KR19990067077A

KR19990067077A - 기능성 랑게르한스 섬의 시험관내 성장 및 그 생체내 사용방법

Info

Publication number: KR19990067077A
Application number: KR1019980703017A
Authority: KR
Inventors: 아몬 비. 펙; 자넷 지. 코넬리우스
Original assignee: 로널드 엠. 쿠드라; 유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 인크.
Priority date: 1994-04-28
Filing date: 1996-10-23
Publication date: 1999-08-16
Also published as: US6001647A

Abstract

본 발명은, 최초로, 시험관내 배양으로 기능성 섬의 성장을 가능케 하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 당뇨병의 생체내 치료를 위하여 포유동물에 이식하기 위한 시험관내 생성 섬형 구조물의 이용에 관한 것이다. 본 발명은 다시, 정상 췌장 조직에서 관측되는 것과 같은 기능적, 형태학적 및 조직학적 특징을 지닌 생체내 기관을 성장하기 위하여 시험관내 성장 섬 이식편을 사용하는 방법에 관한 것이다. 시험관내에서의 이들 세포 및 생체내에서의 이들 기관의 성장능력은 당뇨병과 관련된 연구 및 치료에 있어서 중요한 새로운 수단을 제시하고 있다.

Description

기능성 랑게르한스 섬의 시험관내 성장 및 그 생체내 사용방법

발명의 배경

당뇨병은 하나의 주요한 일반 대중의 건강 문제이다. 국립 당뇨병 자문회 (National Diabetes Advisory Board)에 의하여 의뢰된, 당뇨병을 퇴치하기 위한 국가 장기 계획의 1987년 보고서 (1987 Report of The National Long-Range Plan to Combat Diabetes)에 제시된 바와 같이, 미국에서 600만명이 당뇨병을 앓고 있는 것으로 알려져 있으며, 다시 500만명이 아직 진단되지 않은 질병을 갖고 있다. 해마다, 50만 이상의 새로운 당뇨병 환자가 확인되고 있다. 1984년에 당뇨병은 35,000 미국인 사망의 직접적인 원인이 되었으며 별도의 95,000인의 사망에 관련되는 요인을 제공하였다.

당뇨병에 의한 시각상의 합병증은, 미국내 20 ~ 40세 국민에 있어서의 새로운 경우의 법적맹의 선도요인이 되고 있다. 하지 절단 위험은 당뇨병을 지닌 자가 당뇨병을 지니지 않은 사람보다 15배나 높다. 신장병은 흔하고도 심각한 당뇨병의 합병증이다. 말기 상태의 신장병 치료를 받고 있는 미국내의 모든 신규 환자의 약 30%가 당뇨병을 갖고 있다. 당뇨병을 지닌 사람은 치주에 생기는 질병의 위험도 높다. 치주염은 신속히 진전되어 치아를 상실하게 될 뿐만 아니라, 신진대사 기능을 손상시키게 된다. 당뇨병을 지닌 여성은 심각한 임신 합병증의 위험이 있다. 현재 통계로는, 당뇨병을 지닌 산부의 영아 생존율은 약 7%이다.

분명히, 당뇨병의 경제적 부담은 막대하다. 해마다, 당뇨병 환자 또는 그 합병증 환자가 병원에서 지내는 날은 2400만일이나 된다. 줄잡은 어림으로, 당뇨병에 소요되는 1년간 비용은 240억불 (미국 당뇨병협회 추정, 1988)이 되나; 당뇨병 자체보다도 오히려 당뇨병의 특정 합병증에 흔히 별도의 의료 비용이 소요되기 때문에, 이 질병으로 인한 전반적인 경제적 충격은 보다 심각한 것이다.

당뇨병은 신체가 탄수화물, 지방 및 단백질을 적절히 유지하고 사용하는 것을 불가능하게 하는, 만성의 복합 대사성 질환이다. 이것은 다양한 유전적이며 환경적인 요인의 상호 작용에 의하여 초래되며, 인슐린 생성의 결핍 또는 그 사용의 손상에 의하여 야기되는 높은 혈당량을 특징으로 한다. 당뇨병의 대부분의 경우는 2가지의 임상 형태에 속한다: 형태 I, 즉 소아형 및 형태 II, 즉 성인형이다. 형태 I 당뇨병은 흔히 인슐린 의존성 당뇨병 즉 IDD라 불리운다. 각 형태는 상이한 예후, 치료방법 및 원인을 갖는다.

약 5 ~ 10%의 당뇨병 환자가 IDD이다. IDD는 통상 랑게르한스의 췌장 섬의 인슐린 생성 β세포의 파괴에 기인하는, 부분적 또는 완전한 인슐린 생성 불능을 특징으로 한다. IDD 환자는 매일 인슐린을 주사하여 그 질병을 제어하지 않으면 사망하게 된다.

1970년대 중반까지 당뇨병의 병인을 해명하는데 있어서 몇가지 진전이 있었는데, 이때 형태 I IDD가 자동면역 원인 병인론을 갖고 있다는 증거자료들이 수집되기 시작하였다. 현재는 IDD가, 유전학적으로 발병할 소질이 있는 사람의 랑게르한스의 췌장 섬의 인슐린 생성 β세포를 선별적으로 파괴하는, 진행성 자동면역 반응으로부터 기인하는 것으로 일반적으로 받아들여지고 있다. IDD의 β세포에 대한 자동면역은 체액 (벡케스코브 (Baekkeskov) 등, 1982; 벡케스코브 등, 1990; 레디 (Reddy) 등, 1988; 폰테실리 (Pontesilli) 등, 1987) 및 세포 - 매개 (레디 등, 1988; 폰테실리 등, 1987; 왕 (Wang) 등, 1987) 면역 메카니즘 모두와 관련된다. 체액 면역은, β세포막에 대한 자동항체의 표출 (항 - 69kD 및 섬 - 세포막 자기 항체), β세포 함량 (항 - 카르복시펩티다아제 A1, 항 - 64kD 및 / 또는 항 - GAD 자기항체), 및 / 또는 β세포 분비 생성물 (항 - 인슐린)을 특징으로 한다. 혈청은 IDD를 옮기지 않으나, 항 - β세포 자기항체는 매우 어릴때 발생하여, 환경적인 자극에 대한 의문을 일으키며, 아마도 항원의태와 관련된다. IDD의 자연 경과중의 세포 - 매개 면역학적 반응성의 존재는, 인슐린 염이라고 하는, 췌장 섬내의 염증성 장애로 증명되었다. 염증성 / 면역 세포 침윤물이 조직학에 의하여 선명하게 눈에 보이는 인슐린 염은, T 및 B 임파구, 백혈구 및 천연 킬러 세포를 포함하는 수많은 세포형태를 포함하는 것으로 알려져 왔다 (시그노어 (Signore) 등, 1989; 자아페 (Jarpe) 등, 1991). 인체 IDD의 모델로서 NOD (비 - 비만 당뇨병, Non-Obese Diabetic) 생쥐를 사용하는 양자 면역세포이입 실험은, IDD의 병인에 있어서 자동 - 공격형 T 임파구에 대한 주요 역활을 확립하였다 (벤델락 (Bendelac) 등, 1987; 밀러 (Miller) 등, 1988; 하나후사 (Hanafusa) 등, 1988; 벤델락 등, 1988). 유감스럽게도, 췌장 β세포 파괴의 근원적인 메카니즘은 미지의 상태로 남아 있다.

하기 간행물에 보고된 연구결과를 포함하여, 배양 췌장세포에 대한 최근의 연구는, 배양중 단층으로 또는 응집체로서 성장하는 분화된 또는 부분적으로 분화된 세포의 배양물에 초점이 모아지고 있다. 이들 보고서와는 대조적으로, 본 발명은, 기관원기성진화(器官原基性進化, neogenesis)를 통하여 생체내에서 생성된 정상적인 섬에 훨씬 더 유사한 세포기관의 형태 및 정도를 지닌 섬형 구조가 생성되는 방법 및 구조를 개시한다.

가즈다아(Gazdar) 등 (1980)은 이식 가능한 쥐 섬세포 종양으로부터 구축된, 연속적인 클로날, 인슐린-및 소마토스타틴 (성장 호르몬 분비억제 호르몬)-분비 세포주를 개시하였다. 그러나, 개시된 세포는 종양 형성적이며 다분화능성이 아니였다.

브로더스(Brothers, A.J.)(WO 93/00441, 1993)는 장기간 배양에서 유지된, 췌장 세포를 포함하는, 호르몬 분비세포를 개시하였다. 그러나, 배양된 세포는 다분화능성 간(幹)세포와는 대조적으로 분화된 것으로, 이것은 췌장형 구조물을 재생시키는 그 능력과는 대조적으로, 그 호르몬 분비 표현형을 위한 초기 단계에서 분비된다.

코오스그렌(Korsgren) 등은 태아 돼지 췌장세포의 분화를 유도하기 위한 화합물의 시험관내 스크린을 개시하였다. 본 발명은 태아조직의 사용에 의존하지 않는다.

닐센(Nielsen, J.H.)(WO 86/01530, 1986)은, 완전히 또는 부분적으로 분화된 베타세포의 증식방법을 개시하였다. 그러나 이 방법은, 배양으로 성장된 섬세포의 공급원으로서, 태아조직에 의존하고 있다.

맥에보이(McEvoy) 등 (1982)은 태아 쥐섬의 조직 배양 방법을 개시하고, A, B 및 D 세포의 합성배지 유지, 성장 및 분화에 대한 혈청의 효과를 비교하였다. 역시, 섬세포의 공급원은 태아조직이다.

자야스(Zayas) 등 (EP 0363 125, 1990)은 췌장 내분비세포의 증식방법을 개시하였다. 이 방법은 태아 췌장 조직의 사용에 의존하며, 이식을 위하여 이들 세포를 매몰하기 위하여 교원질을 포함하는 합성구조가 마련되어야 한다. 이식시에 이와같이 생성된 배양세포의 응집체는 혈당량에 일정 효과를 미치기까지는 60∼90일이 소요되며, 유글리세미아(euglycemia)가 근접할 때까지는 110∼120일이 요구된다. 대조적으로, 본 발명은 그 조직화의 유지에 교원질 또는 기타 합성수단이 요구되지 않는 시험관내 성장 섬형구조물을 제공하는데, 이식시에 수용체의 당혈증 상태에 보다 신속한 효과를 제공한다.

쿠운(Coon)등 (WO 94/23572, 1994)은 췌장세포의 확장된, 비-형질전환 세포 배양주의 제조방법을 개시하였다. 응집된 배양세포는 다음에 이식용 교원질 기재에 매몰되었는데, 자야스 등의 상기 구조물에 수반되는 단점 및 본 발명에 의하여 생성된 구조물과의 차이가 인식되었다.

앞서의 보고서에도 불구하고, 기능성 섬형 구조물이 인슐린, 글루카곤 및/또는 소마토스타틴을 발현하는 세포를 함유하며, 인슐린, 글루카곤 및/또는 소마토스타틴이 임상적으로 당뇨병 포유동물에 이식될 수 있어서, 해당 포유동물이 건강 상태를 유지(인슐린 처리의 제거후에)하게 되는 본 발명은 놀라운 것이다. 이것은, 랑게르한스의 췌장섬의 종래 및 면역형광 조직학(라세이(Lacey)등 1957; 바움(Baum) 등 1962; 두보이스(Dubois) 1975; 펠레티어 (Pelletier) 등 1975; 라아손(Larsson) 등 1975)과 함께 최근의 3차원 영상 (브렐제 (Brelje)등, 1989)이 혈당량의 변화에 신속하면서도 양호하게 조절된 반응에 이상적인 췌장섬의 현저한 구축 및 세포 구성을 나타냈기 때문이다. 특히 배형성 중에, 췌장내의 섬 발달이 췌장 관상피세포(픽텟트(Pictet) 등, 1972) 즉 비-섬세포와 일차적으로 결합된 미분화 전구체 세포로부터 개시되는 것으로 보인다는 것을 생각할 때, 상기와 같은 구조물이 시험관내에서 생성될 수 있다는 것은 예상될 수 없다. 관상피세포는 신속히 증식된 후 다양한 섬-결합 세포집단으로 분화된다. (헬러스트롬(Hellerstrom), (1984; 와이어(Weir) 등, 1990; 타이텔만(Teitelman) 등, 1993; 비이티(Beatti) 등 (1994). 얻어진 섬은 장구형 구조물로 구성되는데, 여기서 인슐린 생성 β세포는 비-β세포의 맨틀에 의하여 포위된 코아를 형성한다. 대부분, 글루카곤 생성, α세포(섬이 배엽으로부터 유도된 경우) 또는 변형된 방법으로, 췌장 펩티드-생성 PP세포(섬이 복엽으로부터 유도된 경우)가 외각 피질에 체류한다(상기 브렐제 등, 1989; 상기 와이어 등, 1990). 천연적으로 모수석상인 소마토스타틴-생성 δ 세포는 내부 피질에 체류하며, α(또는 PP)세포 및 β세포를 자극하기 위하여 의족을 뻗는다. 이들 장구형 섬구조는 관상피세포로부터 새 조직을 만들어 분리하여 주변 외분비 조직으로 단거리 이동하기 쉽다. 혈관형성-유도 혈관화는 성숙 섬으로의 직접적인 세동맥 혈류를 초래한다(보너-와이어(Bonner-Weir) 등, 1982; 타이텔만 등 1988; 멘저(Menger) 등 1980). 혈당이 β세포 증식을 자극할 수 있기 때문에, 혈관화는 β세포의 수를 더욱 증가시키는 작용을 할 수도 있다. 마찬가지로, 신경발생은 교감, 반교감 및 펩티드성 신경세포를 지닌 섬의 신경지배를 하게 된다(상기 와이어등, 1990). 본 발명자들이 실험관내에서 기능성 섬형 구조물을 생성할 수 있었고, 상기 구조물은 다음에 이식되어 췌장형 구조물을 생성할 수 있다는 것은, 따라서 매우 괄목할 만한 현상이다.

유감스럽게도, 섬의 세포조직화는 형태 I, 인슐린 의존성 당뇨병(Insulin Depenslent Diabeters, IDD)과 같은 질병에서 파괴될 수 있는데, 여기서 진행형 체액성 및 세포-매개 자동면역 반응은 인슐린 생성 β세포의 특정 파괴를 초래한다(아이젠바아스(Eisenbarth), 1986; 레이터(Leiter) 등, 1987). β세포는 대부분, 분화된 말단 단계 세포로 생각되기 때문에, 몸체는 새로운 β세포를 생성할 능력이 제한되어, β세포 집단이 일단 파괴되면 규칙적인 생활로 장기간의 인슐린 치료가 필요한 것으로 믿어진다. 그러나, 실험동물에 있어서, β세포 집단은 유글리세미아를 유지하기 위하여 증가 및 감소하는 것으로 나타났다(보너-와이어 등, 1994). 가소성은 섬 성장의 2개의 경로를 통하여 일어날 수 있다: 첫째는 췌장 관상피세포의 분화에 의한 신규 섬의 성장 또는 네오게네시스에 의하여 및 둘째는 선재(先在)하는 β세포의 복제를 통한 확장 또는 비대가 그것이다. 배형성중에, β세포 집단은 우선 신규 세포의 분화로부터 확대되나, 후속 태아 단계에 의하여, 분화된 β세포는 복제한다. 다음에 복제는 출생후의 주요 확장 수단인 것으로 여겨지나, 복제능력은 연령과 함께 소멸하는 것으로 보인다. 성체 섬세포는, 글루코오스, 성장 호르몬 및 7, 8개의 펩티드 성장인자와 같이, 신생아기 섬세포 성장을 개시하는 것으로 알려진 자극에의 반응에 의하여 복제하는 것으로 나타났다(스웬 (Swenne) 1992; 헬러스트롬 등, 1988; 보너-와이어 등, 1989, 마리니센(Marynissen)등, 1983; 네일센(Neilsen)등 1992; 브렐제 등, 1993). 이와같은 관측은, 성체내에 β세포 성장수준이 낮으면 기능성 요구를 충족시킬 수 있다는 것을 암시한다. 예를들면, 임신 또는 만성 비만중에, β세포 집단은 현저히 증가하면서도 가역성인데, 그것은 임신종결 후 또는 체중 감소후에, 세포소멸을 통한 β세포 사망의 증가현상이 β세포 집단을 신속히 감소시키기 때문이다.

모든 췌장 내분비 세포형이 동일 관상피세포로부터 분화된다는 것이 일반적으로 수긍되고 있으나 (상기 필텟 등; 상기 헬러스트롬, 1984; 상기 와이어등 1990; 상기 테이텔만등 1993), 그들이 일반적인 간세포/전구세포로부터 유도되었는지의 여부는 불확실하다. 정상적인 성체 췌장에 있어서, 관상피세포내의 약 0.01%의 세포가 섬세포 호르몬을 발현하며, 자극을 받아 신규의 섬, 네오게네시스의 회상체(reminiscent)를 형성하기 위하여 형태학적인 변화를 받을 수 있다. 이 네오게네시스(기관원기성진화)는, 대두 트립신 억제제에 의한 식사처리 (위버(Weaver) 등, 1985), 다량의 인터페론-γ(구 (Gu) 등, 1999), 부분적 췌장제거 (보너-와이어 등, 1993), 셀로판의 췌장 헤드의 포장 (로센버어그 (Rosenberg) 등, 1992), 특정 성장인자 (옥톤코스키 (Octonkoski) 등, 1994) 및 임상적 IDD의 개시에 의하여 실험적으로 유도되어 왔다. 최근에는, Reg 유전자 (와타나베 (Watanabe) 등, 1994, 오톤코스키 (Otonkoski) 등, 1994)에 관심이 모아지고 있는데, 이것은 섬 β세포의 네오게네시스에 있어서의 조절인자로서, 재생성 쥐섬의 공제된 cDNA 라이브러리에서 확인된다. Reg 유전자의 상향 조정(예를들면, 간(肝)세포 성장인자/산란계수에 의하여)은 β세포를 유도하여 질량의 증가를 초래하는 반면에, Reg 유전자의 하향조정(예를들면, 니코틴아미드에 의하여)은 '프리-β' 세포의 분화를 유도하여 세포를 성숙시킨다. 따라서 전구세포/간세포의 집단은 성체췌장 관에 잔류하며, 이 집단의 분화는 특정 자극에 대응하여 생체내에서 유발될 수 있다. 이 작용은 낮은 수준에서 실제적으로 계속 일어날 수도 있다.

시험관내에서 섬 네오게네시스를 재생성하기 위하여 상당한 노력을 하여 왔으나, 성공한 예를 극소수다. 본 발명자들은 최초로, 배양으로 포유동물-유도 섬-생성 간세포(IPSC, Islet-Producing Stem Cell)의 성장 및 확장은 물론 그들의 섬형 구조물로의 분화를 기술한다.

췌장 β세포에 대한 면역학적 공격을 저지하기 위한 가능한 수단으로서, 수많은 방법 (예를들면, 골수이식, 면역억제약 및 자기항원 면역화)이 조사되어 왔다. 그러나, 이들 시도가 효과적이기 위하여는, 마침내 임상적 질병으로 발전한 환자가 확인되어야 한다. 대개는, 많은 백분율의 β세포가 이미 파괴된 지점까지 면역학적 발작이 진전되기 때문에, 환자는 효과적인 개입 치료를 하기에는 너무 늦게 확인된다. β세포는 말기 특수화 세포로 생각되기 때문에, 몸체는 신규의 β세포를 재생성하기에는 용량이 작아서, 정규적인 수명 긴 인슐린 치료를 필요로 한다고 이전에는 믿어왔다. 최근, 이와같은 문제점을 주목하기 위한 하나의 시도는 섬 세포 이식술이다. 섬 세포 이식술은, 섬이 변질유전자형이어서 다음에 동종 면역을 일으킬 수 있다는 단점이 있다. 따라서 IDD 환자로부터 직접 기능적 β세포를 함유하는 랑게르한스 섬을 성장시키면 큰 장점을 지니게 된다.

발명의 요약

본 발명은 인슐린 생성 β세포 및 기타 섬 세포 형태를 함유하는 기능적 섬이, 섬생성 간세포, IPSC를 발생시키는 단일 다분화능성 간세포로부터 장기간 배양으로 성장될 수 있다는 발견에 관한 것이다.

본 발명의 신규 방법은 IPSC가 성체의 췌장에도 존재한다는 발견을 이용하고 있다. 세포는 정상 혈청으로 보충되는 고아미노산 영양 배지에서 배양될 수 있는데, 상기 정상 혈청은 섬 세포의 근원 역활을 하는 동일 포유동물류로부터 바람직하게 유도된다 (상동 혈청). 세포성장의 몇 개의 불연속 상은 IPSC의 선택 및 뒤이어 후대를 초래하게 되고, 후대는 다음에 분화 및 섬형 구조물의 형성으로 유도되는데, 섬형 구조물은 종래 기술의 가상 섬 또는 가상 췌장 조직과 구별가능하다. 첫째 상에서, 췌장으로부터의 세포의 일차 배양물이 저 혈청, 저 글루코오스, 고 아미노산 기본 배지에 놓인다. 이 배양주는 다음에 수주일 동안 방해받지 않는 상태로 남아 기질 세포의 정착을 허용하고 대부분의 분화된 세포가 죽도록 된다. 일단 이 기질 세포층이 성숙하면, 상동성의 정상 혈청과 글루코오스로 보충된 고 아미노산 배지로 세포 배양주를 재공급함으로써 세포 분화가 개시될 수 있다. 추가 기간의 성장 후, 인슐린, 글루카곤, 성장 호르몬 분비억제 호르몬 및 기타 내분비 호르몬을 생성하는 세포를 함유하는 기능성 섬이, 표준 기술을 사용하여 회수될 수 있다.

췌장 유도 비-섬세포(관유도 세포)가 배양에 있어서 β세포를 포함하는 신규 섬형 구조물의 성장에 사용될 수 있다는 것은, 이전에는 알려지거나 추측되지 않았다. 시험관내에서 섬형 조직의 성장을 위한 배양 기술의 뜻밖의 발견은, 당뇨병 연구에 있어서 종전에 실질적으로 오랫동안 장벽이 되었던 문제점을 제거하게 된다. 여기에 기술된 신규방법 및 물질은 당뇨병의 메카니즘을 보다 용이하게 이해할 수 있게 한다. 또한, 배양으로 IPSC로부터 섬형구조물을 생성시키는 능력은, 최초로 가능한 소정의 당뇨병 치료방법을 제시하게 된다. 예를들면, 본 발명에 따라, 당뇨병 환자로부터의 신규 배양 섬이, 인슐린 치료에 대한 환자의 필요성을 조절 또는 제거하는 방법으로서, 환자에 이식될 수 있는데, 그것은 배양된 섬 및/또는 섬 세포가 생체내에서 생성할 수 있기 때문이다. 따라서 본 발명은, 본 발명의 시험관내 성장 섬을, IDD의 생체내 치료를 위하여 포유동물류에 이식하는데 사용하는 것과도 관련된다.

본 발명은 또한, 수반되는 면역학적 파괴에 저항하는 섬 세포의 유전자 조작을 매우 용이하게 한다. 예를들면, 배양된 섬 세포는, 파괴적 면역공정을 억제 또는 방지하는 단백질 또는 펩티드를 발현하도록 형질전환될 수 있다. 기타 유용한 단백질 또는 펩티드가 발현될 수 있다. 또한, GAD, 64kD 섬세포 표면 항원과 같은 특정 자기항원(페이톤(Payton)등, 1995 참조)이나, 분화된 췌장세포상에서 확인된 임의의 기타 마아커의 발현이, 자기 면역 침해를 받지 않거나 거의 받지 않는 분화된 췌장세포를 생성하기 위한 선별공정 또는 표준 유전자 넉 아웃법에 의하여 제거될 수 있다. 이와같은 변이체 또는 넉아웃 세포주의 제조방법은 당분야에 잘 알려져 있는데, 예를들면 미국특허 제5,286,632; 미국특허 제5,320,962; 미국 특허 제5,342,761 및 WO 90/11354; WO 92/03917; WO 93/04169; WO 95/17911에 개시되어 있는 동질성 재조합 방법이 포함되는데, 이들 모두를 여기서 참고로 인용한다. 또한 세포가 췌장형 구조물로 분화하는 것과 같이 인체 백혈구 항원(HLA) 마아커를 발현하지 않도록 변형된 간세포를 준비함으로써, 만능 급혈자 세포가 생성된다(특히, 상기 WO 95/17911 참조).

즉, 개체의 췌장 세포로부터 시험관내 기능성 섬을 성장시키는 능력은, 주요한 기술적 표현을 나타내며, IDD를 치료 및 연구하는 신규 방법의 사용을 용이하게 한다. 다분화능성 간세포가 성인 췌장에 존재한다는 발견으로, 세포의 공급원으로서 태아 조직을 사용할 필요성이 없게 된다(예외없이).

본 발명은 또한 여기에 기술된 방법에 따라 시험관내에서 생성된 섬세포에 관한 것이다. 이들 세포는 시험관내에서 배양된 포유동물 췌장세포 부유액으로부터 생성될 수 있으며, 기능적 섬 세포 및 섬형 조직 구조물을 발생시킬 수 있다.

본 발명은 다시, 다분화능성 간세포 즉, 선조세포, 즉 모든 상이한 형태의 세포를 형성할 수 있는 세포 및 정상적인 췌장을 이루는 조직의 시험관내 성장, 증식 및 분화에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 정상적인 췌장에서 관측되는 것과 유사한, 기능적, 형태학적 및 조직학적 특징을 나타내는 "외-췌장" (ecto-pancreas) 기관 또는 췌장형 구조물을 생성하기 위하여, 시험관내 성장 췌장 간세포를 생체내에서 사용하는 것에 관한 것이다. 따라서, 시험관내 성장 췌장세포로부터 생체내에 기능성 "외 - 췌장"을 생성하는 능력은, 췌장의 손상 또는 파괴를 야기시키는 것으로 알려진 광범위한 췌장병의 치료에 사용될 수 있다.

도면의 간단한 설명

제1A도 내지 1D도는 본 발명의 공정에 따라 성장된 세포를 나타낸다.

제2도는 본 발명에 따라 성장된 섬형 구조물을 나타낸다.

제3A∼3H도는 3A도로부터 시험관내 섬형구조물 발전의 연속 단계를 나타내는데, 3A도는 배양 7∼8주 후의 몇 개의 세포를 나타내며 생존하여 "아접"("bud")하기 시작하며 (제3B도, 상부 우측의 검은 구조), 분리(제3C도, 구역내 몇 개의 위치)되어 여기에 기재된 배양 조건하에서 고도로 조직화된 구조물을 형성한다(제3D∼3H도).

제4도는 고도로 조직화된 형태를 나타내는 제3G∼3H도에 도시된 구조물의 현미경 사진을 나타낸다.

제5도는 중앙에 β-세포 및 주변에 글루카곤 생성 세포를 지닌 구조물의 고도로 조직화된 형태를 나타내는 H/E 착색의 섬형 구조물 횡단면도이다.

제6A∼6F도는 일련의 현미경 사진도인데, 여기서 제3H도에 도시된 바와 같은 섬형구조물이 1차 배양에서 수확된다. 제6B도에 있어서, 구조물은 분해되며 대부분의 세포가 사망되나, 제6C도에서 신규 구조물이 개발된다. 제6D도에서, 몇 개의 신규 구조물이 형성된다. 이 일련의 연속과정 단계는 IPSC가 고갈될 때까지 여러번 반복될 수 있다. 신규 구조물이 형성되는 대신에 제6E도에서와 같이 구조물이 분해되는 경우에 있어서, 분화된 세포는 제6F도에 도시한 바와 같이 증식한다. 쿠운등과 같은 연구자에 의하여 생성된 것으로 생각되는 세포는 이와같은 형태의 증식된 분화세포이다(상기 WO 94/23572 참조).

제7도는 대조 및 인슐린 치료 중단후의 이식 NOD 생쥐의 데이터를 나타낸다.

제8도는 외 췌장을 나타낸다.

약어 및 정의

IPSC는 섬 생성 간(幹)세포이다. IPSC는, 본 발명에 따라 시험관내에서 섬형구조물을 발생시킬 수 있는 능력을 지닌 태아 또는 성체 췌장에서 발견된 관상피세포로부터 유도된 세포의 작은 집단이다 (즉, 이들 세포는 췌장 유도체이나, 분화되지 않는 섬세포이다). 관상피세포가 생체에 이식되면 췌장형 구조물이 형성된다. 췌장형 구조물 및 관상피세포가 생체내에서 천연 췌장 위치 이외의 장소에 이식되면, 췌장형 구조물은 외췌장이라 부른다.

다분화능성 췌장 간세포는, IPSC를 발생시키는 췌장에서 발견되는 세포이다.

성숙 섬세포는, IPSC로부터 발생되며 췌장 호르몬을 생성하는 분화된 세포이다.

섬형 구조물, 또는 젊은 섬은, IPSC로부터의 배양에서 발생되는 세포의 고도로 조직화된 구조물이다(제 3H도, 제4A도와 4B도 및 제5도에 도시된 횡단면도 참조). 분리된 췌장 조직으로부터의 배양주에 위치하는 IPSC가 아닌 대부분의 세포가 사망한 후에, 구조물은 개별 IPSC에 의하여 형성된 초점으로부터 "아접"한다. 섬형 구조물을 이식하면 최종 분화가 일어나 완전히 성숙된 섬세포를 생성한다.

발명의 상세한 설명

본 발명에 따라, 기능성 랑게르한스 섬이 최초로 시험관내 배양으로 성장될 수 있다. 본 발명의 기술은, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴(성장호르몬 분비 억제 호르몬) 또는 기타 내분비 호르몬을 생성할 수 있는 세포 배양주를 초래하게 된다. 대상 단백질을 코드화하는 DNA로 섬 세포를 형질전환시키는 등의 방법에 의하여, 기타 유용한 단백질도 제조될 수 있다. 이들 기능성 세포 배양주를 성장시키는 능력은 당분야의 숙련자로 하여금 종전에는 불가능 하였던 방법을 실행 가능케 한다. 하기 명세서에서 섬형 구조물이라는 용어는 "젊은 섬"이라는 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있는데, 그것은 시험관에서 생성된 이들 구조물이 정상적인 네오게네시스 중에 생체에서 생성된 이들 구조물이 정상적인 네오게네시스 중에 생체에서 생성된 섬의 대부분의 성상을 갖기 때문이다. 이들 세포의 미성숙 본성은, 신속한 최종 분화 및 혈관화로 생체내 이식을 가능케 하여 결과적으로 당뇨병 또는 전당뇨병 상태의 포유동물과 같은 수용체의 침해받은 아니면 손상된 섬에 대하여 그 치료의 필요성에 있어서 기능성 대체 효과를 제공한다.

본 발명의 방법은 포유동물의 췌장으로부터 간세포를 포함하여, 세포의 부유액을 제조하는 방법을 포함한다. 바람직하게는 간세포는 당뇨병전증 포유동물의 췌장으로부터 얻을 수 있다. 그러나, 이미 당뇨병의 임상 징후를 나타내는 포유동물의 섬생성 간세포, IPSC가 본 발명에 사용될 수 있다는 것도 고려되어야 한다. 세포 부유액은 표준기술을 이용하여 제조된다. 세포부유액은 다음에 IPSC의 성장을 용이하게 하는 동시에, IPSC 이외의 분화된 또는 성숙세포의 지속된 성장을 심하게 손상시키는 영양배지에서 배양된다. 바람직한 구체예에서, 영양배지는 고농도의 아미노산을 지닌 것이다. 그와같은 하나의 배지는 클릭의 EHAA 배지로 잘 알려져 있으며 당분야의 숙련자에 용이하게 얻을 수 있다(펙(Peck) 및 바흐(Bach), 1973, 본 목적을 위하여 여기서 참고로 인용한다). 기타 동등한 영양 배지가 제조되어 당분야의 숙련자에 의하여 사용될 수 있다. 이와같은 배지에 요구되는 것은, 그들이 전혀 또는 거의 글루코오스를 갖지 않으며 (약 1mM 미만), 혈청량이 낮아야 한다는 것이다(약 0.5% 미만). 고 아미노산 농도는, 세포류가 배양되는데 필수적이며 배양된 세포를 위한 탄소 공급원을 제공하는 것으로 알려진 아미노산이 바람직하다. 또한, 최소한 하나의 형성기 지질 전구체, 바람직하게는 피루빈산염이 제공된다. 이들 조건은 대부분의 분화된 세포 형태에 스트레스를 가하여 그들은 생존하지 못한다. 그러나, 놀랍게도, 재공급없이 췌장조직으로부터 세포를 연장배양(약 3주)한 결과, IPSC가 생존하며, 연장 배양후에는 증식되기 시작한다. 후속 배양 상태는, 섬세포의 근원이 되는 포유동물과 동종으로부터 나온 정상혈청으로 보충된 배지를 채택한다. 따라서, 생쥐 랑게르한스 섬의 경우에 있어서, 배지는 정상적인 생쥐 혈청으로 보충되는 반면에, 인체 섬 세포인 경우에는 배지는 정상적인 인체 혈청으로 보충된다. 정상적인 혈청의 제조는 당분야의 숙련자에 잘 알려져 있다. 본 발명의 세포배양법에 사용되는 정상적인 혈청의 농도는 약 0.5% ~ 약 10% 범위인데, 생쥐의 경우는 바람직하게는 약 1%이다. 인체 혈청에 있어서는 약 5% 정도로, 높은 농도가 바람직하다.

정상 혈청 및 약 2.5∼10mM 글루코오스로 보충된 영양배지에서 제조된 세포 부유액은 다음에 세포 성장을 용이하게 하는 조건, 바람직하게는 약 35 ~ 40℃ 및 바람직하게는 약 5% CO2 대기에서 배양된다. 이 배양기간은, 따라서, 당분야의 숙련자에게 잘 알려진 표준 공정을 이용하여 수행된다. 이 기간중에 기질 세포 또는 관상피 세포 또는 증식되며 및 궁극적으로 섬형 구조물을 발생시키는 단층을 구축한다. 세포분화의 개시는, 상술한 바와 같이, 정상 혈청으로 보충된 클릭의 EHAA 등과 같은 배지로 배양주를 재공급함으로써 일어날 수 있다. 재공급을 신속히 하면 세포분화가 상당히 광범위한 섬 초점 및 섬형 구조물 형성을 유도하는 것으로 판명되었다. 본 발명자들은, 재공급 배지에 비교적 높은 농도의 글루코오스 (약 10∼25mM 및 바람직하게는 16.7mM)를 내포함으로써 세포 분화가 더욱 강화된다는 것을 발견하였다. 또한, IPSC의 성장 및 분화를 최적화 및 조절하기 위하여, 이것만에 국한되는 것은 아니나, Reg 유전자를 상향 조절하는 인자, 예를들면 간(肝)세포 성장/산란계수, 및 기타 세포성장인자, 예를들면 인슐린형 성장인자, 표피성 성장인자, 표피세포 성장인자, 선유아 세포 성장인자, 니코틴아미드 및 세포성장 및 분화를 조절하는 기타인자를 포함하는 임의의 다수의 기타 생물학적 인자가 배양체에 첨가될 수 있다는 것이 예상된다. 임의의 이들 다양한 인자 또는 그들 조합을 채택함으로써, IPSC 분화과정 중 파종상태로부터 상이한 단계에서, 상이한 파종 밀도도 및 상이한 시간에, IPSC 배양이 최적화된다. 또한, 성장을 증대시키는 분화과정에서의 IPSC 배양체에 첨가되어, 이들 배양체의 성장 및 분화를 촉진시킬 수 있다. IPSC의 성장 및 분화를 증대시키기 위하여 분화의 초기, 중간 및 후기 단계로부터의 IPSC 배양 상청액을 농축하고 이들 농축물의 능력을 시험함으로써 관련인자가 확인된다. 양성효과는, 양성 및 음성 상청액의 2차원 겔 전기 영동법, 양성 농축물에만 존재하는 스폿트의 정제 및 N-말단 배열결정 및 후속 클론닝 및 이들 인자를 코드화하는 유전자의 발현에 의하여, 농축물내의 분자성분과 상호 관련된다.

섬형 구조물의 세포를 병리학적으로 검사하면, 적어도 3개의 구별되는 세포형태가 식별될 수 있으며, 대조 생쥐의 섬으로부터 분비된 섬 세포와 유사한 것으로 나타났다. 재공급의 빈도 때문에 감소된 이들 초점내에서 세포분화가 발생하는데 소요되는 시간이 증가되었다.

본 발명자들은 섬 - 유도 기질세포와 신규 배양 플라스크에 대한 섬 초점을 연속적으로 이전함으로써 섬 생성 배양주를 증식 및 확대할 수 있었다. 이것은, 예를들면 IDD의 신진대사 문제를 반전시키기 위하여 여기에 기술된 방법에 사용하는데 요구되는 충분한 수의 섬의 생성을 용이하게 한다.

섬형 구조물 및/또는 본 발명에 따라 시험관내 제조된 섬 세포가 IDD를 반전시킬 수 있는지를 결정하기 위하여, 섬형 구조물이 NOD 생쥐에 이식되었다. 섬 이식편을 수용한 생쥐는 인슐린 - 의존 당뇨병의 반전을 나타낸 반면에, 미처리 NOD 생쥐는 임상학적 질병의 징후를 보였다. 또한, 이식편의 존속기간 중 어떤 자기면역 발병도 관측되지 않았다. 따라서 본 발명의 섬 이식편은, 인체를 포함하는 포유동물의 당뇨병 치료를 위하여 생채내에 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 면역학적 침해에 관련된 특정 인자에 대하여 저항하도록 조작된 자가이식 섬의 재이식에 의하여, 당뇨병의 진전이 늦추어지거나 정지될 수 있다. 예를들면, 섬은 세포파괴 T세포에 저항하도록 조작될 수 있다(예를들면, 당뇨병 쥐의 인슐린염 유도 T세포와 유사한 섬 특이적 T-세포 및 T-세포 수용체 배열을 확인하는, 듀리노빅(Durinovic) 등, 1994; 특정 당뇨병 유발성 T-세포 클론의 생성을 중단시킴으로써 NOD 쥐에서의 당뇨병 치료에 유용한 펩티드 서열을 확인하는 엘리아스(Elias) 및 코헨(Cohen), 1994; 콜란드(Conrad) 등, 1994는 섬 침윤성 T-세포의 증식을 촉발시키는 막-결합, 섬세포 초항원을 기재하고 있다; 산타마리아(Santamaris) 등 1994는 B7-1 및 TNFα의 공발현의 필요조건 및 섬세포 붕궤에 관하여 기술하고 있는데; 임의의 이들 항원은 공지의 방법에 따라 제거되어 면역성 침해에 대한 이식 섬의 저항성을 개선시킬 수 있다). 전체 섬을 장기간 배양할 수 있다는 것은, β세포의 세포인식, 섬 침윤의 양식 및 β세포 파괴의 면역 메카니즘을 포함하는, IDD의 병인 조사에도 사용될 수 있다. 또한, 이 기술은 섬 이식, 자가이식 섬 대체 및 인공 섬의 개발도 용이하게 한다. 본 발명의 방법에 따른 이들 세포 및 섬형 구조물의 성장은, 세포 분화 및 기능과 관련된 중요한 관점을 학생들에게 가르치고 이해를 증진시키는데 매우 유용하다.

본 발명의 또다른 구체예에 있어서, ISPC를 발생시키는 다분화능성 췌장 간세포가 포유동물로부터 유리된 췌장세포로부터 시험관내 성장된다. 본 발명의 방법과 관련하여 이들 시험관내 성장 세포를 이용하는 놀라운 발견은, 생체내에서, 기능적, 형태학적, 조직학적 특징 및 세포분화를 포함하여, 내분비 및 외분비 조직을 형성하기 위하여 정상 췌장과 유사한 특성을 나타내는 기관을 성장 및 생성할 수 있는 능력이다. 본 발명에 따라 생체내에서 생성된 외 - 췌장 (몸체내의 비정상 부위에 위치한 기관형 췌장)은 주요한 소정의 발견을 나타내며, 이것만에 국한되는 것은 아니나, 췌장염, 췌장 및 IDD를 포함하는 다수의 췌장 관련 발병 조건의 연구, 처방, 반전 또는 치료를 위한 신규 수단을 제공한다. 이것은 질병 조직을 제거하고, 본 발명에 따라 생성된 섬형 구조물을 이식함으로써 완수된다. 또한, 섬형 구조물은 천연 췌장부위에 이식될 수 있다.

본 발명이 췌장 간세포의 배양 및 시험관내 젊은 섬의 생성방법을 제공하기 때문에, 이 세포 형태의 성장 및 분화에 관한 연구가 현재 가능하다. 따라서, 모든 공지의 세포배양, 정제, 유리 및 분석방법이 췌장 세포 분화에 얼마나 많은 형태의 세포가 관여되는지에 관한 시각한 의문에 효과적인 영향을 줄 수 있다. 이들 방법은, 이것만에 국한되는 것은 아니나, 형광 발색 세포분석 분리(FACS, Fluorescence Activated Cell Sorting), 자기 비드 사용(예를들면, 본 목적에 특이적으로 적용되는, 공업적으로 구입 가능한 DYNA BEADS의 사용), 자기적으로 안정화된 유동화 베드(MSFB, Magnetically Stabilized Fluidized Beds, 미국특허 제5,409,813호 참조), 및 당분야에 공지된 임의의 기타 다수의 방법을 내포한다. 본 공정의 경로는 현재 분석 비평될 수 있다. 본 공정의 각 단계에 특이적인 마아커(세포 표면, 세포내 단백질 또는 mRNA)의 확인도, 이것만에 국한되는 것은 아니나, 세포, 세포표면 마아커, 및 췌장 간세포 성숙의 전과정을 통하여 상이한 세포 성분에 대한 모노클로날 항체를 포함하는 항체의 제조; 성숙 및 분화 공정중 상이한 단계에서 췌장세포에 의하여 발현된 항원에 특이적으로 반응하는 T-임파구의 제조(예를들면, 웨그만(Wegmann) 등 1993 참조); T-세포에 의하여 인식된 세포 표면 마아커의 확인 및 제거 및 따라서 T-세포가, 존재할 경우, 분화된 β-세포 파괴를 초래한다(상기 참조); 상이한 단계의 성숙 및 세포 분화에 의하여 생성된 상이한 인자를 야기하는데 있어서 중요한 인자의 확인; 성숙 공정의 상이한 단계에서의 세포로부터 유리된 핵산의 마이너스 잡종형성. 세포분화의 각 관점에 중요한 유전자 생성물의 지적을 가능케 한다; 분화된 전시 PCR (리앙 (Liang)등, 1992 참조); 임의로 프라임된 PCR(웰쉬(Welsh) 등, 1992 참조); 표현형 차이 분석(Representational Difference Analysis) PCR (RDA-PCR) (리시트신(Lisitsyn), 1993 참조); 적절한 숙주기관에서의 이식을 위하여 단일 췌장 전구세포 또는 그들 집단을 캡슐화함으로써, 상기와 같은 방법이 다른 형태의 전구체 또는 조작된 세포의 이식에 과시된다는 이점을 제공한다(알트만(Altman) 등, 1994 참조); 자기 항원 유전자의 넉아웃 또는 저항성 강화 유전자의 삽입에 의한 자기면역 침해를 덜 받는 세포를 생성하기 위하여 췌장 전구세포의 유전자 조작; IPSC로 삽입될 수도 있는 기타 유전자에는, 변경된 세포표면 항원을 제공하거나 또는 세포의 내부 환경에 상이한 생화학적 특성을 제공하는 것들이 포함된다; 이들은, 글루코오스에 대한 세포의 민감도를 증가 또는 감소시키는 효소를 발현시키는 유전자 또는 성장인자에 대한 세포의 반응성을 증가 또는 감소시키는 유전자를 포함한다; 또한, 인슐린, 글루카곤 또는 소마토스타틴의 생성을 증가 또는 감소시키는 유전자도 도입될 수도 있다; 이와같은 형태의 변형이 IPSC에 도입되는 방법의 예에는, 일렉트로포레이션(electroporation), 비루스 벡터, 형질이입 또는 당분야에 잘 알려진 임의의 다수의 기타 방법이 있다(예를들면 WO 95/17911; WO 93/04169; WO 92/03917; WO 90/11354; 미국특허 제5,286,632; WO 93/22443; WO 94/12650; 또는 WO 93/09222호를 참조할 것; 본 목적을 위하여 이들 모두가 참고로 인용된다); 예를들면 인체 백혈구 항원을 제거 또는 변형한 만능 급혈자(넉아웃) 세포의 생성(상기 WO 95/17911 참조). 본 공정은 태아조직의 사용에 의존하지 않기 때문에, IDD로 고통을 받거나 IDD의 고통을 받을 위기에 있는 포유동물로부터 췌장조직을 제거하고, 섬형 구조체를 생체내 성장시키며 및 개체에 그 구조체를 재이식하여, 혈당의 변동에 반응하여 생리학적으로 관련된 양의 인슐린을 생성하는 것이 가능하다.

상기 문헌 및 하기 실시예의 관점에서, 첨부된 특허청구의 범위는 다양한 구체예 및 본 발명의 관점까지 확대되며, 이들 당분야의 숙련자가 인식할 수 있는 것으로, 중요한 본 발명에 의하여 가능하게 된다.

여기에 제시된 데이터는, 유리된 다분화능성 간세포/전구세포로부터의 시험관내 네오게네시스가 가능하나, 1) IPSC의 생성을 허용하는 관상피 세포의 기질 또는 "영양" 세포의 구축; 2) IPSC의 순환적 재생성을 촉진하며 및 IPSC의 조기 분화도 방지하는 특정 배양조건으로 간세포/전구세포 증식의 유도; 3) α,β 및 δ 세포의 확장 및 분화를 포함하는 몇가지 별개의 성장상태와 관련된다. 이 단계는 배양 영양소에서 차이가 나는 배양 환경에 의하여 영향을 받으며 성장인자는 상이한 백분율의 다양한 섬세포 형태를 함유하는 섬을 초래한다. β세포를 그 최종 성숙단계, 즉 그래뉼 인슐린 함유 그래뉼의 형성단계로 유도하는 시험관내 식별 및 글루코오스 반응성도 달성될 수 있다. 이 최종 분화를 달성하는 생체내에 존재하는 인자는 IPSC 배양체에 세포 추출물 또는 성장인자를 첨가하므로써 확인된다.

본 발명자들은 1차 IPSC 배양주를 10개월까지 및 2차 배양주는 다시 14∼16개월 유지하였는데, 각각은 섬형 구조체를 형성하기 위하여 확장 및 분화가 가능하였다. 전당뇨병 상태의 성체로부터 기능성 섬을 성장시키는 능력은 IDD의 치료를 달성하기 위한 가능한 방법에 관하여 주요한 기술적 발전 및 집중적인 관심을 나타내기는 하나, 아마도 이 작업의 가장 중요한 점은, 이식시에 IPSC 및 췌장형 구조체를 발생시킬 수 있는 다분화능성 간세포/전구세포가 정상 및 (전) 당뇨병 성체의 섬에 존재한다는 것을 나타낸다는 점이다. 이와같은 발견은, β세포를 IDD 환자에게 이식하기 위하여 태아, 동종이나 이종의 조직을 사용하거나; 생체내 저혈당증을 반전시키기 위한 새로운 방법의 개발; 새로이 이식된 섬에 대한 면역학적 반응의 연구; 및/또는 면역적 피해에 대하여 저항성을 지닌 섬을 창출할 필요성을 제거한다.

여기에 제시된 데이터를 기준으로, 발병 후의 형태I IDD 환자에 대하여 작성된 완화기간이, 오직 진행되는 자기 면역작용에 의하여 후속적으로 진정되기 위하여 간세포 성장이 유도되는 시간을 실제로 나타낼 지도 모른다는 것을 생각해 본다는 것은 매력적이다. 자기 유래섬의 재이식은 면역적 침해에 저항하기 위한 세포 조작이 필요한 것으로 생각되기 때문에, 여기에 개시된 바와같은 섬 간세포의 확인 및 배양은 상술한 유전자 조작을 위하여 필수적인 것이다.

놀랍게도, 본 발명의 시험관내 생성된 섬의 이식은 여기서 조사된 기간에 걸쳐 면역학적 침해의 현상을 보이지 않았다. 배양으로 마아크로파아지를 희석해 버리거나, 또는 상기 이식이 주변 관용을 유도할 수도 있기 때문에, 자기항원(들)이 배양된 세포상에서 발현되지 않으며, 또는 자기항원(들)이 존재하지 못할 수 있다는 것이 가능하다. 전체 섬의 장기배양의 가능성은, β세포의 세포인식, 섬 침윤의 모델 및 β세포 파괴의 면역 메카니즘을 포함하는, IDD의 병인론에 관한 연구를 용이하게 한다. 또한, 이 기술은 섬 이식, 자기 유래 섬 대체, 인공섬의 개발을 촉진하며 인슐린 치료의 필요성을 감소시킨다.

따라서, 본 발명은, 섬형 구조체를 생성하기 위하여 섬 생성 간세포, IPSC의 시험관내 성장 방법을 제공한다. 본 방법은, 0.5%의 낮은 함량의 정상 혈청 및 1mM 이하의 글루코오스로 보충된 기본 영양배지에서, 포유동물로부터 얻은 췌장 세포를 배양하고, 최소한 약 3주간 IPSC가 성장하도록 하며, 및 약 0.5∼10%의 정상 혈청 및 약 2.5mM∼10mM의 글루코오스로 보충된 영양배지에 IPSC를 재공급하여 성숙 섬세포로 세포분화를 개시하는 단계를 포함한다. 췌장 세포는, 인체 및 쥐를 포함하는 포유동물로부터 얻을 수도 있으며, 혈청은 동일 류의 포유동물로부터 얻을 수 있다. 배지는 배양되는 동물류의 세포성장에 필수적인 모든 아미노산을, 배양주가 고갈되지 않는 것이 보장될 수 양만큼 함유한다. 재공급시, 재공급 배지는 바람직하게는 분화를 자극하기에 충분한 정도의 양으로 글루코오스 및 혈청을 함유한다. 또한, 본 방법에 따라, 일단 분화가 시작되면, 세포는 바람직하게는 자주 재공급된다(약 1주일에 한번). 본 방법은 섬세포 및 섬형 조직 구조체를 생성한다.

본 방법은 또한, 이것만에 국한되는 것은 아니나, 인슐린, 글루카곤 및 소마토스타틴을 포함하는 내분비 호르몬의 공급원을 제공하는데, 상기 내분비 호르몬은 IPSC 배지로부터 회수될 수 있거나, 또는 췌장형 구조체를 생성하기 위하여 섬형 구조체를 포유동물의 조직으로 이식하므로써 포유동물에 직접 방출될 수 있다. 이와같은 이식은, 포유동물에 췌장형 기관을 생성하기 위하여 섬형 구조체를 이식하므로써 포유동물의 췌장 질병을 치료하는 방법을 제공하게 된다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 섬세포 또는 섬형 구조체는, IDD 자기항원 또는 HLA 마아카를 생성하지 않아서, 인슐린 이외의 인슐린 의존성 당뇨병 결합 자기항원을 발현시키지 않을 정도로 유전자적으로 변형되거나, 또는 간세포가 췌장형 기관으로 분화되는 것과 같이, 인체 백혈구 항원을 발현하지 않도록 변형된다. 또한, 췌장 간세포는 인슐린, 글루카곤, 소마토스타민 및 기타 췌장 생성인자 침투성 캡슐에 캡슐화될 수도 있다. 췌장 간세포의 분화를 분석하는 방법도 제공되는데, 그 방법은, 생체에서 하나 이상의 췌장 간세포를 배양하며 상기 하나 이상의 간세포가 췌장형 구조체로 분화를 개시하도록 유도하는 단계를 포함한다. 이 방법은 또한 분화과정 중 다수의 다른 단계에 대하여 특이적인 단백질 마아커 또는 mRNA의 식별을 가능케한다. 단백질 마아커는 세포 표면상에서 발현될 수도 있으며 분비될 수도 있고, 또는 그들은 세포내에 존재할 수도 있다. 본 발명의 다른 관점에서, 췌장 간세포에 또는 좀더 분화된 췌장 세포에 선택적으로 결합하는 리간드 결합분자 또는 리간드 결합분자의 제조방법이 제공된다. 그 방법은, 천연 β-임파구 또는 T-임파구와 확인된 단백질 마아커를 접촉시키고, 및 β-임파구 또는 T-임파구를 배양 및 확장하여, 리간드 결합 분자를 생성하는 세포 집단을 얻는 단계를 포함한다. 이들 리간드 결합 분자는, 췌장 간세포 및 완전히 분화된 췌장 세포 사이의 임의의 단계에서 췌장 간세포 또는 부분적으로 분화된 췌장세포를 유리시키는 방법을 제공한다. 이 방법은, 소정의 분화단계에서의 세포에 의하여 발현된 단백질 마아커에 결합된 특정 리간드 결합 분자를 지닌 세포를 포함하는 세포의 집단으로부터 세포를 선별하는 단계를 포함한다. 변형된 방법으로서, 본 방법은, 세포의 표면상에 부재하는 단백질 마아커에 결합하는 특정 리간드 결합 분자를 지닌 세포를 포함하는 세포의 집단으로부터 기타 세포를 선별 및 제거하는 단계를 포함한다. 또다른 관점에서 본 발명은, IDD로 고통을 받는 또는 IDD의 위험단계에 있는 포유동물의 치료방법을 제공하는데, 이 방법은 다음단계를 포함한다:

a. 포유동물로부터 췌장조직의 제거;

b. 췌장에 존재하는 다분화능성 췌장세포를 시험관에서 배양하여 섬형 구조체를 형성; 및

c. 상기 섬형 구조체를 상기 포유동물에 이식.

본 발명의 다른 관점에서, IPSC의 미분화 또는 분화상태에서 인슐린 의존성 당뇨병 자기 항원을 발현하지 않도록 변형된 IPSC가 제공된다. 바람직하게는, 변형 결과 발현되지 않는 자기항원은 GAD, 64kD 섬세포 항원 및 HLA 마아커로부터 분리된다.

본 발명의 방법의 일부로서, 다분화능성 간세포 또는 전구세포로부터의 시험관내 네오게네시스 방법이 제공되는데, 그 방법은 다음 단계를 포함한다:

a. IPSC의 생성을 허용하는 관 췌장 상피세포의 기질 또는 "영양" 세포 단층의 구축;

b. IPSC의 순환적 재생성을 촉진하고 또한 IPSC의 조기 분화도 방지하는 배양조건으로 간세포/전구세포 증식을 유도; 및

c. IPSC를 확장 및 분화하여 α, β 및 δ 세포를 포함하는 섬형 구조체를 생성. 바람직하게는, 배양-생성 섬형 구조체는, 섬형 구조체의 중앙에서 인슐린-특이적 스테인으로 착색되는, 큰, 분화된 세포; 주위에서 글루카곤-특이적 스테인으로 착색되는 작은 분화된 세포; 및 내부 피질에서 임의의 내분비 호르몬 특이적 스테인으로 착색되지 않는, 증식하는 및 미분화세포를 특징으로 한다. 그 구조체는 또한, 단백질 분해효소의 존재하에 기계적 또는 기타 수단에 의하여 구조체를 단일세포 현탁액으로 분쇄하고 계속하여 개별 세포를 착색할 때, 글루카곤 특이적 스테인(α세포), 인슐린 특이적 스테인 (β 세포) 또는 소마토스타인 특이적 스테인 (δ세포)으로 착색되는 개별 세포 집단이 관측되는 점을 특징으로 한다. 본 발명에 의한 시험관내 네오게네시스 방법은 바람직하게는 하기 단계를 포함한다:

a. 거의 또는 전혀 글루코오스가 없으며, 혈청이 약 0.5% 이하의 농도, 췌장 세포가 얻어진 동물류의 세포에 필요한 필수 아미노산 및 지질 공급원을 포함하는 취소배지에, 상기 배지내의 약 99%의 세포가 사망할 때까지, 방해받지 않은 췌장 세포를 분산 및 방치 (상태 I);

b. 약 1∼10mM 글루코오스 및 약 0.5%∼10% 혈청(그러나 독소량 미만)으로 보충된 최소배지로, 단계(a)의 배양체를 재공급 및 신속한 증식이 일어날 때까지 약 1주일에 한번 재공급;

c. 0.5%∼10% 혈청 및 약 10∼25mM 글루코오스로 보충되고 및, 선택적으로 성장 또는 세포 인자가 첨가된 최소배지로, 단계 (b)의 배양체를 재공급(상태 III);

d. 섬형 구조체가 배지로 아접하도록 허용;

e. 섬형 구조체를 회수.

이 공정은 연속적으로 상피세포 더하기 초기단계를 이전하고, 시험관내에서 섬형구조체를 배양 증식함으로써 몇번 반복될 수도 있다.

여기에 사용된 바와 같이 "성장"이라는 용어는 세포를 살아있는 상태로 유지시키는 것을 가리키며, 이들만에 국한되는 것은 아니나, 세포의 증식 및/또는 분화를 포함한다. "증식"이라는 용어는 세포분열의 결과 배양주에 존재하는 세포의 수가 증가하는 것을 가르킨다.

아래의 실시예는, 본 발명을 실시하기 위하여, 최상의 양태를 포함하는 공정을 설명하고 있다. 이들 실시예는 제한적으로 해석되어서는 안된다. 별도의 지시가 없는 한 모든 백분율은 중량기준이며, 모든 용매 혼합물 비율은 용적 기준이다.

실시예 1 - 기능적 랑게르한스 섬의 배양

다른 문헌 (쉬이 (Shieh) 등, 1993)에 상세히 기재되어 있는 바와 같이, 19 ~ 20주된, 당뇨병전증의 숫 NOD / UF 생쥐의 췌장으로부터 유리된 전체 섬으로부터, 섬 세포의 단세포 부유액이 준비되었다. 전형적으로, NOD 군체의 약 25%의 숫 생쥐가 이 나이에서 임상적 IDD를 가지며 모두가 심각한 인슐린 염증을 갖게 된다. 섬 세포는 정상 생쥐혈청로 보충된, 글루코오스 고갈된 또는 글루코오스가 없는 클릭의 EHAA 배지(NMS) 0.25% (상기 펙 및 바하, 1973; 펙 및 클릭 (Click), 1973)에 재부유되고, 25cm²의 조직배양 플라스크에 평판배양 및 5% CO₂대기중 37℃에서 배양되었다. 이 상태에서, 2가지 결과가 가능하게 된다: 첫째, 섬-침윤 세포가 우위를 차지하여 면역세포주가 구축될 수도 있고, 또는 둘째로, 관상피세포(이들 배양체에서 흔히 기질세포라 한다)가 우위를 차지하여 "영양세포" ("nurse cell") 단층의 성장을 허용할 수도 있게 된다. 기질형 세포 단층의 성장은, 섬 침윤 세포가 일시에, 그러나 제한된 숫자로 평판 배양될 때 일어나는 것으로 보인다. 침윤세포의 수가 감소된 섬 세포의 농축은, 경사 분리법 (상기 자아페 (Jarpe) 등, 1991)에 의하여 달성될 수 있다. 배양접시에 부착된 소수의 상피형 세포를 남기고, 대다수(>99%)의 원래 세포는 이 배양기간중에 사망한다(제 1A도 및 3A도, 단계 I). 기질세포 배양주는 4 ~ 5주간 미방해 상태 (즉, 재공급 없이)로 방치되면, 증식되어 배양용기의 전체 바닥 면을 덮게 된다(제 3C도 및 3D도).

NMS 및 글루코오즈 또는 슈크로오즈 또는 설탕 동등물을 포함하는 설탕 용액으로 보충된 클릭의 EHAA 배지로 배양주를 재공급함으로써, 배양주의 분화 및 내분비 호르몬 발현이 개시되었다. 전형적으로 설탕은 클루코오즈이다. 클루코오즈의 농도는 약 0.25mM ~ 10mM일 수 있는데 통상적으로는 약 2.5mM이다. 약 0.5%의 정상 NOD 또는 NMS도 바람직하게 포함된다. 시험관내 세포 배양주 재공급 기술은 당분야에 잘 알려져 있는데, 통상적으로 약 50% ~ 약 90%의 낡은 영양배지를 제거하고 및 배양 플라스크에 새로운 배지를 첨가시키는 것을 포함한다. 재공급을 신속히 하면 세포 분화를 나타내는 섬 성장의 중심 (여기서 초점이라 한다)의 수를 증가시키게 된다. 재공급 속도는, 예를들면 약 1주일 간격일 수 있다. 바람직하게는, 재공급 속도는 약 5 ~ 6일 간격이다. 작은 환형 세포가, 거의 아접에 의한 것처럼, 상피세포 단층의 상부에 나타났다(제 1B도 및 3D도, 단계 II).

최고점 생성시에는, 단일 25cm²(4in²) 조직 배양 플라스크에서 50 ~ 100 초점이 동시에 발생하였다. 각 개별 환형세포는 신속히 증식되었으며, 딸세포는 세포 집합을 형성하였다(제 1C도). 신속한 재공급은 세포 집합 수량의 증가를 유도하였고, 각 집합내의 세포수를 증가시켰다. 섬형 구조체의 유도(단계 III)는, 정상 쥐 혈청(0.5%) 및 높은 함량의 글루코오스(10mM∼25mM 및 바람직하게는 약 16.7mM 글루코오스-제1D도 및 3E∼3F도 참조)로 보충된 EHAA 배지로 배양주를 재공급함으로써 강화되었다. 세포증식 및 분화가 진전됨에 따라, 섬의 구성이 일어나며 섬은 그 자신 캡슐형 물질에 둘러쌓이는 것으로 보이기까지도 한다. 성숙 섬(단계 IV)은 견고히 밀집된 세포로 구성된 부드러운 회전 타원체로 보인다(제 3F∼3H도). 이 분화는, 다른 쥐의 스트레인으로부터의 혈청보다도 NOD 쥐로부터의 혈청이 사용될 때 강화되는 것으로 보이며 NOD 쥐 혈청중의 보다 높은 함량의 인슐린형 성장인자(IGF), 상피성장인자(EGF) 및/또는 간실질세포 성장인자(HFF)가 이 효과의 원인이 되는 것으로 믿어진다. 섬은 일반적으로 일정크기 (약 100∼150μ, 제2도, 2개 집합체의 융합으로 일반크기의 약 2배까지 성장되기도 하나)까지 성장한 후, 기질층을 떼어내어 매질에 부유하게 된다. 이들 유리 - 부유 섬은, 췌장섬이 생체내 공급원으로부터 유리되어 유사한 조건하에서 배양될 때 관측되는 것과 유사하게, 48 ~ 72시간내에 분류되었다. 다음에 이 공정이 연속적으로 수행될 수도 있다(제6A∼6D도 및 하기 실시예 5 참조).

자연분리 또는 파스퇴르 피펫을 이용하여 기질층으로부터의 제거후 수집된 섬형 구조물은 배지에서 온화하게 세척된 후, 환류 피펫작업에 의하여 단일 세포 부유액으로 분쇄되었다. 단일 세포 부유액이 세포원심분리에 의하여 제조된 후, 일방 형태학 및 인슐린 생성을 위하여 염색되었다. 초점은 내분비 호르몬 글루카곤 (α세포), 인슐린 (β세포) 및/또는 성장 호르몬 분비억제 호르몬 (δ세포)을 생성하는 세포를 함유하였다. 또한, 배양된 섬에 함유된 주세포 형태를 가르키는, 항 - 인슐린 항체로 양성으로 염색된 세포의 주집단은 인슐린 - 생성 β세포이다. 제 1A도 내지 1D도는 배양 과정 중 발전하는 다양한 세포형태를 나타내고 있다. 제2도는 본 발명의 방법에 따라 세포의 시험관내 배양 후에 얻어진 잘 발전된 섬을 나타내고 있다.

실시예 2 - 인체 섬 세포의 배양

인체 섬 세포를 배양하기 위하여, 실시예 1에 기재된 바와 유사한 공정이 이용되었다. 본 발명의 발명은 세포 배양을 개시하는데 있어서 태아 세포의 이용을 필요로 하지 않기 때문에 특히 유리하다. 하나의 바람직한 구체예에서, 인체 세포는 정상 인체 혈청으로 보충된 클릭의 EHAA 배지 (또는 그 동등물)에 부유될 수 있다. 바람직하게는, 배지에 사용된 정상 인체 혈청의 농도는 상태 I 및 II에서 각각 약 0.25%∼1%이며, 후속 상태중에서는 5%이다. 배양주는, 바람직하게는 수주간, 재공급 없이 미분배 상태로 방치되어야 한다(상태 I). 배양 약 4 ~ 5주후, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 정상 인체 혈청 및 글루코오즈로 보충된 클릭의 EHAA 배지로 배양주를 재공급함으로써 세포 분화가 개시될 수 있다. 뒤이어 섬형 구조물이 수집될 수 있으며, 실시예 1에 기술된 바와 같이 다시 증식을 위하여 단일 세포 부유액이 제조된다.

실시예 3 - 시험관내 성장 섬 세포의 이식

1DD의 병발증을 반전시키기 위한, 이들 시험관내 생성 섬형 구조물의 효율성을 시험하기 위하여, NOD의 췌장 조직으로부터 본 발명의 방법에 따라 시험관내 성장된 일부 기질세포 및 약 150 ~ 200 초점이, 환류 피펫작업에 의하여 조직 배양 플라스크로부터 이동되었다. 다음에 세포는, 매일 인슐린 주사로 유지된 선천성 당뇨병 NOD 생쥐의 신장 캡슐 밑에 이식되었다. 이식은 피하주사침으로 신장 캡슐에 구멍을 내고, 구멍부위를 통하여 엷은 모세관을 신장내로 꿰뚫고, 섬초점을 직접 피층 영역에 주입시킴으로써 완수되었다. 모세관은 주의깊게 회수되고 구멍 부위는 부식된다. 각 이식 생쥐의 외과적 절개는 피부가 치료의 징후를 보일 때까지 고정된다. 이식된 생쥐는 4일간은 종일 투여량의 인슐린 주사로 유지되며, 다음에 2일간은 반나절 투여량으로 유지된 후, 생쥐는 더 이상의 인슐린 처리로부터 완전히 떨어졌다. 대조 동물은 이식편을 수용하지 않은 당뇨병 NOD 생쥐로 구성되었다.

인슐린 처리로부터 떨어진 후 8∼14일 내에, 대조 NOD 생쥐는 혼수상태, 호흡곤란, 체중감소, 혈당량 증가(400∼800mg/dl), 소모증후군, 상처치료의 실패 및 18∼22일내의 사망을 포함하는, 명백한 질병의 신속한 발병 현상을 보였다(제 7도). 이식된 NOD 생쥐는 약 180∼220mg/dl의 혈당량 (이것은 생쥐의 정상 범위보다 약간 상회하는 수치임)을 유지하였고, 증가된 활동성, 외과적 및 혈액 유출부위의 신속한 치료 현상을 보였으며, 호흡곤란을 일으키지 않았고, 조직학적 연구를 위하여 이식 55일 후 죽을 때까지 건강을 유지하였다(제 7도). 비장내 이식에서도 유사한 현상이 관측되었다.

이들 데이터는, 이식된 생체내 생성 섬이 실험과정 시간에 걸쳐 안정된 혈당량을 유지하는데 필요한 인슐린을 공급한다는 개념과 일치한다.

실시예 4 - 외측-췌장의 생체내 생성

실시예 3에 기재된 바와 같은 섬 세포로 이식된 생쥐의 이식부위의 조직학적 검사결과는 시험관내에서 생성된 섬 - 형성 간세포의 또다른 특징을 나타내었다. 신장의 이식부위로부터 "유출된" ("leaked") 이식 세포는 다시 증식 및 분화되었고, 고도로 구조된 외 - 췌장을 형성하였다. 첫째, 내분비 췌장으로 조직을 형성한 증식 내분비 세포만으로 구성된 외 - 췌장조직은 혈관을 자극하는 것으로 완성된다. 이 외분비 췌장은 섬형 내분비 구조물을 형성하도록 진전된다(제 8도 참조). 따라서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 시험관내 세포 배양주는 완전히 새로운 췌장을 재생성할 수 있는 다분화능성 췌장 간세포를 함유한다. 내분비 및 외분비 조직 모두를 함유하는 췌장의 성장은, 췌장염 및 췌장암을 포함하는 췌장병의 새로운 치료방법을 제공한다.

실시예 5 - IPSC의 장기간 증식

소수의 상피세포 더하기 몇 개의 초기단계를 연속적으로 이전하고, 섬형 구조체를 새로운 배양 플라스크로 증식시킴으로써 IPSC의 장기간(>1년) 증식이 달성되었다. 단일 25cm²조직 배양 플라스크로부터의 세포가 5∼10개의 150cm²조직 배양 플라스크로 성공적으로 확장되었다. 흥미롭게도, 균일한 연속적인 이전은, 분리된 섬형 구체와 유사하게 섬 구조체가 "용융"되어버리는 결과를 초래하면서, 새로운 기질 단층이 형성된다(제6A∼6B도). 그러나, 연속적으로 이전된 배양주는 1차 배양주보다 훨씬 빨리, 및 보다 많은 수(배양 면적 평방인치당 200∼250 구조체-제6C∼6D도)로 신규 섬을 생성하였다. 그러나, 결국, 많은 회수의 섬형 구조체의 연속 성장 및 생성후에는, 섬형 구조체가 "용융"후에, 오직 분화된 세포만이 증식되는 결론에 도달한다(제6E∼6F도 참조). 대부분의 분화된 세포를 죽이지 않는 조건하에서 1차 췌장 조식이 1차 배양에서 성장된다면, 가시적인 섬형 구조체의 형성없이도 동일한 현상이 발생될 수 있다.

실시예 6 - 섬형 구조체의 분석

조기, 배양-생성 섬형 구조체의 일련의 부위의 전자 현미경 사진 및 그들 부위(각각 제4도 및 5도에 도시)은 다시한번 성장의 균일성을 나타낸다. 인슐린으로 약하게 착색된 큰, 어느 정도 분화된 세포가 주변에 나타나는 반면에, 임의의 내분비 호르몬 항체로도 착색되지 않은 현저한 수의 조기, 증식중인 및 미분화 세포가 내부 피질에 존재하였다. 시험관내 성장 섬내에 존재하는 세포 표현형을 좀더 자세히 측정하기 위하여, 상피세포 단층으로부터 분리하여 섬형 구조체를 수집, 배지에서 온화하게 세척한 후, 0.25% 트립신과 같은 단백질 분해효소 존재하에서의 환류 피펫팅과 같은 기계적 수단에 의하여 단일 세포 현탁액으로 분쇄하였다. 단일 세포 현탁액의 슬라이드가 세포원심분리에 의하여 제조되고, 일반 형태학 또는 세포함량을 위하여 착색되었다. H/E 착색에 따라 몇 개의 형태학적으로 구별되는 성숙 및 미성숙 세포 형태가 관측된다. 또한, 항-글루카곤(α 세포), 항-인슐린(β 세포) 또는 항-소마토스타틴(δ세포) 항체로 착색된 개별세포 집단은, 간세포/전구세포의 다분화능성이 섬형 구조체를 발생시킨다는 것을 나타낸다. 이들 관측 결과는 다음의 두가지 점을 강조한다. 첫째, 내분비 호르몬에 대하여 약하게 착색된 것은 시험관내 생성 섬의 세포가 비교적 미숙 상태로 남으며, 따라서 생체내 이식시 더욱 분화할 수 있다는 것을 암시하며, 둘째, >100%의 세포가 내분비 호르몬 착색으로 간주된다는 사실은, 테이텔만 등(상기 테이텔만, 1993)에 의하여 최근 보고된 바와 같이, 일부 세포가 반드시 글루카곤 및 인슐린 모두를 동시에 발현한다는 것을 가르킨다.

실시예 7 - 췌장 세포의 제한 희석-단일 췌장 간세포의 클론닝

상술한 방법에 따라, 췌장 조직이 배지에 분산된다. 분화된 췌장 세포의 클로날 생성용 단일 간세포를 유지하기 위하여, 분산된 췌장세포가 당분야에 잘 알려진 방법에 따라 한계 희석된다. 즉, 예를들면, 분산된 샘플내의 세포수/ml의 초기 평가후에 연속적으로 10배로 희석되어, 최종 희석이 마이크로타이터 웰, 또는 이와같은 형태의 희석 실험에 적합한 기타 용기당 최대로, 평균 0.3 세포를 산출하도록 한다. 그 후, 세포는, 초점이 발달하기 시작할 때까지, 미방해 상태가 유지되도록 한다. 이들 초점은, 단일 다분화능성 간세포 또는 IPSC로부터 발생하는 간세포로서, 그 각각은 배양되어 이식용 섬형 구조체를 산출하여 췌장형 구조체를 형성할 수 있다.

실시예 8-상이한 단계의 췌장 간세포 분화와 연관된 마아커의 식별 및 각 단계의 분화에 특이적인 리간드 결합 분자의 제조

실시예 7에 따라 또는 유사한 방법으로 생성된, 유리된 간세포의 초점이, 실시예 1 또는 유사한 방법에 의한 분화의 유도 전후에 모두 분석된다. 간세포로부터 완전히 분화된 췌장 세포까지, 각 단계의 세포가 다음과 같이 분석된다:

A.핵산: 미분화 전구세포 및 완전히 분화된 췌장세포를 포함하는 각 분화단계에서, mRNA가 유리된다. 이 RNA는, 이것만에 국한되는 것은 아니나, 폴리 A와 같은 만능 프라이머를 이용하는 PCR 의존성 증폭방법을 포함하여, 당분야에 공지된 표준방법 (마니아티스 등, 1982)에 따라, cDNA를 제조하는데 사용된다. 각 증폭은, 췌장 간세포 발전의 각 단계에서 발현된 메시지의 라이브러리를 나타낸다. 따라서, 각 단계로부터 cDNA를 혼성하고 및 미혼성 상태로 남은 메시지를 유리함으로써, 간세포에는 존재하지 않으나 완전히 분화된 췌장세포에는 존재하는 메시지가 확인된다. 마찬가지로, 분화된 전시 PCR, 임의로 프라임된 PCR 또는 RDA-PCR (상기 참조)과 같은 방법이 사용될 수도 있다. 이와같은 양식에서, 다른 분화단계에 존재하는 메시지를 삭제함으로써 각 단계에 특이적인 메시지가 식별된다. 또한 이 방법에 의하여, 분화공정의 각 단계에서의 유전자 생성물이, 삭제된 메시지에 의하여 코드화된 생성물의 발현에 의하여 식별된다. 다음에 모노클로날 항체를 포함하는 항체는, 당분야에 잘 알려진 방법에 따라, 항원으로서 이들 유전자 생성물을 사용하여 생성된다(고딩 (Goding), J.W., 1986 참조). 이들 항체는 다음에, 췌장세포의 세포 표면상에서 발현된 마아커에 대한 친화성을 기준으로 소정 분화단계로부터 세포를 유리하는데 사용된다. 또한, 분화된 췌장세포의 표면상에서 발현된 특정 마아커의 식별은, 상기 미국특허 제 5,286,632; 미국특허 제 5,320,962; 미국특허 제 5,342,761 및 WO 90/11354; WO 92/03917; WO/93/04169 및 WO 95/17911호에 개시된 바와 같은 방법에 따라, 간세포에서의 변이를 지시하기 위하여 식별된 배열을 이용하는 부위-지향 변이유발에 의하여 췌장세포의 넉아웃 세포주의 생성을 가능케한다. 넉아웃 유전자 생성물을 산출하지 않는 변이세포의 선별은, 그 생성물이 존재하지 않는 세포의 클론을 제공하기 위하여 선택된 특이적 유전자 생성물에 대한 항체를 이용하여 완수된다.

B.단백질 마아커: 미분화 전구세포 및 완전히 분화된 췌장세포를 포함하여, 각 분화단계에서, 당분야에 공지된 방법에 따라 항체가 온전세포 및 세포하 분획으로 생성된다. 이 공정의 특정 예는 다음과 같다:

a)쥐 항-생쥐 IPSC mAbs의 생성: IPSC-특이적 항원에 대하여 활성화된 B 임파구의 선별을 강화하기 위하여, 쥐가 정상 생쥐 조직으로 면역화되고, 면역 7일 후 시클로포스파미드로 처리되었다. 시클로포스파미드는 반응성 B세포를 선별적으로 죽임으로써, 정상 생쥐 항원에 미반응성인 쥐를 잔류시킨다. 면역 14일 후, 쥐는 다양한 단계의 생쥐 IPSC 배양으로부터 수집된 세포로 재도전을 받는다. 이와같은 제2차 도전 3∼4주 후, 쥐는 3일간 IPSC 배양 세포로 재면역된 후, SPO/2 골수종 파트너로 용융된다. 양성적으로 반응하는 항체는 선별되어 클론화된다.

b)생쥐 항-인체 IPSC mAbs의 생성: 생쥐가 정상 인체조직으로 면역된 후, 시클로포스파미드 처리후에 다양한 인체 IPSC 배양단계로부터의 세포로 재도전을 받는 것을 제외하고는, 쥐 항-생쥐 mAbs의 생성을 위하여 상술한 동일 방법을 사용하여, 생쥐 항-인체 IPSC mAbs가 제조된다.

c)섬세포 성장의 다양한 분화단계의 식별에 항-IPSC mAbs의 이용:IPSC 배양 세포에 대하여 발생된 mAbs가, FACS 또는 자기적으로 안정화된 유동화 베드(하기 참조)에서와 같이 당분야에 공지된 기타 수단으로, 이들 시약에 의하여 규정된 다양한 세포 집단을 분류하는데 사용된다. 분류된 세포집단은, 그들 분화단계 (예를들면, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, β-가락토시나제, 티로신 히드록시라제, Reg-유전자의 공발현) 및 그들 성장능력(예를들면, IPSC 배양을 개시하는 그들 능력)에 대하여 조사되었다.

섬의 네오게네시스에 연루되는 세포의 분화 마아커 및 세포 표면을 한정하는 시약은 이 연구분야에 있어서의 과학적 집단에 유용하다. 또한, 이와같은 시약은 IPSC 그 자체의 유리(또는 부유화)를 크게 촉진한다. IPSC의 유리는, 전체 섬 대신에 IPSC를 IDD 환자에게 재이식하는 효율성의 시험을 허용하고, 또는 췌장에 직접 이식을 허용하며, 별도의 췌장 이식 필요성을 제거한다.

또한 이들 항체는, 췌장 세포의 세포 표면상에서 발현된 마아커에 대한 친화성을 기준으로, 임의의 소정 분화단계로부터 세포를 유리하는데 사용된다. 분화된 췌장 세포의 표면상에서 발현된 특정 마아커의 식별로 췌장 세포의 넉아웃 세포주의 생성이 가능하게 된다. 불필요한 유전자 생성물을 생성하지 않는 세포는, 그 생성물이 존재하지 않는 세포의 클론을 선별하기 위하여 항체를 사용함으로써 선별된다. 유사한 방법으로, 분화된 췌장 세포의 붕궤 및 T-세포 인식에 대하여 중요한 마아커가, 분화공정을 횡단하여 천연 T-세포를 온전한 췌장세포 또는 그들 세포하 분획으로 활성화함으로써 식별된다. T-세포 활성화에 중요한 마아커의 식별은, 이들 마아커를 제거함으로써, 분화된 상태에서, 자기면역 파괴에 저항성이 있는 세포를 생성하기 위한 간세포의 후속 변형을 가능케 한다.

실시예 9 - 상이한 분화단계에서 췌장세포의 유리

실시예 8에 의하여 식별된 리간드 결합 분자 및 마아커를 사용하여, 췌장간세포 또는 부분적으로 또는 완전히 분화된 췌장 세포가 당분야에 잘 알려진 방법으로 유리될 수 있다. 따라서, 순수한 간세포의 집단이 간세포 마아커에 대한 항체를 이용하여 유리되는, 미국특허 제 5,061,620; 5,437,994; 5,399,493호에 개시된 조혈간세포 유리방법이, 여기에 완전히 제시된 것처럼, 참고로 인용된다. 마찬가지로, 미국특허 제 5, 409,813호에 개시된, 자기적으로 안정화된 유동화 베드(MSFB, Magnetically Stabilized Fluidized Beds)를 사용하여 세포 혼합물로부터 포유동물 세포를 분리하는 방법이, 여기에 완전히 개시된 것처럼 참고로 인용된다. 각 췌장간세포 분화단계에서 식별된 마아커에 대한 항체는 자기화 가능 베드에 부착되고, 세포는 자기적으로 안정화된 유동화 베드를 관통한다. 항체 결합 자기화 가능 베드에 부착된 세포, 또는 베드를 통하여 유동하는 세포가 유리된다.

특정세포를 유리하기 위하여 당분야에 공지된, 임의의 다수의 기타 방법이 본 목적을 위하여 사용될 수도 있다. 이들만에 국한되는 것은 아니나, 이들 방법에는 불필요 세포의 완전한 파괴; 세포 패닝(cellular panning); 면역친화성(immuno affinity) 크로마토그라피; 현탁분리; 및 연한천 유리 기술이 포함된다(프레시레이(Freshrey, R.I., 1988 참조).

실시예 10 - 췌장 간세포 분화를 촉발시키는 인자 및 간세포의 상이한 분화단계에서 생성된 인자의 분석

실시예 9의 방법 또는 유사한 방법으로 유리된 세포가, 실시예 1의 방법 또는 유사한 배양 방법으로 배양되었다. 성장배지에 상이한 인자를 첨가하고, 세포상의 분화유도 효과를 관측함으로써 유도 분화에 있어서 중요한 인자가 검정된다. 다양한 세포로부터 조절된 배지가 시험될 수 있으며, 췌장 간세포 분화를 일으키는 인자가, 정제 검정수단으로서 분화의 유도를 이용하여 유리된다. 글루코오스, 기타 화학약품, 호르몬 및 혈청 분획과 같은 기타 인자가 유사하게 시험되어 중요한 분화유도 인자를 유리한다.

상이한 분화단계에서 생성된 인자가 유리되어 분화공정의 각 단계에서 세포의 조절 배지로부터 분석된다. 이들 인자는, 간세포 및 부분적으로 분화된 간세포의 추가 분화에 대한 자동분비 효과에 대하여 시험된다.

실시예 11 - 자기항체, CTL 저항체 및 HLA 변형 분화된 췌장 세포를 생성하기 위한 췌장간세포의 유전자적 변형

실시예 1 또는 2에 의하여 배양되거나 또는 실시예 8에 따라 유리된 췌장 간세포가, 상기 미국특허 제 5,286,632; 미국특허 제5,320,962; 상기 미국특허 제5,342,761; 및 상기 WO 90/11354; 상기 WO 92/03917; 상기 WO 93/04169; 및 상기 WO 95/17911호에 개시된 바와 같은 방법에 따라 자기항체 및 CTL 저항 간세포 및 분화된 췌장 세포를 생성하기 위하여, 당분야에 공지된 임의의 방법에 따라 유전자 변형 처리된다. 변형적인 방법으로, 저항성 간세포의 선별은, 자기 항체 또는 IDD 결합 CTL 또는 IDD 특이적 자기항체로 활성화된 CTL의 존재하에 이들 세포를 배양하므로써 완수된다. 이들 기술의 결과, 항체 또는 T-임파구 의존성 메카니즘에 의한 파괴에 대한 저항성이 증가된 세포가 생성된다. 이와같은 세포는, 자기면역 과정에 의한 파괴에 대하여 저항성이 증가된 췌장형 구조체를 제공하기 위하여, 상기 실시예 3 및 4에 개시된 바와 같이, 적절한 조직의 적절한 숙주에 이식된다.

마찬가지로, 췌장간세포 및 분화된 세포의 인체 백혈구 항원 프로필이, 선택적으로는 반복 공정에 의하여 변형되는데, 여기서 간세포가 정상의 동종 임파구에 노출되고, 생존 세포가 선별된다. 변형된 방법으로, 간세포 또는 분화된 세포로부터 HLA 마아커를 제거하기 위하여 부위 지향 변이유발법이 이용되고, 이와같이 생성된 또는 췌장형 구조체로부터 유리된 신규 간세포가, 이식을 필요로 하는 수용체 포유동물에 이식하는데 사용된다.

특정 실시예에서, 네오마이신-저항성 유전자, 네오를 지닌 아네노-결합 비루스(AAV, Adeno-Associated Virus)벡터 시스템이 이용된다. AAV는 진핵세포를 형질이입하는데 사용된다(라파체(Laface), 1988). 또한, 플레오마이신 저항성 유전자를 지닌 pBABE-블레오 셔틀 벡타 시스템이 사용된다(모겐스테인(Morgenstein 1990). 이 셔틀 벡타는 인체세포를 박테리아 유도 유전자로 형질전환하는데 사용될 수 있다.

a)IPAC의 형질이입:배양된 IPSC가, 직접 감염에 의한 AAV 네오 벡타 또는 전기 영동에 의한 pBABE-2-블레오 벡타의 레트로비루스 세그먼트에도 형질이입된다. C-PEG 완충제(ETA 및 고 글루코오스로 보충된 인산염 완충작용 식염수)를 사용하여, 구축된 IPSC 배양주로부터의 부착성 세포가 조직 배양 플라스크로부터 온화하게 제거된다. 이들 세포는, DMEM 및 레트로비루스 소재를 함유하는 10% 태아 쥐 혈청에 부유되고, pBABE-블레오의 경우에는, 전기영동법으로 처리된다(전기 영동법이 직접적인 비루스 감염법에 비하여 명확히 엄격한 방법이기 때문에, 전기 영동처리되는 세포가 생존능력에 대한 검사가 된다. IPSC 배양 세포의 생존능력은, 생체 염료의 배제능력 및 글루코스아미노글리칸 및 과산화수소와 같은 손상-관련 세포 생성물의 분석에 의하여 측정된다). 형질이입된 세포의 2차 배양주가 구축된다. 재배양 세포가 플레오마이신 또는 네오마이신 각각에 대한 저항성에 대하여 선별된다.

b)형질전환 세포내의 프로-비루스 DNA의 식별:적절한 형질이입작용 비루스 DNA의 존재에 관하여, 네오마이신 또는 플레오마이신 저항성 배양세포가 시험된다. C-PEG 완충제를 사용하여 세포가 배양 플라스크로부터 이동되어 프로테인나제 K를 함유하는 용해 완충제에서 소화된다. DNA가 페놀/클로로포름 추출된 후, 에탄올/아세트산 나트륨으로 침전된다. PCR을 이용하여 프로비루스 DNA가 식별된다. 제 1 반응에 있어서, PCR 프라이머가 사용되는데, 이것은 적절한 저항성 유전자의 전체적 오픈 리딩 프레임을 증폭시킨다. 제 2 PCR 반응에 있어서, PCR 생성물이 주형으로서 사용된다. 선택된 내부 5' 및 3' 프라이머가 사용되는데, 이것은 공지의 염기쌍 크기의 내부 서열을 증폭시킨다. 최종 PCR 생성물은, 아가로우스 겔의 브롬화 에타듐 착색 후 전기 영동 및/또는 사우턴 블롯트의 프로빙에 의하여 검출된다.

c)형질전환의 안정성:형질이입 세포를 장기간 성장 배양하고, 상술한 바와 같이 프로비루스 DNA의 존재에 대하여, 그들을 주기적으로 시험함으로써, 형질전환의 장기간 안정성이 측정된다.

이들 연구결과는, 표적 세포로서 IPSC를 사용하는 형질전환 방법의 효율성 및 재생산성에 관한 정보를 제공한다. 또한, 그들은 IDD 환자를 치료하는데 있어서 형질전환 IPSC를 이용할 수 있는 제 2의 근거를 마련한다.

실시예 12 - 시험관에 생성 섬의 캡슐화 및 포유동물에의 이식

세포의 캡슐화 방법은 당분야에 잘 알려져 있다(예를들면, 알트만(Altman) 등, 1984, Trans. Am. Soc. Art. Organs.30: 382 - 386 페이지. 이를 여기서 참고로 인용하는데, 상기 문헌에서는, 인체 인슐리노마가 선택적 침투성 마크로캡슐에 둘러싸인다). 따라서, 선택적으로 실시예 2에 따라 유전자적으로 변형된, 유리된 시험관내 생성 섬 또는 실시예 3 및 4에 따라 생성된 췌장형 구조체는, 인슐린, 글루카곤 및 소마토스타틴 침투성 캡슐제로 캡슐화된다. 바람직하게는 상기 캡슐제는 저 알레르기성이며, 용이하고도 안정되게 표적 조직내에 적응하며, 분화된 세포의 파괴없이, 기능성 성분으로의 분화가 보장되도록, 이식 구조에 부가적인 보호작용을 제공한다.

여기에 기재된 실시예 및 구체예는 오직 예시적인 목적만을 위한 것이며, 그와같은 점에서의 다양한 수식 및 변경이 당분야의 숙련자에게 암시될 수 있고, 본 출원서의 범위 및 취지와 첨부된 특허청구의 범위에 포함된다는 것을 이해하여야 한다.

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Claims

0.5% 이하의 정상 혈청 및 1mM 이하의 글루코오스로 보충된 기본 영양 배지에서 포유동물류로부터의 췌장 세포를 배양하고, 섬 생성 간세포, IPSC가 3주 이상 성장되도록 하며, 및 상기 배양중인 IPSC에, 0.5∼10%의 정상 혈청 및 2.5mM∼10mM의 글루코오스로 보충된 영양 배지로 재공급함으로써, 성숙 섬 세포로 세포 분화를 개시하는 단계를 포함하는, 섬세포 또는 섬형 구조체를 생성하기 위한 섬 생성간세포의 시험관내 성장방법.
제1항에 있어서, 췌장 세포가 인체 섬 세포이며 혈청이 정상 인체 혈청인 방법.
제1항에 있어서, 췌장 세포가 생쥐 섬 세포이며 혈청이 정상 생쥐 혈청인 방법.
제1항에 있어서, 영양배지가 고 아미노산 영양배지를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 세포 배양주에 재공급하는데 사용된 배지가 글루코오즈를 또한 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 배양된 간세포의 분화가, 췌장 세포 배양주에 상동성의 정상 혈청으로 보충된 영양배지로 재공급함으로써 4 ~ 5주의 배양주 성장 시점에서 개시되는 방법.
제1항에 있어서, 배양주에의 재공급에 의하여 세포분화가 개시된 후, 배양주에 1주일 간격으로 재공급되는 방법.
제1항에 있어서, 정상 혈청이, 섬 세포가 얻어지는 포유동물과 동류의 포유동물로부터 얻어지는 방법.
제1항에 있어서, 섬형 조직 구조체가 IPSC의 분화후에 생성되는 방법.
제1항의 방법에 의하여 생성된 섬 세포.
제9항의 방법에 의하여 생성된 섬형 조직 구조체.
제 1항에 따라 췌장세포를 배양하고, 췌장 세포 배양주로부터 내분비 호르몬을 회수하는 단계를 포함하는 내분비 호르몬의 생성방법.
제12항에 있어서, 호르몬이 인체 호르몬인 방법.
제12항에 있어서, 호르몬이 생쥐 호르몬인 방법.
제12항에 있어서, 정상 혈청으로 보충된 영양배지로 IPSC 세포 배양주에 재공급함으로써, 분화가 4 ~ 5주의 배양 성장 시점에서 개시되는 방법.
제12항에 있어서, 내분비 호르몬이 인슐린, 글루카곤 및 소마토스타틴으로 구성되어 있는 군으로부터 선택되는 방법.
제1항의 방법에 의하여 생성된 섬 세포 또는 섬형 구조체를 포유동물의 조직에 이식하는 단계를 포함하는, 포유동물에 췌장형 기관을 생성하는 방법.
제17항의 방법에 따라 포유동물 생체내에 췌장형 기관을 생성하는 단계를 포함하는, 포유동물의 췌장의 질병을 치료하는 방법.
0.5% 이하의 정상 혈청 및 1mM 이하의 글루코오스로 보충된 기본 영양배지에서, 포유동물류로부터의 췌장 세포에 존재하는 섬 생성 간세포, IPSC를 성장시키고, IPSC가 3주 이상 성장되도록 하며 및 배양중인 IPSC에, 0.5∼10%의 정상 혈청 및 2.5mM∼10mM의 글루코오스로 보충된 영양배지로 재공급함으로써 성숙 섬세포로의 세포 분화를 개시시키는 단계에 의하여 생성된 섬형 구조체를, 포유동물에 이식함으로써 생성된 췌장형 기관.
제1항에 있어서, 섬형 구조체가, α세포, β세포 및 δ세포로 구성되어 있는 군으로부터 선택된 세포를 포함하는 방법.
제17항에 있어서, 포유동물에 이식된 섬형 구조체 또는 섬 세포가 이식편을 수용하는 포유동물에 자기 유래적 (autologous)인 방법.
제17항에 있어서, 포유동물이 인간인 방법.
제19항에 있어서, 기관이 인체에서 생성되는 췌장형 기관.
제17항의 방법에 의하여 생성된 췌장형 기관을 지닌 인간 이외의 포유동물.
제24항에 있어서, 포유동물이 생쥐인 포유동물.
포유동물의 조직에 하나 이상의 췌장 간세포를 이식하는 단계를 포함하는, 포유동물에 췌장형 기관을 생성하는 방법.
제26항의 방법에 의하여 생성된 포유동물내의 췌장형 기관.
제26항에 있어서, 췌장 간세포가 췌장형 기관으로 분화되도록, 하나 이상의 췌장 간세포가 인슐린 이외의 인슐린 의존성 당뇨병 관련 자기항원을 발현하지 않도록 변형되거나 또는 인체 백혈구 항원을 발현하지 않도록 변형되는 방법.
제26항에 있어서, 하나 이상의 췌장 간세포가 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴 및 기타 췌장 생성 인자 침투성 캡슐에 캡슐화되는 방법.
시험관내에서 하나 이상의 췌장 간세포를 배양하는 단계를 포함하는 췌장 간세포 분화의 분석방법.
제30항에 있어서, 상기 하나 이상의 간세포가 췌장형 구조물로 분화를 개시하도록 유도하는 단계를 또한 포함하는 방법.
제31항에 있어서, 분화 공정중 복수의 상이한 단계에 특이적인 단백질 마아커 또는 mRNA를 식별하는 단계를 또한 포함하는 방법.
제32항에 있어서, 단백질 마아커가 세포 표면상에서 발현되며, 분비되고, 또는 세포내에서 존재하는 방법.
천연 B-임파구 또는 T-임파구와, 제33항의 방법에 의하여 식별된 단백질 마아커를 접촉시키고, 상기 B-임파구 또는 T-임파구를 배양 및 확장하여, 리간드-결합 분자를 생성하는 세포 집단을 얻는 단계를 포함하는, 췌장 간세포 또는 보다 분화된 췌장 세포에 선별적으로 결합하는 리간드-결합 분자의 제조방법.
제34항의 방법에 의하여 제조된 리간드-결합 분자.
제35항에 있어서, 리간드-결합 분자가 항체, 모노클로날 항체 또는 T-세포 수용체인 리간드-결합 분자.
임의의 분화단계에서의 세포에 의하여 발현된 세포 표면 단백질 마아커에 결합하는 제 35항의 리간드-결합 분자로, 상기 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 상기 세포를 선별, 또는 상기 세포의 표면상에 부재하는 세포 표면 단백질 마아커에 결합하는 제 35항의 리간드-결합 분자로, 상기 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 기타 세포를 선별 및 제거하는 단계를 포함하는, 췌장 간세포 및 완전히 분화된 췌장 세포 사이의 임의의 단계에서 췌장 간세포 또는 부분적으로 분화된 췌장 세포를 유리하는 방법.
제37항의 방법에 의하여 유리된, 유리 세포.
유리된 췌장 간세포 또는 유리된 췌장 간세포의 집단.
하기 a∼c 단계를 포함하는, IDD병을 앓고 있는 또는 IDD병을 앓을 위험이 있는 포유동물의 치료방법:

a. 상기 포유동물로부터 췌장 조직을 제거;

b. 상기 췌장 조직내에 존재하는 다분화능성 췌장 간세포를 시험관내 배양하여 섬형 구조물을 생성; 및

c. 상기 섬형 구조물을 상기 포유동물에 이식.
IPSC의 미분화 상태나 또는 분화상태에서 인슈린 의존성 당뇨병 자기 항원을 발현하지 못하도록 변형된 IPSC.
제41항에 있어서, 변형된 결과로 인하여, 발현되지 않는 자기 항원이, GAD, 64kD 섬세포 표면 항원, 및 HLA 마아커로부터 선택되는 변형된 IPSC.
제5항에 있어서, 10∼25mM 글루코오스, 간(肝)세포 성장/산란인자, 표피세포 성장인자, 선유아세포 성장인자, 표피성 성장인자, 인슐린형 성장인자, 니코틴아미드, 또는 IPSC에 의하여 생성된 자기분비 성장인자를 내포함으로써, 분화가 강화되는 방법.
제43항에 있어서, 재공급 배지의 글루코오스 농도가 16.7mM인 방법.
다음 a∼c 단계를 포함하는, 단분화능성 간세포 또는 전구세포로부터 섬의 시험관내 네오게네시스 방법.

a. IPSC의 생성을 허용하는 관 췌장 상피세포의 기질 또는 "영양" 세포 단층을 구축;

b. IPSC의 순환적 재생성을 촉진하고 또한 IPSC의 조기 분화를 방지하는 배양조건으로, 간세포/전구 세포의 증식을 유도; 및

c. IPSC를 확장 및 분화하여 α, β 및 δ 세포를 포함하는 섬형 구조물을 생성.
초기 단계에 더하여 상피세포를 연속적으로 이전하고, 시험관내 배양으로 섬형 구조물을 증식시키는 단계를 포함하는, IPSC의 장기간 증식방법.
섬형 구조물의 중앙에서 인슐린 특이적 스테인으로 착색되는 대형, 분화된 세포; 주변에서 글루카곤 특이적 스테인으로 착색되는 소형의 분화된 세포; 및 내부 피질에서 어떤 내분비 호르몬 특이적 스테인으로도 착색되지 않는, 증식중인 미분화된 세포를 특징으로 하며, 구조물이, 단백질분해 효소의 존재하에 기계적 수단에 의하여 섬형 구조물을 단일 세포 현탁액으로 분쇄한 후, 개별 세포의 착색시에, 글루카곤 특이적 스테인(α세포), 인슐린 특이적 스테인 (β세포)이나 소마토스타틴 특이적 스테인 (δ세포)으로 착색되는 개별 세포집단이 관측되는 것을 또한 특징으로 하는, 배양-생성 섬형 구조물.
제45항에 있어서, 하기 a∼e 단계를 포함하는, 섬의 시험관내 네오게네시스 방법.

a. 글루코오스가 거의 또는 전혀 없으며, 0.5% 이하의 혈청, 췌장 세포가 얻어진 포유동물류의 세포에 대한 필수 아미노산 및 흔적량의 지질 공급원을 포함하는 최소 배지에, 99%의 배양세포가 사망할 때까지, 미방해 췌장 세포를 분산 및 방치(상태 I);

b. 단계 (a)의 배양주에, 1∼10mM 글루코오스 및 0.5∼10% 혈청(단, 독소량 미만)으로 보충된 최소배지로 재공급 및 신속한 증식이일어날 때까지 1주일에 1회 재공급;

c. 단계 (b)의 배양주에, 0.5∼10% 혈청 및 10∼25mM 글루코오스로 보충된 및, 선택적으로, 성장인자 또는 세포인자가 첨가된 최소배지로 재공급(상태 III);

d. 섬형 구조물이 배지로 아접하도록 허용; 및

e. 섬형 구조물을 회수 .