ES2299417T3

ES2299417T3 - Metodo para producir preparaciones de celulas endocrinas pancreaticas madura e inmaduras, preparacion de las celulas y su utilizacion para el tratamiento de la diabetes mellitus.

Info

Publication number: ES2299417T3
Application number: ES00201326T
Authority: ES
Inventors: Daniel Pipeleers
Original assignee: Beta-Cell NV
Current assignee: Beta-Cell NV
Priority date: 2000-04-12
Filing date: 2000-04-12
Publication date: 2008-06-01
Anticipated expiration: 2020-04-12
Also published as: US6686197B2; CA2363971A1; ATE384781T1; DE60037876D1; DK1146117T3; EP1146117A1; EP1146117B1; PT1146117E; DE60037876T2; US20020177228A1; CA2363971C

Abstract

Método in vitro para la producción a gran escala de una preparación de células endocrinas pancreáticas maduras e inmaduras que comprende la etapa de disgregar el órgano pancreático completo, comprendiendo los islotes de Langerhans, en células y pequeños agregados celulares, sin aislar los islotes de Langerhans en una forma en la que se encuentran en el páncreas intacto y que comprende, además, la etapa de, preferentemente mediante decantación por contracorriente, eliminar las partículas superiores a 100 µm.

Description

Método para producir preparaciones de células endocrinas pancreáticas madura e inmaduras, preparación de las células y su utilización para el tratamiento de la diabetes mellitus.

La presente invención se refiere a un método de producción a gran escala de preparación de células endocrinas pancreáticas y su utilización en el tratamiento de la diabetes mellitus.

Antecedentes de la invención

La diabetes mellitus se define como un estado crónico de hiperglucemia. Dicho trastorno metabólico aparece cuando resulta insuficiente la liberación de insulina, bien como resultado de un defecto primario en el nivel de las células \beta productoras de insulina o bien cuando las células \beta no consiguen compensar una resistencia periférica aumentada a la insulina. Los niveles elevados de glucosa se pueden contrarrestar mediante cambios permanentes en el estilo de vida y mediante la administración diaria de hipoglucemiantes, en forma de inyecciones de insulina o de comprimidos de sulfonilureas. Los tratamientos actuales, sin embargo, no consiguen una normalización completa en la homeostasis de la glucosa. Los pacientes diabéticos, por lo tanto, se enfrentan al riesgo de desarrollar complicaciones crónicas como consecuencia de los episodios recurrentes de hiperglucemia. Se conoce que presentan, como grupo, una incidencia superior de retinopatías y de ceguera, de nefropatías e insuficiencias renales, de neuropatías y amputaciones, de vasculopatías y de trastornos cardiovasculares. Se considera la diabetes, por lo tanto, como un problema de salud importante. La enfermedad se diagnostica en más de un 5% de la población occidental. Su impacto en la calidad de vida de cada paciente es variable pero para toda la vida (Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus "Informe del comité de expertos sobre el diagnóstico y clasificación de la diabetes mellitus", Diabetes Care 20, 1183-1197, 1997).

Actualmente se estudia una pluralidad de estrategias intentando encontrar modos de detener la progresión de la enfermedad en cualquiera de sus etapas preclínicas o clínicas. Varias se orientan a las células \beta pancreáticas con el propósito de reincorporar una masa de células \beta funcionales que resulte suficiente para restituir, por lo menos en parte, un circuito de control endógeno en el que se libere la insulina en función de las necesidades metabólicas. Existen esencialmente dos modos de alcanzar dicho objetivo. El primero implica el implante de células \beta exógenas a fin de sustituir la población de células \beta endógenas o complementar la misma. Se ha demostrado que corrige el estado diabético en pacientes que habían perdido por completo su masa endógena de células \beta (Warnock et al., Diabetologia 35: 89-95, 1992; Ricordi et al., Transplantation 53: 407-414, 1992; Gores et al., Lancet 341: 19-21, 1993; Scharp et al., Transplantation 51: 76-85, 1991). El segundo consiste en administrar fármacos que incrementen la masa de células \beta endógenas funcionales, provocando la neoformación de células \beta, prolongando su supervivencia o corrigiendo su función homeostática. Ambas estrategias requieren la disponibilidad de grandes cantidades de células \beta, bien como injertos celulares para su implantación, o bien como modelo de ensayo para seleccionar y desarrollar nuevos fármacos en el laboratorio.

El número de pacientes que se podrían beneficiar de un injerto de células \beta se estima en, como mínimo, un 0,5 por ciento de la población total, lo que supera claramente el número de candidatos para otros tipos de injertos. También resulta claro que el desarrollo de fármacos que actúen sobre las células \beta implica una selección y unos ensayos preclínicos extensos para los que resultarán necesarias unas grandes cantidades de células normales. No existe todavía una fuente de células \beta que satisfaga adecuadamente ambas necesidades. Se han utilizado páncreas humanos para producir preparaciones de células \beta para trasplantes, así como para estudios in vitro pero el número de órganos donados resulta claramente insuficiente; además, los criterios de donación de órganos impiden su utilización para el desarrollo de fármacos. Estas restricciones incrementan la necesidad de producir células \beta a partir de otras especies.

Entre los mamíferos superiores, se considera a los cerdos como una fuente potencialmente útil de preparaciones de células \beta ya que los cerdos resultan relativamente fáciles de criar y debido a que la insulina porcina es muy similar a la insulina humana. Se han desarrollado métodos para aislar islotes y preparaciones tisulares a partir de páncreas de cerdos fetales, neonatos y adultos. Dichas preparaciones pueden normalizar un estado diabético en ratones inmunoincompetentes e inmunocompetentes (Korsgren et al., Surgery 113, 205-214, 1993; Korbutt et al., J. Clin. Invest. 97, 2119-2129, 1996; Thomas et al., Transplantation 67 846-854, 1999; Lu et al., Xenotransplantation 5, 154-163, 1998). Ya se han trasplantado preparaciones de islotes de cerdos fetales en pacientes diabéticos, sin embargo sin éxito (Groth et al., Lancet 344, 1402-1404, 1994). Todavía se desconoce si se pueden realizar xenotrasplantes en pacientes humanos y, en caso afirmativo, el nivel de éxito de los mismos. La utilización de preparaciones de reagregados de células \beta con un tamaño y composición celulares seleccionados puede contribuir en una investigación de dichas condiciones. Nuestros estudios en roedores han demostrado que los agregados de células endocrinas de los islotes presentan una inmunogenia inferior como aloinjerto que el tejido de los islotes intacto (Pipeleers et al., Diabetes 40, 908-919, 1991; Pipeleers et al., Diabetes 40, 920-930, 1991; Pipeleers - Marichal et al., Diabetes 40, 931-938, 1991, Pipeleers et al., Diabetologia 34, 390-396, 1991). Ilustran también cómo las variaciones de la composición celular influencian en la capacidad metabólica de los injertos (Keymeulen et al., Diabetologia 40: 1152-1158, 1997; Keymeulen et al., Diabetes 45, 1814-1821, 1996). A pesar de que dichos experimentos demostraron la utilidad de la realización de injertos de células \beta en el laboratorio, no ofrecieron una metodología adecuada para su implantación clínica. Los métodos que se utilizaron para componer los injertos de células \beta de rata no permiten preparaciones a gran escala de células endocrinas pancreáticas. Implican el aislamiento previo de los islotes de Langerhans (definidos en la presente memoria como microórganos con un diámetro > 100 \mum que contienen una mezcla de tipos celulares endocrinos, entre ellos las células \beta productoras de insulina) y de este modo se descartaban las células \beta que se encuentran presentes como células simples o como agregados celulares pequeños; se supone que las células \beta simples se encuentran adyacentes a las células endocrinas inmaduras, es decir, células que se pueden diferenciar en células \beta. Como resultado de dicha extracción, poco se conoce sobre dichas células \beta y las células endocrinas inmaduras. Su proporción relativa (con respecto a los números incorporados en islotes) no resulta, sin embargo, insignificante durante las primeras etapas de vida (In't Veld et al., Diabetologia 35: 272-276, 1992); en el páncreas humano, continúan siendo numerosas a lo largo de la vida adulta (Bouwens & Pipeleers, Diabetologia 41: 629-633, 1998). Debido a que la migración y la asociación de células endocrinas pancreáticas en las estructuras normales de los islotes se considera como una etapa en la maduración (Pictet & Rutter, development of the embryonic pancreas ("desarrollo del páncreas embrionario"). En: Steiner D. F., Freinkel N. (ed.) Handbook of Physiology ("Manual de Fisiología"), Sección 7 Endocrinology Vol I: Endocrine Pancreas ("Endocrinología Vol. I: El páncreas endocrino"), Baltimore: Williams & Wilkins, 1972 p. 25-66), las células endocrinas que no se producen en dichos microórganos se pueden definir como "inmaduras". A pesar de que las propiedades de las células \beta inmaduras y de las células endocrinas inmaduras no han sido bien caracterizadas, son probablemente distintas de las de los "islotes" que han madurado bajo la influencia de su microanatomía y de las células endocrinas contiguas normales (Orci & Unger, The Lancet 2: 1243-1244, 1975; Pipeleers, Experientia 40: 1114-1126, 1984; Pipeleers, Diabetologia 30: 277-291, 1987). Las funciones de los islotes se consideran como normales en las células \beta maduras; las células \beta maduras son mayores que sus homólogas inmaduras (Pipeleers, observaciones sin publicar). Existen pruebas indirectas de que las células \beta inmaduras pueden alcanzar el crecimiento de la masa de células \beta. La pérdida de dichas células durante el procedimiento de aislamiento se espera, por lo tanto que produzca una preparación purificada de células endocrinas que sea únicamente representativa de la población celular madura, que contiene únicamente una subpoblación de las células \beta y que presenta una baja capacidad de crecimiento, tres consecuencias que resultan desventajosas cuando se van a utilizar células aisladas para las estrategias mencionadas anteriormente, particularmente la construcción de injertos de células \beta y el desarrollo de fármacos que pretenden incrementar la masa de células \beta funcionales.

A fin de superar dichos problemas la presente invención proporciona un método según la reivindicación 1. Las formas de realización preferidas del método según la presente invención se describen en las reivindicaciones subordinadas 2 a 14. Las preparaciones por sí mismas y su utilización constituyen el tema de las reivindicaciones 15 a 24.

En el aspecto más general de la presente invención se proporciona un método in vitro para la preparación de células endocrinas pancreáticas de mamífero que comprende la etapa de disgregar el órgano pancreático completo, comprendiendo los islotes de Langerhans, en células y pequeños agregados celulares, sin aislar los islotes de Langerhans en una forma en la que se encuentran en el páncreas intacto y, además, comprende la etapa de, preferentemente mediante decantación por contracorriente, eliminar las partículas superiores a 100 \mum.

El tejido pancreático intacto se define en la presente memoria como el órgano pancreático o cualquiera de sus fragmentos tras su disección del cuerpo del mamífero.

Una célula endocrina pancreática se define como una célula que se encuentra en, o se aísla de, el tejido pancreático intacto y que expresa un marcador endocrino, es decir, una molécula que se ha identificado en las células endocrinas pero no en las exocrinas. Dicho marcador puede corresponder a un constituyente de una vesícula secretora endocrina o a cualquier otro componente celular.

Las células endocrinas inmaduras se definen mediante uno o más de los criterios siguientes: 1) Un fenotipo celular característico de células endocrinas fetales pero no de células endocrinas adultas, por ejemplo la presencia de inmunorreactividad a la gastrina o de inmunorreactividad a la sinaptofisina, sin reacción positiva para cualquiera de las hormonas pancreáticas adultas, por ejemplo insulina, glucagón, somatostatina, polipéptidos pancreáticos. 2) Se producen en el tejido pancreático como una unidad de como máximo cuatro células endocrinas. 3) Expresión de un marcador que no se encuentra en las células endocrinas homólogas de islotes pancreáticos adultos, tales como la citoqueratina 19 (CK19; humana) o la citoqueratina 7 (CK7; cerdo). Las células \beta inmaduras presentan característicamente un tamaño celular significativamente inferior si se compara con las células \beta adultas (inferiores al diámetro medio de las células \beta adultas menos tres desviaciones típicas) y una baja respuesta al estímulo máximo con glucosa (estimulación < 3 veces de la liberación de insulina); el tamaño de dichas células aumenta bajo condiciones de maduración.

Las células endocrinas maduras se definen por su ubicación en los islotes pancreáticos de los que se conoce que presentan una vascularización típica (Bonner-Weir & Orci, Diabetes 31, 883-889, 1982; Pictet & Rutter, en: Steiner D. F., Freinkel N. (ed.) Handbook of Physiology ("Manual de Fisiología"), Sección 7 Endocrinology Vol I: Endocrine Pancreas ("Endocrinología Vol. I: El páncreas endocrino"), Baltimore: Williams & Wilkins, 1972 pp 25-66).

Las células \beta maduras se caracterizan por su biosíntesis regulada por la glucosa y por la liberación de insulina, y su almacén y liberación de insulina que es > 90 por ciento procesado en su forma madura.

Contrariamente a lo que se ha descrito previamente, y utilizado habitualmente, los métodos de aislamiento de islotes pancreáticos (Lacy P. E. & Kostianovsky M., Diabetes 16: 35-39, 1967) la presente invención no pretende aislar los "islotes de Langerhans" en la forma en la que se encuentran en el páncreas intacto. En cambio, el órgano pancreático entero, comprendiendo los "islotes de Langerhans" se disgrega en células individuales y pequeños agregados celulares antes de realizar las etapas de aislamiento de las células endocrinas maduras e inmaduras.

Al seleccionar la edad del páncreas, y las condiciones experimentales, el método puede producir preferentemente células endocrinas maduras o inmaduras o sus subtipos. De este modo, la disgregación de páncreas de fetos tardíos de cerdo, la separación de las células simples a partir de las fracciones disgregadas y el cultivo de la fracción separada bajo unas condiciones específicas permite una purificación a gran escala de células endocrinas inmaduras, de ambos tipos \beta y \alpha. La presente invención describe las condiciones específicas en las que se puede utilizar la presente preparación 1) para producir injertos con un potencial importante de crecimiento de células \beta in vivo, 2) para diseñar y realizar ensayos de selección de fármacos in vitro. En líneas generales, proporciona el método para producir - a partir de páncreas de distintas edades y especies - preparaciones de células endocrinas con una composición celular y propiedades seleccionadas para utilizar como autoinjertos, aloinjertos o xenoinjertos así como para seleccionar y examinar fármacos en el laboratorio.

Descripción de la invención I Descripción general de la invención

La presente invención describe la producción de preparaciones de células endocrinas maduras e inmaduras a partir de páncreas de mamíferos para utilizar en el tratamiento de la diabetes, más específicamente la producción de injertos de células \beta con un crecimiento potencial y proporcionar modelos experimentales en los que se puedan seleccionar fármacos por sus efectos terapéuticos en una masa de células \beta funcionales.

Se puede utilizar el método en una producción a gran escala de células endocrinas de páncreas de diversas especies, especialmente a partir de páncreas fetales de gestación tardía y más específicamente a partir de páncreas fetales porcinos, proporcionando unas preparaciones con un tamaño y composición celular definidos, una pureza seleccionada de células \beta y \alpha, capacidad de biosíntesis de insulina predecible y capacidad de crecimiento de células \beta.

Dicha aplicación particular utilizando páncreas fetales tardíos presenta las ventajas siguientes si se compara con las preparaciones posnatales procedentes de especies superiores:

1.: un riesgo de infección inferior

2.: una pureza superior de las células endocrinas

3.: un número superior de células endocrinas por procedimiento técnico

4.: una capacidad de crecimiento remarcable y una supervivencia superior de la masa de células \beta

5.: unas propiedades funcionales más reproducibles.

En comparación con otros métodos de aislamiento de células endocrinas fetales el método presenta las ventajas siguientes:

1.: una pureza superior de las células endocrinas y sus subtipos

2.: un número superior de células endocrinas por órgano

3.: la capacidad de seleccionar (sub)tipos de células endocrinas particulares y realizar preparaciones finales en función de las necesidades metabólicas.

4.: la disponibilidad de células endocrinas inmaduras.

Dichas propiedades hacen que el método resulte útil para 1) la preparación de injertos celulares para su trasplante a pacientes diabéticos, 2) la preparación de preparaciones celulares para seleccionar fármacos que regulen la masa de células \beta funcionales.

II Descripción detallada de la invención

La forma de realización más preferida del método comprende seis etapas que, en combinación, producen preparaciones de células endocrinas pancreáticas con un tamaño, composición y madurez seleccionados:

1.: La disgregación del tejido pancreático intacto hasta el punto en que todo el tejido, comprendiendo los islotes de Langerhans, queda preferentemente disgregado en agregados celulares de < 100 \mum.

2.: La separación de los fragmentos disgregados pancreáticos en función del tamaño de partícula utilizando decantación por contracorriente para seleccionar células simples con un tamaño comprendido entre 6 y 15 \mum (que comprenden las células endocrinas inmaduras) y agregados pequeños con un tamaño comprendido entre 15 y 100 \mum (que comprenden células endocrinas maduras).

\newpage

3.: La eliminación de las células acinares de las fracciones seleccionadas mediante centrifugación en gradiente de densidad.

4.: El enriquecimiento en células endocrinas maduras o inmaduras mediante el cultivo en medios sin suero especialmente formulados.

5.: La purificación de células endocrinas maduras o inmaduras, células \alpha o \beta y sus precursoras mediante citofluorometría de flujo.

6.: La composición de preparaciones de células endocrinas con un tamaño, composición y madurez seleccionados.

Las etapas 1 a 4 se utilizan para purificar células endocrinas maduras e inmaduras desde el 1 al 5 por ciento en tejido intacto hasta un mínimo del 60 por ciento y preferentemente el 90 por ciento. La etapa 5 es necesaria si se necesita una purificación adicional de las preparaciones enriquecidas en células endocrinas (in)maduras, \alpha o \beta. Dicho procedimiento permite un aislamiento a gran escala de células endocrinas pancreáticas al mismo tiempo que ofrece la posibilidad de seleccionar células según las necesidades experimentales. Una pureza superior en las células endocrinas intactas se asocia a una inmunogenia inferior (Pipeleers et al., Diabetes 40, 920-930, 1991; Pipeleers-Marichal et al., Diabetes 40, 931 -938, 1991; Pipeleers et al., Diabetologia 34: 390-396, 1991), la inclusión de células endocrinas o \beta inmaduras se asocia a un potencial de crecimiento superior, la adición de células \alpha incrementa y favorece la supervivencia y el funcionamiento de las células \beta (Pipeleers, Diabetologia 30, 277-291, 1987; Ling et al., Diabetologia 37, 15-21, 1994; Keymeulen et al., Diabetologia 40: 1152-1158, 1997), las preparaciones estandarizadas de células \beta resultan necesarias para los efectos metabólicos estandarizados en la diabetes (Keymeulen et al., Diabetologia 41: 452-459, 1998), se requieren poblaciones celulares purificadas para los ensayos con fármacos (Pipeleers et al., Endocrinology 117: 806-816, 1985; Gorus et al., Diabetes 37, 1090-1095, 1988).

Etapa 1

La preparación del tejido endocrino pancreático se realiza tradicionalmente mediante la digestión con colagenasa de las glándulas pancreáticas y mediante la separación de una fracción enriquecida en islotes de Langerhans utilizando métodos que aíslen las partículas tisulares superiores (> 100 \mum) (mediante aislamiento manual bajo el microscopio de disección) o las partículas con una densidad inferior (< 1,07 g/ml). Dichas fracciones están enriquecidas en islotes de Langerhans y se pueden utilizar para purificar células \beta y células \alpha endocrinas (Pipeleers et al., Endocrinology 117: 806-816, 1985). Dichos métodos presentan la desventaja de que provocan la pérdida de células endocrinas (inmaduras) que se encuentran en las partículas tisulares menores o/y en partículas con una densidad superior. Dicha pérdida puede resultar significativa en términos cuantitativos y cualitativos ya que significará la pérdida de células (inmaduras) y de pequeños agregados celulares que resultan importantes en el crecimiento de la masa de células \beta. Se ha seleccionado, por lo tanto, otra estrategia metodológica que se inicia con la disgregación del tejido pancreático intacto hasta el punto de que todo el tejido, que comprende los islotes de Langerhans, se disgrega en partículas < 100 \mum. Dichas partículas a continuación constituyen la base de todas las etapas posteriores del proceso.

La utilización de dicha estrategia permite el aislamiento de un número superior de células endocrinas, que comprende las células endocrinas inmaduras y las células \beta inmadura, que el enfoque clásico basado en los "islotes de Langerhans".

En la etapa 1, el tejido pancreático se disgrega mecánicamente durante una incubación y tras la misma, en primer lugar con colagenasa durante un máximo de 30 minutos y a continuación con un quelador cálcico de ácido edético (o EGTA [ácido etilenglicoltetraacético]) en un medio sin calcio que contiene desoxirribonucleasa durante un máximo de 30 minutos. Las concentraciones de colagenasa se determinan por baño enzimático y se activan basándose en, respectivamente, separar el tejido intacto en partículas con un diámetro < 500 \mum en 20 minutos y mantener dicha preparación sin cadenas y la posterior aglutinación celular. El medio sin calcio reduce la adherencia celular y permite una disgregación suave del tejido endocrino en células simples y agregados celulares pequeños. Las células endocrinas se encontrarán presentes en partículas inferiores a 100 \mum y, en los páncreas fetales, particularmente como células simples con un diámetro comprendido entre 6 y 15 \mum. Las células endocrinas mas maduras se encontrarán en partículas con un diámetro comprendido entre 15 y 100 \mum. Las partículas superiores a 100 \mum se eliminan mediante un tamiz de 100 \mum o por decantación por contracorriente en la que las partículas inferiores se recogen con un caudal de 225 ml/min y una velocidad del rotor de 250 rpm (centrífuga Beckman J-6B, rotor JE 10x).

Etapa 2

En esta etapa las células endocrinas inmaduras se separan de las células agregadas, comprendiendo las células endocrinas maduras, al mismo tiempo que se descartan los fragmentos residuales. Se basa en nuestro descubrimiento de que la aplicación de la etapa 1 en el tejido fetal provoca la liberación de las células endocrinas inmaduras como unidades simples con un diámetro comprendido entre 6 y 15 \mum. Se consigue mediante nuestra adaptación de la técnica de decantación por contracorriente para separar las partículas con un diámetro comprendido entre 6 y 15 \mum de aquellas con un diámetro comprendido entre 15 y 100 \mum. La suspensión de partículas se bombea a 25 ml/min en un decantador Beckman (Palo Alto, Ca) JE 10x dispuesto en una centrífuga Beckman J6B a 1500 rpm, mediante lo que se separarán los fragmentos residuales y las partículas de escala \mum se retendrán en la cámara. La velocidad de la bomba se incrementará a continuación hasta 190 ml/min a fin de impulsar las partículas con un diámetro comprendido entre 6 y 15 \mum hacia el exterior de la cámara del rotor: se recoge dicha fracción (fracción < 15 \mum) y comprende las células endocrinas inmaduras simples. La velocidad de la centrífuga se reduce a continuación a 0 rpm de tal modo que se pueda recoger el contenido del rotor como fracción de 15 a 100 \mum. Cuando se aplica en la fracción < 100 \mum de un disgregado obtenido a partir de páncreas fetales de cerdo en gestación tardía, todas las células endocrinas de la fracción < 15 \mum presentan marcadores de inmadurez (falta de la respuesta típica a la glucosa, expresión del marcador celular de conducto CK7).

Etapa 3

Las dos fracciones que se aíslan tras la decantación por contracorriente se encuentran contaminadas por células acinares que presentan una densidad superior (> 1,070 g/ml) a la de las células endocrinas. Se utiliza la centrifugación en gradiente de densidad para reducir el nivel de contaminación: las fracciones celulares procedentes de páncreas fetales porcinos de gestación tardía se someten a gradientes de Percoll discontinuos con densidades de 1,040 g/ml y 1,075 g/ml. Se recogen las preparaciones enriquecidas con células endocrinas en la interfase de las capas de densidades 1,040 g/ml y 1,075 g/ml; proporcionan unas preparaciones con >40 por ciento de células endocrinas intactas. Las células endocrinas de la interfase de la fracción de 6 a 15 \mum son todas inmaduras; su número se encuentra sistemáticamente entre 1 y 3 \cdot 10^{7} células por páncreas (porcino) fetal.

Si se considera el número medio de fetos (n = 9) por cerda - y por lo tanto por experimento de aislamiento -, la producción de células endocrinas es por lo menos de 10^{8} células endocrinas por aislamiento a una pureza > 40%. El procedimiento, por lo tanto, presenta un gran nivel de aislamiento de células endocrinas. Este rendimiento es superior que el que se obtiene a partir de un páncreas de un donante humano; asimismo se puede reproducir sistemáticamente.

Al final de la etapa 3, las interfases comprenden asimismo un cierto número de células no granuladas muchas de las cuales se encuentran unidas a las células endocrinas. Esta población de células no granuladas - o una fracción de las mismas - va a contribuir al crecimiento de la masa de células \beta mediante las células endocrinas inmaduras, es decir, células que se pueden diferenciar en células \beta.

Etapa 4

Las dos fracciones recogidas en la etapa 3, particularmente la interfase de < 15 \mum y la interfase de 15 a 100 \mum, se encuentran enriquecidas adicionalmente en células endocrinas inmaduras y maduras mediante el cultivo en unos medios especialmente formulados:

\bullet: En el caso de las células endocrinas inmaduras dicho medio es el medio de F10 sin suero con albúmina (máximo 0,5%) como proteína y suplementos de nicotinamida (5 mM), glucocorticoides (máximo 10^{-6} M de hidrocortisona), isobutilmetilxantina (IBMX, 50 \muM); en comparación con el medio utilizado en el cultivo de islotes de Langerhans dicho medio mantiene la supervivencia de las células endocrinas inmaduras y permite un almacenamiento incrementado de hormonas durante el cultivo prolongado (incremento del doble en el contenido de insulina celular tras 4 semanas de cultivo). El grado de maduración y de diferenciación se inhibe mediante la adición de suero y aumentando la concentración de calcio hasta 2 mM; estos últimos suplementos se pueden utilizar para preparar fracciones con más células precursoras de células \beta.

\bullet: En el caso de las células endocrinas maduras, el medio de cultivo es similar al descrito previamente en el caso de células \beta humanas (Ling & Pipeleers, J. Clin. Invest. 98, 2805-2812, 1996), particularmente medio de Ham F10 sin suero con albúmina (0,5%) e IBMX (50 \muM).

Tras cuatro días de cultivo de la interfase < 15 \mum, el número de células dañadas se puede reproducir en un 10 por ciento, el de células endocrinas intactas en más de un 70 por ciento, el de las células no granuladas entre un 10 y un 25 por ciento. Las células \beta sintetizan proinsulina con una velocidad de por lo menos 10 fmol / 10^{3} células \beta / hora. Dichos ensayos de control de calidad de la composición y funcionamiento celular se pueden ampliar con ensayos de control microbiológicos y toxicológicos.

En el caso del objetivo del implante en humanos, los animales de procedencia se obtienen a partir de cepas sin patógenos específicos según las normas de la Federation of European Laboratory Animal Science 1 Associations ["Federación Europea de Asociaciones para las Ciencias de Animales de Laboratorio"] (FELASA) tal como las define dicha asociación (Laboratory Animals 32: 1-17, 1998) y que cumplen con las normativas de seguridad biológica tal como propone la US Food and Drug Administration ["Dirección Federal de Fármacos y Alimentos"] (Registro Federal 49920-49932, agosto 1996).

Las preparaciones celulares descritas anteriormente se pueden utilizar para el trasplante y corrección de la diabetes en ratones se ha demostrado que se consigue el crecimiento de sus masas de células \beta (véase ejemplo V). Se pueden utilizar para purificar composiciones de (sub)tipos celulares (etapa 5) y para diseñar modelos experimentales de células simples y agregadas con un tamaño, composición y madurez seleccionados (etapa 6).

Etapa 5

Las preparaciones obtenidas a partir de la etapa 4 se pueden disociar en células simples utilizando tripsina y desoxirribonucleasa. La suspensión celular se somete a continuación a citofluorometría de flujo (FACS) y dispersión frontal (FSC), dispersión lateral (SSC) y fluorescencia (FL) a 488 nm de excitación y 520 - 540 nm de emisión como parámetros discriminatorios. Las poblaciones de los (sub)tipos celulares se distinguen con respecto a la ubicación de las células no granuladas intactas que comprenden las células endocrinas inmaduras (FSC baja, SSC baja, FL baja); con una SSC superior: enriquecimiento en células \alpha; con unas FSC y FL superiores: enriquecimiento en células \beta, presentando las precursoras de las células \beta y las células \beta inmaduras unas FSC y FL inferiores a las de las células \beta maduras. Se ajustan ventanas para la purificación de dichos (sub)tipos celulares como células simples.

Etapa 6

Los (sub)tipos de células recogidos tras la etapa 5 se pueden cultivar como células simples en placas de cultivo revestidas con polilisina utilizando el medio definido en la etapa 4 para las células endocrinas inmaduras o maduras. Se cultivan las células no granuladas con células endocrinas inmaduras (que contienen precursoras de las células \beta) en el medio para las células endocrinas inmaduras con suero fetal al 10 por ciento.

Las células descritas en las etapas 4 y 5 se pueden reagregar asimismo en partículas de un tamaño seleccionado mediante incubación con agitación giratoria en un incubador con CO_{2} utilizando el medio especificado en el párrafo anterior y a unas densidades celulares comprendidas entre 10^{4} y 2 \cdot 10^{5} por cm^{2} de superficie de las placas de cultivo bacteriano utilizadas en los cultivos en suspensión. Se obtienen agregados celulares de un tamaño creciente incrementando la densidad celular e incrementando la velocidad y la duración de la agitación giratoria. Se pueden formar asimismo agregados de composición variada mezclando poblaciones celulares purificadas en distintas proporciones.

Las preparaciones obtenidas en la etapa 4 y 5 se pueden utilizar para trasplantar y para cultivos a corto o largo plazo. Resulta útiles en el tratamiento de la diabetes, particularmente como fuente de insulina en receptores diabéticos y tanto en modelos in vitro como in vivo para la selección de fármacos.

Los injertos compuestos in vitro y las preparaciones celulares cultivadas se pueden someter a un análisis funcional así como a ensayos de control de calidad microbiológica que requieran las autoridades competentes. Las preparaciones celulares se pueden seleccionar de este modo en función de su seguridad y eficacia al mismo tiempo que se mantienen en cultivo y antes de la implantación real en pacientes diabéticos.

Ejemplos Ejemplo I

Aislamiento de masas y purificación de células pancreáticas porcinas fetales.

Se anestesiaron cerdas gestantes de 108 a 114 días de gestación y se procedió a la extracción quirúrgica de los fetos en condiciones estériles en un quirófano, se decapitaron los fetos (longitud del embrión 28 \pm 5 cm [media \pm DT]) y se extrajeron los páncreas mediante disección en condiciones asépticas y se recogieron en un medio de aislamiento estéril (Pipeleers et al., Endocrinology 117: 806-816, 1985). Con más de 100 disecciones, se recogió una media de nueve fetos por cerda gestante. Se cortó el tejido en pequeños fragmentos de aproximadamente 1 mm^{3} de tamaño.

Tras lavar los fragmentos del tejido con el medio de aislamiento, se suspendieron los fragmentos en 200 ml de medio de aislamiento con 0,3 mg/ml de colagenasa-P (Roche) (temperatura ambiente) y a continuación se agitaron durante 15 minutos. La digestión del tejido se filtró a través de un filtro de 500 \mum y el filtrado se centrifugó a través de una disolución con una densidad de 1,040 (6' a 1500 rpm) tras lo que se almacenó el sedimento. El material que quedó en el filtro de 500 \mum se incubó de nuevo con colagenasa durante otros 15' y a continuación se filtró y se centrifugó del modo anterior, almacenándose de nuevo el sedimento. El material que permanecía en el filtro la segunda vez se resuspendió en un medio de disociación sin calcio (Pipeleers & Pipeleers-Marichal, Diabetologia 20: 654-663, 1981) y se dispersó durante 15 minutos de incubación a temperatura ambiente antes de proceder a la filtración y centrifugación del modo descrito anteriormente; dicho procedimiento de disociación se repitió con el material que permanecía en el filtro.

Las cuatro fracciones de sedimentos se suspendieron en un medio de aislamiento que contenía suero de ternera recién nacida (NCD) al 2% y se filtró a través de un filtro de 100 \mum para eliminar los grupos grandes de células; el filtrado comprendía ahora células simples y pequeños agregados celulares (< 100 \mum de diámetro). Dicha suspensión celular se bombeó en una cámara de un rotor de decantación por contracorriente JE-10X (Beckman instruments Inc, Palo Alto, CA) y se centrifugó a 1500 rpm y se ajustó la bomba a 190 ml/min. Bajo dichas condiciones, las partículas con un diámetro de < 15 \mum se hicieron salir de la cámara, que de este modo conservaba partículas con un tamaño superior (15 - 100 \mum). Las fracciones decantadas se centrifugaron y se resuspendió el sedimento en un medio con una densidad de 1,040 y se aplicaron sobre la parte superior de un medio con una densidad de 1,075; tras la centrifugación durante 20 minutos a 2500 rpm, se extrajo la interfase entre 1,040 y 1,075 con una pipeta de Pasteur siliconada y se lavó con medio de aislamiento que contenía NCS al 2%. Se contaron las células en una cámara de recuento Bürker.

A partir de la fracción decantada <15 \mum, se obtuvieron entre 30 y 50 millones de células por cada páncreas fetal. Dichas células eran simples (> 60%); se sembraron en placas de Petri bacteriológicas de 14 cm que contenían medio de HAM F10 con 110 mg/% de glucosa, 0,075 mg/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina, 2 mM de glutamina, 2 mM CaCl_{2}, 50 \muM de isobutilmetil-xantina (IBMX), 1 \muM de hidrocortisona, 5 mM de nicotinamida y albúmina de suero bovino al 0,5%, con 0,5 a 1,0 millones de células por ml de medio. Tras 16 h de cultivo a 37ºC y CO_{2} al 5% en aire, se lavaron las células y se sustituyó el medio por el mismo tipo de HAM F10 tal como anteriormente con la excepción de una concentración de calcio inferior (0,2 mM). Bajo dichas condiciones, se mantuvieron las células en un cultivo de suspensión hasta 6 semanas. Durante el cultivo, las células se reagregaron espontáneamente; el tamaño del agregado se incrementó aumentando la densidad celular del medio y por rotación.

Durante los cuatro primeros días de cultivo, el número total de células disminuyó en un 40%, principalmente como resultado de la desintegración de las células dañadas y las células acinares. La preparación celular ahora comprendía por lo menos el 70 por ciento de células endocrinas (con un 30 a 50% de células \beta que contenían insulina, un 15 a 45% de células \alpha que contenían glucagón, un 5 a 10% de células D que contenían somatostatina, de un 10 a un 25% de células no granuladas (es decir, células que no contenían los típicos gránulos secretores endocrinos tal como se puede observar al microscopio electrónico), < 5% de células exocrinas y < 10% de células muertas (figura 1). El contenido en insulina de dicha preparación celular se encontraba comprendido entre 0,3 y 1,5 \mug de insulina / \mug de ADN y de 4 a 7 ng por cada mil células \beta. Dicho contenido en insulina celular es cinco veces inferior al de las células \beta maduras. La inmadurez de las células \beta se ilustra asimismo mediante su positividad con respecto al marcador celular de conducto citoqueratina 7, y su escasa respuesta secretora y biosintética a la glucosa (inferior a una estimulación triple). Dicha fracción se considera, por lo tanto, que contiene células \beta inmaduras. Otras células de dicha preparación son asimismo inmaduras y todas ellas expresan el marcador citoqueratina 7; debido a que son asimismo positivas para la sinaptofisina se han de considerar como pertenecientes a la estirpe endocrina. Como dichas células no presentan las típicas vesículas secretoras endocrinas, se han de considerar que representan células endocrinas inmaduras. Dichas células endocrinas inmaduras son por lo tanto precursoras de células \beta inmaduras que presentan las típicas vesículas secretoras endocrinas en su citoplasma.

Cuando se añadió suero de ternera fetal al 10% o suero porcino, las preparaciones conservaron una proporción superior de células no granuladas (hasta el 40%) durante períodos de cultivo superiores. Dichas células son positivas para la citoqueratina 7 y para la sinaptofisina y negativas para la anhidrasa carbónica lo que sugiere que dicha fracción contiene células precursoras de las endocrinas.

En un medio sin suero, la preparación estaba compuesta completamente de células endocrinas, con una ligera mayoría de células que contenían insulina (40 a 60%). Durante un período de cuatro a diez semanas, el tamaño de las células \beta y su contenido en insulina aumentó progresivamente. Cuando se extrajo la nicotinamida y los glucocorticoides, las células incrementaron su respuesta a la glucosa a juzgar por su actividad secretora de insulina durante la venoclisis a unas concentraciones de glucosa bajas (2,5 mM de glucosa) y elevadas (5 - 7,5 - 10 mM). Dicho signo de maduración funcional iba acompañado de una pérdida de la tinción de la citoqueratina 7 (figura 2). Las células endocrinas inmaduras pueden por lo tanto madurar in vitro; pueden madurar asimismo in vivo tras el trasplante (véase a continuación).

A partir de la fracción decantada de 15 a 100 \mum, se obtuvieron entre 15 y 25 millones de células por cada páncreas fetal. Dicha fracción está compuesta principalmente de células agregadas (menos de un 20% de células simples) y por lo tanto contiene células endocrinas maduras. El cultivo, en un medio sin nicotinamida y glucocorticoides conduce a una preparación del 60 al 80% de células endocrinas agregadas con células \beta maduras, y un 20 a un 30% de células no granuladas.

Ejemplo II

Utilización de la citofluorometría de flujo (FACS) para un enriquecimiento adicional de las preparaciones en células endocrinas inmaduras o maduras, en particular células \beta.

1) Purificación de preparaciones de células inmaduras que se encuentran compuestas predominantemente de células no granuladas y que contienen células endocrinas inmaduras Preparación inicial

-: Fracción de decantación < 15 \mum.

-: Cultivo durante 4 días en el medio de HAM Fl0 utilizado para células inmaduras y enriquecido con suero de ternera recién nacida al 2% y CaCl_{2} hasta una concentración final 2 mM.

-: Disociada en un medio sin calcio que contiene tripsina y desoxirribonucleasa.

-: Composición: células no granuladas > 40%; células endocrinas 35 - 50%.

Condiciones de la FACS

-: Análisis de dispersión lateral (SSC) y fluorescencia a 488 nm de excitación, emisión a 520 - 540 nm (FL1).

-: Clasificación de ventanas R1, R2 y R3 (figura 3a).

-: Composición celular de las fracciones obtenidas: contenido R1 + R2 > 70% de células no granuladas, con una fluorescencia superior en la población R2 como marcador de células endocrinas inmaduras

R3 contiene > 85% de células endocrinas

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2) Enriquecimiento en células \beta inmaduras Preparación inicial

-: Fracción de decantación < 15 \mum.

-: Cultivo durante como mínimo siete días en el medio de HAM F10 utilizado para células inmaduras.

-: Composición de la preparación inicial antes de proceder a la FACS: > 70% de células endocrinas.

Condiciones de la FACS

-: Análisis de dispersión lateral (SSC) y fluorescencia a 488 nm de excitación, emisión a 520 - 540 nm (FL-1).

-: Clasificación de ventanas R1, R2 y R3 (figura 3b).

-: Composición celular de las fracciones obtenidas:

: Contenido R1 > 50% de células inmaduras positivas a la insulina.

: Contenido R2 > 90% de células endocrinas maduras.

: Contenido R3 > 75% de células positivas al glucagón.

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3) Purificación de las células \beta inmaduras y de las células que contienen glucagón Preparación inicial

-: Fracción de decantación < 15 \mum.

-: Composición de la preparación inicial antes de proceder a la FACS: > 75% de células endocrinas.

Condiciones de la FACS

-: Análisis de dispersión lateral y dispersión frontal.

-: Clasificación de las ventanas R1, R2, R3, R4 y R5 (figura 3c). Composición celular de las fracciones obtenidas: R1 contiene > 75% de células positivas a la insulina, R3 + R4 contienen > 90% de células positivas al glucagón.

Ejemplo III

Las células \beta obtenidas de fetos porcinos producen insulina en una proporción comparable a la de las células \beta de un ser humano adulto.

Se recogieron preparaciones de células endocrinas tal como se obtuvieron en el ejemplo I a partir de las placas de cultivo y se lavaron en el medio de aislamiento. Un ensayo de toxicidad por fluorescencia (Hoorens et al., J. Clin. Invest. 98, 1568-1574, 1996) indica menos de un 15% de células muertas. Se incubaron muestras de 25.000 a 75.000 células en 500 \mul de medio de HAM F10 enriquecido con albúmina de suero bobino al 0,5% y 25 \muCi de ^{3}H-tirosina (5 \muM de concentración final). Se realizó el marcado de las proteínas nuevas sintetizadas durante 120 minutos a 37ºC y un 95% de O_{2} / 5% de CO_{2}. Se determinó la síntesis de proteínas totales y de proinsulina tal como se ha descrito anteriormente (Ling & Pipeleers, Endocrinology 134, 2614-2621, 1994). Los datos se expresan por 1000 células \beta. Con 10 mM de glucosa las proporciones de la biosíntesis de insulina (41 \pm 3 fmol por 10^{3} células \beta por 2 horas) resultan comparables a los de las células \beta de seres humanos adultos (37 \pm 8 fmol por 10^{3} células \beta por 2 horas; p > 0,05). Con 0 mM de glucosa, las proporciones son inferiores en ambas especies, pero el descenso es únicamente del 50% en las células \beta fetales (figura 4).

Ejemplo IV

Las células \beta de fetos porcinos se parecen a las células \beta humanas - más que las células \beta de rata - en su metabolismo de la glucosa y, por consiguiente, en la señalización posterior de la glucosa.

Las proporciones de utilización y oxidación de la glucosa se compararon en preparaciones de células \beta humanas aislada (HP), porcinas fetales (FP) y de rata, que se incubaron durante 2 horas con glucosa marcada con ^{3}H y con ^{14}C. Dichos estudios indicaron un incremento en función de la dosis en las proporciones de utilización y oxidación en las tres especies, pero las preparaciones humanas y de fetos porcinos utilizaron de 5 a 10 veces más glucosa que las células \beta de rata (tabla 1). Las células \beta presentaron las proporciones inferiores de oxidación de la glucosa que alcanzaron su máximo con glucosa 5 mM; dicho intervalo de oxidación en función de la dosis se corresponde con el intervalo de libe-
ración y síntesis de la insulina en función de la dosis cuando las células \beta fetales se exponen a la glucosa (figura 5).

Ejemplo V

Las preparaciones de células endocrinas porcinas fetales pueden normalizar la diabetes en ratones.

Las preparaciones celulares obtenidas tal como se ha descrito en el ejemplo I se reagregaron durante la noche mediante incubación con agitación giratoria (Queu Orbital Shaker a 21 rpm) a un 5% de CO_{2} en aire a 37ºC en placas de Petri bacteriológicas de 14 cm con una densidad de aproximadamente 10^{5} células/cm^{2}. Los agregados se implantaron en ratones atímicos inmunodeficientes que se habían convertido en diabéticos mediante la inyección intravenosa de 90 mh/kg de peso corporal de aloxán. Se anestesiaron los animales con avertina y se realizó una incisión en la piel dorsolateral en el nivel del riñón, se extrajo el riñón y se realizó una pequeña incisión en la cápsula renal; se introdujo un obturador entre la cápsula renal y el parénquima renal y se separó cuidadosamente la cápsula del tejido subyacente. Las células pancreáticas porcinas reagregadas se recogieron de su placa de cultivo y se colocaron en un pequeño volumen de medio de HAM F10 que contenía un 5% de suero de ratón sin complemento tras lo que se pusieron en tubos estériles de plástico fino cerrados en los extremos mediante dos pinzas quirúrgicas metálicas, y posteriormente se centrifugaron a mano durante 2' a aproximadamente 100 rpm. Inmediatamente antes de la implantación se cortó la punta del tubo y se inyectó el material sedimentado bajo la cápsula renal en un receptáculo preparado mediante las cánulas. La abertura en la cápsula renal se suturó utilizando un dispositivo eléctrico de cauterización a bajas temperaturas y se volvió a colocar el riñón en la cavidad corporal tras lo que se cerró la incisión con puntos de sutura. Se realizó el seguimiento de los animales semanalmente determinando su glucemia en ayunas a partir de una gota de sangre obtenida de la vena de la cola utilizando un glucómetro y se extrajo el injerto tras 40 a 200 días y se determinó el contenido en insulina.

Los animales trasplantados presentaron una normalización de sus niveles de glucemia de 4 a 14 semanas tras el implante y permanecieron normoglucémicos durante más de 100 días (tabla 2). Dicha normalización no era debida a la insulina restante en el páncreas, ya que los niveles de insulina extraídos en dicho órgano resultaron de < 0,6 \mug/órgano (el contenido de insulina pancreática de animales no diabéticos es de 15 - 25 \mug). El contenido de insulina del injerto resultó de 5 a 25 \mug en el momento del implante y aumentó hasta diez veces durante los 200 días del período de seguimiento.

La rapidez de la normalización varió con el número de células \beta implantadas, tardando 10 semanas en el caso de los implantes con 0,8 millones de células \beta, 8 semanas en el caso de 1,6 millones de células \beta y 4 semanas en el caso de 3 millones de células \beta. Las células \beta maduran tras el trasplante: pierden su positividad para la citoqueratina 7 en 10 días. Su función glucostática mantiene unos niveles bajos de glucosa en el animal trasplantado, incluso tras una provocación con glucosa oral (figura 6).

La perfusión in vitro de un riñón de ratón nu/nu que contiene un injerto de células pancreáticas fetales tal como se ha descrito anteriormente demostró que las células \beta del riñón respondían a la glucosa. En la figura 7 se presentan los resultados de la perfusión de un injerto 112 días tras su implante. Se observó una respuesta de liberación de insulina en función de la dosis que se podía aumentar con 10 mM de glucagón.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Efecto del cultivo en la composición celular de la preparación de células porcinas fetales "inmaduras": (a) porcentaje de células endocrinas determinado por microscopia electrónica (b) porcentaje de insulina ( ) y glucagón () determinado mediante inmunocitoquímica. Los datos expresan el porcentaje del total de células contadas y representa la media \pm SEM [error típico de la media] de 3 - 11 determinaciones.

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Figura 2: Inmunocitoquímica para la citoqueratina 7 () y la sinaptofisina () en preparaciones de células endocrinas porcinas fetales durante 9 semanas de cultivo. Virtualmente todas las células permanecen positivas para la sinaptofisina mientras que el porcentaje de células positivas para la citoqueratina 7 disminuye progresivamente con el tiempo de cultivo. Se observa un rápido descenso en la positividad para la citoqueratina 7 (reducción a menos del 20 por ciento en 24 horas) cuando se omiten la hidrocortisona y la nicotinamida del medio de cultivo.

Figura 3: Condiciones de la FACS para el aislamiento de células no granuladas (a; ventanas R1 y R2), células \beta inmaduras (b; ventana R1), células que contienen glucagón (c; ventanas R3 + R4).

Figura 4: Biosíntesis de la insulina mediante células porcinas fetales en función de la concentración de glucosa en el medio.

Figura 5: Liberación de insulina de células fetales cultivadas en función de la concentración de glucosa en el medio. Las células se cultivaron durante un largo período en un medio que contenía glucocorticoides y nicotinamida, tras lo que se eliminaron estos dos últimos componentes del medio de cultivo durante las 24 horas previas al experimento de perfusión.

Figura 6: Ensayo de tolerancia a la glucosa intraperitoneal en ratones atímicos normales de control (o) y en diabéticos trasplantados.

Figura 7: Maduración in vivo de células \beta porcinas fetales. Veinte semanas tras el trasplante de las células \beta porcinas fetales bajo la cápsula renal, los riñones se sometieron a perfusión a distintas concentraciones de glucosa. Se observa una estimulación de la liberación de insulina en función de la dosis entre 2,5 y 20 mM de glucosa, lo que constituye una indicación de una maduración funcional.

TABLA 1 Utilización de la glucosa y oxidación de la glucosa por parte de células endocrinas pancreáticas porcinas fetales (FP), humanas y de ratas

1

TABLA 2 Efecto de los implantes de células de los islotes porcinas fetales en ratones atimicos diabéticos

2

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En los documentos que figuran en la descripción

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La lista de documentos indicada por el solicitante se ha confeccionado exclusivamente para información del lector y no forma parte de la documentación de la patente europea. Dicha lista se ha elaborado con gran esmero. Sin embargo, la Oficina Europea de Patentes declina toda responsabilidad por eventuales errores u omisiones. Literatura de no patentes citadas en la descripción

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\bulletWARNOCK et al. Diabetologia, 1992, vol. 35, 8995 [0003]

\bulletRICORDI et al. Transplantation, 1992, vol. 53, 407-414 [0003]

\bulletGORES et al. Lancet, 1993, vol. 341, 19-21 [0003]

\bulletSCHARP et al. Transplantation, 1991, vol. 51, 76-85 [0003]

\bulletKORSGREN et al. Surgery, 1993, vol. 113, 205-214 [0005]

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\bulletLU et al. Xenotransplantation, 1998, vol. 5, 154-163 [0005]

\bulletGROTH et al. Lancet, 1994, vol. 344, 1402-1404 [0005]

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\bulletKEYMEULEN et al. Diabetologia, 1997, vol. 40, 1152-1158 [0005] [0021]

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\bulletLING; PIPELEERS. Endocrinology, 1994, vol. 134, 2614-2621 [0054]

Claims

1. Método in vitro para la producción a gran escala de una preparación de células endocrinas pancreáticas maduras e inmaduras que comprende la etapa de disgregar el órgano pancreático completo, comprendiendo los islotes de Langerhans, en células y pequeños agregados celulares, sin aislar los islotes de Langerhans en una forma en la que se encuentran en el páncreas intacto y que comprende, además, la etapa de, preferentemente mediante decantación por contracorriente, eliminar las partículas superiores a 100 \mum.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el tejido pancreático intacto se disgrega mediante incubaciones secuenciales con agitación, en primer lugar en presencia de colagenasa y en segundo lugar en un medio sin calcio.

3. Método según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dichas incubaciones con agitación se alternan con una centrifugación a través de una capa con una densidad < 1,04 g/ml.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además la etapa de, preferentemente por decantación por contracorriente, retener de dicha suspensión celular la fracción de células simples con un tamaño <
15 \mum, preferentemente con un tamaño de 6 - 15 \mum.

5. Método según la reivindicación 4, que comprende además la etapa de enriquecer dicha suspensión celular en células endocrinas inmaduras y/o maduras.

6. Método según la reivindicación 5, en el que las células acinares contaminantes se eliminan mediante centrifugación en gradiente de densidad a través de una capa con una densidad de 1,075 g/ml.

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además la etapa de, preferentemente por decantación por contracorriente, retener de dicha suspensión celular la fracción de agregados celulares con un tamaño de 15 a 100 \mum.

8. Método según la reivindicación 7, que comprende además la etapa de enriquecer dicha suspensión celular en células endocrinas inmaduras y/o maduras.

9. Método según la reivindicación 8, en el que las células acinares contaminantes se eliminan mediante centrifugación en gradiente de densidad a través de una capa con una densidad de 1,075 g/ml.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que las preparaciones de células dispersas de la fracción < 100 \mum se utilizan para purificar adicionalmente células \beta con un fenotipo maduro o inmaduro, células \alpha que contienen glucagón, y/o células no granuladas que contienen células endocrinas precursoras, mediante (auto) citofluorometría de flujo (FACS).

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 y 8 a 10, en el que las células endocrinas pancreáticas inmaduras se enriquecen, mediante el cultivo en suspensión en un medio sin suero que contiene glucocorticoides y nicotinamida.

12. Método según la reivindicación 11, en el que las células endocrinas pancreáticas inmaduras se maduran in vitro en un medio sin suero.

13. Método según la reivindicación 11, en el que las células endocrinas inmaduras se mantienen adicionalmente añadiendo suero.

14. Método según la reivindicación 13, en el que las células se cultivan durante por lo menos 4 semanas.

15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el tejido pancreático se obtiene a partir de fetos de cerdo.

16. Método según la reivindicación 15 en el que el feto de cerdo se obtiene a partir de una cerda gestante de por lo menos 108 días de gestación.

17. Preparación que comprende células y agregados celulares de células endocrinas pancreáticas maduras e inmaduras que se pueden obtener mediante el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

18. Preparación de células endocrinas pancreáticas viables que comprende células inmaduras de menos de 15 pm, que contienen más del 40% de células endocrinas intactas que se pueden obtener mediante el método según la reivindicación 6.

19. Cultivo celular de la preparación según la reivindicación 18 que comprende por lo menos un 70% de células endocrinas.

20. Cultivo celular según la reivindicación 19, en el que por lo menos el 40% de las células son células que contienen insulina.

21. Cultivo celular según la reivindicación 20, en el que por lo menos el 40% de las células son inmunoreactivas a la insulina.

22. Cultivo celular según la reivindicación 20, que demuestra una actividad biosintética de insulina superior a 10 fmol / 10^{3} células \beta / hora.

23. Cultivo celular según la reivindicación 22, caracterizado porque comprende entre un 60 y un 80% de células endocrinas.

24. Preparación según las reivindicaciones 17 ó 18, o cultivo celular según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, para utilizar en el tratamiento de la diabetes mellitus, preferentemente en humanos.

25. Preparación según las reivindicaciones 17 ó 18, o cultivo celular según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, para utilizar en procedimientos de diagnóstico.

26. Utilización de la preparación según las reivindicaciones 17 ó 18, o cultivo celular según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, en la selección de fármacos.