DE60037876T2

DE60037876T2 - Verfahren zur Herstellung von entwickelten und unentwickelten Pankreasendokrinezellen, Zellpräparat und Verwendung davon zur Behandlung von Diabetes

Info

Publication number: DE60037876T2
Application number: DE60037876T
Authority: DE
Inventors: Daniel Pipeleers
Original assignee: Beta-Cell NV
Current assignee: Beta-Cell NV
Priority date: 2000-04-12
Filing date: 2000-04-12
Publication date: 2009-01-29
Anticipated expiration: 2020-04-13
Also published as: EP1146117B1; DE60037876D1; EP1146117A1; CA2363971A1; ES2299417T3; US6686197B2; CA2363971C; DK1146117T3; ATE384781T1; PT1146117E; US20020177228A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur großtechnischen Produktion einer Zubereitung von reifen und unreifen endokrinen Pankreaszellen und ihre Verwendung zur Behandlung von Diabetes mellitus.
Hintergrund der Erfindung
Diabetes mellitus ist als chronischer Zustand von Hyperglykämie definiert. Diese Störung des Stoffwechsels tritt auf, wenn die Freisetzung von Insulin entweder als Folge eines primären Defekts auf der Ebene der Insulin produzierenden beta-Zellen oder sekundär, wenn die beta-Zellen den erhöhten peripheren Widerstand gegen Insulin nicht kompensieren können, nicht ausreichen wird. Der Verschiebung zu erhöhten Glucosespiegeln kann durch anhaltende Anpassungen des Lebensstils und durch tägliche Verabreichung von hyperglykämischen Mitteln in Form von Insulininjektionen oder Sulfonylharnstoff-Tabletten entgegengewirkt werden. Mit derzeitigen Behandlungen gelingt jedoch keine erfolgreiche vollständige Normalisierung der Glucosehomöostase. Diabetische Patienten sind daher mit dem Risiko konfrontiert, chronische Komplikationen als Folge rezidivierender Vorfälle von Hyperglykämie zu entwickeln. Es ist bekannt, dass sie ein höheres Auftreten von Retinopathie und Blindheit, von Nephropathie und Nierenversagen, von Neuropathie und Amputationen, von Vaskulopathie und kardiovaskulärer Erkrankung als Gruppe zeigen. Diabetes wird daher als wichtiges Gesundheitsproblem betrachtet. Die Erkrankung wird bei mehr als 5 Prozent der westlichen Bevölkerung diagnostiziert. Ihr Einfluss auf die Lebensqualität von jedem Patienten variiert, dauert jedoch das ganze Leben (Report of the Expert Committee an the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus [Bericht des Expertenkomitees über die Diagnose und Klassifizierung von Diabetes Mellitus], Diabetes Care 20, 1183–1197, 1997).
Derzeit wird eine Vielzahl von Strategien in dem Versuch untersucht, Möglichkeiten zu finden, die das Fortschreiten der Erkrankung in irgendeinem der präklinischen oder klinischen Stadien aufhalten. Einige sind auf pankreatische beta-Zellen gerichtet mit dem Ziel, eine funktionale beta-Zellmasse wiedereinzusetzen, die dazu ausreicht, wenigstens teilweise einen endogenen Kontrollmechanismus wiederaufzubauen, in dem Insulin als Funktion des metabolischen Bedarfs freigesetzt wird. Es gibt im Wesentlichen zwei Möglichkeiten, dieses Ziel zu erreichen. Die erste beinhaltet eine Implantation fremder beta-Zellen, um die endogene beta-Zellpopulation auszutauschen oder zu ergänzen. Es wurde gezeigt, dass sie den diabetischen Zustand in Patienten verbessert, die vollständig ihre endogene beta-Zellmasse verloren haben (Warnock et al., Diabetologia 35: 89–95, 1992; Ricordi et al., Transplantation 53: 407–414, 1992; Gores et al., Lancet 341: 19–21, 1993; Schare et al., Transplantation 51: 76–85, 1991). Die zweite besteht aus dem Verabreichen von Wirkstoffen, die die endogene funktionale beta-Zellmasse erhöhen, indem sie entweder eine Neubildung von beta-Zellen induzieren, was ihr Überleben verlängert, oder ihre homöostatische Funktion verbessern. Beide Strategien erfordern die Verfügbarkeit von großen Mengen von beta-Zellen entweder als Zelltransplantate zur Implantation oder als Testmodell zum Screenen und Entwickeln neuer Wirkstoffe im Labor.
Die Anzahl an Patienten, die von einem beta-Zelltransplantat profitieren könnten, wird zurückhaltend auf 0,5 Prozent der Gesamtbevölkerung geschätzt, was in hohem Maße die Anzahl an Kandidaten für andere Arten von Transplantaten übersteigt. Es ist auch klar, dass die Entwicklung von Wirkstoffen, die auf die beta-Zellen wirken, ein ausgiebiges präklinisches Screenen und Testen beinhaltet, für das große Mengen an normalen Zellen erforderlich sind. Bislang gibt es noch keine Quelle für beta-Zellen, die in geeigneter Weise beide Erfordernisse erfüllen kann. Humane Pankreata wurden zum Erzeugen von beta-Zellzubereitungen für Transplantationen sowie für in vitro-Studien verwendet, die Anzahl an Spenderorganen reicht jedoch größtenteils nicht aus; zudem schränken Kriterien für die Spende humaner Organe ihre Verwendung für die Entwicklung von Wirkstoffen. Diese Einschränkungen erhöhen den Bedarf danach, beta-Zellen aus anderen Spezies zu erzeugen.
Unter den höheren Säugern werden Schweine als potentiell nützliche Quelle für beta-Zellzubereitungen in Betracht gezogen, da ihrer Verwendung für medizinische Anwendungen weniger ethische Hindernisse als bei Primaten oder anderen Haustieren entgegenstehen, weil Schweine relativ leicht zu züchten sind und Schweineinsulin humanem Insulin sehr ähnlich ist. Es wurden Verfahren entwickelt, Inseln und Gewebezubereitungen aus fötalen, neonatalen und adulten Schweinepankreata zu isolieren. Diese Zubereitungen können einen diabetischen Zustand in immun-inkompetenten und in immun-kompetenten Mäusen normalisieren (Korsgren et al., Surgery 113, 205–214, 1993; Korbutt et al., J. Clin. Invest. 97, 2119–2129, 1996; Thomas et al., Transplantation 67: 846–854, 1999; Lu et al., Xenotransplantation 5, 154–163, 1998). Fötale Schweineinselzubereitungen wurden bereits in diabetische Patienten transplantiert, jedoch ohne Erfolg (Groth et al., Lancet 344, 1402–1404, 1994). Es ist noch nicht bekannt, ob und wenn wie erfolgreich eine Heterotransplantation bei Menschen ausgeführt werden kann. Die Verwendung reaggregierter beta-Zellzubereitungen mit ausgewählter Größe und Zellzusammensetzung könnte bei einer Suche nach solchen Zuständen helfen. Unsere Studien in Nagetieren haben gezeigt, dass gereinigte endokrine Inselaggregate eine geringere Immunogenität als Allotransplantate zeigen als intaktes Inselgewebe (Pipeleers et al., Diabetes 40, 908–919, 1991; Pipeleers et al., Diabetes 40, 920–930, 1991; Pipeleers-Marichal et al., Diabetes 40, 931–938, 1991, Pipeleers et al., Diabetologia 34, 390–396, 1991). Sie veranschaulichen auch, wie Schwankungen in der Zellzusammensetzung die metabolische Kapazität der Transplantate beeinflussen (Keymeulen et al., Diabetologia 40: 1152–1158, 1997; Keymeulen et al., Diabetes 45, 1814–1821, 1996). Obwohl diese Versuche die Nützlichkeit zusammengesetzter beta-Zelltransplantate im Labor zeigten, boten sie keine geeignete Methodik für klinische Implantationen. Die Verfahren, die wir zum Zusammensetzen der beta-Zelltransplantate von Ratten verwendeten, erlauben keine großtechnischen Zubereitungen von endokrinen Pankreaszellen. Sie beinhalten eine vorhergehende Isolierung der Langerhans-Inseln (hierin als Mikroorgane mit einem Durchmesser > 100 μm definiert, die eine Mischung von endokrinen Zelltypen, einschließlich den Insulin produzierenden beta-Zellen einschließen) und damit das Verwerfen von beta-Zellen, die als einzelne Zellen oder als kleine Zellaggregate vorhanden sind; es wird angenommen, dass sich einzelne beta-Zellen in der Nähe von unreifen endokrinen Zellen, d. h. Zellen, die zu beta-Zellen differenzieren können, befinden. Als Folge dieses Entfernens ist über diese beta-Zellen und die unreifen endokrinen Zellen wenig bekannt. Ihr relativer Anteil (in Bezug auf die in den Inseln enthaltenen Mengen) ist jedoch während früher Lebensphasen nicht signifikant (In't Veld et al., Diabetologia 35: 272–276, 1992); in dem humanen Pankreas bleiben sie während des gesamten adulten Lebens zahlreich (Bouwens und Pipeleers, Diabetologia 41: 629–633, 1998). Da die Migration und Assoziierung von endokrinen Pankreaszellen in typische Inselstrukturen als ein Schritt der Reifung betrachtet wird (Pictet und Rutter, Entwicklung des ambryonischen Pankreas. In: Steiner DF, Freinkel N (Hrsg.) Handbook of Physiology, Abschnitt 7, Endocrinology Ausg. I: Endocrine Pancreas, Baltimore: Williams & Wilkin, 1972, S. 25–66), können die endokrinen Zellen, die nicht in diesen Mikroorganen auftreten, als „unreif" definiert werden. Obwohl die Eigenschaften der unreifen beta-Zellen und der unreifen endokrinen Zellen nicht sehr gut charakterisiert wurden, unterscheiden sie sich wahrscheinlich von denjenigen der „Inseln", die unter dem Einfluss ihrer typischen Mikroanatomie und der benachbarten endokrinen Zellen reiften (Orci und Unger, The Lancet 2: 1243–1244, 1975; Pipeleers, Experientia 40: 1114–1126, 1984; Pipeleers, Diabetologia 30: 277–291, 1987). Die Funktionen der Inseln werden als für reife beta-Zellen typisch angesehen; reife beta-Zellen sind größer als ihre unreifen Gegenstücke (Pipeleers, unveröffentlichte Beobachtungen). Es gibt einen indirekten Beweis, dass die „unreifen" beta-Zellen ein Wachstum der beta-Zellmasse erreichen können. Der Verlust dieser Zellen während des Isolierungsprozesses führt daher erwartungsgemäß zu einer gereinigten endokrinen Zellzubereitung, die nur für die reife Zellpopulation charakteristisch ist, die nur eine Subpopulation der beta-Zellen enthält und ein geringes Wachstumsvermögen zeigt, drei Folgen, die unvorteilhaft sind, wenn die isolierten Zellen für die oben genannten Strategien, nämlich die Konstruktion von beta-Zelltransplantaten und die Entwicklung von Wirkstoffen, die die Erhöhung der funktionalen beta-Zellmasse anstreben, verwendet werden sollen.
Um diese Probleme zu umgehen, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren gemäß Anspruch 1 bereit. Bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens gemäß der Erfindung sind in den Unteransprüchen 2 bis 14 beschrieben. Die Zubereitungen an sich und ihre Verwendung sind Gegenstand der Ansprüche 15 bis 24.
In dem breitesten Aspekt der Erfindung wird ein in vitro-Verfahren für die Zubereitung von endokrinen Säugerpankreaszellen bereitgestellt, welches den Schritt des Dissoziierens des gesamten Pankreasorgans, einschließlich der Langerhans-Inseln, in Zellen und kleinen Zellaggregaten, ohne Isolieren der Langerhans-Inseln in der Form, in der sie in dem intakten Pankreas auftreten, und ferner den Schritt des, bevorzugt durch Gegenfluss-Elutriation, Entfernens von Partikeln, die größer als 100 μm sind, umfasst.
Intaktes Pankreasgewebe ist hierin als das Pankreasorgan oder jedes seiner Segmente nach der Dissektion aus dem Körper des Säugers definiert.
Eine endokrine Pankreaszelle ist als Zelle definiert, die in intaktem Pankreasgewebe gefunden wird oder aus diesem isoliert wurde und die einen endokrinen Marker, d. h. ein Molekül, das in endokrinen, jedoch nicht in exokrinen Zellen identifiziert wurde, exprimiert. Dieser Marker kann einem Bestandteil eines endokrinen sekretorischen Vesikels oder irgendeinem anderen Zellbestandteil entsprechen.
Unreife endokrine Zellen sind durch eines oder mehrere der folgenden Kriterien definiert: 1) ein zellulärer Phänotyp, der für fötale endokrine Zellen, jedoch nicht für adulte endokrine Zellen charakteristisch ist, zum Beispiel das Vorhandensein einer Gastrin-Immunreaktivität oder einer Synaptophysin-Immunreaktivität, ohne eine positive Reaktion auf irgendeines der adulten pankreatischen Hormone, d. h. Insulin, Glucagon, Somatostatin, pankreatischem Polypeptid; 2) das Auftreten in pankreatischem Gewebe als Einheit von maximal vier endokrinen Zellen; 3) die Expression eines Markers, der nicht in homologen endokrinen Zellen von adulten pankreatischen Inseln gefunden wird, wie beispielsweise Cytokeratin 19 (CK19; human) oder Cytokeratin 7 (CK7; Schwein). Unreife beta-Zellen zeigen üblicherweise eine signifikant kleinere Zellgröße als adulte beta-Zellen (kleiner als der mittlere Durchmesser von adulten beta-Zellen minus drei Standardabweichungen) und eine schlechte Responsivität auf einen maximalen Glucosestimulus (< 3-fache Stimulierung der Insulinfreisetzung); die Größe dieser Zellen nimmt unter Reifebedingungen zu.
Reife endokrine Zellen sind durch ihre Position in pankreatischen Inseln definiert, die bekanntermaßen eine typische Vaskularisierung zeigen (Bonner-Weir und Orci, Diabetes 31, 883–889, 1982; Pictet und Rutter, In: Steiner DF, Freinkel N (Hrsg.) Handbook of Physiology, Abschnitt 7, Endocrinology Ausg. I: Endocrine Pancreas, Baltimore; Williams & Wilkins, 1972 S. 25–66).
Reife beta-Zellen sind durch ihre durch Glucose regulierte Biosynthese und Freisetzung von Insulin und ihre Speicherung und Freisetzung von Insulin, das zu > 90 Prozent in seine reife Form verarbeitet wird, charakterisiert.
Im Gegensatz zu den vorher beschriebenen und standardmäßig verwendeten Verfahren für die Isolierung pankreatischer Inseln (Lacy PE und Kostianovsky M, Diabetes 16: 35–39, 1967) strebt die Erfindung nicht das Isolieren der „Langerhans-Inseln" in der Form, in der sie in dem intakten Pankreas vorkommen, an. Stattdessen wird das gesamte pankreatische Organ, einschließlich der „Langerhans-Inseln" in einzelne Zellen und kleine Zellaggregate dissoziiert, bevor Schritte zum Isolieren der reifen und unreifen endokrinen Zellen unternommen werden.
Durch Auswählen des Alters des Pankreas und der experimentellen Bedingungen kann das Verfahren in vorteilhafter Weise reife oder unreife endokrine Zelle oder ihre Subtypen liefern. Die Dissoziation spät-fötaler Schweinepankreata, die Elutriation einzelner Zellen aus diesem Dissoziat und die Kultur der Elutriationsfraktion unter bestimmten Bedingungen erlaubt eine großtechnische Reinigung der unreifen endokrinen Zellen, sowohl der beta- als auch der alpha-Zelltypen. Die Erfindung beschreibt die bestimmten Bedingungen, unter denen diese Zubereitung 1) zum Erzeugen von Transplantaten mit einem wesentlichen Potential zu beta-Zellwachstums in vivo, 2) zum Konstruieren und Durchführen von Screening-Tests nach Wirkstoffen in vitro verwendet werden kann. Allgemein stellt es ein Verfahren zum Erzeugen – aus Pankreata verschiedenen Alters und unterschiedlicher Spezies – von endokrinen Zellzubereitungen ausgewählter Zellzusammensetzungen und -eigenschaften für eine Verwendung als Auto-, Allo- und Heterotransplantate sowie für das Screenen und Beurteilen von Wirkstoffen im Labor bereit.
Beschreibung der Erfindung
I Allgemeine Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung beschreibt die Produktion von Zubereitungen von reifen und unreifen endokrinen Zellen aus dem Säugerpankreas zur Verwendung bei der Behandlung von Diabetes uns insbesondere die Produktion von beta-Zelltransplantaten mit Wachstumspotential und die Bereitstellung von Versuchsmodellen, in denen Wirkstoffe auf ihre therapeutischen Effekte auf die funktionale beta-Zellmasse gescreent werden können.
Das Verfahren kann zur großtechnischen Produktion von endokrinen Zellen aus Pankreata verschiedener Spezies, insbesondere aus fötalen Pankreata in der Spätschwangerschaft und ganz besonders aus fötalem Schweinepankreas verwendet werden, wobei Zubereitungen mit definierter Größe und Zellzusammensetzungen, ausgewählter Reinheit in beta- und alpha-Zellen, vorhersagbarer biosynthetischer Kapazität von Insulin und der Fähigkeit von beta-Zellwachstum erzielt werden.
Diese bestimmte Anwendung unter Verwenden von spätem fötalem Schweinepankreas bietet im Vergleich zu postnatalen Zubereitungen aus höheren Spezies die folgenden Vorteile:

1. ein geringeres Infektionsrisiko
2. eine höhere Reinheit der endokrinen Zellen
3. eine höhere Anzahl an endokrinen Zellen pro technischer Vorgehensweise
4. eine unterschiedliche Kapazität für das Wachstum und ein längeres Überleben der beta-Zellmasse
5. reproduzierbarere funktionelle Eigenschaften

Im Vergleich mit anderen Verfahren für die Isolierung fötaler endokriner Zellen bietet das Verfahren die folgenden Vorteile:

1. eine höhere Reinheit der endokrinen Zellen und ihrer Subtypen
2. eine höhere Anzahl an endokrinen Zellen pro Organ
3. die Fähigkeit, bestimmte endokrine Zell(sub)typen auszuwählen und finale Zubereitungen entsprechend der metabolischen Anforderungen zusammenzustellen
4. die Verfügbarkeit unreifer endokriner Zellen

Diese Eigenschaften machen das Verfahren für 1) die Zubereitung von Zelltransplantaten für eine Transplantation in diabetischen Patienten und 2) die Zubereitung von Zellzubereitungen zum Screenen nach Wirkstoffen, die die funktionale beta-Zellmasse regulieren, nützlich.
II Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die am meisten bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens umfasst sechs Schritte, die zusammen endokrine Pankreaszellzubereitungen mit ausgewählter Größe, Zusammensetzung und Reife erzielen:

1. Dissoziation intakten Pankreasgewebes zu dem Punkt, an dem alle Gewebe, einschließlich der Langerhans-Inseln, bevorzugt in Zellaggregaten von < 100 μm dispergiert sind.
2. Auftrennung des pankreatischen Dissoziats entsprechend der Partikelgröße unter Verwenden von Gegenstrom-Elutriation, um einzelne Zellen mit einer Größe von 6 bis 15 μm (einschließlich unreifer endokriner Zellen) und kleine Aggregate mit einer Größe von 15 bis 100 μm (einschließlich reifer endokriner Zellen) auszuwählen
3. Eliminierung azinöser Zellen aus ausgewählten Fraktionen mittels Dichtegradientenzentrifugation.
4. Anreicherung der reifen oder unreifen endokrinen Zellen durch Kultivierung in speziell formulierten, serumfreien Medien.
5. Reinigung reifer oder unreifer endokriner alpha- oder beta-Zellen und ihrer Vorläufer mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung.
6. Zusammenstellung endokriner Zellzubereitungen mit ausgewählter Größe, Zusammensetzung und Reife.

Die Schritte 1 bis 4 werden zum Reinigen von reifen und unreifen endokrinen Zellen von 1 bis 5 Prozent intaktem Gewebe bis zu einem Minimum von 60 Prozent und bevorzugt 90 Prozent verwendet. Der Schritt 5 ist notwendig, wenn eine weitere Reinigung in (un)reife endokrine, mit alpha- oder beta-Zellen angereicherte Zubereitungen erforderlich ist. Diese Vorgehensweise erlaubt eine großtechnische Isolierung von endokrinen Pankreaszellen, während sie gleichzeitig die Möglichkeit zum Auswählen von Zellen gemäß den experimentellen Anforderungen bietet. Eine höhere Reinheit der intakten endokrinen Zellen ist mit einer geringeren Immunogenizität verbunden (Pipeleers et al, Diabetes 40, 920–930, 1991; Pipeleers-Marichal et al., Diabetes 40, 931–938, 1991; Pipeleers et al., Diabetologia 34: 390–396, 1991), der Einschluss unreifer endokriner Zellen oder beta-Zellen ist mit einem höheren Wachstumspotential verbunden, die Zugabe von alpha-Zellen erhöht und begünstigt das Überleben und die Funktion von beta-Zellen (Pipeleers, Diabetologia 30, 277–291, 1987; Ling et al., Diabetologia 37, 15–21, 1994; Keymeulen et al., Diabetologia 40: 1152–1158, 1997) standardisierte beta-Zellzubereitungen sind für standardisierte metabolische Effekte bei Diabetes erforderlich (Keymeulen et al., Diabetologia 41: 452–459, 1998), gereinigte Zellpopulationen sind für das Testen von Wirkstoffen erforderlich (Pipeleers et al., Endocrinology 117: 806–816, 1985; Gorus et al., Diabetes 37, 1090–1095, 1988).
Schritt 1
Die Zubereitung von endokrinem Pankreasgewebe wird klassich durch Collagenaseverdau der Pankreasdüsen und durch Abtrennen einer Fraktion, die an Langerhans-Inseln angereichert ist, unter Verwenden von Verfahren, die größere (> 100 μm) Gewebepartikel (durch manuelle Isolierung unter dem Dissektionsmikroskop) oder Partikel mit geringerer Dichte (< 1,07 g/ml) isolieren, durchgeführt. Diese Fraktionen sind an Langerhans-Inseln angereichert und können zum Reinigen von endokrinen beta-Zellen und alpha-Zellen verwendet werden (Pipeleers et al., Endocrinology 117: 806–816, 1985). Diese Verfahren weisen den Nachteil auf, dass sie zum Verlust von (unreifen) endokrinen Zellen führen, die in kleineren Gewebepartikeln oder/und in Partikeln mit höherer Dichte enthalten sind. Dieser Verlust kann in quantitativer und qualitativer Sicht signifikant sein, da es den Verlust von (unreifen) Zelle und kleinen Zellagggregaten bedeuten wird, die für das Wachstum der beta-Zellmasse wichtig sind. Wir haben daher eine andere methodische Strategie ausgewählt, die mit der Dissoziation von intaktem Pankreasgewebe bis zu dem Punkt, an dem jedes Gewebe, einschließlich der Langerhans-Inseln, in Partikel < 100 μm zerlegt wird, startet. Diese Partikel bilden dann die Basis für alle nachfolgenden Verarbeitungsschritte.
Die Verwendung dieser Strategie erlaubt die Isolierung größerer Anzahlen von endokrinen Zellen, einschließlich reifer endokriner und unreifer beta-Zellen, dann den klassischen auf „Langerhans-Inseln" basierenden Ansatz.
In Schritt 1 ist das pankreatische Gewebe während und nach einer Inkubation, zunächst mit Collagenase für maximal 30 Minuten und dann mit einem Calciumchelator EDTA (oder EGTA) in einem calciumfreien Medium, das DNase enthält, für maximal 30 Minuten, mechanisch dispergiert. Die Collagenase-Konzentrationen werden pro Enzym-Charge bestimmt und entsprechend auf Basis eines Zersetzens des intakten Gewebes in Partikel mit einem Durchmesser < 500 μm innerhalb von 20 Minuten und Freihalten dieser Zubereitung von Fasern und anschließendem Zellverklumpen festgesetzt. Das calciumfreie Medium verringert die Zelladhäsion und erlaubt eine schonende Dissoziation des endokrinen Gewebes in einzelne Zellen und kleine Zellaggregate. Unreife endokrine Zellen werden in Partikeln von kleiner als 100 μm und, in fötalen Pankreata, insbesondere als einzelne Zellen mit einem Durchmesser von 6 bis 15 μm vorhanden sein. Die meisten reifen endokrinen Zellen werden in Partikeln mit einem Durchmesser von 15 bis 100 μm auftreten. Partikel, die größer als 100 μm sind, werden durch einen 100 μm-Screen oder durch Gegenstrom-Elutriation, in denen die kleineren Partikel mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 225 ml/min und einer Rotorgeschwindigkeit von 250 rpm (Beckman-Zentrifuge J-6B, Rotor JE10x) gesammelt werden, entfernt.
Schritt 2
In diesem Schritt werden einzelne unreife endokrine Zellen von aggregierten Zellen, einschließlich reifer endokriner Zellen, abgetrennt, während die Zelltrümmer verworfen werden. Er basiert auf unserer Feststellung, dass die Anwendung von Schritt 1 auf das fötale Gewebe zu der Freisetzung von unreifen endokrinen Zellen als einzelne Einheiten mit einem Durchmesser von 6 bis 15 μm führt. Er wird durch unsere Anpassung der Technik von Gegenstrom-Elutriation, um Partikel mit einem Durchmesser von 6 bis 15 μm von solchen mit einem Durchmesser von 15 bis 100 μm abzutrennen, erreicht. Die Partikelsuspension wird mit 25 ml/min in einen JE10x-Elutriator von Beckman (Palo Alto, CA), der in eine Beckman J6B-Zentrifuge bei 1500 rpm gestellt wurde, gepumpt, wodurch die Zelltrümmer herausgespült werden und Partikel > 6 μm in der Kammer gehalten werden. Die Geschwindigkeit der Pumpe wird dann auf 190 ml/min erhöht, um die Partikel mit einem Durchmesser von 6 bis 15 μm aus der Rotorkammer zu drücken: diese Fraktion wird gesammelt (< 15 μm-Fraktion) und enthält die einzelnen unreifen endokrinen Zellen. Die Geschwindigkeit der Zentrifuge wird dann auf 0 rpm verringert, so dass der Inhalt des Rotors als 15–100 μm-Fraktion gesammelt werden kann. Wenn dies auf eine < 100 μm-Fraktion eines Dissoziats von fötalen Schweinepankreata aus der Spätschwangerschaft angewendet wird, zeigen alle endokrinen Zellen in der < 15 μm-Fraktion Markierungen von Unreife (Mangel an typischer Glucose-Responsivität, Expression des Marker CK7 von duktalen Zellen).
Schritt 3
Die beiden Fraktionen werden nach der Gegenstrom-Elutriation isoliert, mit azinösen Zellen, die eine höhere Dichte (> 1,070 g/ml) als endokrine Zellen zeigen, kontaminiert. Dichtegradientenzentrifugation wird zum Verringern des Kontaminationsniveaus verwendet: die Zellfraktionen von fatalen Schweinepankreata aus der Spätschwangerschaft werden diskontinuierlichen Percoll-Gradienten mit Dichten von 1,040 g/ml und 1,075 g/ml unterworfen. Mit endokrinen Zellen angereicherte Zubereitungen werden in der Zwischenphase der Dichteschichten mit 1,40 und 1,075 g/ml gesammelt; sie erzielen Zubereitungen mit > 40 Prozent intakten endokrinen Zellen. Die endokrinen Zellen in der Zwischenphase aus der 6–15 μm-Fraktion sind alle unreif; ihre Anzahl beträgt stetig zwischen 1 und 3 × 10⁷ Zellen pro fötalem (Schweine-)Pankreas.
Unter Berücksichtigung der mittleren Anzahl an Föten (n = 9) pro Sau – und daher pro Isolierungsversuch – beträgt die Ausbeute an endokrinen Zellen mindestens 10⁸ endokrine Zellen pro Isolierung mit einer Reinheit von > 40%. Die Vorgehensweise bietet daher eine großtechnische Isolierung von endokrinen Zellen an. Diese Ausbeute ist höher als diejenige aus humanem Spenderpankreas; sie wird ebenso stetig reproduziert.
Am Ende von Schritt 3 enthalten die Zwischenphasen einen Anteil nicht-granulierter Zellen, von denen mehrere mit endokrinen Zellen verbunden sind. Diese nicht-granulierte Zellpopulation – oder eine Fraktion davon – trägt durch unreife endokrine Zellen, d. h. Zellen, die in beta-Zellen differenzieren können, zu dem Wachstum der beta-Zellmasse bei.
Schritt 4
Die beiden aus Schritt 3 gesammelten Fraktionen, nämlich die Zwischenphase von < 15 μm und die Zwischenphase von 15–100 μm, werden an unreifen und reifen endokrinen Zellen durch Kultivieren in speziell formulierten Medien angereichert:

– für unreife endokrine Zellen ist dieses Medium serumfreies HAM's F10 mit Albumin (max. 0,5%) als Protein und Supplemente von Nicotinamid (5 mM), Glucocorticoiden (max. 10^–6 M Hydrocortison), Isobutylmethylxanthin (IBMX, 50 μM); im Vergleich zu den für die Kultivierung von Langerhans-Inseln verwendeten Medien erhält dieses Medium das Überleben von unreifen endokrinen Zellen und erlaubt ihre erhöhte Speicherung von Hormonen während einer verlängerten Kultivierung (2-fache Erhöhung bei einem zellulären Insulingehalt nach 4 Kulturwochen); der Grad der Reife und der Differenzierung wird durch Zusetzen von Serum und Erhöhen der Konzentration an Calcium auf 2 mM unterdrückt; diese letzteren Supplemente können zum Zubereiten von Fraktionen mit mehr Vorläuferzellen von beta-Zellen verwendet werden.
– für reife endokrine Zellen ähnelt das Kulturmedium demjenigen, das bereits für humane beta-Zellen beschrieben wurde (Ling und Pipeleers, J. Clin. Invest. 98, 2805–2812, 1996), nämlich serumfreies HAM's F10 mit Albumin (0,5%) und IBMX (50 μM).

Nach 4-tägiger Kultur der Zwischenphase < 15 μm liegt der Anteil an zerstörten Zellen reproduzierbar unter 10 Prozent, der an intakten Zellen über 70 Prozent, der an nicht-granulierten Zellen zwischen 10 und 25 Prozent. Die beta-Zellen synthetisieren Proinsulin mit einer Rate von mindestens 10 fmol/10³ beta-Zellen/Stunde. Diese Qualitätskontrolltests für die zelluläre Zusammensetzung und Funktion werden durch mikrobiologische und toxikologische Kontrolltests erweitert.
Für die Zwecke humaner Implantationen stammen die Quellentiere aus Herden, die entsprechend der Normen der Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA), wie sie von dieser Assoziation definiert wurden (Laboratory Animals 32: 1–17, 1998) und mit den biologischen Sicherheitsstandards, wie sie von der US Food and Drug Administration vorgeschlagen wurden (Federal Register 49920–49932, August 1996) übereinstimmen, von spezifischen Pathogenen frei sind.
Die oben beschriebenen Zellzubereitungen können zur Transplantation und Verbesserung von Diabetes in Mäusen verwendet werden; es wurde gezeigt, dass sie ein Wachstum ihrer beta-Zellmasse (siehe Beispiel V) erreichen. Sie können zum Reinigen zusammengesetzter Zell(sub)typen (Schritt 5) und zum Konstruieren von Versuchsmodellen einzelner und aggregierter Zellen mit ausgewählter Größe, Zusammensetzug und Reife (Schritt 6) verwendet werden.
Schritt 5
Die aus Schritt 4 erhaltenen Zubereitungen können unter Verwenden von Trypsin und DNase in einzelne Zellen dissoziiert werden. Die Zellsuspension wird dann einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (fluorescence-activated cell sorting, FACS) unter Verwenden von Vorwärtsstreulicht (forward scatter, FSC), Seitwärtsstreulicht (sidewards scatter, SSC) und Fluoreszenz (FL) mit einer Anregung bei 488 nm und einer Emission bei 520 bis 540 nm als Unterscheidungsparameter unterworfen. Populationen von Zell(sub)typen werden in Bezug auf die Lokalisierung der intakten, nicht-granulierten Zellen, einschließlich unreifer endokriner Zellen unterschieden (geringes FSC, geringes SSC, geringes FL); bei höherem SSC: Anreicherung in alpha-Zellen; bei höherem FSC und FL: Anreicherung in beta-Zellen, wodurch beta-Zell-Vorläufer und unreife beta-Zellen geringeres FSC und FL als reife beta-Zellen zeigen.
Die Intervalle werden für die Reinigung dieser Zell(sub)typen als einzelne Zellen festgesetzt.
Schritt 6
Die nach Schritt 5 gesammelten Zell(sub)typen können als einzelne Zellen auf mit Polylysin beschichteten Kulturplatten unter Verwenden der in Schritt 4 für unreife oder reife endokrine Zellen definierten Medien kultiviert werden. Die nicht-granulierten Zellen mit den unreifen endokrinen Zellen (die die beta-Zell-Vorläufer enthalten) werden in dem Medium für unreife endokrine Zellen mit 10 Prozent fötalem Serum kultiviert.
Die unter Schritt 4 und 5 beschriebenen Zellen können auch durch Inkubation unter Rotationsschütteln in einem CO₂-Inkubator unter Verwenden der in dem vorhergehenden Abschnitt beschriebenen Medien und mit Zelldichten von 10⁴ bis 2 × 10⁵ pro cm² Oberfläche der für die Suspensionskulturen verwendeten bakteriologischen in Partikel mit ausgewählter Größe reaggregiert werden. Zellaggregate mit zunehmender Größe werden durch Erhöhen der Zelldichte und Erhöhen der Geschwindigkeit und Dauer des Rotationsschüttelns erhalten. Aggregate mit verschiedener Zusammensetzung können auch durch Mischen gereinigter Zellpopulationen in verschiedenen Anteilen gebildet werden.
Die in Schritt 4 und 5 erhaltenen Zubereitungen können für Transplantationen und für Kurz- oder Langzeitkulturen verwendet werden. Sie sind bei der Behandlung von Diabetes, nämlich als Insulinquelle in diabetischen Empfängern und als in vitro- oder in vivo-Modell für das Screenen nach Wirkstoffen nützlich.
Die in vitro zusammengesetzten Transplantate und die kultivierten Zellzubereitungen können einer funktionalen Analyse sowie den mikrobiologischen Qualitätskontrolltests, die von Aufsichtsbehörden gefordert werden, unterzogen werden. Die Zellzubereitungen können daher, während sie in Kultur gehalten werden und vor der tatsächlichen Implantation in diabetische Patienten, auf ihre Sicherheit und Effizienz gescreent werden.
BEISPIELE
Beispiel 1
Massenisolierung und Reinigung fötaler Schweinepankreaszellen
Schwangere Säue mit 108- und 114-tägiger Schwangerschaft wurden anästhetisiert und ihre Föten wurden operativ unter sterilen Bedingungen in einem Operationsraum entfernt, die Föten (Kopf-Steiß-Länge 28 ± 2 cm (Mittelwert ± Standardabweisung)) wurden enthauptet und die Pankreata durch Dissektion unter aseptischen Bedingungen entfernt und in sterilem Isolierungsmedium gesammelt (Pipeleers et al., Endocrinology 117: 806–816, 1985). Bei den letzten 100 Dissektionen wurden im Mittel neun Föten pro schwangerer Sau gesammelt. Das Gewebe wurde mit einer Schere in kleine Fragmente von annähernd 1 mm³ Größe geschnitten.
Nach Waschen der Gewebefragmente mit Isolierungsmedium wurden die Fragmente in 200 ml Isolierungsmedium mit 0,3 mg/ml Collagenase-P (Roche) (Raumtemperatur) suspendiert und dann 15 Minuten lang geschüttelt. Der Gewebeverdau wurde durch einen 500 μm-Filter filtriert und das Filtrat durch eine Lösung mit einer Dichte von 1,040 (6 Minuten bei 1500 rpm) zentrifugiert worauf das Pellet aufbewahrt wurde. Das Material, das auf dem 500 μm-Filter zurückblieb, wurde dann weitere 15 Minuten mit Collagenase inkubiert und dann filtriert und wie vorher zentrifugiert, worauf das Pellet erneut aufbewahrt wurde. Das Material, das das zweite Mal auf dem Filter blieb, wurde in einem calciumfreien Dissoziationsmedium resuspendiert (Pipeleers und Pipeleers-Marichal, Diabetologia 20: 654–663, 1981) und während einer 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur dispergiert, bevor es wie oben beschrieben filtriert und zentrifugiert wird; dieses Dissoziationsverfahren wurde an dem Material, das auf dem Filter zurückblieb, wiederholt.
Die vier Pellet-Fraktionen wurden in Isolierungsmedium, das 2% Neugeborenenkälberserum (NCS) enthielt, suspendiert und durch einen 100 μm-Filter filtriert, um große Zellcluster zu entfernen; das Filtrat wurde nun aus einzelnen Zellen und kleinen (< 100 μm Durchmesser) Zellaggregaten zusammengesetzt. Diese Zellsuspension wurde in die Kammer eines JE-10X-Gegenstrom-Elutriationsrotors (Beckman Instruments Inc., Palo Alto, CA) gepumpt und mit 1500 rpm und einer Pumpeneinstellung von 190 ml/min zentrifugiert. Unter diesen Bedingungen wurden Partikel mit einem Durchmesser von < 15 μm aus der Kammer gespült, die so Partikel mit einer großen Größe (15 bis 100 μm) zurückbehielt. Die elutrierten Fraktionen wurden zentrifugiert und das Pellet wurde in einem Medium mit einer Dichte an 1,040 resuspendiert und oben auf ein Medium mit einer Dichte von 1,075 gelegt; nach einer 20-minütigen Zentrifugation bei 2500 rpm wurde die Zwischenphase zwischen 1,040 und 1,075 mit einer silikonisierten Pasteur-Pipette entfernt und mit 2% NCS enthaltendem Isolierungsmedium gewaschen. Die Zellen wurden in einer Bürker-Zählkammer ausgezählt.
Aus der elutrierten < 15 μm-Fraktion wurden zwischen 30 und 50 Millionen Zellen für jeden fötalen Pankreas erhalten. Diese Zellen waren einzelne Zellen (> 60%); sie wurden auf 14 cm große bakteriologische Petrischalen, die HAM's F10 mit 110 mg/% Glucose, Penicillin 0,075 mg/ml, Streptomycin 0,1 mg/ml, 2 mM Glutamin, 2 mM CaCl₂, 50 μM Isobutylmethylxanthin (IBMX), 1 μM Hydrocortison, 5 mM Nicotinamid und 0,5% Rinderserumalbumin, mit 0,5 bis 1,0 Millionen Zellen pro ml Medium enthielten, ausplattiert. Nach 16-stündiger Kultur bei 37°C und 5% CO₂ in Luft wurden die Zellen gewaschen und das Medium durch den gleichen Typ HAM's F10 wie zuvor, außer mit einer geringeren Calciumkonzentration (0,2 mM) ausgetauscht. Unter diesen Bedingungen wurden die Zellen bis zu 6 Wochen lang in einer Suspensionskultur gehalten. Während der Kultivierung reaggregierten die Zellen spontan; die Größe des Aggregats wurde durch Erhöhen der Zelldichte in dem Medium und durch Rotation erhöht.
Während der ersten 4 Tage der Kultivierung verringerte sich die Gesamtanzahl der Zellen um 40%, vorwiegend als Folge eines Aufschlusses zerstörter Zellen und azinöser Zellen. Die Zellzubereitung wurde nun aus mindestens 70 Prozent endokrinen Zellen (mit 30 bis 50% Insulin enthaltenden beta-Zellen, 15 bis 45% Glucagon enthaltenden alpha-Zellen, 5 bis 10% Somatostatin enthaltenden D-Zellen), 10 bis 25% nicht-granulierten Zellen (d. h. Zellen, die nicht die typischen endokrinen sekretorischen Körnchen enthalten, wie sie unter dem Elektronenmikroskop zu sehen sind), < 5% exokrinen Zellen und < 10% toten Zellen zusammengesetzt (1). Der Insulingehalt dieser Zellzubereitung betrug von 0,3 bis 1,5 μg Insulin/μg DNA und von 4 bis 7 ng pro tausend beta-Zellen. Dieser zelluläre Insulingehalt ist fünffach kleiner als in den reifen beta-Zellen. Die Unreife der beta-Zellen wird auch durch ihre Positivität auf den Marker Cytokeratin 7 duktaler Zellen und ihre schlechte sekretorische und biosynthetische Responsivität für Glucose (weniger als 3-fache Stimulation) veranschaulicht. Es wird daher angenommen, dass diese Fraktion unreife beta-Zellen enthält. Andere Zellen in dieser Zubereitung sind auch unreif, da sie alle den Marker Cytokeratin 7 exprimieren; da sie auch für Synatophysin positiv sind, sollte angenommen werden, dass sie zu der endokrinen Linie gehören. Da sich diese Zellen nicht mit den typischen endokrinen, sekretorischen Vesikeln präsentieren, sollte angenommen werden, dass sie unreife endokrine Zellen repräsentieren. Solche unreifen endokrinen Zellen sind daher Vorläufer von unreifen beta-Zellen, die in ihrem Zytoplasma die typischen endokrinen sekretorischen Vesikel präsentieren.
Wenn 10 Prozent fötales Kälberserum oder Schweineserum zugesetzt wurden, behielten die Zubereitungen einen höheren Anteil an nicht-granulierten Zellen (bis zu 40%) für längere Kultivierungsdauern bei. Diese Zellen sind für Cytokeratin 7 und für Synatophysin positiv und für Carboanhydrase negativ, was nahe legt, dass diese Fraktion endokrine Vorläuferzellen enthält.
In serumfreiem Medium wurde die Zubereitung vollständig aus endokrinen Zellen, mit einer Mehrheit aus Insulin enthaltenden Zellen (40 bis 60%) zusammengesetzt. Über einen Zeitraum von vier bis zehn Wochen nahm die Größe der beta-Zellen und ihr Insulingehalt schrittweise zu. Wenn Nicotinamid und Glucocorticoide entfernt wurden, erhöhten die Zellen ihre Glucose-Responsivität, wie durch ihre Insulin-sekretorische Aktivität während der Perfusion mit wenig (2,5 mM Glucose) und mehr (5 bis 7,5 mM) Glucose beurteilt wurde. Dieses Anzeichen funktionaler Reifung ging mit einem Verlust der Cytokeratin 7-Färbung einher (2) einher. Die unreifen endokrinen Zellen reifen daher in vitro; sie reifen auch nach einer Transplantation in vivo (siehe unten).
Aus der elutrierten 15–100 μm-Fraktion wurden zwischen 15 und 25 Millionen Zellen für jeden fötalen Pankreas erhalten. Diese Fraktion ist hauptsächlich aus aggregierten Zellen (weniger als 20% einzelne Zellen) zusammengesetzt und enthält daher reife endokrine Zellen. Die Kultivierung in Medium ohne Nicotinamid uns Glucocorticoiden führt zu einer Zubereitung aus 60 bis 80 Prozent aggregierten endokrinen Zellen mit reifen beta-Zellen und 20 bis 30 Prozent nicht-graulierten Zellen.
Beispiel II
Verwendung von fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) zum weiteren Anreichern der Zubereitungen an unreifen oder reifen endokrinen Zellen, insbesondere beta-Zellen
1) Reinigung von Zubereitungen unreifer Zellen, die vorwiegend aus nicht-granulierten Zellen bestehen und unreife endokrine Zellen enthalten
Startzubereitung:

– Elutriationsfraktion < 15 μm
– 4 Tage lang in HAM's F10-Medium, das für unreife Zellen verwendet wird und mit 2% Neugeborenenkälberserum und CaCl₂ bis zu einer Endkonzentration von 2 mM supplementiert worden war.
– dissoziiert in calciumfreiem Medium, das Trypsin und DNase enthielt.
– Zusammensetzung: nicht-granulierte Zellen > 40%; endokrine Zellen 35–50%.

FACS-Bedingungen:

– Analyse auf Seitwärtsstreuung (SSC) und Fluoreszenz bei Anregung mit 488 nm, Emission mit 520 bis 540 nm (FL1)
– Sortierung von R1-, R2- und R3-Intervallen (3a)
– Zellzusammensetzung der erhaltenen Fraktionen: R1 + R2 enthalten > 70% nicht-granulierte Zellen mit einer höheren Fluoreszenz in der R2-Population als Marker für unreife endokrine Zellen R3 enthält > 85% endokrine Zellen

2) Anreicherung an unreifen beta-Zellen
Startzubereitung:

– Elutriationsfraktion < 15 μm
– kultiviert für mindestens sieben Tage in HAM's F 10-Medium, das für unreife Zellen verwendet wird
– Dissoziation in calciumfreiem Medium, das Trypsin und DNase enthielt
– Zusammensetzung der Startzubereitung vor der FACS: > 70% endokrine Zellen.

FACS-Bedingungen:

– Analyse auf Seitwärtsstreuung (SSC) und Fluoreszenz bei Anregung mit 488 nm, Emission mit 520 bis 540 nm (FL-1)
– Sortierung von R1-, R2- und R3-Intervallen (3b)
– Zellzusammensetzung der erhaltenen Fraktionen: R1 enthält > 50% unreife Insulin-positive Zellen R2 enthält > 90% reife endokrine Zellen R3 enthält > 75% Glucagon-positive Zellen

3) Reinigung unreifer beta-Zellen und Glucagon enthaltender Zellen:
Startzubereitung:

– Elutriationsfraktion < 15 μm
– kultiviert für mindestens sieben Tage in HAM's F10-Medium, das für unreife Zellen verwendet wird
– Dissoziation in calciumfreiem Medium, das Trypsin und DNase enthielt
– Zusammensetzung der Startzubereitung vor der FACS: > 75% endokrine Zellen.

FACS-Bedingungen:

– Analyse auf Seitwärtsstreuung und Vorwärtsstreuung
– Sortierung von R1-, R2-, R3-, R4- und R5-Intervallen (3c)
– Zellzusammensetzung der erhaltenen Fraktionen: R1 enthält > 75% Insulin-positive Zellen R3 + R4 enthalten > 90% Glucagon-positive Zellen

Beispiel III
Aus fötalem Schwein stammende beta-Zellen erzeugen Insulin mit einer Rate, die mit derjenigen in adulten humanen beta-Zellen vergleichbar ist
Zubereitungen endokriner Zellen, wie sie in Beispiel I erhalten wurden, werden von den Kulturplatten gesammelt und in Isolierungsmedium gewaschen. Ein Fluoreszenztoxizitätstest (Hoorens et al., J. Clin. Invest. 98, 1568–1574, 1996) gibt weniger als 15% tote Zellen an. Proben mit 25.000 bis 75.000 Zellen werden in 500 μl HAM's F10-Medium, das mit 0,5% Rinderserumalbumin und 25 μCi ³H-Tyrosin (5 μM Endkonzentration) supplementiert worden war, inkubiert. Das Markieren neu synthetisierter Proteine wird in einem Zeitraum von 120 Minuten bei 37°C und 95% O₂/5% CO₂ durchgeführt. Die vollständige Synthese von Proteinen und Proinsulin wurde so, wie bereits beschrieben wurde (Ling und Pipeleers, Endocrinology 134, 2614–2621, 1994) gemessen. Die Daten sind pro 1000 beta-Zellen angegeben. Bei 10 mM Glucose sind die Raten der Insulin-Biosynthese (41 ± 3 fmol pro 10³ beta-Zellen alle 2 Stunden) mit denjenigen in adulten humanen beta-Zellen (37 ± 8 fmol pro 10³ beta-Zellen alle 2 Stunden; p > 0,05) vergleichbar. Bei 0 mM Glucose sind die Raten in beiden Spezies niedriger, die Abnahme beträgt jedoch nur 50% bei fötalen beta-Zellen (4).
Beispiel IV
Fötale Schweine-beta-Zellen ähneln hinsichtlich ihres Glucose-Stoffwechsels und daher bei der nachfolgenden Glucose-Signalgebung eher humanen beta-Zellen – als Rattenbeta-Zellen.
Die Raten der Verwertung und Oxidation von Glucose wurden in Zubereitungen isolierter humaner (HP), fötaler Schweine-(FP) und Ratten-beta-Zellen, die 2 Stunden lang mit ³H- und ¹⁴C-markierter Glucose inkubiert worden waren, verglichen. Diese Untersuchungen gaben die dosisabhängige Zunahme der Raten der Verwertung und Oxidation in den drei Spezies an, die humanen und fötalen Schweinezubereitungen verwerteten jedoch 5 bis 10-mal mehr Glucose als die Ratten-beta-Zellen (Tabelle 1). Die fötalen beta-Zellen zeigten die niedrigsten Raten der Glucoseoxidation, die ihr Maximum bei 5 mM Glucose erreichte; dieser Bereich der dosisabhängigen Oxidation entspricht dem Bereich der dosisabhängigen Insulinfreisetzung und -synthese, wenn fötale beta-Zellen Glucose ausgesetzt werden (5).
Beispiel V
Zubereitungen fötaler endokriner Schweinezellen sind dazu in der Lage, Diabetes in Müusen zu normalisieren
Die wie unter Beispiel I beschrieben erhaltenen Zellzubereitungen wurden durch Inkubation unter Rotationsschütteln (Queu Orbital-Schüttler mit 21 rpm) mit 5% CO₂ in Luft bei 37°C in 14 cm großen bakteriologischen Petrischalen mit einer Zelldichte von annähernd 10⁵ Zellen/cm² über Nacht reaggregiert. Die Aggregate wurden in immundefiziente Nacktmäuse, die durch intravenöse Injektion von 90 mg/kg Körpergewicht Alloxan diabetisch gemacht worden waren, implantiert. Die Tiere wurden mit Avertin anästhetisiert und in der Höhe der Niere wurde in der dorso-lateralen Haut ein Schnitt gemacht, die Niere extrudiert und ein kleiner Schnitt in der Nierenkapsel gemacht; zwischen der Nierenkapsel und dem Nierenparenchym wurde ein Obdurator insertiert und die Kapsel wurde vorsichtig von dem darunter liegenden Gewebe abgelöst. Die reaggregierten Schweinepankreaszellen wurden von ihrer Kulturplatte gesammelt und in ein kleines Volumen HAMF10, das 5% dekomplementiertes Mausserum enthielt, gebracht, worauf sie in ein steriles dünnes Plastikrohr, das am Ende mit zwei chirurgischen Metallklammern blockiert war, aufgenommen wurden und anschließend per Hand 2 Minuten lang mit annähernd 100 rpm zentrifugiert wurden. Unmittelbar vor der Implantation wurde die Spitze des Rohrs abgeschnitten und das pelletierte Material unter die Nierenkapsel in die durch die Kanüle präparierte Tasche injiziert. Die Öffnung in der Nierenkapsel wurde unter Verwenden einer elektrischen Niedrigtemperaturbrenneisenvorrichtung genäht und die Niere wieder in die Körperhöhle eingesetzt, worauf der Schnitt durch Zunähen geschlossen wurde. Die Tiere wurden wöchentlich durch Messen ihrer Nüchternglykämie an einem Tropfen Blut aus der Schwanzvene unter Verwenden eines Glucometers verfolgt und das Transplantat wurde nach 40 bis 200 Tagen entfernt und der Insulingehalt gemessen.
Die transplantierten Tiere zeigten 4 bis 14 Wochen nach der Implantation eine Normalisierung ihrer Glykämieniveaus und blieben für mehr als 100 Tage normoglykämisch (Tabelle 2). Diese Normalisierung ergab sich nicht aus dem im Pankreas bleibenden Insulin, da gefunden wurde, dass die Spiegel von extrahiertem Insulin in diesem Organ < 0,6 μg/Organ betrugen (der Insulingehalt im Pankreas nicht-diabetischer Tiere beträgt 15 bis 25 μg). Der Insulingehalt des Transplantats betrug zum Zeitpunkt der Transplantation 5 bis 25 μg und nahm während dem Zeitraum nach 200 Tagen um das Zehnfache zu.
Die Schnelligkeit der Normalisierung variierte mit der Anzahl an implantierten beta-Zellen, wobei 10 Wochen für Implantate mit 0,8 Millionen beta-Zellen, 8 Wochen für 1,6 Millionen beta-Zellen und 4 Wochen für 3 Millionen beta-Zellen benötigt wurden. Die beta-Zellen reifen nach der Implantation: sie verloren ihre Positivität für Cytokeratin 7 innerhalb von 10 Tagen. Ihre Glycostatfunktion behält, selbst nach einer oralen Anregung mit Glucose, geringe Glucosesiegel in dem transplantierten Tier bei (6).
Die in vitro-Perfusion einer nu/nu-Mäuseniere, die ein fötales Pankreastransplantat, wie es oben beschrieben wurde, enthielt, zeigte, dass die beta-Zellen in der Niere für Glucose responsiv waren. In 7 sind die Ergebnisse der Perfusion von einem Transplantat 112 Tage nach der Implantation gezeigt. Es wurde die Reaktion einer dosisabhängigen Insulinfreisetzung beobachtet, die mit 10 mM Glucagon erhöht werden konnte.
Legenden der Figuren:
1: Effekt der Kultivierung auf die zelluläre Zusammensetzung der „unreifen" fötalen Schweinezellzubereitung: (a) Prozent endokrine Zellen, wie sie mittels Elektronenmikroskop bestimmt wurden; (b) Prozent Insulin- ⟨⟩ und Glucagon- () Zellen, wie sie mittels Immunzytochemie bestimmt wurden. Die Daten geben den Prozentsatz der insgesamt ausgezählten Zellen und den Mittelwert ± Standardabweichung von 3 bis 11 Bestimmungen an.
2: Immunzytochemie für Cytokeratin 7 ⟨⟩ und Synatophysin () in fötalen endokrinen Schweinezellzubereitungen während 9-wöchiger Kultivierung. Nahezu alle Zellen bleiben für Synatophysin positiv, während die Prozent der für Cytokeratin 7 positiven Zellen während der Kultivierungsdauer schrittweise abnimmt. Wenn Hydrocortison und Nicotinamid aus dem Kulturmedium weggelassen werden, wird eine schnelle Abnahme der Positivität für Cytokeratin 7 (Abnahme auf weniger als 20 Prozent innerhalb von 24 Stunden) beobachtet.
3: FACS-Bedingungen für die Isolierung von nicht-granulierten Zellen (a; Intervalle R1 und R2), unreife beta-Zellen (b; Intervall R1), Glucagon enthaltende Zellen (c; Intervall R3 + R4).
4: Biosynthese von Insulin durch fötale Schweinezellen als Funktion der Glucosekonzentration im Medium.
5: Insulinfreisetzung kultivierter fötaler Schweinezellen als Funktion der Glucosekonzentration im Medium. Die Zellen wurden in Medium, das Glucocrticoide und Nicotinamid enthielt, langzeitkultiviert, worauf die letzteren beiden Bestandteile 24 Stunden vor dem Perfusionsversuch aus dem Medium weggelassen wurden.
6: Test der intraperitonealen Glucosetoleranz bei normaler Kontrolle (o) und transplantierten diabetischen (o) Nacktmäusen.
7: In vivo-Reifung fötaler Schweine-beta-Zellen. Zwanzig Wochen nach der Transplantation fötaler Schweine-beta-Zellen unter die Nierenkapsel wurden die Nieren mit verschiedenen Glucosekonzentrationen durchschwemmt. Zwischen 2,5 und 20 mM Glucose wird eine dosisabhängige Stimulierung der Insulinfreisetzung beobachtet, die ein Anzeichen für eine funktionale Reifung ist.

Claims

In-vitro-Verfahren zur großtechnischen Produktion einer Zubereitung von reifen und unreifen endokrinen Pankreaszellen, umfassend den Schritt der Dissoziation des ganzen Pankreasorgans, einschließlich der Langerhans-Inseln, in Zellen und kleine zelluläre Aggregate, ohne die Langerhans-Inseln unter der Form zu isolieren, in welcher sie im intakten Pankreas vorkommen, und weiterhin umfassend den Schritt der Entfernung von Teilchen größer als 100 μm, bevorzugt durch Gegenfluss-Elutriation.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das intakte Pankreasgewebe durch sequentielle Schüttelinkubationen dissoziiert wird, zuerst in Gegenwart von Collagenase und dann in einem kalziumfreien Medium.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Schüttelinkubationen sich abwechseln mit einer Zentrifugation durch eine Schicht mit einer Dichte < 1,04 g/ml.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, weiterhin umfassend den Schritt des Zurückhaltens der Fraktion an Einzelzellen mit einer Größe < 15 μm, bevorzugt mit einer Größe von 6–15 μm, aus der Zellsuspension, bevorzugt durch Gegenfluss-Elutriation.
Verfahren nach Anspruch 4, weiterhin umfassend den Schritt der Anreicherung der Zellsuspension an unreifen und/oder reifen endokrinen Zellen.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei kontaminierende azinöse Zellen mittels Dichtegradientenzentrifugation durch eine Schicht mit einer Dichte von 1,075 g/ml entfernt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, weiterhin umfassend den Schritt des Zurückhaltens der Fraktion zellulärer Aggregate mit einer Größe von 15 bis 100 μm aus der Suspension der Zellen, bevorzugt durch Gegenfluss-Elutriation.
Verfahren nach Anspruch 7, weiterhin umfassend die Anreicherung der Zellsuspension an unreifen und/oder reifen endokrinen Zellen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei kontaminierende azinöse Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation durch eine Schicht mit einer Dichte von 1,075 g/ml entfernt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei dispergierte Zellpräparationen aus der < 100 μm Fraktion eingesetzt werden, um Beta-Zellen mit einem reifen oder unreifen Phänotyp, Glucagon-enthaltende Alpha-Zellen und/oder nicht-granuläre Zellen, welche endokrine Vorläuferzellen enthalten, durch (auto)fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) weiter zu reinigen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5, 6 und 8 bis 10, wobei unreife endokrine Pankreaszellen durch Suspensionskultur in serumfreiem Medium, welches Glucocorticoide und Nikotinamid enthält, angereichert werden.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei unreife endokrine Pankreaszellen in vitro in serumfreiem Medium ausgereift werden.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei unreife endokrine Zellen durch Zugabe von Serum weiterhin erhalten werden.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zellen für minimal 4 Wochen kultiviert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Pankreasgewebe aus Schweineföten erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das fatale Schwein aus einer schwangeren Sau mit einer minimalen Schwangerschaft von 108 Tagen erhalten wird.
Zubereitung, umfassend Zellen und Zellaggregate an reifen und unreifen endokrinen Pankreaszellen, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Zubereitung an lebensfähigen endokrinen Pankreaszellen, umfassend unreife Zellen von weniger als 15 μm, die mehr als 40% an intakten endokrinen Zellen enthalten, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 6.
Zellkultur der Zubereitung nach Anspruch 18, welche zumindest 70% an endokrinen Zellen aufweist.
Zellkultur nach Anspruch 19, wobei zumindest 40% der Zellen Insulin-enthaltende Zellen sind.
Zellkultur nach Anspruch 20, wobei wenigstens 40% der Zellen Insulin-immunreaktiv sind
Zellkultur nach Anspruch 20, welche eine Insulinbiosyntheseaktivität von mehr als 10 fmol/10³ Beta-Zellen/Stunde zeigt.
Zellkultur nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie 60–80% an endokrinen Zellen enthält.
Zubereitung nach einem der Ansprüche 17 oder 18, oder Zellkultur nach einem der Ansprüche 19 bis 23, zur Verwendung bei der Behandlung von Diabetes Mellitus, bevorzugt bei Menschen.
Zubereitung nach einem der Ansprüche 17 oder 18, oder der Zellkultur nach einem der Ansprüche 19 bis 23, zur Verwendung bei diagnostischen Verfahren.
Verwendung einer Zubereitung nach einem der Ansprüche 17 oder 18, oder der Zellkultur nach einem der Ansprüche 19 bis 23, beim Wirkstoff-Screening.