavagem ocorre preferencialmente revestindo a matriz coberta por células com uma camada de meio de cultura, e em seguida, o excesso líquido de meio de cultura e células não aderentes é aspirado. De preferência, esta etapa é repetida pelo menos uma vez.

Em outra etapa (f) a matriz lavada, revestida com células, repousa novamente (segunda fase de repouso). O repouso dura no máximo 180 minutos, especialmente 30 a 180 minutos, especialmente preferido é um repouso de aproximadamente uma hora. O repouso ocorre preferencialmente no armário de cultura, especialmente sob condições padrão, a uma temperatura de 37°C, uma percentagem de 5 % de CO₂ e com uma umidade relativa do ar de 95 %.

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Depois da segunda fase de repouso, na etapa (g) , a matriz revestida com células é congelada em um meio de congelamento (etapa de congelamento). Antes do congelamento e depois da segunda fase de repouso, de preferência, a matriz revestida com células é novamente lavada, sobretudo para retirar células residuais, não aderentes (etapa de lavagem). De preferência, o procedimento corresponde à etapa (e).

O processo de acordo com a presente invenção também 10 propõe inocular células hepáticas isoladas em uma matriz com certa densidade, e depois de uma determinada seqüência de fases de repouso e lavagem das células não aderentes, congelá-las no meio de congelamento. Assim, uma matriz coberta de células é congelada, especialmente uma matriz de 15 colágeno, na qual as células se aderem e estão presentes especialmente em uma monocátnada. Graças às medidas de acordo com a presente invenção, surpreendentemente é obtida uma cultura de células intactas que pode ser particularmente bem congelada, ou seja, criopreservada.

Isto enfatiza que as culturas preparadas e criopreservadas de acordo com a presente invenção são particularmente viáveis (vitais) após o descongelamento e apresentam um grande número de células aderentes à matriz. As células

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10/27 descongeladas podem vantajosamente ser recultivadas em uma monocamada confluente.

O processo de acordo com a presente invenção surpreendentemente é especialmente poupador para as células e, portanto, também é apropriado para células menos robustas, tais como hepatócitos isolados de órgãos humanos. Sobre tudo, ficou evidente que as células preparadas e criopreservadas de acordo com a presente invenção, caso sejam cobertas com uma segunda matriz após o descongelamento, mantêm durante vários dias, especialmente durante mais do que três dias, sua atividade metabólica ou sua competência metabólica plena.

Em uma modalidade preferida do processo de acordo com a presente invenção, o congelamento na etapa (g) é feito com meio de congelamento que é adicionado com uma quantidade de aproximadamente 0,5 ml por mm² de área da base da placa de cultivo. Para tal, de preferência, a matriz revestida com células é coberta com uma camada do meio de congelamento. De preferência, o meio de congelamento contém 10% de soro fetal bovino (SFB) e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).

Em uma modalidade particularmente preferida, no resfriamento controlado da etapa (g), isto é congelamento, ocorre após a adição de um meio de congelamento,

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11/27 preferencialmente a temperaturas de 80°C negativos ou menos. De preferência são usadas taxas de esfriamento de 0,5 a -20°C por minuto para o resfriamento. Em uma variação preferida, a passagem de fases é compensada; isto e feito, de preferência, por meio de um aquecimento curto com taxas de aquecimento de preferencialmente +1 a +3°C por minuto.

Após a preparação e o congelamento de acordo com a presente invenção das células hepáticas isoladas em uma matriz, a matriz coberta de células é armazenada em estado congelado no escopo da criopreservação. De preferência, a temperatura durante o armazenamento é de 80°C negativos ou menos, de preferência especial, 150°C negativos ou menos.

Convenientemente, o armazenamento ocorre em um freezer ou na fase de vapor de ar líquido, ou nitrogênio líquido. É lógico que também todos os outros processos para o armazenamento de células em temperaturas baixas são apropriados. Uma pessoa versada na técnica selecionará os processos de armazenamento de acordo com seu objetivo de uso e de acordo com sua utilidade.

A presente invenção refere-se também a um processo para a criopreservação de células hepáticas isoladas que contém as etapas de (a) a (g) acima caracterizadas, sendo que em outra etapa (h) a matriz congelada revestida com células é armazenada durante um período não determinado de

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12/27 tempo que é selecionado em função da área e do objetivo de uso.

Em outra etapa (i) subseqüente, dependendo da área e do objetivo de aplicação, preferencialmente imediatamente antes do uso ou em outro momento apropriado, a matriz congelada revestida com células é descongelada. Isto preferencialmente é feito colocando-se sobre a matriz congelada revestida com células uma camada de um meio de cultura quente. De preferência, a matriz congelada revestida com células encontra-se em uma placa de cultivo, por exemplo, uma placa de 6 poços. De preferência, a placa é retirada do congelador ou do tanque de nitrogênio e, de preferência, imediatamente depois é incubada durante aproximadamente cinco minutos no armário de cultura sob condições padrão (37°C, 5 % de CO₂, 95 % de umidade relativa do ar) . Preferencialmente, um meio de descongelamento (meio 1) é então pipetado, de preferência, lentamente e em gotas, sobre a matriz revestida com células. A título de orientação: em uma superfície de cerca de 9,6 cm² (placa de 6 poços) é colocado cerca de um ml de Meio 1. A temperatura do meio preferencialmente é de aproximadamente 37 °C. O processo é repetido em cada placa de cultivo de células. A título de orientação: no máximo são usadas três placas de 6 poços, de modo que, em no

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13/27 máximo 18 poços, a. matriz revestida com células β coberta com uma camada de meio quente. Subseqüentemente, cada placa de cultura ou poço é revestida da mesma forma, com uma camada da mesma quantidade de Meio 1 (1 ml por 9,6 cm²) , de preferência, lentamente e em gotas. Em uma modalidade preferida, o Meio 1 é um meio de descongelamento contendo soro, o qual preferencialmente contém 10% de soro fetal bovino.

Em outra etapa do processo (j), especialmente células 10 não aderentes ou soltas, não vitais são retiradas da matriz revestida com células por meio de lavagem, de modo que se obtém uma matriz livre de células não aderentes. Para tal, o sobrenadante acima da matriz revestida com células obtido através da adição de Meio 1 na etapa (i) é, em primeiro lugar, aspirado o mais completamente possível. O sobrenadante contém essencialmente células descongeladas, não vitais e não aderentes. Em uma modalidade especialmente preferida, depois disto, outro meio, isto é, o Meio 2, é adicionado, de preferência gota a gota, à matriz revestida 20 com células. 0 Meio 2 tem preferencialmente uma temperatura de aproximadamente 37°C. No caso da adição do Meio 2, é preferencialmente escolhido o procedimento de duas etapas apresentado na etapa (i); inicialmente a primeira metade do

Meio é respectivamente distribuído em todas as placas de

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14/27 cultivo de células, e em seguida, a segunda metade e coxrespondentemente distribuída. As quantidades adicionadas do Meio 2 correspondem às quantidades do Meio 1 na etapa (i) . O Meio 2 possui preferencialmente uma composição que diverge da do meio de descongelamento (Meio 1) . O Meio 2 preferencialmente contém soro e contém de preferência 10 % de soro fetal bovino.

Em outra modalidade especialmente preferida, as matrizes revestidas com células e cobertas com uma camada de Meio 2 são então incubadas durante aproximadamente 30 minutos no armário de cultura sob condições padrão (fase de repouso, incubação).

Para a retirada de células não aderentes e não vitais, o sobrenadante acima da matriz revestida com células é então aspirado o mais completamente possível da placa de cultivo de células. Dessa forma obtém-se uma matriz revestida com células essencialmente livre de células não aderentes e não vitais.

Em uma próxima etapa (k) a matriz descongelada, lavada, revestida com células é coberta com uma camada de uma segunda matriz, de preferência, uma matriz de colágeno, de preferência especial, um gel de colágeno, ou o gel é vertido sobre a mesma. Preferencialmente, o gel adicionado, preferencialmente vertido, endurece dentro de poucos

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15/27 minutos até uma hora. Em uma modalidade preferida, a composição da primeira matriz, matriz inferior, e da segunda matriz, matriz superior, aplicada após o descongelamento, essencialmente é igual, de preferência, idêntica. De preferência, a segunda matriz, a superior, é vertida sobre a monocamada de células hepáticas descongeladas aderentes na matriz inferior como um gel. De acordo com a presente invenção, dessa forma é obtida uma cultura de sanduíche, onde células hepáticas isoladas estão embutidas entre duas matrizes, em particular dois géis de colágeno.

Na etapa final (1) , as células embutidas entre as matrizes são recultivadas e, dependendo da área de aplicação e do objetivo de uso, usadas conforme planejado, que é preferencialmente em testes in vitro, imediatamente ou após um período de cultivo adequadamente escolhido.

As células hepáticas isoladas, descongeladas e recultivadas, preparadas e criopreservadas de acordo com a presente invenção, possuem uma taxa de vitalidade especialmente alta. Elas mostram sua capacidade metabólica por um período especialmente longo de tempo após o descongelamento. Vantajosamente, o procedimento de acordo com a presente invenção pode também criopreservar e descongelar com sucesso hepatócitos isolados de órgãos

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16/27 humanos, menos robustos, de modo que possam, em seguida, ser usados durante um período maior de tempo nos testes in vitro apropriados. Surpreendentemente, é obtida uma cultura de células onde as células podem ser essencialmente recultivadas como uma monocamada confluente e onde a percentagem de células não vitais e/ou não aderentes é muito pequena.

A presente invenção refere-se também a um processo para a produção de uma cultura de sanduíche de células hepáticas isoladas criopreservadas, sendo que pelo menos as etapas de (a) a (1) , dos processos de acordo com a presente invenção, são executados, e é obtida uma cultura de sanduíche de células embutidas entre uma matriz superior e uma matriz inferior.

Finalmente, a presente invenção também se refere a um processo para a produção de uma cultura de sanduíche de células hepáticas isoladas, onde o tecido hepático de um organismo animal ou humano é primeiramente preparado e, em seguida, as células hepáticas São isoladas do tecido, e pelo menos as etapas do processo, de acordo com a presente invenção, de (a) a (1) são executadas. A pessoa versada na técnica selecionará, em dependência da área de aplicação e da propriedade, processos conhecidos para o isolamento das células hepáticas de tecidos.

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Por fim, a presente invenção também se refere a uma cultura de sanduíche que pode ser obtida através do processo acima mencionado e que de preferência é feita através do processo. Uma cultura de sanduíche de acordo com a presente invenção apresenta todas as vantagens acima mencionadas e significa uma cultura aprimorada de células hepáticas isoladas em comparação com o estado da técnica.

Exemplos de execução.

Nos exemplos e nas figuras a seguir a presente invenção 10 é descrita com mais detalhes. Os exemplos não devem ser entendidos como sendo restritivos, pelo contrário, com eles a idéia inventiva, base da presente invenção, será explicada mais detalhadamente, e as vantagens da presente invenção serão ilustradas mais concretamente.

As figuras mostram:

A Figura 1 mostra micrografias de hepatócitos cultivados (escala cerca de 150 vezes).

A Figura IA mostra hepatócitos humanos recentemente isolados.

A Figura 1B mostra hepatócitos humanos criopreservados.

A Figura 2 mostra o número de hepatócitos vitais em função do tempo de cultivo.

A Figura 3 mostra a formação de 6β-ΟΗΤ e de 16α-OHT depois da indução de enzimas com rifampicina.

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Exemplo 1: A preparação de hepatócitos humanos para_a criopreservação.

1.1 O isolamento de hepatócitos humanos.

Hepatócitos de doadores humanos foram isolados de modo 5 em si conhecido de partes de tecido já retiradas cirurgicamente que foram retiradas com o consentimento do doador. Para tal, os tecidos foram perfurados, sendo que os hepatócitos se soltaram do complexo tecidual e foram obtidos da solução de perfusão. A viabilidade dos hepatócitos coletados foi determinada por meio de Trypan Blue-Assay.

Para os demais experimentos somente foram usadas preparações de células que mostraram mais do que 70% de exclusão de

Trypan Blue.

1.2 Preparação de uma matriz.

Nos experimentos seguintes foram usados recipientes de cultura de células na forma de placas de vários poços, placa de 6 poços (tipo 657 160, da firma Greiner Bio-One) . As placas foram revestidas com gel de colágeno nativo que de preferência foi isolado de rabos de ratos. Como alternativa, foram usadas placas de vários poços, placas de 6 poços (tipo 657 950 CELLCOAT, Firma Greiner Bio-One). As placas de 6 poços tinham uma superfície de fundo de 9,6 cm² por poço.

1.3 Inoculação das células.

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Os hepatócitos isolados foram inoculados nas placas de vários poços. Para tal, foi preparada uma suspensão dos hepatócitos isolados a qual continha de 2,5 a 3 milhões de hepatócitos vitais por 2 ml de suspensão. Para cada poço da placa de 6 poços foram pipetados 2 ml dessa suspensão de células. A densidade das células foi, portanto, de 2600 a 3200 hepatócitos vitais por 1 mm² de superfície do recipiente de cultivo de células.

Após a inoculação, as placas repousaram por 10 aproximadamente uma hora. Para tal, as placas foram colocadas em um armário para culturas, onde prevaleciam condições padrão (37°C, 5 % de CO₂, 95% de umidade relativa do ar) . O repouso permitiu que as células da suspensão aderissem ao gel de colágeno. A aderência bem sucedida pôde ser avaliada por meio de controle microscópico. Depois da fase de aderência/repouso, o sobrenadante da suspensão de células, que continha essencialmente células não aderentes, foi aspirado.

1.4 Congelamento da matriz revestida de células.

Depois da aspiração do sobrenadante, foi acrescido aproximadamente 1 ml de Meio 1 por poço a uma temperatura de 37°C. Depois, as células repousaram durante aproximadamente mais uma hora novamente na estufa sob condições padrão.

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Então, o sobrenadante, contendo essencialmente células nao aderentes, foi aspirado.

O Meio 1 é derivado de um meio de cultivo de células padrão para hepatócitos e contém 10% de soro fetal bovino (SFB).

Para o congelamento, foram acrescidos 0,5 ml de meio de congelamento para cada poço. A adição do meio de congelamento ocorreu continuamente. Depois da adição do meio de congelamento, as placas foram imediatamente colocadas na maquina de congelamento pré-resfriada para 0°C e o programa de congelamento foi configurado.

O meio de congelamento baseia-se essencialmente no Meio e contém 10% de soro fetal bovino (SFB) e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).

O programa de congelamento forneceu uma compensação da passagem de fases e alcançou uma temperatura alvo de 100°C negativos.

As placas de cultura de células congeladas em seguida foram armazenadas a uma temperatura de 151°C negativos em um freezer ou na fase gasosa no tanque de nitrogênio.

Exemplo 2:Descongelamento de hepatócitos criopreservados.

As culturas de hepatócitos, congeladas de acordo com o exemplo 1 e armazenadas a 151°C negativos, foram descongeladas depois de um tempo de armazenamento de até

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21/27 quatro semanas e recultivadas para o uso posterior em ensaios in vitro.

Para o descongelamento das culturas de hepatócitos criopreservadas, as placas de 6 poços, imediatamente depois de retiradas do congelador ou do tanque de nitrogênio, foram primeiramente transferidas durante cinco minutos para uma estufa operada com condições padrão (veja o exemplo 1). Em seguida, para cada poço, 1 ml do Meio 1 pré-aquecido para 37°C (veja o Exemplo 1) foi acrescido lentamente e gotejado em cada poço. Este processo foi repetido para no máximo três placas de 6 poços descongelando simultaneamente, isto é, no máximo para 18 poços.

Em seguida, o processo foi repetido, novamente 1 ml de

Meio 1 foi acrescido a cada poço, respectivamente. Então o sobrenadante foi aspirado com uma pipeta Pasteur. O sobrenadante continha essencialmente células descongeladas, não vitais e não aderentes.

Para lavagens adicionais, do mesmo modo foram acrescidas respectivamente duas vezes 1 ml de Meio 2 a 37°C.

0 Nisso, o Meio 2, conforme descrito acima para o Meio 1, foi acrescido em duas passagens de 1 ml para cada poço. As placas são então incubadas durante aproximadamente 30 minutos no armário de cultivo sob condições padrão. Depois

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Ha incubação, todo o sobrenadante contendo células não vitais e não aderentes, foi aspirado com uma pipeta Pasteur.

A monocamada assim obtida de hepatócitos aderentes foi coberta por outra camada ds gel de colágeno, a fim de se obter uma configuração de sanduíche. O gel de colágeno endureceu depois de vertido dentro de cerca de 30 minutos. Ele tinha uma composição que correspondia essencialmente à composição do gel de colágeno inferior o qual foi introduzido nos recipientes de cultivo.

O Meio 2 é um meio padrão para o cultivo a longo prazo de hepatócitos e contém 10% de soro fetal bovino (SFB).

O recultivo da cultura de sanduíche obtida aconteceu no

Meio 2 que foi substituído por um novo Meio 2 a cada 24 horas.

Exemplo 3: Determinação do número das células vitais.

O número das células viáveis (vitais) foi determinado em culturas de hepatócitos recentemente isolados e em culturas de hepatócitos criopreservados de acordo com a presente invenção, pela contagem de células morfologicamente 20 intactas. Neste ponto, fotografias de superfícies de comparação com um tamanho de 0,259 mm² foram contadas. A partir do número das células intactas encontradas em uma superfície de comparação, o número de células intactas em todo o recipiente de cultivo foi calculado (para as placas

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23/27 de 6 poços usadas com uma superfície de 9,6 cm² por poço, resultou em um fator de correção de 3700).

Antes do congelamento e em diversos momentos depois do descongelamento depois da criopreservação, a morfologia dos hepatócitos recultivados foi documentada por fotografias e comparada com culturas de hepatócitos recentemente isolados e cultivados.

Resultados:

A Figura 1 mostra a morfologia de hepatócitos humanos recentemente isolados e inoculados em uma camada de gel de colágeno (Figura IA) , e a morfologia de hepatócitos humanos isolados, criopreservados, descongelados e recultivados durante sete dias (Figura 1B) . As células criopreservadas recultivadas quase não podem ser distinguidas morfologicamente de células recentemente isoladas.

A percentagem de células vivas na cultura foi somente um pouco menor em comparação com a percentagem de células vivas em culturas de hepatócitos recentemente isolados. A Figura 2 mostra o número da hepatócitos humanos vivos (vitais) em função do período do recultivo depois do descongelamento dos hepatócitos. A curva de comparação mostra o número de hepatócitos humanos vivos no cultivo de células recentemente isoladas durante o mesmo período. Inicialmente, para a criopreservação, foram inoculadas três

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24/27 milhões de células, para a preparação fresca, 1,5 milhões de células.

Fica evidente que os hepatócitos humanos descongelados recultivados crescem de modo confluente e que o número de células vivas aderentes não se distingue significativamente do número de células vivas em culturas frescas comparáveis. É digno de menção que mesmo após um período de cultivo mais longo o número de células vivas nos preparados criopreservados descongelados permanece quase que constante.

Exemplo 4: A atividade enzimática de hepatócitos criopreservados.

Uma boa referência para a competência metabólica e/ou enzimática de células hepáticas é a capacidade de indução de hidroxilação enzimática de testosterona. Em células hepáticas intactas existe um nível basal dessa reação onde é formada hidroxitestosterona (OHT). A taxa de formação pode ser incrementada em células intactas por meio de indução enzimática. A detecção da formação de OHT em hepatócitos cultivados permite, portanto, tirar conclusões sobre a competência enzimática e a função fisiológica dos hepatócitos cultivados.

A análise e quantificação da hidroxilação de testosterona régio-seletiva ou estéreo-seletiva foram executadas de modo em si conhecido, por exemplo, conforme

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25/27 publicado em Friedrich et al. , 2003 (J. Chromatogr. B.

784:49 a 61).

Para esta verificação foram descongelados hepatócitos humanos criopreservados de acordo com a presente invenção e recultivados por dois dias e em seguida encubados para mais 24 horas em rifampicina. A rifampicina induz a hidroxilação de testosterona nas posições 6β, 16oí e 2β. A hidroxilação de testosterona na posição 6a não é estimulada pela rifampicina. Portanto, a medição de testosterona hidroxilada em 6a serviu para a comparação da medição da indução de enzimas através de rifampicina.

Como controle, foram, da mesma forma, incubadas em rifampicina culturas recentemente isoladas durante 24 horas após terem sido cultivadas durante dois dias. As condições de cultivo foram selecionadas em analogia ao processo de acordo com a presente invenção.

Além da capacidade de indução de enzimas, foi determinado o nível basal de testosterona nas células criopreservadas e recultivadas e nas células recentemente preparadas e cultivadas.

Resultados.

Hepatócitos criopreservados recultivados e hepatócitos recentemente preparados cultivados mostram uma capacidade de indução de enzimas comparável. Os valores médios para a

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26/27 indução da hidróxilação de testosterona são mostrados na tabela a seguir:

	Hepatócitos criopreservados recultivados (de acordo com a presente invenção)	Hepatócitos recentemente isolados (exemplo de comparação)
Hidroxilação 6β	2,8 vezes	2,3 vezes
Hidroxilação 16a	2,4 vezes	1,6 vezes
Hidroxilação 2β	2,3 vezes	2,4 vezes

Como era de se esperar, a rifampicina não pode induzir a formação de hidroxitestosterona 6α (OHT 6a), nem nos hepatócitos criopreservados e recultivados nem nos hepatócitos recentemente cultivados.

A Figura 3 mostra a concentração absoluta de hidroxitestosterona formada (mostrado a título de exemplo para OHT 6β e OHT 16a) antes e depois da indução de hidroxilação de testosterona com rifampicina. Na parte esquerda da figura são mostrados os resultados para os hepatócitos recentemente cultivados, na parte direita são mostrados os resultados para os hepatócitos criopreservados e recultivados de acordo com a presente invenção. A Figura

3A mostra a formação de OHT 6β, a Figura 3B mostra a formação de OHT 16a. Os Box-and-Whisker-Plots mostram os

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27/27 quartis. Mostra o nível de significância p < 0,05 (teste

t) .

Das experiências com células hepáticas criopreservadas em suspensão sabe se que a criopreservação diminui em alto grau não nível basal durante a hidroxilação de testosterona em comparação com hepatócitos recentemente preparados. Como era de se esperar, também nas células hepáticas criopreservadas na monocamada, o nível basal dos hepatócitos recultivados diminui em comparação com a cultura fresca. Porém, ainda era bem detectável depois de e 72 horas depois do descongelamento.

Em particular fica evidente que os hepatócitos criopreservados mostraram uma clara capacidade de indução de hidroxilação de testosterona 72 horas depois do descongelamento e depois de uma pré-incubação de 24 horas com rifampicina.

A atividade basal mantida durante pelo menos três dias junto com a capacidade não diminuída de indução são indicações importantes para o fato de que os hepatócitos humanos criopreservados de acordo com a presente invenção podem ser usados com êxito para um grande número de testes in vitro.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para a preparação de células hepáticas para a criopreservação caracterizado pelo fato de compreender as etapas:

(a) Preparar uma matriz;

(b) Preparar células hepáticas isoladas;

(c) Inocular as células hepáticas na matriz com uma densidade de 2 a 4 x 10³ mm;

(d) Deixar repousar a matriz revestida de células durante 10 a 180 minutos, a fim de as células aderirem â matriz;

(e) Retirar por meio de lavagem da matriz revestida de células as células que não aderiram;

(f) Deixar repousar â matriz revestida de células até no máximo 180 minutos; e (9) Congelar a matriz revestida de células em um meio de congelamento.
2. Processo, de acordo com a reivindicação l, caracterizado pelo fato de que a matriz é uma matriz de colágeno.
3. Processo, de acordo com uma as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que na etapa (d) o repouso é de 30 a 90 minutos.
4. Processo, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que na etapa (e) é feita uma cobertura com uma camada do meio de cultivo e em seguida o sobrenadante líquido acima da matriz revestida de células é aspirado.
5. Processo, de acordo com uma a reivindicações 1 a 4,

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2/3 caracterizado pelo fato de que na etapa (f) o repouso dura de 30 a 180 minutos.
6. Processo, de acordo com uma as reinvindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que na etapa (g) é acrescida

uma quantidade de 0/5 pl mm² de meio de congelamento. 7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o meio de congelamento contém soro fetal bovino (FCS) e DMSO. 8. Processo, de acordo as reivindicações 1 a 7,

caracterizado pelo fato de que na etapa (g) o congelamento é realizado cobrindo a matriz revestida de células com meio de congelamento e controlando o resfriamento até 80°C negativos ou menos, a taxas de resfriamento de 0,5 a 20°C min^-1, eventualmente com compensação da transição de fases.
9. Processo para o armazenamento e recultivo de células hepáticas isoladas caracterizado pelo fato de que compreender as etapas:

(a) a (g) ao processo conforme definido pelas reivindicações cie l a 8;

(h) Armazenamento da matriz revestida de células congelada;

(i) Descongelamento da matriz revestida de células congelada;

(j) Retirada por meio de lavagem das células não aderentes da matriz revestida de célula;

(k} Cobrir a matriz revertida de células descongelada com uma segunda matriz; e (l) Recultivar as células embutidas entre as matrizes.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 9,

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3/3 caracterizado pelo fato de que na etapa (h) o armazenamento é feito a 150° C negativos.
11. Processo, de acordo com â reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que na etapa (i) a matriz revestida de células é coberta com um meio de cultivo quente.
12. Processo, de acordo com as reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que na etapa (j) a matriz revestida de células é coberta com um meio de cultivo, e em seguida o sobrenadante líquido acima da matriz revestida de células é aspirado.
13. Processo para a preparação de uma cultura de sanduíche de células hepáticas isoladas caracterizado pelo fato de que compreender as etapas de (a) a (1) do processo conforme definido com uma das reivindicações 9 a 12.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que na etapa (a) compreende a etapa de:

(Al) isolar células hepáticas do tecido hepático de um organismo animal ou humano, em que a referida etapa Al ocorre fora do corpo de um organismo animal ou humano.

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