DE102011121317A1

DE102011121317A1 - Gerüstfreie Leberzellaggregate zur Verwendung bei der Transplantation

Info

Publication number: DE102011121317A1
Application number: DE102011121317A
Authority: DE
Inventors: Jörg-Matthias Pollok; Jeanette Bierwolf
Original assignee: Universitatsklinikum Hamburg Eppendorf
Current assignee: SWISSCI AG, CH
Priority date: 2011-12-16
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2013-06-20
Also published as: US20140363473A1; WO2013087843A1; CN104302762A; EP2791321A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Sphäroiden aus humanen, primären Hepatozyten. Das Verfahren umfasst die Kultivierung von isolierten, humanen, primären Hepatozyten auf einem Polysaccharid-Gerüst unter Bedingungen, die die Bildung von Hepatozyten-Sphäroiden ermöglichen, und anschließendes Auflösen des Polysaccharid-Gerüsts, um die Hepatozyten-Sphäroide freizusetzen. Die Sphäroide, die durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnen werden, eignen sich insbesondere dafür, in ein Individuum transplantiert zu werden, das unter einer Leberkrankheit leidet.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Sphäroiden aus humanen, primären Hepatozyten. Das Verfahren umfasst die Kultivierung von isolierten, humanen, primären Hepatozyten auf einem Polysaccharid-Gerüst unter Bedingungen, die die Bildung von Hepatozyten-Sphäroiden erlauben, und anschließendes Auflösen des Polysaccharid-Gerüsts, um die Hepatozyten-Sphäroide freizusetzen. Die durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnenen Sphäroide sind insbesondere dazu geeignet, in ein Individuum transplantiert zu werden, das unter einer Leberkrankheit leidet.
Hintergrund
Orthotope Lebertransplantation ist die am häufigsten angewandte heilende Behandlung für auf der Leber beruhende metabolische Störungen oder hepatisches Versagen. Auf Grund eines Mangels an Organen besteht ein großer Bedarf, alternative Behandlungen zu entwickeln, die normale Leberfunktionen unterstützen oder wiederherstellen. Interessanterweise sind bereits kleine Mengen (5%–10%) transplantierten Lebergewebes in der Lage, ausreichende Funktion zur Korrektur eines metabolischen Leberschadens bereit zu stellen, und es werden sogar nur 1%–5% an Lebermasse für die Regeneration in Patienten mit Leberversagen benötigt (Puppi et al., (2009) Methods Mol. Biol 481, 1; Pietrosi et al. (2009), World J Gastroenterol 15, 2074).
Im Stand der Technik wurden Einzelzellsuspensionen für Leberzelltransplantationen in Betracht gezogen und dieser Ansatz wurde in mehr als 80 Fallbeschreibungen aus verschiedenen Zentren verwendet (Fitzpatrick et al. (2009), J Intern Med 266, 339). Bedauerlicherweise wurde in den meisten Leberkrankheiten aufgrund von niedrigen Zellanwachsraten ein begrenzter Erfolg erzielt. Daten aus einem Rattenmodell zeigen, dass durch die meisten Transplantationsansätze letztlich nur 0,5% der transplantierten Hepatozyten in der Empfängerleber anwachsen und es ist relativ wenig über das Langzeitentwicklungen des Anwachsens von transplantierten Hepatozyten im Menschen bekannt (Allen et al. (2001) J Lab Clin Med 138, 298). Im Falle eines Kleinkindes mit Refsum's-Syndrom ergaben 8 intraportale Infusionen mit einzelnen Hepatozyten nicht mehr als 0,25% Anwachsen (Sokal et al. (2003), Transplantation 76, 735). Probleme, die mit geringen Anwachs- und Repopulationsraten in den Empfängerlebern einhergehen, stellen die Haupthürde für eine erfolgreiche Behandlung von Leberkrankheiten durch Hepatozyten-Transplantation in Menschen dar.
Die Transplantation von dreidimensionalen (3D) Gerüsten, auf denen Hepatozyten kultiviert wurden, ist eine weitere Alternative, die im Stand der Technik in Betracht gezogen wurde, um die geringen Zellanwachsraten, die in Transplantationsansätzen mit Einzelzellsuspensionen beobachtet wurden, zu überkommen. Diese Vorgehensweise beruht auf der Annahme, dass durch eine erhöhte Stabilität und Widerstandsfähigkeit gegen Stress, dreidimensionale, hepatische Mikrogewebe mit größerer Wahrscheinlichkeit in erkranktem Lebergewebe anwachsen. Es wurden z. B. Poly-L-Milchsäure (poly-L-lactic acid, PPLA) Polymere als Gerüste für hepatisches ”Tissue Engineering” verwendet (Török et al. (2011) Liver Transpl. 17, 104–114). Diese Gerüste werden in den Empfänger transplantiert und werden langsam innerhalb einer bestimmten Zeit nach der Transplantation abgebaut. Es ist jedoch bekannt, dass auf Gerüsten beruhende Transplantation oft mit einer unzureichenden Blutversorgung der transplantierten Hepatozyten und mit einem ungewünschten Verlust an Galle verbunden ist.
Demgemäß besteht ein Bedarf an neuen therapeutischen Ansätzen zur heilenden Behandlung von Leberstörungen oder hepatischen Versagen. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Kultivierung von isolierten, humanen Hepatozyten, vorzugsweise humanen, primären Hepatozyten, in dreidimensionale Lebermikrogewebe zur Verfügung. Diese Lebermikrogewebe, die üblicherweise als Hepatozyten-Sphäroide bezeichnet werden, sind besonders für das Anwachsen in erkranktem und/oder funktionsgestörtem Lebergewebe eines Empfängers geeignet. Das Verfahren der Erfindung stellt isolierte Hepatozyten-Sphäroide zur Verfügung, die frei von jeglichen künstlichen Gerüsten oder Trägerstoffen, wie z. B. PLLA-Polymeren, sind. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Hepatozyten auf einem Polysaccharid-Gerüst kultiviert, welches nach der Sphäroidbildung aufgelöst wird. Nach Auflösung des Polysaccharid-Gerüsts können intakte Hepatozyten-Sphäroide für nachgeschaltete in vivo oder in vitro Verwendungen geerntet werden, z. B. für Toxizitätsstudien oder Transplantation in einen Empfänger. So umgeht das Verfahren der Erfindung die Nachteile, die im Zusammenhang mit Einzelzell-Infusionen und Matriximplantation berichtet wurden. Die isolierten Sphäroide sind mit hohen Zellanwachsraten und schneller Integration in das Empfänger-Lebergewebe verbunden, wodurch sie eine erhebliche Hilfe in der Berichtigung von metabolischen Leberschäden und fulminantem Leberschaden darstellen.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von dreidimensionalen Aggregaten humaner Hepatozyten, vorzugsweise humaner, primärer Hepatozyten, zur Verfügung, die insbesondere für die Verwendung in der Transplantationsmedizin geeignet sind.
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung daher ein Verfahren zur Herstellung eines Sphäroids aus kultivierten, humanen, primären Hepatozyten zur Verfügung, das Schritte umfasst, bei denen man:

(a) humane, primäre Hepatozyten auf einem Polysaccharid-Gerüst unter Bedingungen kultiviert, die die Bildung eines Hepatozyten-Sphäroids erlauben;
(b) das Polysaccharid-Gerüst auflöst, um das Hepatozyten-Sphäroid freizusetzen;
(c) das Hepatozyten-Sphäroid von dem Kulturmedium trennt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf die Herstellung von Lebersphäroiden gerichtet, die metabolisch vitale, humane Hepatozyten umfassen oder aus diesen bestehen und die besonders nützlich für die langfristige Unterstützung von Leberfunktionen nach der Transplantation sind. Wie vorliegend verwendet bezieht sich ”Hepatozyten-Sphäroid” auf dreidimensionale, sphäroidale Zellaggregate aus humanen Hepatozyten, die durch interzelluläre Verbindungen, wie z. B. ”Tight Junctions”, miteinander verbunden sind. Die Gegenwart von intrazellulären Verbindungen kann durch vielfältige, im Stand der Technik bekannte Verfahren nachgewiesen werden, z. B. durch Transmissions-Elektronen-Mikroskopie. Alternativ kann das Auftreten von ”Tight Junctions” durch einen Nachweis des Zonula-Okkludens-Proteins 1 (Zo-1) überprüft werden. Die durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnenen Aggregate haben eine Größe durch die sie geeignet sind, in einer Transplantation mittels portaler Infusion verwendet zu werden. Vorzugsweise ist der Durchmesser eines Sphäroids mindestens 50 μm, mindestens 100 μm, mindestens 150 μm, mindestens 200 μm oder mehr.
Die Sphäroide werden auf der Oberfläche und/oder innerhalb der Poren der Polysaccharid-Gerüste kultiviert. Das Verfahren zur Herstellung der transplantierbaren, erfindungsgemäßen Sphäroide umfasst als einen ersten Schritt die Aussaat von humanen, primären Hepatozyten auf ein Polysaccharid-Gerüst. Wie vorliegend verwendet sind ”primäre” Hepatozyten Hepatozyten, die aus der Leber eines Menschen durch im Stand der Technik bekannte Verfahren isoliert wurden. Z. B. können die Hepatozyten aus einem explantierten, gesunden Spenderorgan gewonnen werden. Alternativ können die primären Hepatozyten auch aus einem explantierten Organ eines Individuums gewonnen werden, das unter einer Leberkrankheit leidet; im letzteren Falle ist es jedoch bevorzugt, dass die Hepatozyten, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden sollen, von funktionalem Lebergewebe genommen werden, d. h. aus einem Teil der Leber, der nicht von der Krankheit betroffen ist.
In noch einer weiteren Ausführungsform werden die humanen, primären Hepatozyten durch eine Leberbiopsie gewonnen. Z. B. kann eine Leberbiopsie während einer Unterleibsoperation durchgeführt werden, indem Gewebeproben von einer oder mehreren Stellen der Leber entfernt werden. Alternativ kann eine Biopsie transvenös durch die Blutgefäße oder perkutanös durch Verwendung einer hohlen Nadel, die durch die Haut in die Leber eingeführt wird, durchgeführt werden. CT-Scan- oder Ultraschallbilder können verwendet werden, um die Nadel während der Biopsie zu steuern. Alternativ kann eine laparoskopische Leberbiopsie durchgeführt werden, um die humanen, primären Hepatozyten zu ernten, die für das erfindungsgemäße Verfahren benötigt werden. In einer bevorzugten, erfindungsgemäßen Ausführungsform wurden die humanen Hepatozyten, die zur Aussaat auf die Polysaccharide verwendet werden, aus einem lebendigen, humanen Spender durch Leberbiopsie gewonnen.
Die Gewebeproben, die aus der Biopsie gewonnen wurden, werden normalerweise unmittelbar nach der Entfernung aus dem Organ mit einem geeigneten Puffer perfundiert. Geeignete Puffer, die zur Gewebsperfusion verwendet werden können, umfassen Custodiol^® HTK-Lösung, University of Wisconsin-Lösung (UW-Lösung) oder andere Lösungen, die im Stand der Technik im Zusammenhang mit Organperfusion beschrieben wurden. Anschließend werden die Gewebeproben normalerweise bearbeitet, um eine Einzelleberzell-Lösung zu erhalten. Dies kann z. B. durch ein Kollagenaseverdau-Verfahren erreicht werden, z. B. das Zwei-Schritt-Verfahren, welches von Dandri et al. ((2001), Hepatology 33, 981) beschrieben wird. Die aus den Gewebeproben freigesetzten Hepatozyten können filtriert und mit einem geeigneten Puffer, wie z. B. dem ”Hepatocyte Wash Medium” (Invitrogen), gewaschen werden und entweder sofort für die Aussaat auf die Polysaccharid-Gerüste genutzt oder in flüssigem Stickstoff schockgefroren werden und bis zur weiteren Verwendung bei –80°C gelagert werden.
Ein besonderer Vorteil des Verfahrens der vorliegenden Erfindung liegt in der Möglichkeit, humane Hepatozyten direkt aus dem Individuum zu gewinnen, das eine Hepatozyten-Zelltransplantation benötigt. In solch einer Ausführungsform werden die Sphäroide, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, aus primären Hepatozyten gewonnen, die zum Patienten autolog sind, was den besonderen Vorteil hat, dass eine Immunsuppression nach dem Transfer der Hepatozyten-Aggregate in den Empfänger vermieden werden kann, was regelmäßig nach Transplantation von allogenen Zellen nötig ist. Die Transplantation von autologen Sphäroiden ist insbesondere in Fällen hilfreich, in denen ein Patient mit einer Leberkrankheit belastet ist, die zur Zerstörung von bestimmten Gebieten der Leber geführt hat, während andere Regionen des Organs immer noch von funktionellem Lebergewebe besiedelt sind. In diesen Fällen können Hepatozyten aus funktionalen Regionen des Organs durch eine Leberbiopsie gewonnen werden und diese Zellen können als Ausgangsmaterial für das vorliegend beschriebene Verfahren verwendet werden. Leberdefekte, in denen die Leber noch funktionales und vitales, hepatisches Gewebe enthält, umfassen, z. B. chronische, nicht-infektiöse Leberkrankheiten, wie Leberzirrhose und metabolische Leberkrankheiten.
Alternativ können die erfindungsgemäßen Hepatozyten-Sphäroide auch aus einem humanen Spender gewonnen werden, der nicht das Individuum ist, welches durch die Transplantation der Hepatozyten-Sphäroide behandelt werden soll. In einem solchen Ansatz werden die primären Hepatozyten, die als ein Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren dienen, aus einem Spender-Individuum gewonnen, das genetisch nicht identisch mit dem, die Sphäroide empfangenden, Empfänger-Individuum ist (allogene Transplantation). Eine chronische Immunsuppression ist normalerweise in Fällen notwendig, in denen die Sphäroide, die transplantiert werden sollen, zu dem Empfänger allogen sind, um eine Abstoßung der transplantierten Zeilen in dem Empfänger zu vermeiden. Immunsuppressive Wirkstoffe, die an das Individuum, das ein erfindungsgemäßes, allogenes Hepatozyten-Sphäroid empfängt, verabreicht werden können, beinhalten z. B. Corticosteroide, Anti-Metaboliten, wie z. B. Methotrexat, Azathioprin, Leflunomid, Cyclosporin, Tacrolimus, Sirolimus, Everolimus, Mycophenolat-Mofetil und Antikörper, wie z. B. Muromonab-CD3 und Rituximab.
Die primären Hepatozyten, die aus dem Spender gewonnen und wie oben beschrieben verarbeitet wurden, werden dann auf ein Polysaccharid-Gerüst ausgesät und zu Sphäroiden kultiviert. Dieser Schritt wird ex vivo, d. h. außerhalb des menschlichen Körpers, durchgeführt. Wie vorliegend verwendet ist ein Gerüst oder Trägerstoff eine dreidimensionale Polymermatrix, welche die Zellanheftung unterstützt und die Bildung von interzellulären Kontakten zwischen den Zellen, die auf die genannte Matrix oder den Trägerstoff ausgesät sind, ermöglicht. Die Begriffe ”Gerüst” und ”Trägerstoff” werden vorliegend austauschbar verwendet werden. Vorzugsweise ist das Gerüst oder der Trägerstoff ein poröses Material, das es den Zellen, die darauf ausgesät sind, erlaubt, auf der Oberfläche und/oder innerhalb der Poren zu wachsen. Die Anzahl der Zellen, die auf das Polysaccharid-Gerüst ausgesät sind, wird von verschiedenen Faktoren abhängen, wie z. B. dem spezifischen Material und der Größe des Gerüsts, auf das die Hepatozyten geimpft werden, den Bedingungen, die bei der nachfolgenden Kultivierung der Hepatozyten verwendet werden, und dem Alter der Zellen, die für die Aussaat auf die Gerüste verwendet werden. Werden frisch isolierte, primäre Hepatozyten für die Aussaat verwendet, so wird die Anzahl der Zellen, die für die Aussaat eines einzelnen Gerüsts mit einem Durchmesser von ungefähr 15–20 mm und einer Dicke von 1–2 mm verwendet wird, in der Größenordnung von etwa 1 × 10⁴, 5 × 10⁴, 1 × 10⁵, 5 × 10⁵, 1 × 10⁶, 5 × 10⁶, 1 × 10, 5 × 10⁷, 1 × 10⁸, 5 × 10⁹, oder mehr sein. Vorzugsweise wird die Anzahl von Zellen, die für die Aussaat eines Gerüsts dieser Größe verwendet wird, in der Größenordnung von 1 × 10⁶ bis 1 × 10⁸ sein, stärker bevorzugt 1 × 10⁶. Die Impfung wird z. B. durch Suspension einer zuvor bestimmten Anzahl isolierter Hepatozyten in einem geeigneten Volumen eines Puffers (z. B. 200–400 μl) und Anwendung der Lösung auf das Gerüst erreicht.
Das Polysaccharid-Gerüst zur Verwendung in der Herstellung von transplantierbaren Sphäroiden kann jegliches Polysaccharid-Material sein, das im Gebiet des ”Tissue Engineering” als eine Matrix, an die sich Zellen anheften können, beschrieben wurde. Vorzugsweise ist das Polysaccharid-Gerüst in seiner Natur hochporös, wodurch ein günstiges Mikromilieu für die Bildung der Sphäroide in den Zwischenräumen der Poren angeboten wird. Das erfindungsgemäß zu verwendende Gerüst ist aus einem Material zusammengesetzt, das unter milden Bedingungen aufgelöst werden kann, die die Lebensfähigkeit und die strukturelle Integrität der Sphäroide nicht nachteilig beeinflussen, die sich auf der Oberfläche und/oder innerhalb der Poren der Gerüste gebildet haben. Geeignete Materialien umfassen gebräuchliche Geliermittel, z. B. Alginat, Agar, Carrageen, verarbeitete Eucheuma-Algen, Johannisbrotkernmehl, Guarakernmehl, Traganth, Gummi arabicum, Xanthangummi, Tarakernmehl, Pektin und Zellulosen (z. B. Methylzellulose). Andere Polysaccharide, die unter milden Bedingungen aufgelöst werden können, können ebenfalls verwendet werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst oder besteht das Gerüst zur Kultivierung der erfindungsgemäßen Hepatozyten-Sphäroide aus Alginat. Wie vorliegend verwendet bezieht sich Alginat auf ein Salz oder Ester der Hetero-Polysaccharid-Alginsäure, wobei sich letztere aus sich wiederholenden Einheiten von β(1-4)D-Mannuronsäure und α(1-4)L-Guluronsäure zusammensetzt. Das Gerüst kann z. B. ein Natrium-, Kalium-, Kalzium- oder Ammoniumsalz der Alginsäure umfassen oder aus einem solchen bestehen. Alginat-Gerüste für ”Tissue Engineering” sind kommerziell erhältlich, z. B. das AlgiMatrix^TM 3D Culture System von Invitrogen (Carlsbad, USA).
Die isolierten Hepatozyten, die auf die Gerüste ausgesät wurden, werden nachfolgend unter Bedingungen kultiviert, die die Bildung von Hepatozyten-Sphäroiden erlauben. Es wird ausdrücklich ein Kulturmedium verwendet werden, das geeignet ist, um humane Hepatozyten zu kultivieren. Zellkulturmedien, die an die Anforderungen von humanen Hepatozyten angepasst sind, sind im Stand der Technik bekannt und umfassen z. B. Williams Medium E (Invitrogen, Carlsbad, USA), Hepatocyte Culture Medium (BD Bioscience, Heidelberg, Deutschland), Basal HepaRG Medium (3H Biomedical AB, Uppsala, Schweden), HBM Basal Medium (Lonza Cologne GmbH, Köln, Deutschland) oder Hepatocyte Basal Medium (United States Biological, Swampscott, USA). Die Medien können mit weiteren Verbindungen wie Wachstumsfaktoren, Puffern, Antibiotika und dergleichen ergänzt werden, um die Sphäroidbildung auf den speziellen Gerüsten zu optimieren.
Ein Kulturmedium, das sich als besonders nützlich erwiesen hat, ist z. B. Williams Medium E, das mit den folgenden Inhaltsstoffen ergänzt wurde: 200 mM endotoxinarmes L-Alanyl-L-Glutamin (Biochrom, Berlin, Deutschland), 1 M HEPES Puffer (Biochrom), 100 mM Natriumpyruvat (Invitrogen), 4 μg/mL Insulin (Invitrogen), 5 nM Dexamethason (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 10 ng/mL epidermaler Wachstumsfaktor (Invitrogen), 10 ng/mL rekombinantes, humanes Thrombopoietin (Cell Systems, St. Katharinen, Deutschland), 10 ng/mL rekombinanter, humaner Hepatozyten-Wachstumsfaktor (Bachem, King of Prussia, USA), 10% hitzeinaktiviertes, fötales Rinderserum (Invitrogen) und 1% Penicillin/Streptomycin (Invitrogen). Das Kulturmedium, das in den unten stehenden Beispielen verwendet wurde, ist in Bierwolf et al. ((2011), Biotechnol Bioeng.; 108(1):141–50) beschrieben.
Ein weiteres Kulturmedium, das zur Kultivierung der Hepatozyten auf den Gerüsten verwendet werden kann, ist serumfreies Williams E Medium (ohne L-Glutamin), das mit 2 mM N-Acetyl-1-Alanyl-1-Glutamin (Biochrom), einem 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazin-Ethansulfonsäure-Puffer (Biochrom), 4 μg/mL Insulin (Gibco BRL), 1 mM Natriumpyruvate (Gibco BRL), 5 nM Dexamethason (Sigma, St. Louis, USA), 10 ng/mL epidermaler Wachstumsfaktor (Gibco BRL) und 1% Penicillin/Streptomycin (Biochrom) ergänzt wurde.
Die Gerüste können unter statischen Bedingungen in einer befeuchteten Atmosphäre von etwa 5% CO₂ und 95% Luft in einem Inkubator inkubiert werden. Die Gerüste können bei einer Temperatur zwischen 30–40°C kultiviert werden, vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 33°C und 38°C, und stärker bevorzugt bei 37°C. Die Zellkultur wird für einen Zeitraum von 1–21, vorzugsweise 3–10, und stärker bevorzugt 5–7 Tage aufrecht erhalten.
Die eingesäten Gerüste können alternativ auch in einem Rezirkulations-Bioreaktor kultiviert werden. Um die Hepatozyten einem rezirkulierenden Mediumsfluss auszusetzen, wurden eingesäte Gerüste in einem ”Cellmax Quad Flow”-Modul senkrecht zu dem Strömungsvektor fixiert (siehe Török et al. (2011), Liver Transplantation 17:104–114). Z. B. kann ein pulsierender Kulturmediumsfluss von 10–40 mL/Minute, z. B. 24 mL/Minute, verwendet werden. Zweidrittel des Volumens des rezirkulierenden Kulturmediums sollte während des gesamten Kulturzeitraums jeden zweiten Tag ausgetauscht werden. Der Fachmann wird ohne Weiteres in der Lage sein, alternative Kulturbedingungen zu bestimmen, die zur Anzüchtung der Hepatozyten, die auf den Gerüsten eingesät wurden, zu dreidimensionalen Hepatozyten-Sphäroiden verwendet werden können.
Nachdem das Hepatozyten-Sphäroid auf dem Gerüst seine vorbestimmte Größe und Differenzierungsstadium erreicht hat, wird das Gerüst aufgelöst, um die Sphäroide in das Kulturmedium freizusetzen. Der Zeitpunkt, zu dem das Gerüst aufgelöst werden muss, wird abhängig von den spezifischen verwendeten Kulturbedingungen und der gewünschten Größe und Differenzierungsstadium des Sphäroids variieren. Das Differenzierungsstadium des Sphäroids kann z. B. durch Untersuchung der Sphäroide in regelmäßigen Intervallen durch Elektronenmikroskopie überwacht werden. Das genaue Verfahren, das zur Auflösung des Gerüsts verwendet wird, hängt von dem Gerüst ab, das zur Kultivierung der Hepatozyten verwendet wurde. In einer Ausführungsform der Erfindung werden Enzyme zu den Gerüsten hinzugefügt, welche das Gerüst abbauen, während die Sphäroide nicht beeinflusst werden. Es wurden zahlreiche Enzyme, die spezifisch Polysaccharide abbauen, beschrieben, wie z. B. Xantan (Hashimoto et al. (2003), J Biol Chem, 278(9):7663–73), Agar (Leon et al. (1992), Appl and Environ Microbiology 58 (12):4060–4063), Zellulose (Lynd et al. (2002), Microbiol Mol Biol Rev, 66(3):506–77), Pektin (Blanco et al. (1999), FEMS Microbiol Lett, 175(1):1–9), unter anderen.
Besteht das Polysaccharid-Gerüst aus Alginat, so ist es bevorzugt, es durch die Zugabe eines chelatierenden Agens, wie z. B. Zitrat oder EDTA, aufzulösen. Alginat benötigt divalente Kationen, wie z. B. Ca²⁺, um seine polymerisierte Struktur aufrecht zu erhalten. Entzug der Kationen durch chelatierende Agenzien, wie z. B. EDTA, führt zum Abbau des Alginats. Es kann, z. B., wenn das Algi-Matrix^TM 3D Kultursystem von Invitrogen verwendet wird, ein Natriumzitrat-haltiger oder ein Versen-haltiger, auflösender Puffer gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet werden. Die Gerüste werden für 5–30 Minuten in der Gegenwart einer geeigneten Menge des Zitrat- oder Versen-haltigen Puffers inkubiert, bis die Gerüste sich vollständig aufgelöst haben und die Sphäroide vollständig in das umgebende Medium freigesetzt wurden. Die durch den Auflösungsschritt gewonnenen Sphäroide sind frei von dem Alginat-Gerüst, das sie während des Kultivierungsschritts umgeben hat.
Im Allgemeinen sollte während der Auflösung darauf geachtet werden, die Hepatozytenaggregate, die auf der Oberfläche des Polysaccharid-Gerüsts angezüchtet wurden, nicht zu beschädigen. Es sollte sichergestellt werden, dass das Gerüstmaterial aufgelöst wird, ohne die Integrität oder metabolische Funktion des gewebeartigen Hepatozyten-Sphäroids zu beeinflussen. Z. B. darf, wenn das Gerüstmaterial durch die Zugabe von Citrat zu dem Kulturmedium aufgelöst wird, die Konzentration des Citrats nicht so hoch sein, dass die Hepatozyten, die dem Gerüstmaterial anheften, lysiert werden. Dem Fachmann stehen verschiedene, im Stand der Technik bekannte Verfahren zur Abschätzung der Lebensfähigkeit der Hepatozyten zur Verfügung. Wie in dem untenstehenden Beispiel 3 beschrieben, ist es z. B. möglich, die Freisetzung von Laktatdehydrogenase (LDH) von beschädigten Zellen zu bestimmen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen und um nach toxologischen Defekten zu suchen, die durch die Reagenzien verursacht wurden, die zur Auflösung der Trägerstoff-Gerüste verwendet wurden.
Die Sphäroide, die in der Lösung suspendiert wurden nachdem die Trägerstoffe aufgelöst wurden, werden dann durch Trennung von dem Kulturmedium geerntet. Die Sphäroide können z. B. durch Zentrifugation bei 200 × g für 3–5 Minuten geerntet werden. Alternativ können die Sphäroide auch durch Filtration durch ein Filtermaterial geerntet werden, das eine Porengröße aufweist, die Zellaggregate mit einem Durchmesser von mindestens 50, 100 oder 150 μm zurückhält. Die geernteten Sphäroide können optional einmal oder mehrere Male gewaschen werden, um unerwünschte Substanzen zu entfernen, die die gewünschten nachfolgenden Verwendung, z. B. Transplantation, beeinträchtigen könnten. Zum Beispiel können die Sphäroide mit ”Hepatocyte Wash Medium” (Invitrogen, Carlsbad, USA) gewaschen werden, um zelluläre Trümmer oder Substanzen, die zur Auflösung des Trägerstoffes verwendet wurden, wie z. B. Enzyme und dergleichen, zu entfernen. Die geernteten Sphäroide können unmittelbar zur Transplantation in den Empfänger oder für in vitro Studien verwendet werden oder sie können in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Sphäroid aus humanen, primären Hepatozyten, welches durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt werden kann. Vorzugsweise wird das isolierte Sphäroid aus humanen, primären Hepatozyten hergestellt, indem man

(a) humane, primäre Hepatozyten auf einem Alginat-Gerüst unter Bedingungen kultiviert, welche die Bildung eines Hepatozyten-Sphäroids erlauben;
(b) das Alginat-Gerüst auflöst, vorzugsweise durch Zugabe eines chelatierenden Agens, wie z. B. Zitrat oder EDTA, um das Hepatozyten-Sphäroid freizusetzen;
(c) das Hepatozyten-Sphäroid von dem Kulturmedium abtrennt, vorzugsweise durch Filtration oder Zentrifugation.

Das Sphäroid, das durch das obige Verfahren erhalten wird, ist vorzugsweise für die Verwendung in einem Verfahren zur Leberzelltransplantation wie an anderer Stelle beschrieben.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein isoliertes Hepatozyten-Sphäroid aus kultivierten, humanen, primären Hepatozyten, wobei das Sphäroid frei von jeglichem künstlichen Gerüstmaterial ist. Das bedeutet, dass das Sphäroid nicht an einem künstlichen Gerüstmaterial, das gemeinhin im Fachgebiet des ”Tissue Engineerings” verwendet wird, wie z. B. Alginat, PLLA und dergleichen, befestigt oder anderweitig mit einem solchen verbunden ist. Wie vorliegend verwendet bezieht sich künstliches Gerüst auf synthetische Matrixen, die nicht in natürlichem Lebergewebe vorkommen. Der Begriff sollte nicht so aufgefasst werden, dass er z. B. die natürlich vorkommende extrazelluläre Matrix beinhaltet.
Die erfindungsgemäßen Hepatozyten-Sphäroide zeigen eine gut erhaltene leberzellspezifische Funktionalität und Morphologie. Zum Beispiel sind die Hepatozyten innerhalb der Sphäroide in funktionaler Verbindung miteinander, wie z. B. durch Nachweis des Zonula Occludens Proteins 1 (Zo-1) gezeigt wurde. Zo-1 ist ein Marker für ”Tight Junctions”, der die Bildung von Gallencanaliculi zwischen benachbarten Hepatozyten in der Leber anzeigt. In einer bevorzugten Ausführungsform sind Gallencanaliculi zwischen benachbarten Hepatozyten in mindestens 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% oder mehr der Hepatozyten innerhalb des durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Sphäroids vorhanden.
Anders als Zellaggregate, die durch die Kultivierung von Zellen, die von etablierten Zelllinien abgeleitet sind, hergestellt werden, umfassen oder bestehen die erfindungsgemäßen Sphäroide aus hoch differenzierten Hepatozyten, die ein exzellentes metabolisches Profil zeigen, was zeigt, dass die Hepatozyten die entgiftende Funktion von natürlichem Lebergewebe unterstützen. Z. B. haben die Sphäroide die Fähigkeit zur Produktion von humanem Albumin und α1-Antithrypsin behalten. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beträgt die Produktion von humanem α1-Antithrypsin in den Hepatozyten des Sphäroids mindestens 50%, stärker bevorzugt 60%, 70%, 80%, 90% oder sogar bis zu 95% oder mehr der Herstellung, die in frisch isolierten, humanen, primären Hepatozyten bestimmt wurde, wenn diese unter den gleichen Bedingungen getestet wurden, z. B. in einem ELISA Assay, wie dem im untenstehenden Beispiel 5 beschriebenen, oder in einem nukleinsäurebasiertem Nachweis-Assay, z. B. quantitativer RT-PCR. In ähnlicher Weise beträgt die Produktion von humanem Albumin in den Hepatozyten des erfindungsgemäßen Sphäroids mindestens 50%, stärker bevorzugt mindestens 60%, 70%, 80%, 90% oder sogar bis zu 95% oder mehr der Herstellung, die in frisch isolierten, humanen, primären Hepatozyten bestimmt wird, die unter den gleichen Bedingungen getestet wurden. Ein Verfahren zur Bestimmung der Produktion von humanem Albumin in Hepatozyten ist z. B. in dem untenstehenden Beispiel 4 beschrieben. Es können jedoch auch andere Testassays verwendet werden, um die Albuminexpression zu messen, z. B. quantitative RT-PCR.
Die von der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellten isolierten Sphäroide sind insbesondere geeignet, um im Fachgebiet der Medizin, vorzugsweise der Transplantationsmedizin, verwendet zu werden. Hepatozyten-Implantationsansätze, die im Stand der Technik beschrieben wurden, sind üblicherweise mit niedrigen Zellanwachsraten und marginalen Effekten, die in den meisten Leberkrankheiten erreicht werden, verbunden. Eine Transplantation der durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellten Sphäroide resultiert in hochfunktionalem Gewebe, welches schnell in die Leber des Empfängers integriert wird. Daher verbessert eine Transplantation von zellulären Sphäroiden als Alternative zu Einzelzellen die Zellanwachs- und Repopulationsraten in Empfängerlebern.
Wie in den untenstehenden Beispielen gezeigt, wurden Hepatozyten aus den Lebern von drei Spendern, die unter metabolischen Leberkrankheiten litten, zur dreidimensionalen Zellkultivierung auf Alginat-Gerüsten verwendet. Die Bildung von Sphäroiden wurde nach drei Kulturtagen beobachtet und die Sphäroide näherten sich ihrem maximalen Durchmesser von beinahe 100 μm an Tag 7. Immunhistologische Studien wurden durchgeführt, um Zell-Zell-Wechselwirkungen und Reorganisation oder neue Gewebsregeneration innerhalb der Poren der Gerüste zu untersuchen. Diese Studien haben gezeigt, dass die Hepatozyten-Sphäroide, die auf Alginat-Gerüsten kultiviert wurden, eine Feinstruktur etabliert haben, die typisch für Lebergewebe ist, wie durch CK18 Immunfluoreszenzfärbung gezeigt wurde. Ferner zeigte der Nachweis von Aktinfilamenten, die durch Phalloidinmarkiert wurden, und die positive Färbung von Zo-1 die erneute Bildung von Gallencanaliculi und eine bipolare Konfiguration (siehe Beispiel 7). Die Erhaltung einer polarisierten Zell- und Membranarchitektur ist für die biliäre Sekretion und xenobiotische Eliminierung unerlässlich. Zusätzlich zeigt die positive Kernfärbung für den Hepatozyten-spezifischen Transkriptionsfaktor HNF-4 die Gegenwart von hochdifferenzierten Zellen innerhalb des neuen Lebergewebes an (siehe Beispiel 7). Ferner stellten Echtzeit-PCR-Studien Beweise zur Verfügung, dass die Sphäroide, die auf Alginat-Gerüsten kultiviert wurden, aus hochdifferenzierten Hepatozyten zusammengesetzt sind, obwohl ein Expressionsverlust im Vergleich zu dem nativen Gewebe beobachtet wurde. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Sphäroide, die erfindungsgemäß gewonnen wurden, in höchstem Maße für den Ersatz und/oder die Ergänzung von erkranktem Lebergewebe geeignet sind.
Die durch die Erfindung zur Verfügung gestellten Sphäroide haben einen Durchmesser von mindestens 50, 100 oder 150 μm. Die Größe der Sphäroide kann durch Änderung der Kultivierungszeit angepasst werden. Unter den in den untenstehenden Beispielen verwendeten Bedingungen wurden nach einer Kultivierungszeit von 7 Tagen Sphäroide mit einer Größe von ungefähr 100–150 μm gewonnen. Wenn bestimmte Transplantationen Hepatozyten-Aggregate fordern, die kleiner als 100 μm sind, ist es ohne Weiteres möglich, die Kultivierungszeit zu kürzen, z. B. auf 3–4 Tage. Vorzugsweise wird die Größe der Sphäroide, die in den Empfänger transplantiert werden, 150 μm nicht überschreiten, um das Risiko einer Pfortaderthrombose und Spenderzellembolisation in die Lungen zu minimieren.
Aufgrund ihrer Fähigkeit in Lebergewebe zu integrieren und Lebergewebefunktionen zur Verfügung zu stellen, sind die erfindungsgemäßen, isolierten Sphäroide insbesondere zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung einer Leberkrankheit in einem Patienten geeignet. Der Begriff „Leberkrankheit” bezieht sich wie vorliegend verwendet auf eine große Vielfalt von Erkrankungen, die durch eine beeinträchtigte Funktion der Leber charakterisiert sind. Leberkrankheiten, die durch Transplantation der erfindungsgemäßen Hepatozyten-Sphäroide behandelt werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Hepatitis A, B und C, Leberzirrhose, α1-Antitrypsin-Mangel, Wilson Krankheit, Hämochromatose, Gallengangaufstau, Glykogenspeicherkrankheit, Reye-Syndrom in kleinen Kindern, angeborene Thyrosinämie Typ I, parasitäre Infektionen, primäre sklerosierende Cholangitis, sekundäre sklerosierende Cholangitis, chronisches Budd-Chiari-Syndrom, polyzystische Leberkrankheit, Oxalose, Harnstoffzyklusdefekte, Mitochondriales Depletionssyndrom, Alagille-Syndrorn, Crigler-Najjar-Syndrom, primäre familiäre intrahepatische Cholestase, neonatale Hepatitis, Gallengangatresie, fulminantes Leberversagen, alkoholische Zirrhose, Autoimmunhepatitis, Overlap-Syndrom, Lebervergiftung auf Grund von Paracetamol, Phalloidin oder sonstigen Agenzien.
Transplantation der erfindungsgemäßen Hepatozyten-Sphäroide kann auf verschiedenen Wegen erreicht werden, z. B. durch Transplantation in die Milz oder Pankreas oder durch direkte Einführung in die Leber, z. B. durch portale Infusion.
Wie vorliegend an anderer Stelle erörtert, ist es insbesondere bevorzugt, dass die Hepatozyten-Sphäroide von primären Hepatozyten abgeleitet sind, die in Bezug auf den Patienten autolog sind. Dies bedeutet, dass primäre Hepatozyten aus der Leber eines Individuums entnommen werden, um dreidimensionale Hepatozyten-Sphäroide herzustellen, und die ex vivo kultivierten Sphäroide dann zurück in denselben Patienten transplantiert werden. Auf diese Weise kann eine Abstoßung der transplantierten Hepatozyten-Sphäroide durch das Immunsystem des Empfängers vermieden werden.
Ein weiterer besonderer Vorteil der Erfindung ist die Möglichkeit, die Verfügbarkeit von hochqualitativen Hepatozytenaggregaten über mehrere Tage auszudehnen. In üblichen Zelltransplantationsansätzen kann es vorkommen, dass unmittelbar nach Entfernung der primären Hepatozyten aus den Spenderorganen kein geeigneter Patient vorhanden ist, um die Zellen zu empfangen. Es wurde im Stand der Technik gezeigt, dass Kryokonservierung humaner Hepatozyten die Zellqualität und ein erfolgreiches Anwachsen der Zellen in dem Lebergewebe beeinträchtigt. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden die isolierten, primären Hepatozyten für mehrere Tage ohne einen signifikanten Verlust ihrer metabolischen Funktion kultiviert, wodurch die Verfügbarkeit an hochfunktionalen Zellen auf bis zu 7 Tage, bis zu 10 Tage oder sogar mehr, nach Entfernung der primären Hepatozyten verlängert wird. Alternativ können die erfindungsgemäßen Sphäroide bis zur Verwendung in einer Transplantation auch in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei Temperaturen zwischen –20°C und –80°C gelagert werden.
Die Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Transplantation eines Hepatozyten-Sphäroids aus kultivierten, humanen Hepatozyten in einen Empfänger der dessen bedarf, wobei das Verfahren Schritte umfasst, bei denen man

(a) isolierte, humane, primäre Hepatozyten auf einem Polysaccharid-Gerüst unter Bedingungen kultiviert, die die Bildung eines Hepatozyten-Sphäroids erlauben;
(b) das Polysaccharid-Gerüst auflöst, um das Hepatozyten-Sphäroid freizusetzen;
(c) das Hepatozyten-Sphäroid von dem Kulturmedium trennt; und
(d) das Hepatozyten-Sphäroid, das in dem obigen Schritt (c) gewonnen wurde, in den Empfänger transplantiert.

Der Empfänger, der einer solchen Transplantation bedarf, ist vorzugsweise ein Individuum, das unter einer der oben genannten Leberkrankheiten leidet.
Ein weiterer Vorteil, der mit den erfindungsgemäßen Hepatozyten-Sphäroiden verbunden ist, ist die Möglichkeit primäre Hepatozyten aus einem Patienten zu gewinnen, der unter einer Leberkrankheit leidet, die durch einen Defekt in einem einzelnen Gen verursacht wird. Zum Beispiel können metabolische Leberkrankheiten auf einem Mangel in einem einzelnen Gen beruhen während die Leber ansonsten normal funktioniert. In diesen Fallen kann das Verfahren der Erfindung in einem gentherapeutischen Ansatz angewandt werden. Im Speziellen, wird eine funktionale Version des abnorm mutierten Gens in eine unspezifische oder spezifische Position des Genoms primärer Hepatozyten, die aus einem Patienten gewonnen wurden, inseriert werden. Die auf diese Weise veränderten Hepatozyten werden anschließend verwendet, um Sphäroide gemäß dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren herzustellen. In einem abschließenden Schritt werden die Sphäroide dann in den Patienten implantiert, der einer Behandlung bedarf, welches vorzugsweise der Patient ist, aus dem die Hepatozyten gewonnen wurden.
Zur Ersetzung des dysfunktionalen Gens, das die Leberkrankheit verursacht, wird eine intakte Kopie dieses Gens in einen viralen oder nicht-viralen Vektor kloniert. Das Gen wird operabel mit einem Promotorelement und, optional, mit einem Enhancer-Element verknüpft werden, um seine Expression in den Hepatozyten sicherzustellen. Der Vektor wird typischerweise ein viraler Vektor sein. Geeignete virale Vektoren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind rekombinante DNA oder RNA Viren, stärker bevorzugt replikationsdefiziente Viren, und umfassen, z. B., entgifteten Retrovirus, Adenovirus, Lentivirus, Adeno-assoziierten Virus (AAV), Herpesvirus, Pockenvirus, Vacciniavirus, Poliovirus, Sindbisvirus, Polyomavirus, wie z. B. Simianvirus 40 (SV 40), Humanes-Immunschwäche-Virus (HIV) und andere.
Adenoviren sind besonders bevorzugt, da die Transduktionseffizienz typischerweise mit Adenoviren im Vergleich zu anderen Viren höher ist. Der Adenovirus kann ein Humaner Adenovirus Typ 5 (hAd5) Vektor, ein E1-gelöschter und/oder ein E3-gelöschter Adenovirus sein. Beispielsweise kann ein adenoviraler Vektor durch die „Rescue Recombination” Technik, wie in McGrory et al. ((1988), Virology 163:614–617) beschrieben, konstruiert werden. Kurz gesagt wird das Transgen von Interesse in einen Shuttlevektor kloniert, der einen Promotor, einen Polylinker und flankierende adenovirale Sequenzen enthält, aus denen die E1A/E1B Gene gelöscht wurden. Geeignete Shuttlevektoren umfassen z. B. das Plasmid „pACl” (McGrory, et al. (1988), Virology 163:614–617) das Anteile des linken Ende des Humanen Adenovirus 5 Genoms kodiert, dem aber die frühe Proteinregion fehlt, die die E1A und E1B Sequenzen umfasst, die für die virale Replikation essenziell sind. Ein weiteres geeignetes Shuttleplasmid ist „ACCMVPLPA” (Gomez-Foix et al. (1992), J. Biol. Chem. 267: 25129–25134) das einen Polylinker, einen CMV Promotor und ein SV40 Polyadenylierungssignal umfasst, welches von partiellen Adenovirussequenzen flankiert wird, aus denen die E1A/E1B Gene entfernt wurden. Das Shuttleplasmid kann z. B. durch Lipofektion oder Kalziumphosphattransfektion mit einem Plasmid co-transfiziert werden, das das gesamte Humane Adenovirus 5 Genom mit einer Länge umfasst, die zu groß ist, um in geeignete Wirtszellen verkapselt zu werden (z. B. humane 293 Zellen). In einer Untergruppe von Zellen wird es zur „Rescue Recombination” zwischen dem Shuttlevektor und dem Helferplasmid kommen, wodurch ein Plasmid erschaffen wird, das das Gen von Interesse an der Stelle der E1A/E1B Gene und der zusätzlichen Sequenzen, die vorher das Plasmid zu groß für eine Verkapselung gemacht haben, enthält. Dies kann z. B. mit dem im Stand der Technik gut bekannten beta-Galaktosidase/X-Gal System überwacht werden. Das sich ergebende Plasmid von Interesse wird klein genug sein, um verkapselt zu werden, aber replikationsdefizient sein (siehe z. B. Giordano et al. (1996), Nature Medicine 2: 534–539).
Rekombinante virale Vektoren können nach Standardverfahren Plaque-gereinigt werden. Z. B. können rekombinante, adenovirale Vektoren in humanen 293 Zellen (die E1A und E1B Funktionen in trans zur Verfügung stellen) zu Titern im Bereich von 10⁷–10¹³ virale Partikel/mL vermehrt werden. Vor einer Anwendung in vivo können virale Vektoren durch Gelfiltrationsverfahren, wie z. B. Sepharosesäulen, entsalzt und durch anschließende Filtration aufgereinigt werden. Aufreinigung reduziert potenzielle schädliche Effekte in dem Individuum, an das die Vektoren verabreicht werden. Der verabreichte Virus ist im Wesentlichen frei von Wildtyp- und replikationskompetentem Virus. Die Reinheit des Virus kann durch geeignete Verfahren, wie z. B. PCR Amplifikation, bewiesen werden.
Nicht-virale Expressionsvektoren können ebenfalls verwendet werden, um ein funktionales Gen in ein humanes Individuum einzubringen. Geeignete Expressionsvektoren erlauben die in vivo Expression des Gens in der Zielzelle. Beispiele für nicht-virale Expressionsvektoren umfassen Vektoren wie z. B. Cages (Niwa et al. (1991), Gene, 108: 193–200), pBK-CMV, pcDNA3.1, pZeoSV (Invitrogen, Stratagene). Diese Vektoren können z. B. durch direkte Injektion oder nicht-invasive Katheter oder Injektorverfahren verabreicht werden. Alternativ können Zielzellen, die aus einem Individuum z. B. durch ein Biopsieverfahren entfernt wurden, mit dem Vektorkonstrukt in einem ex vivo Verfahren transfiziert werden. Die Zellen können dann in ein Individuum implantiert oder anderweitig verabreicht werden, vorzugsweise in das Individuum aus dem sie gewonnen wurden. Geeignete Verfahren für den Transfer von nicht-viralen Vektoren in Zielzellen sind z. B. das Lipofektionsverfahren, Kalziumphosphat-Copräzipitationsverfahren, DEAE-Dextranverfahren und direkte DNA-Einführungsverfahren, die Mikroglasröhrchen verwenden, und dergleichen. Vor Einführung des Vektors können die Hepatozyten mit einem Permeabilitationsagenz behandelt werden, wie z. B. Phosphatidylcholin, Streptolysine, Natriumcaprate, Dekanoylkarnitin, Weinsäure, Lysolezithin, Triton K-100 und dergleichen.
Die erfolgreiche Behandlung von Lebererkrankungen durch Gentherapie wurde bereits im Stand der Technik gezeigt. Z. B. beschrieben Grossmann et al. (1994), Nat Genet 6, 335, einen ex vivo Gentherapieansatz für familiäre Hypercholesterolämie. Kurz gesagt wurde ein Patient, der unter dieser Krankheit litt, mit autologen Hepatozyten transplantiert, die genetisch mit rekombinanten Retroviren korrigiert worden waren, die den LDL Rezeptor trugen. Der Patient tolerierte das Verfahren gut und eine Untersuchung des Lebergewebes vier Monate nach der Therapie zeigte Anzeichen für ein Anwachsen von Zellen, die das Transgen exprimierten. Das LDL/HDL Verhältnis des Patienten nahm von 10–13 vor der Gentherapie auf 5–8 nach der Gentherapie ab und diese Verbesserungen blieben für mehr als 18 Monate stabil. Eine andere Erkrankung, die durch Gentherapie geheilt werden könnte, ist die erblich bedingte Ornithin-Transcarbamylase-Defizienz (OTCD), eine seltene Harnstoffzyklusstörung, die durch eine Anzahl von verschiedenen Mutationen in dem Gen, das für die Ornithin-Transcarbamylase kodiert, verursacht wird.
Gemäß eines weiteren Aspekts können die erfindungsgemäßen Hepatozyten-Sphäroide auch in Toxizitätsuntersuchungen Verwendung finden. Z. B. werden die Sphäroide hilfreich sein, um Hepatotoxizität einer Verbindung, wie z. B. einem Medikamentenkandidaten, abzuschätzen. Zu diesem Zweck kann ein Medikamentenkandidat mit den erfindungsgemäßen Hepatozyten-Sphäroiden in einer Konzentration und unter Bedingungen in Kontakt gebracht werden, die der Situation in vivo nach Verabreichung des Medikamentenkandidaten in den Patienten entsprechen. Im Allgemeinen wird ein Medikamentenkandidat mit den dreidimensionalen Sphäroiden in Kontakt gebracht und für eine vorher bestimmte Inkubationszeit inkubiert werden, z. B. für etwa 1–24 Stunden. Nachdem Kontaktieren des Sphäroids mit dem Medikamentenkandidat werden ein oder mehrere leberspezifische Faktoren oder Parameter gemessen, wie z. B. die Expression des HNF-4 Transkriptionsfaktors und/oder die Expression von α1-Antitrypsin. Die Ergebnisse, die aus den Messungen hervorgehen, werden mit denen verglichen, die aus Sphäroidkontrollen hervorgehen, die nicht mit dem Medikamentenkandidaten in Kontakt gebracht wurden. Jegliche Verringerung in der Expression der leberspezifischen Faktoren kann eine mögliche Hepatotoxizität des Medikamentenkandidaten anzeigen. Da Hepatotoxozität oft aus dem Zusammenwirken von zwei oder mehreren verschiedenen Medikamenten entsteht, können die erfindungsgemäßen Sphäroide ferner verwendet werden, um Kombinationen eines Medikamentenkandidaten mit anderen bekannten Medikamenten zu untersuchen.
Andererseits können Sphäroide, die aus erkranktem Lebergewebe hergestellt wurden, bequem als ein Modellsystem in Assays zur Wirkstoffsuche verwendet werden, um die Wirksamkeit eines Medikamentenkandidaten in der Heilung oder Verbesserung der Symptome der betreffenden Krankheit zu untersuchen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt den Verlust an Hepatozyten während einer Kulturzeit von 14 Tagen, gemessen anhand des DNA Gehalts (1A) und der LDH Freisetzung aus beschädigten Zellen (1B).
2 zeigt die Ergebnisse aus Messungen verschiedener Hepatozytenfaktoren in Überständen von Sphäroiden, die auf Alginat-Gerüsten kultiviert wurden. 2A zeigt die Konzentration von humanem Albumin in absoluten Zahlen, während 2B die Konzentration von humanem Albumin im Verhältnis zum DNA Gehalt pro Gerüst zeigt. 2C zeigt die Konzentration von α1-Antitrypsin. 2D zeigt die Konzentration von α1-Antitrypsin im Verhältnis zu dem DNA Gehalt pro Gerüst. 2E zeigt die Herstellung von Harnstoff. 2F zeigt die Herstellung von Harnstoff im Verhältnis zu dem DNA Gehalt pro Gerüst.
3 zeigt die Genexpressionsergebnisse, bestimmt durch Echtzeit-PCR von Hepatozyten, die auf Alginat-Gerüsten kultiviert wurden, im Vergleich zu nativem Gewebe und frisch isolierten Zellen.
4 zeigt die Genexpression, bestimmt durch Echtzeit-PCR von erfindungsgemäßen Hepatozytensphäroiden nach Transplantation in murine Leber. 1 = natives Lebergewebe; 2 = primäre Hepatozyten nach Isolation; 3 = nach einem Tag in Kultur; 4 nach sieben Tagen in Kultur; 5 = acht Wochen nach Transplantation in Mäuse.
Beispiele
Die vorliegende Studie wurde durch das Komitee der Ärztekammer Hamburg in Übereinstimmung mit den Nationalen Richtlinien und der 1975er Erklärung von Helsinki genehmigt. Sie wurde durchgeführt, nachdem die schriftliche Zustimmung der Eltern jedes Patienten erhalten wurde.
BEISPIEL 1: ISOLATION PRIMÄRER HEPATOZYTEN

Primäre, humane Hepatozyten wurden aus den Lebern von drei Individuen isoliert, die unter metabolischen Krankheiten litten und sich einer Lebertransplantation unterzogen. Zwei Patienten waren durch Harnstoffzyklusstörungen geplagt, während ein Patient unter primärer Oxalose litt. Tabelle 1 zeigt weitere Details über die Spenderdaten.

Patient	Spenderalter	Spenderdiagnose	Zeit der kalten Ischämie (Stunden)	zelluläre Labensfähigkeit (%)
A	15 Monate	Ornithin-Transcarbamylase-Defizienz	30	99
B	32 Monate	Carbamoyl-Phosphate-Synthetase-Defizienz	24	80
C	18 Jahre	Primäre Oxalose	48	95
Durchschnittliche Lebensfähigkeit ± Standardabweichung (%)				91.3 ± 8.2

Tabelle 1: Details zu Patienten, aus denen primäre, humane Hepatozyten für die in vitro Testung gewonnen wurden.

Unmittelbar nach der Explantation wurde das Lebergewebe mit kalter (4°C) Custodiol^® HTK Lösung (Dr. F. Köhler Chemie, Bensheim, Deutschland) perfundiert und bei 4°C bis zum Zeitpunkt der Hepatozytenisolation gelagert. Proben von nativem Gewebe wurden schockgefroren und bei –80°C gelagert bevor das Zellisolationsverfahren begonnen wurde.
Ein Kollagenaseverdau in zwei Schritten wurde, wie zuvor in Dandri et al. (2001), Hepatology 33, 981, beschrieben, verwendet, um eine Einzelleberzellsuspension zu erhalten. Das Lebergewebe wurde in einer sterilen Glasschale platziert, die sich in einem Wasserbad bei 37°C befand. Ein Zweig der Pfortader (Vena Portae) wurde kanüliert und das Lebergewebe wurde bei 37°C mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 40 bis 100 ml/min entsprechend der Größe der Leberprobe perfundiert. Die erste Perfusionslösung war ein Kalzium-freier Puffer mit einer Dauer von 8 bis 10 Minuten. Anschließend wurde die Perfusion mit einer 0,05% Kollagenaselösung (Worthington Collagenase Type II, Worthington) für 10–30 Minuten fortgesetzt. Schließlich wurde das verdaute Lebergewebe in kaltes ”Hepatocyte Wash Medium” (Invitrogen) platziert und die Leberkapsel wurde eingeschnitten. Die Hepatozyten wurden mit sanftem Schütteln des Gewebes mobilisiert und die Suspension wurde durch ein Nylonnetz mit einer Porengröße von 100 μm filtriert. Nach der Filtration wurden die Hepatozyten durch Zentrifugation bei 50 × g für fünf Minuten abgetrennt und dreimal mit ”Hepatocyte Wash Medium” gewaschen. Die Zellzahl und -lebensfähigkeit wurden durch einen Trypan-Blau-Test bestimmt. Proben von Zellen wurden in flüssigem Stickstoff unmittelbar nach dem Isolationsverfahren schockgefroren und bei –80°C für die weitere Analyse gelagert.
Ergebnisse: Humane Hepatozyten konnten erfolgreich aus metabolisch erkrankten Lebern durch das oben beschriebene Verfahren isoliert werden. Eine durchschnittliche zelluläre Lebensfähigkeit von 91,3 ± 8,2% (n = 3 Isolationen) wurde durch einen Trypan-Blau-Test unmittelbar nach der Isolation der Hepatozyten aus den Lebern bestimmt. Insbesondere die Isolationen aus den Spenderorganen mit langen Zeiten einer kalten Ischämie (Patient A und C) hatten ein exzellentes Ergebnis von 99% bzw. 95% zellulärer Lebensfähigkeit.
BEISPIEL 2: ZELLAUSSAAT UND -KULTIVIERUNG
Alginat-Gerüste in Platten mit 24 Vertiefungen (AlgiMatrix^TM 3D Culture System) wurden von Invitrogen (Carlsbad, CA, USA, Cat. Nr. 12684-023) erworben. Nach Angaben des Herstellers sind die Gerüste frei von aus Tieren gewonnen Verbindungen und haben eine Porengröße von 50–200 μm. Unmittelbar vor ihrer Verwendung wurden die Gerüste in eine Kulturplatte mit 24 Vertiefungen mit einer speziellen Oberfläche für ultra-geringes Anheften (Corning, Lowell, USA) transferiert, um die Anheftung von Zellen auf der Kulturplatte zu minimieren.
Hepatozyten wurden in Kulturmedium resuspendiert, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Die Alginat-Gerüste wurden mit einem definierten Volumen von 200 μl Zellsuspension pro Gerüst, welches 1 × 10⁶ Hepatozyten umfasst, homogen eingesät. Nach der Aussaat wurden 400 μl Kulturmedium pro Vertiefung hinzugefügt. Hepatozyten auf Alginat-Gerüsten wurden in ergänztem Williams' Medium E ohne L-Glutamin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) wie zuvor beschrieben (Bierwolf et al. (2011) Biotechnol Bioeng 108, 141) kultiviert. Cytochrom P450 (CYP) Isoenzyme wurden in zwei der drei Experimente induziert. Dementsprechend wurde das Kulturmedium ab Tag 3 der Zellkultur mit 2% DMSO, 2 mM 3-Methylcholanthren und 10 mM Dexamethason (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) ergänzt. Die Gerüste wurden während eines Kulturzeitraums von 14 Tagen unter statischen Bedingungen in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ und 95% Luft bei 37°C inkubiert. Das Kulturmedium wurde alle 24 Stunden ausgetauscht. Der Überstand wurde jeden zweiten Tag gesammelt und bei 4°C oder –20°C für weitere Analysen gelagert.
Der DNA Gehalt pro Gerüst wurde zur Abschätzung des Austretens von Hepatozyten aus den Gerüsten gemessen. An Tag 1, 7 und 14 der Zellkultur wurden die Gerüste gemäß der Angaben des Herstellers aufgelöst. 1 ml warmer (37°C) ”AlgiMatrix^TM Dissolving Buffer” (Invitrogen) wurde pro Röhrchen hinzugefügt und die Röhrchen wurden bei 37°C für 10 Minuten inkubiert. Nach Inkubation wurden die Röhrchen bei 200 × g für 4 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Verfahren wurde wiederholt. Die freigesetzten Zellen/Sphäroide wurden mit ”Dulbecco's Phosphate Buffered Saline” (Invitrogen, Carlsbad, USA) gewaschen und bei –80°C gelagert. Die DNA wurde unter Verwendung des ”QIAamp DNA Mini”-Kits (Qiagen, Germantown, MD, USA) gemäß der Angaben des Herstellers aufgereinigt. Für die DNA Messungen wurde die Absorption bei 260 nm überwacht.
Ergebnisse: Es wurde gefunden, dass unmittelbar nach der Zellaussaat zahlreiche Hepatozyten in den Gerüstporen immobilisiert waren. Nach 24 Stunden in 3D Kultur zeigten die Hepatozyten Aggregation innerhalb der Poren der Gerüste. Ab Tag 3 wurde die Bildung von Sphäroiden beobachtet, die sich ihrem maximalen Durchmesser von beinahe 100 μm an Tag 7 annäherten.
Die Bestimmung des DNA Gehaltes der Gerüste zeigte nur einen marginalen Verlust von Hepatozyten während der 14-tägigen Kultivierungszeit (1A). Eine durchschnittliche Menge von 5,79 ± 0,92 μg DNA wurde einen Tag nach der Zellaussaat festgestellt. Die DNA Konzentration pro Polymer an Tag 7 lag bei 4,02 ± 1,85 μg, was auf einen Verlust von 30,57% im Verhältnis zu Tag 1 hindeutet. An Tag 14 der 3D-Zellkultur wurden 3,75 ± 2,53 μg DNA pro Gerüst im Format mit 24 Vertiefungen nachgewiesen, was auf einen Verlust von 35,23% Zellen im Verhältnis zum Tag 1 hindeutet.
BEISPIEL 3: LAKTATDEHYDROGENASE-ASSAY
Laktatdehydrogenase(LDH)-Freisetzung aus beschädigten Zellen wurde überwacht, um die zelluläre Lebensfähigkeit zu bestimmen und nach, durch die Gerüste und deren Abbauprodukte verursachte, toxikologische Effekte zu suchen. Wie die anderen biochemischen Assays, die untenstehend in den Beispielen 4–6 erklärt werden, wurde die Messung der LDH Freisetzung jeden zweiten Tag während der Zellkultivierung unter Verwendung von Zellfreien Kulturüberständen, d. h. Kulturmedium, das für die letzten 24 Stunden in Kontakt mit den kultivierten Sphäroiden war, durchgeführt. Die LDH Aktivität wurde unter Verwendung eines ”Cytotoxicity Detection KitPlus”, das auf colorimetrischen Messungen basiert (Roche, Basel, Schweiz), bestimmt. Die Inkubationszeit in einer dunklen Umgebung wurde präzise befolgt. Eine LDH Standardkurve wurde mit einer LDH Lösung aus Schweinemuskel erstellt (Roche). Die Farbreaktionen bei 490 nm und 690 nm wurden überwacht und die LDH Menge wurde im Verhältnis zur Standardkurve und unter Berücksichtigung der Verdünnung und des Hintergrundes berechnet.
Ergebnisse: die LDH Freisetzung von beschädigten Zellen nahm von 6,05 ± 3,49 μg/μl an Tag 1 auf 2,10 ± 0,79 μg/μl an Tag 5 ab und blieb danach bei sehr geringen Mengen bis zum Ende der Zellkultur beinahe konstant (1B). Dies deutet darauf hin, dass die kultivierten Zellen nur unter geringfügigen zellulären Membranschäden litten.
BEISPIEL 4: HUMANES ALBUMIN-ASSAY
Die Konzentration an humanem Albumin wurde durch einen Enzym-Immunassay (ELISA) unter Verwendung eines Quantifizierungskits für humanes Albumin (ICL, Newberg, OR, USA) gemessen. Die Absorption bei 450 nm wurde für jede Probe im Verhältnis zu einer Standardkurve überwacht. Die Menge an Albumin wurde von Standards interpoliert, die auf die Probenverdünnung und den Hintergrund korrigiert waren.
Ergebnisse: Die Konzentration an humanem Albumin in 24 Stunden-Überstand nahm von 1513 ± 561 ng/ml an Tag 1 auf ein Maximum von 2714 ± 2571 ng/ml an Tag 7 zu und nahm danach auf 841 ± 776 ng/ml nach 14 Tagen in Alginat-Gerüst verwendender 3D Kultur ab (2A). Diese Ergebnisse wurden in ein Verhältnis mit der DNA, die in Beispiel 2 bestimmt wurde, gesetzt. Bei Berechnung der Ergebnisse des Albuminassays auf die DNA Menge pro Gerüst nahm die 24-stündige Albuminsekretion pro μg DNA von 253 ± 53 ng/ml an Tag 1 auf 528 ± 375 ng/ml an Tag 7 zu und nahm auf eine Menge von 161 ± 104 ng/ml am Ende der 3D Zellkultur ab (2B).
BEISPIEL 5: α1-ANTITRYPSIN ASSAY
Für die quantitative Bestimmung von α1-Antitrypsin in Zellkultur wurde das ELISA-System der Immundiagnostik AG (Bensheim, Deutschland) verwendet, welches die hepatische Form von α1-Antitrypsin nachweist. Die Absorption wurde bei 450 nm und 620 nm bestimmt. Die Werte von α1-Antitrypsin in den Proben wurden aus im Kit enthaltenen Standards mit bekannten Konzentrationen unter Berücksichtigung der Verdünnung und des Hintergrundes berechnet. Eine positive und eine hochpositive Kontrolle wurden darüber hinaus als Qualitätskontrollen untersucht.
Ergebnisse: Es wurde eine aktive Herstellung von α1-Antitrypsin während des gesamten Kulturzeitraums von 14 Tagen beobachtet, wobei die maximale Herstellungsrate an Tag 3 gemessen wurde, an dem 965 ± 493 ng Protein pro ml in dem 24-stündigen Zellkulturüberstand nachgewiesen wurde (2C). Unter Berücksichtigung des DNA Gehalts pro Gerüst nahmen die Mengen von 103 ± 27 ng/ml α1-Antitrypsin pro μg DNA an Tag 1 auf 236 ± 157 ng/ml pro μg DNA an Tag 7 der Zellkultur zu. Die Werte an Tag 14 nahmen auf 139 ± 118 ng/ml pro μg DNA ab, aber sie waren immer noch höher als die an Tag 1 gemessenen Werte (2D).
BEISPIEL 6: HARNSTOFF-ASSAY
Die Harnstoffherstellung wurde durch einen quantitativen, kolorimetrischen Harnstoff-Assay-Kit vom Biochain Institute (Hayward, CA, USA) bestimmt. Zur Abschätzung der Harnstoffwerte in den Proben wurde die optische Dichte bei 430 nm gemessen und von einem Harnstoffstandard (der im Kit enthalten war) unter Berücksichtigung der Probenverdünnung und des Hintergrunds berechnet.
Ergebnisse: Die Ergebnisse der Harnstoffherstellung wurden auf Grund der unterschiedlichen zu Grunde liegenden Krankheiten für jedes einzelne Experiment ausgewertet. Die Patienten A und B litten unter Harnstoffzyklusstörungen, wodurch unterschiedliche Werte der Harnstoffherstellung im Vergleich mit Patient C, der unter Oxalose litt, zu erwarten waren. Die Ergebnisse des Harnstoffassays sind in 2E bzw. 2F dargestellt. Die Hepatozyten der Patienten A und B zeigten eine beinahe konstante Harnstoffherstellung pro μg DNA, aber die Mengen waren, wie erwartet, während des gesamten Kulturzeitraums gering (2F). Die Leberzellen des Patienten C stellten höhere Mengen an Harnstoff her. Die maximale Menge an Harnstoffherstellung im Verhältnis zum DNA Gehalt pro Gerüst wurde an Tag 7 nachgewiesen, an dem 24 ± 2 μg Harnstoff pro ml und μg DNA gemessen wurden. In diesem Experiment waren die Werte am Tag 14 (15 ± 1 μg/ml/μg DNA) im Vergleich mit den Grundlinienwerten an Tag 1 (13 ± 1 μg/ml/μg DNA) höher.
BEISPIEL 7: Histologische Studien
An den Tagen 1, 7 und 14 der Zellkultur wurden die Gerüste in Tissue-Tek (Sakura, Staufen, Deutschland) eingebettet und in 16 μm dicke Schnitte geschnitten. Nach der Fixierung in Aceton wurden die Schnitte mit Hämatoxylin and Eosin (HE) zur Auswertung der zellulären Lebensfähigkeit und mit Perjodsäure-Schiff (PAS) zur Abschätzung der Glykogenspeicherkapazität gefärbt und durch Transmissionslichtmikroskopie analysiert.
Ferner wurde die Aktivität von Hepatozyten-spezifischen Faktoren durch Immunfluoreszenzfärbungen gezeigt. Hoechst 33258 (Invitrogen) wurde als Gegenfärbung für lebensfähige Zellkerne in allen Färbungen angewendet (Verdünnung 1:20000, eine Minute Inkubation). Die Schnitte wurden durch Fluoreszenzmikroskopie visualisiert. Eine ”Hepatocyte nuclear factor 4” (HNF-4)/Cytokeratin 18(CK18)-Immunfluoreszenzdoppelfärbung wurde etabliert, um den Zustand der Zelldifferenzierung zu überwachen. HNF-4 ist einer der bedeutendsten, in der Leber angereicherten, nukleären Hepatozyten-Transkriptionsfaktoren in normalem Lebergewebe. Die Schnitte wurden für eine Stunde mit 1:200 verdünntem, polyklonalem HNF-4 Antikörper aus der Ziege (Santa Cruz Biotchnology, Santa Cruz, CA) gemeinsam mit 1:100 verdünntem, monoklonalem Maus-anti-Mensch CK-18 Antikörper (Antibodies-Online, Aachen, Deutschland) inkubiert. Als sekundäre Antikörper wurden Alexa Fluor 555-konjugierte Esel-anti-Ziege (rot) und Alexa Fluor 488-konjugierte Esel-anti-Maus (grün) Antikörper (Invitrogen) verwendet.
Das Zonula Occludens Protein 1 (Zo-1) ist ein Marker für ”Tight Junctions”, der die Bildung von Gallencanaliculi zwischen benachbarten Hepatozyten in der Leber und eine bipolare Konfiguration anzeigt. Ein polyklonaler Antikörper aus dem Kaninchen gegen Zo-1 wurde von Invitrogen erworben (1:20, 1 Stunde). Der Ziege-anti-Kaninchen-Sekundärantikörper war mit Alexa Fluor 555 konjugiert (rot) und durch Invitrogen hergestellt. Zum Nachweis der Gallencanaliculi wurden die Schnitte für eine Stunde in Alexa 488-markiertem Phalloidin (Invitrogen; 1:50, 1 Stunde) inkubiert, um die Aktinfilamente zu färben (grün).
Cytochrom P450 wurde in primären, humanen Hepatozyten mit einem polyklonalen primären Antikörper aus dem Kaninchen von MBL International (Woburn, MA, USA; 1:100, 1 Stunde) wie zuvor beschrieben gefärbt (Laszlo et al. (2008) Histochem Cell Biol 130, 1005). Es wurde ein Alexa 555-konjugierter Ziege-anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (rot) von Invitrogen verwendet.
Ergebnisse: Die HE Färbung zeigte, dass primäre, humane Leberzellen, die auf Alginat-Gerüsten kultiviert wurden, eine hohe zelluläre Lebensfähigkeit bis an Tag 7 in der Kultur behielten. Ferner wurde ein gut organisiertes zytoskeletales Netzwerk innerhalb der Sphäroide durch die immunfluoreszente Färbung von Cytokeratin 18 nachgewiesen. An Tag 14 wurde ein Verlust an intaktem Zytoskelett und eine verringerte Lebensfähigkeit mit zentraler Sphäroidnekrose durch HE und Immunfluoreszenzfärbung beobachtet. Die PAS Reaktion zeigte gut erhaltene Glykogenlagerung in allen Bereichen der Hepatozytenspäroide bis zu 7 Tagen in Kultur. Die Glykogenspeicherkapazität zeigt an, dass die kultivierten Zellen funktionale Hepatozyten sind. An Tag 14 blieben einzelne Zellen innerhalb der Sphäroide negativ für die PAS Reaktion, was einen dementsprechenden Verlust an Funktion oder eine De-Differenzierung anzeigt.
An Tag 7 wurden HNF-4-positive Hepatozytenkerne in Kombination mit einem in vivo-artigem Zytoskelett der 3D-Zellkultur nachgewiesen, was auf eine hochgradig erhaltene Zelldifferenzierung hinwies. Ferner zeigte Immunfluoreszenzfärbung ZO-1-positive Hepatozyten innerhalb der Sphäroide an Tag 7 der Kultur. ZO-1 ist zwischen benachbarten Zellen als zwei parallele Streifen sichtbar, die Gallencanaliculi abgrenzen. Für den Nachweis von Aktinfilamenten in Gallencanaliculi wurde Alexa 488-markiertes Phalloidin verwendet. Neubildung von Gallencanaliculi zwischen benachbarten Heptozyten wurde an Kulturtag 7 beobachtet, wobei diese eine Leber-artige Feinstruktur innerhalb der Sphäroide aufwiesen. Im Hinblick auf Cytochrom P450 zeigte die Immunfluoreszensfärbung nach sieben Kulturtagen positive Zellen, was auf die Fähigkeit toxische Substanzen zu metabolisieren hindeutet.
Aus den histologischen Studien kann geschlossen werden, dass Hepatozyten nach sieben Tagen in Kultur auf den Alginat-Gerüsten am Besten für die Transplantation geeignet waren.
BEISPIEL 8: APOPTOSEASSAY
An Tag 7 der Zellkultur wurde ein Gerüst gemäß den Angaben des Herstellers und wie oben beschrieben aufgelöst. Die freigesetzten Zellen/Sphäroide wurden in Tissue-Tek eingebettet und in 8 μm dicke Schnitte geschnitten. Eine terminale, Deoxynukleotidyltransferase-vermittelte dUTP-Biotin ”Nick End Labeling” (TUNEL)-Reaktion wurde unter Verwendung des ”In Situ Cell Death Detection Kits” (Roche) zur Identifikation von apoptotischen Zellen (grün) durchgeführt. Das Kit wurde gemäß der Richtlinien des Herstellers angewandt. Zusätzlich zum TUNEL wurde eine Immunfluoreszenzfärbung von CK18 für das Zytoskelett (1:100, 60 min Inkubation) unter Verwendung eines Alexa Fluor 555-markierten Ziege-anti-Maus-Sekundärantikörpers (rot), der durch Invitrogen hergestellt wurde (1:800, 45 Minuten Inkubation), durchgeführt.
Ergebnisse: Die Ergebnisse der TUNEL Reaktion mit CK18 Immunfluoreszenzfärbung als Hintergrund deuteten darauf hin, dass an Tag 7 die meisten Zellen mit einem intakten Zytoskelett und Kernen lebensfähig und nur einige einzelne Zellen positiv für die TUNEL Reaktion waren. Hieraus kann geschlossen werden, dass das Verfahren zur Auflösung von Gerüsten sicher ist und keine Apotose in den Hepatozyten induziert.
BEISPIEL 9: RT-PCR UND ECHTZEIT-PCR
Nach der Ernte an Tag 1, 7 und 14 der Kultur wurden die Gerüsten aufgelöst. Die freigesetzten Zellen/Sphäroide wurden in 350 μl RLT-Puffer (Qiagen) und 3,5 μl β-Mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) aufgenommen. Das gleiche Verfahren wurde mit dem nativem Gewebe beziehungsweise den Zellen, die direkt nach der Isolation gefroren wurden, durchgeführt. Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des ”RNeasy Mini Kits” (Qiagen) aus dem Lysat extrahiert. Der RNA Gehalt und seine Reinheit wurden durch Absorptionsmessungen bei 260 bzw. 260/280 nm bestimmt. Zur cDNA Synthese wurde das ”First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR (AMV)” von Roche gemäß der Angaben des Herstellers verwendet. Die Synthesereaktion des ersten cDNA Stranges wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 25°C für 10 Minuten, 42°C für 60 Minuten, 99°C für 5 Minuten und Abkühlen auf 4°C.
Echtzeit-PCR Amplifikation wurde eingesetzt, um die Genexpression von Leberzell-spezifischen Faktoren unter Verwendung des ”QuantiTect SYBR Green PCR Kits” (Qiagen, Hamburg, Deutschland) in Kombination mit genspezifischen ”QuantiTect Primer Assays” (Qiagen) zu quantifizieren. Die Details für die Zielgene sind in Tabelle 2 aufgelistet. Die Expression von Leberzell-spezifischen Faktoren wurde unter Verwendung des komparativen CT-Verfahrens, das die Genexpression in Bezug auf ein internes ”Housekeeping”-Gen berechnet, quantifiziert. Humanes Beta-Aktin (ACTB) wurde auf Grund seiner stabilen Expression als interne Kontrolle verwendet. Alle Reaktionen wurden in Duplikaten durchgeführt und bestanden aus 12,5 μl ”2× Quanti-Tect SYBR Green PCR Master Mix”, 2,5 μl ”10× QuantiTect Primer Assay” und 1 μl cDNA als PCR-Matrize. Die Reaktionen wurden unter Verwendung des ”StepOnePlus” Echtzeit-PCR-Systems (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) durchgeführt. Die Zyklusbedingungen waren wie folgt: 95°C für 10 Minuten, gefolgt von 45 Zyklen mit 94°C für 15 Sek, 60°C für 30 Sek und 72°C für 30 Sek. Schmelzkurvenanalyse wurde routinemäßig durchgeführt.
Ergebnisse: Die Genexpressionsniveaus von aus der Leber abgeleiteten Faktoren wurden durch quantitative Echtzeit-PCR ausgewertet. 3 fasst die Genexpressionsergebnisse von in 3D kultivierten Hepatozyten im Vergleich zu dem nativen Gewebe sowie den frisch isolierten Zellen zusammen. Es wurde eine konstante Albumin mRNA-Expression in nativem Gewebe bzw. frisch isolierten Zellen gemessen, während das PCR Signal von Albumin in kultivierten Zellen beinahe 10% der Basislinien-Gewebe Werte betrug. Die Expression von CYP1A2 wurde stark durch das Isolationsverfahren beeinflusst. Die Mengen in den frisch isolierten Zellen nahmen im Vergleich zu den nativen Gewebe drastisch ab. Die CYP P450 Enzymexpression wurde nicht in dem Experiment induziert, das die Zellen von Patient A verwendete. Die CYP1A2 Expressionsniveaus in diesem Experiment waren aus diesem Grund wie erwartet geringer als in den späteren Versuchen (in der Figur durch ein Sternchen markiert). Die CYP3A4 Genexpression war bereits in dem Basisgewebe sehr gering und in den kultivierten Zellen nicht nachweisbar. Die Kopienanzahl von Transferrin blieb während des gesamten Kultivierungszeitraums konstant. Das PCR Signal der Phase-II-Enzym-UDP-Glukuronosyltransferase (UGT1A1) nahm an Tag 1 ab, erholte sich jedoch in einem späteren Kulturstadium. Ferner wurde eine unbeeinflusste Expression der Phase-II-Enzym-Glutathion-S-Transferase (GSTA1) nachgewiesen.
BEISPIEL 10: IN VIVO TRANSPLANTATION

Für die in vivo Experimente wurden primäre humane Hepatozyten aus den Lebern von drei Patienten isoliert. Zwei Patienten litten unter der Ahornsirupkrankheit und ein Patient unter primärer Oxalose. Tabelle 2 stellt mehr Details bezüglich der Spender zur Verfügung. Sphäroide wurden, wie in den oben stehenden Beispielen 1 und 2 beschrieben, hergestellt und in uPA/scid-Mäuse über die Milz transplantiert, wie detaillierter beschrieben in Dandri et al. (2000), Hepatology 32 (1), 139–146; Dandri et al. (2001), Hepatology 33 (4), 981–988; Dandri et al. (2005), J Hepatology 42 (1), 54–60; Dandri et al. (2008), Hepatology 48 (4), 1079–1086; Petersen et al. (2008), Nature Biotechnology 26 (3), 335–341.

Patient	Spender Alter/Geschlecht	Spenderdiagnose	Zeit der kalten Ischämie (Stunden)	Zelluläre Lebensfähigkeit (%)
A	18 Jahre/m	Primäre Oxalose	48	95
B	4 Monate/m	Ahornsirupkrankheit	16	75
C	2 Monate/m	Ahornsirupkrankheit	7	99
Durchschnittliche Lebensfähigkeit ± Standardabweichung (%)				89.5 ± 10.5

Tabelle 2: Details zu den Patienten aus denen primäre, humane Hepatozyten für die in vivo Testung gewonnen wurden.

Acht Wochen nach der Transplantation wurden die Mäuse getötet und die Leberorgane wurden untersucht. Unmittelbar vor der Tötung wurde Serum entnommen und auf humanes Albumin in dem in Beispiel 4 beschriebenen ELISA-Assay getestet. Humanes Albumin kann nur in Fällen hergestellt werden, in denen die transplantierten Sphäroide erfolgreich in die murine Leber integriert wurden. Die aus den Mäusen gewonnen Organe wurden ebenfalls durch andere histologische Färbeverfahren untersucht, einschließlich humanes Cytokeratin 18, α1-Antitrypsin, Zo-1, Cytochrom P450 und HNF-4.
Ergebnisse:

Wie in den untenstehenden Tabellen gezeigt werden kann, waren acht Wochen nach der Transplantation sieben Tiere positiv für humane Hepatozyten. In drei der Tiere, die aus dieser Gruppe getestet wurden, wurde humanes Albumin im Serum der Empfängermäuse nachgewiesen, was zeigt, dass die transplantierten Sphäroide erfolgreich in das murine Lebergewebe integriert waren.

Patient	3D Vorkultur (Tage)	Anzahl transplantierter Mäuse	Mäuse, positiv für humane Hepatozyten	Humanes Albumin in Serum (mg/ml)
A	7	5	1	0,497
B	7	5	2	1,312
				1,396
C	6	5	4	Nicht analysiert
Gesamte Tiere		15	7

Tabelle 3: Ergebnisse aus den Transplantationsexperimenten

Diese Ergebnisse wurden ferner durch die Ergebnisse der histologischen Experimente unterstützt. Bier konnte gezeigt werden, dass die humanen Hepatozyten nach Integration in die Mausleber begannen zu proliferieren und Cluster zu bilden, die durch Färbung gegen humanes Cytokeratin 18 visualisiert werden konnten. Die Bildung von ”Tight Junctions” und ”Gap Junctions” wurde durch Färbung gegen humanes Zo-1 bzw. humanes Connexion 32 nachgewiesen.
Zusätzliche histologische Färbeverfahren offenbarten, dass die Hepatozyten, die in murines Lebergewebe integriert worden waren, humanes α1-Antitrypsin und den leberspezifischen Faktor HNF-4 herstellten. Die Gegenwart von neuen Gallencanaliculi innerhalb des transplantierten Gewebes wurde durch Färbung mit Phalloidin visualisiert. Die funktionale Fähigkeit der humanen Hepatozyten in der Mausleber toxische Verbindungen abzubauen wurde durch Färbung gegen Cytochrom P450 nachgewiesen.
Die Expression von leberspezifischen Genen in der murinen Leber wurde durch Echtzeit-PCR nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Die in der PCR Analyse verwendeten Primer wurden entworfen, um ausschließlich humane Transkripte nachzuweisen. Die Ergebnisse der PCR zeigen, dass die Expression von leberspezifischen Genen im Vergleich zu humanem nativen Lebergewebe herunterreguliert ist, wenn die Zellen in vitro in Sphäroide kultiviert werden; wenn jedoch in murine Leber transplantiert wird, so werden die initialen Expressionslevel wieder erreicht. In einigen Fällen waren die Expressionslevel, die nach der Transplantation in Mäuse nachgewiesen wurden, höher als die in dem nativen, humanen Lebergewebe.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Isoliertes Hepatozyten-Sphäroid aus kultivierten, humanen, primären Hepatozyten, wobei das Sphäroid frei von jeglichem künstlichen Gerüstmaterial ist.
Isoliertes Sphäroid gemäß Anspruch 1, wobei die Produktion von humanem α1-Antitrypsin in den Hepatozyten des Sphäroids mindestens 50% der in frisch isolierten, humanen, primären Hepatozyten festgestellten Produktion beträgt.
Isoliertes Sphäroid gemäß einem der Ansprüche 1–2, wobei die Produktion von humanem Albumin in den Hepatozyten des Sphäroids mindestens 50% der in frisch isolierten, humanen, primären Hepatozyten festgestellten Produktion beträgt.
Isoliertes Sphäroid gemäß einem der Ansprüche 1–2, wobei in mindestens 50% der Hepatozyten des Sphäroids Gallencanaliculi zwischen benachbarten Hepatozyten vorhanden sind.
Isoliertes Sphäroid gemäß einem der Ansprüche 12, wobei das Sphäroid einen Durchmesser von mindestens 50 μm hat.
Isoliertes Sphäroid gemäß einem der Ansprüche 1–5 zur Verwendung in der Leberzelltransplantationsmedizin.
Isoliertes Sphäroid gemäß einem der Ansprüche 1–5 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung einer Leberkrankheit bei einem Patienten.
Isoliertes Sphäroid gemäß Anspruch 7, wobei die Leberkrankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hepatitis A, B und C, Leberzirrhose, α1-Antitrypsin-Mangel, Wilson-Krankheit, Hämochramatose, Gallengangaufstau, Glykogenspeichererkrankung, Reye-Syndrom bei kleinen Kindern, angeborene Tyrosinämie Typ I, parasitäre Infektionen, primär sklerosierende Cholangitis, sekundär sklerosierende Cholangitis, chronisches Budd-Chiari-Syndrom, polyzystische Lebererkrankung, Oxalose, Harnstoffzyklusdefekte, mitochondriales Depletions-Syndrom, Alagille-Syndrom, Crigler-Najjar-Syndrom, primäre familiäre intrahepatische Cholestase, neonatale Hepatitis, Gallengangsatresie, fulminantes Leberversagen, alkoholische Zirrhose, Autoimmunhepatitis, Overlap-Syndrom, Lebervergiftung auf Grund von Paracetamol, Phalloidin oder sonstigen Agenzien.
Isoliertes Sphäroid gemäß Anspruch 8, wobei das Sphäroid von primären Hepatozyten abgeleitet ist, die für den Patienten autolog sind.
Verfahren zur Herstellung eines Sphäroids aus humanen, primären Hepatozyten, Schritte umfassend, bei denen man: (a) isolierte, humane, primäre Hepatozyten auf einem Polysaccharid-Gerüst unter Bedingungen kultiviert, die die Bildung eines Hepatocyten-Sphäroids erlauben; (b) das Polysaccharid-Gerüst auflöst, um das Hepatocyten-Sphäroid freizusetzen; und (c) das Hepatozyten-Sphäroid von dem Kulturmedium abtrennt.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das Polysaccharid-Gerüst ein Alginat-Gerüst ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11, wobei das Alginat-Gerüst in Schritt (b) durch Zugabe von Zitronensäure oder EDTA aufgelöst wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10–12, wobei die Trennung des Hepatocyten-Sphäroids in Schritt (d) eine Filtration und/oder Zentrifugation umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10–13, wobei die Kultivierung in Schritt (a) für 7–14 Tage durchgeführt wird.
Isoliertes Hepatozyten-Sphäroid aus humanen, primären Hepatozyten, das durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10–14 erhältlich ist.
Verwendung eines isolierten Hepatozyten-Sphäroids gemäß einem der Ansprüche 1–9 oder 15 für in vitro Hepatotoxizitäts-Studien oder Wirkstoff-Screening-Assays.