DE60123574T2

DE60123574T2 - Präparation und xenotransplantation von inseln aus schweinen

Info

Publication number: DE60123574T2
Application number: DE60123574T
Authority: DE
Inventors: Robert Bartlet Elliott; Riccardo Calafiore; Guiseppe Basta
Original assignee: Diabcell Pty Ltd
Current assignee: Diatranz Otsuka Ltd
Priority date: 2000-01-20
Filing date: 2001-01-19
Publication date: 2007-08-09
Anticipated expiration: 2021-01-20
Also published as: DE60123574D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verbesserungen in und/oder bezüglich der Behandlung von Diabetes mit Hilfe der Xenotransplantation. Genauer gesagt, doch nicht ausschließlich, betrifft die vorliegende Erfindung die Präparation von lebensfähigen xenotransplantierbaren porzinen Inseln und/oder die Behandlung eines an Diabetes leidenden Säugerpatienten (einschließlich Menschen), welche die Transplantation von lebensfähigen porzinen Inseln, die zum Produzieren von Insulin im Wirt fähig sind, in das Säugetier einbezieht.
HINTERGRUND
Typ 1 (Insulin-abhängiger) Diabetes mellitus ist eine verbreitete endokrine Störung, die zu einer erheblichen Morbidität und Mortalität führt und beträchtliche Kosten für die einzelnen Patienten und das Gesundheitssystem verursacht.
Eine Behandlung mit Insulin, obgleich lebensrettend, bietet häufig keine hinreichende Kontrolle des Blutzuckerspiegels, um die befürchteten krankheitsbedingten Komplikationen zu vermeiden, was die Anstoß für eine intensive Erforschung besserer Methoden für die Aufrechterhaltung normaler Blutzuckerspiegel gab.
Unter den neueren vorgeschlagenen Behandlungsstrategien hat die Transplantation pankreatischer β-Inselzellen, die entweder von anderen Menschen oder von Tieren gewonnen werden, weltweit die meiste Beachtung gefunden. Der Grund hierfür ist, dass eine Transplantation nicht nur die Insulin-sezernierende Einheit, sondern auch die genaue Feinabstimmung der Insulinfreisetzung als Reaktion auf viele neuronale und humorale Signale, die innerhalb und außerhalb der Langerhans-Inseln erzeugt werden, wiederherstellt.
Die Transplantation humaner Inselzellen ist durch den Mangel an humanem Inselgewebe begrenzt. Die Verwendung von porzinen Inselzellen wird gegenwärtig als die vielversprechendste Alternative betrachtet, da:

(a) die Versorgung mit porzinen Zellen ohne weiteres durch eine Optimierung der Beschaffung von Spendertieren erhöht werden kann;
(b) porzines und humanes Insulin hinsichtlich der Struktur sehr ähnlich sind;
(c) die physiologischen Zuckerspiegel in Schweinen denjenigen in Menschen ähnlich sind.

Das Grundprinzip dieses Behandlungsansatzes (als Xenotransplantation bezeichnet) ist, dass die implantierten porzinen Inseln das Potenzial besitzen, die normale physiologische Insulinreaktion bei Typ 1 Diabetes zu imitieren, so dass nahezu normale Blutzuckerspiegel ohne eine Insulinverabreichung oder mit einer verminderten Notwendigkeit der Verabreichung erreicht werden können. Folglich werden die Langzeitfolgen der Diabetes verhindert, und die Patienten sollten eine geringere Hypoglykämie erfahren als dies mit den gegenwärtig empfohlenen „intensiven" Insulintherapieplänen der Fall ist.
GEGENSTAND DER ERFINDUNG
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zum Präparieren porziner Inseln, mit dem für eine Xenotransplantation in einem Patienten lebensfähige Inseln produziert werden, wobei die Inseln zum Produzieren von Insulin in einem Säugerwirt fähig sind, sowie das Inselpräparat, das auf diese Weise produziert worden ist oder unabhängig davon, wie es produziert worden ist, oder eine ähnliche Form bereitzustellen.
Alternativ oder zusätzlich besteht ein weiterer Gegenstand darin, ein Verfahren zur Behandlung eines an Diabetes leidenden Säugerpatienten bereitzustellen, welches die Xenotransplantation von porzinen Inseln in den Säugerpatienten beinhaltet.
Alternativ oder zusätzlich besteht ein weiterer Gegenstand darin, zumindest der Öffentlichkeit und der Medizin einen zweckdienlichen alternativen Ansatz für die Behandlung von Diabetes zur Verfügung zu stellen.
ANGABEN ZUR ERFINDUNG
Ein erster Aspekt der Erfindung besteht in einem Verfahren zum Präparieren eines xenotransplantierbaren porzinen Inselpräparats, das auf die Xenotransplantation hin zum Produzieren von porzinem Insulin in einem geeigneten Empfänger-Säugetier fähig ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte beinhaltet oder umfasst:

(i) Herstellen einer Kultur von geerntetem Pankreas, welches Pankreas von Ferkeln einer voll ausgetragenen Trächtigkeit oder einer nahezu voll ausgetragenen Trächtigkeit geerntet worden ist;
(ii) gleichzeitig mit Schritt (i) und/oder nach Schritt (i) Extrahieren von pankreatischen β-Inselzellen aus der Kultur des geernteten Pankreas; und
(iii) Aussetzen des Pankreas oder der Inselzellen einem Anästhetikum;

Vorzugsweise liegen diese Ferkel, aus denen die pankreatischen β-Inselzellen isoliert werden, im Bereich von –20 bis +10 Tagen einer voll ausgetragenen Trächtigkeit.
Vorzugsweise liegen diese Ferkel im Bereich von –7 bis +10 Tagen einer voll ausgetragenen Trächtigkeit.
Vorzugsweise ist die Collagenase aus humaner Liberase^® oder porziner Liberase^® ausgewählt.
Vorzugsweise ist diese Collagenase humane Liberase^®.
Vorzugsweise umfasst die Kultur geernteten Pankreas in einem supportiven Säugeralbumin, das im Wesentlichen frei von nicht-menschlichen mikrobiologischen Agenzien ist.
Vorzugsweise ist das Säugeralbumin humanes Serumalbumin (HSA).
Vorzugsweise werden die Inseln nach ihrer Extraktion aus dem Pankreas mit Nicotinamid behandelt.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren außerdem den Schritt der Behandlung der Inseln mit IgF-1 oder dem N-terminalen Tripeptid von IgF-1 (GPE).
Vorzugsweise ist die IgF-1 oder GPE-Exposition für jene Zellen von Ferkeln größer, die am weitesten von der vollen Gestation entfernt sind und vorzugsweise erfolgt eine IgF-1 Exposition für alle Zellen unabhängig von ihrer Beziehung zur vollen Gestation.
Vorzugsweise werden das Pankreas oder die Inseln einem geeigneten Anästhetikum ausgesetzt, das Lignocain ist.
Vorzugsweise beinhaltet Schritt (ii) des Verfahrens das mechanische Reduzieren des geernteten Pankreas in Gegenwart des Anästhetikums für die Inseln.
Vorzugsweise ist ein Antibiotikum mit den Inselzellen assoziiert.
Vorzugsweise ist dieses Antibiotikum Ciproxin.
Das Verfahren der Erfindung kann den folgenden Schritt einbeziehen oder umfassen:

(iii) Einkapselung der Inselzellen mit einem biokompatiblen xenotransplantierbaren Material, wobei dieses Material in vivo sowohl für Glucose als auch Insulin porös ist, wobei Nicotinamid zu den Inseln oder Inselzellen vor der Einkapselung in einem beliebigen oder in mehreren Stadien des Verfahrens gegeben wird.

Vorzugsweise sind diese Ferkel, von denen die pankreatischen β-Inselzellen extrahiert sind, voll oder fast voll ausgetragen und liegen von –20 bis +10 Tage der vollen Gestation.
Vorzugsweise ist dieses biokompatible Material ein geeignetes Alginat.
Vorzugsweise liegt das Alginat in ultrareiner Form vor.
Vorzugsweise ist jede Insel oder Gruppe von Inseln in einer in vivo für Insulin und Glucose porösen biokompatiblen Alginat- oder einer alginatähnlichen Umhüllung eingefangen.
Vorzugsweise liefert die Einkapselung eine Umhüllung, die, einmal implantiert, einen direkten Gewebekontakt mit den Inseln verhindert.
Vorzugsweise umfasst jede Einkapselung das Präsentieren der Inseln und einer geeigneten Alginatlösung in einer Quelle von kompatiblen Kationen, um dadurch die Inseln in einem Kation-Alginat-Gel einzufangen.
Vorzugsweise ist dieses Alginat-Gel ein Calcium-Alginat-Gel.
Vorzugsweise ist dieses in der Lösung verwendete Alginat Natriumalginat und die Insel- und Natriumalginat-Lösung wird als Tröpfchen in einem Bad von geeigneten Kationen präsentiert.
Vorzugsweise ist die Insel- und die Natriumalginat-Lösung 1,6% w/w.
Vorzugsweise wird die Insel- und Natriumalginat-Lösung als ein Tröpfchen durch eine Tröpfchen-erzeugende Nadel präsentiert.
Vorzugsweise sind die geeigneten Kationen Calciumchlorid.
Vorzugsweise werden die in Gel eingeschlossenen Inseln mit einem positiv geladenen Material beschichtet und werden danach mit einer äußeren Schicht eines geeigneten Alginats versehen.
Vorzugsweise ist das positiv geladene Material Poly-L-Ornithin.
Vorzugsweise wird dann das die Inseln einfangende Gel innerhalb der äußeren Beschichtung verflüssigt.
Vorzugsweise umfasst oder erfolgt die Verflüssigung durch die Zugabe von Natriumcitrat.
Vorzugsweise produziert die Einkapselung Kapseln.
Vorzugsweise enthalten die Kapseln eine Vielzahl an Inselzellen.
Vorzugsweise enthalten die Kapseln im Wesentlichen drei Inselzellen
Vorzugsweise besitzen die Kapseln einen Durchmesser im Wesentlichen von 300 bis 400 μm.
Vorzugsweise folgen auf die Verflüssigung des Alginats, das die Inseln einfängt, die weiteren Schritte:

– Waschen der Kapseln
– weiteres Beschichten der Kapseln mit Alginat, um jegliche verbliebene Veränderung auf der Poly-L-Ornithinschicht zu neutralisieren und einen direkten Kontakt des Poly- L-Ornithins mit Geweben zu verhindern, wenn die gesamte Kapsel transplantiert wird.

Vorzugsweise ist das Alginat mit einem Verfahren hergestellt worden, das die Schritte umfasst:
Ernte der Meeresalgen → Waschen → Alginatextraktion → Filtration → Fällung → Trocknen.
Eine xenotransplantierbare Kapsel kann gemäß dem oberen Verfahren präpariert werden.
Ein xenotransplantierbares Präparat, das aus lebensfähigen porzinen Inseln besteht oder diese umfasst, kann gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung präpariert werden.
Vorzugsweise umfasst die xenotransplantierbare Kapsel mit wenigstens einer pankreatischen β-Inselzelle wenigstens eine lebensfähige porzine pankreatische β-Inselzelle, die von einem in vivo Glucose-porösen und Insulin-porösen biokompatiblen Material umschlossen ist.
Die Erfindung kann bei einem Verfahren zur Behandlung eines an Diabetes leidenden Säugerpatienten angewendet werden, das umfasst:

(a) Extrahieren pankreatischer β-Inselzellen von Ferkeln einer voll ausgetragenen oder nahezu voll ausgetragenen Trächtigkeit,
(b) gleichzeitig mit und/oder nach a) Behandeln dieser Inseln mit Nicotinamid,
(c) Einkapseln dieser Inseln in einem biokompatiblen Material, das eine Wanderung von Glucose zu und Wanderung von Insulin weg von den Inseln in vivo erlaubt, und
(d) Injizieren oder anderweitiges Implantieren der eingekapselten Inselzellen von Schritt (c), um eine wirksame Menge an lebensfähigen porzinen Inselzellen, die zur Produktion von Insulin in dem Patienten fähig sind, in diesen Säugerpatienten zu transplantieren.

Vorzugsweise umfasst das Verfahren außerdem den Schritt der Verabreichung von Nicotinamid an den Säugerpatienten wenigstens im Anschluss an die Transplantation.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren außerdem den Schritt der Verordnung vor oder nach dem Implantierungsschritt einer caseinfreien Diät für den Patienten (wie hier beschrieben).
Vorzugsweise umfasst das Verfahren außerdem den Schritt der IgF-1 oder GPE-Exposition der pankreatischen β-Inselzellen in irgendeinem Stadium nach Extraktion aus den Ferkeln und vor der Einkapselung.
Vorzugsweise erfolgt das Ernten der Inseln zumindest während irgendeiner wesentlichen Konfrontation (z.B. Zerkleinern und/oder enzymatische Behandlung) in Gegenwart eines vor Verletzungen schützenden Agens.
Vorzugsweise wird das vor Verletzungen schützende Agens während der Isolierung und/oder Präparierung für eine Einkapselung verwendet.
Vorzugsweise ist das vor Verletzungen schützende Agens aus geeigneten Anästhetika ausgewählt.
Vorzugsweise ist das vor Verletzungen schützende Agens Lignocain.
Vorzugsweise ist der Patient vor, während oder nach dem Schritt (d) einem Therapieplan mit einer cholesterinsenkenden Medikation unterzogen worden.
Vorzugsweise gehört das Medikament zur „Statin"-Familie.
Vorzugsweise ist das Medikament Pravastatin.
Vorzugsweise wird die Ausbeute an lebensfähigen porzinen Inseln, die bei dem Extraktionsschritt a) erhalten wird, durch die Verwendung einer geeigneten Collagenase verbessert.
Vorzugsweise ist die Collagenase aus humaner Liberase^® oder porziner Liberase^® ausgewählt.
Vorzugsweise ist diese Collagenase humane Liberase^®.
Vorzugsweise umfasst der Extraktionsschritt a) eine mechanische Behandlung der Inseln.
Vorzugsweise folgt der mechanischen Behandlung des Pankreasgewebes eine Anwendung eines geeigneten Anästhetikums.
Vorzugsweise ist das Anästhetikum Lignocain.
Die Erfindung kann auch bei einem Verfahren für die Behandlung eines Säugerpatienten, der an Diabetes leidet oder eine Prädisposition für Diabetes besitzt, angewendet werden, wobei dieses Verfahren die folgenden Schritte einbezieht oder umfasst:

(A) (i) Ernten des Pankreas von Ferkeln einer voll oder nahezu voll ausgetragenen Trächtigkeit,
(ii) Kultivieren des geernteten Pankreas in Säugeralbumin, das im Wesentlichen frei von nicht-humanen mikrobiologischen Agenzien ist,
(iii) gleichzeitig mit Schritt (ii) und/oder nach Schritt (ii) Extrahieren der pankreatischen β-Inselzellen aus dem geernteten Pankreas mit Hilfe einer geeigneten Liberase^®, wobei die Inseln (wenigstens in irgendeinem Stadium der Ausführung von (A)) Nicotinamid ausgesetzt werden;
(B) (i) Einkapseln der in (A) präparierten Inseln mit einem geeigneten Einkapselungsmaterial, durch das sowohl eine Wanderung von Glucose als auch von Insulin möglich ist, und
(ii) Implantieren der eingekapselten porzinen Inseln in das Empfänger-Säugetier.

Vorzugsweise ist die Collagenase aus humaner Liberase^® oder porziner Liberase^® ausgewählt.
Vorzugsweise ist die Collagenase humane Liberase^®.
Vorzugsweise umfasst der Extraktionsschritt a) eine mechanische Behandlung der Inseln.
Vorzugsweise folgt der mechanischen Behandlung des Pankreasgewebes eine Anwendung eines geeigneten Anästhetikums.
Vorzugsweise ist das Anästhetikum Lignocain.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren außerdem den Schritt der Verabreichung von Nicotinamid an das Empfänger-Säugetier vor oder nach dem Implantierungsschritt.
Vorzugsweise umfasst das Verfahren außerdem den Schritt der Verordnung vor oder nach dem Implantierungsschritt einer caseinfreien Diät für den Patienten (wie hier beschrieben).
Vorzugsweise beinhaltet das Verfahren außerdem den Schritt des Unterziehens des Patienten vor oder nach dem Implantierungsschritt den Schritt einer cholesterinsenkenden Medikation.
Vorzugsweise gehört der Cholesterinsenker zur „Statin"-Familie.
Vorzugsweise ist dieser Cholesterinsenker Pravastatin oder Simvistatin.
AUSFÜHRLICHE ERÖRTERUNG
1. Allgemeines
Für die vorliegende Erfindung wurde die Möglichkeit erkannt, geeignete Inseln aus Ferkeln zu gewinnen, deren Insulin ähnliche Strukturen wie humanes Insulin zeigt und die ähnliche physiologische Blutzuckerspiegel wie die Menschen aufweisen. Die verwendeten Ferkel sind voll oder nahezu voll ausgetragen. Die Inseln werden in ein geeignetes xenotransplantierbares Ausgangsmaterial, das im Menschen lebensfähig ist, mit Hilfe der folgenden zuverlässigen Verfahren umgewandelt, die sich auf das Ernten und Extrahieren der Inseln, der Behandlung der Inseln vor der Xenotransplantation wie auch auf Therapiepläne für eine Verwendung derartiger Inseln beziehen.
Der Hauptvorteil einer Transplantation von porzinen Inselzellen gegenüber der Transplantation von humanen Inselzellen ist, dass die Quelle der Inselzellen ohne weiteres vermehrt werden kann und die biologische Sicherheit der Zellen vor der Transplantation gründlich untersucht werden kann. In der Praxis kann die Entnahme des Pankreas und die Inselzell-Isolation in einer idealen Umgebung rasch durchgeführt werden.
Wichtige Überlegungen, die für den Einsatz von porzinen Inselzellen bei Versuchsansätzen der Transplantation bei Typ 1 Diabetes bedeutsam sind, umfassen folgende:

– Die strukturellen und biologischen Ähnlichkeiten von porzinem und humanem Insulin
– Die Tatsache, dass porzines Insulin seit mehreren Jahrzehnten zur Behandlung von Diabetes verwendet worden ist (und das erst vor relativ kurzer Zeit durch Insulin mit der Humansequenz ersetzt worden ist); und
– Die ähnlichen physiologischen Blutzuckerspiegel bei Menschen und Schweinen (Weir & Bonner-Weir, 1997). Dies bedeutet effektiv, dass porzine Inselzellen erwartungsgemäß ähnlich wie ihre humanen Pendants bei der Aufrechterhaltung äquivalenter Glucosekonzentrationen reagieren.

2. Die Natur der Krankheitsursache von Diabetes
Eine erfolgreiche Langzeit-Allotransplantation von humanen Inseln kann in über 80% der Patienten erreicht werden, wenn die Krankheit von nicht-immunen Prozessen hervorgerufen ist. Im Gegensatz hierzu können selbst von einem nicht-diabetischen Zwilling gewonnene Inseln einen autoimmunen Diabetes bei dem diabetischen Zwillingsgeschwister nicht langandauernd revertieren. Dies unterstreicht die entscheidende Rolle der Autoimmunität beim Versagen der Inseltransplantation. Diese Beobachtungen sind bei der Allotransplantation bei Nagern mit Diabetes bestätigt worden, wo der Diabetes, der von einer Autoimmunität hervorgerufen worden war, mit einem Diabetes verglichen wurde, der durch eine Pankreatektomie oder chemische β-Zellzerstörung hervorgerufen worden war. Ein Großtiermodell eines autoimmunen Diabetes gibt es nicht. Es ist möglich, dass die Verwendung von Inseln einer anderen Spezies (Xenotransplantation) eine autoimmune Zerstörung transplantierter Inseln verhindern könnte, da der immunologische Prozess der Xenotransplantatabstoßung sich von einer Allotransplantatabstoßung unterscheidet, was für den Menschen allerdings absolut hypothetisch ist.
3. Isolierung und Präparierung von porzinen Inselzellen für eine Xenotransplantation
3a. Tierquelle und Transport
Alle Tiere, die als eine Quelle für Pankreasgewebe für eine Xenotransplantation dienen sollen, sind von einer spezifischen Pathogen-freien (SPF) Schweinezuchteinrichtung erhalten worden, die in Übereinstimmung mit der American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) geführt wird. Die Einrichtung hält eine Kohorte mit einem hohen Gesundheitsstatus sowie mit hervorragenden landwirtschaftlichen Standards und arbeitet mit einem Aufzeichnungssystem, das einfach zugänglich ist und unbeschränkt dokumentiert wird. Spendersauen und Zuchteber sind mit dem vorrangigen Ziel ausgewählt, eine starke Heterosis in der Filialgeneration zu bilden.
3b. Isolierung und Reinigung der Inselzellen
Nach der chirurgischen Entnahme werden die Spenderpankreata in eine Reinraumvorrichtung für eine weitere Verarbeitung in einem kalten Kunststoffbehälter in 50 ml Röhrchen, die kalte isotonische Hanks-Salzlösung (HBSS) mit 0,2% humanem Serumalbumin enthalten, überführt. Blutproben werden von jedem Spender für Virustests und Toxoplasmoseserologie eingesandt. Proben von jedem Organ werden in einer Tiefkühltruhe bei –80°C für weitere Tests, falls erforderlich, aufbewahrt.
3c. Verdau
Die Inselzellen werden mit Hilfe eines Collagenase-Standardverdaus des zerkleinerten Pankreas mit einem von Ricordi et al. (1990) dokumentierten Verfahren mit einigen Modifikationen isoliert. Unter Anwendung einer aseptischen Technik werden die Bauchspeicheldrüsen mit Liberase^® (1,5 mg/ml) gedehnt, von übermäßigem Fett, Blutgefäßen und Bindegewebe befreit, und bei 37°C in einem Wasserbadschüttler 15 min bei 120 rpm verdaut. Der Verdau wird mit Hilfe von Lignocain durchgeführt, das mit der Liberase^® Lösung gemischt ist, um eine Zerstörung der Zellen während des Verdaus zu vermeiden. Nach dem Verdau werden die Zellen durch ein steriles 400 mm mesh-Sieb in ein steriles Becherglas passiert. Ein zweiter Verdau wird für jegliches nicht verdaute Gewebe durchgeführt.
Wir haben festgestellt, dass viel größere Ausbeuten pro neonatales porzines Pankreas eher mit der Verwendung von porziner oder humaner Liberase^TM (z.B. in Neuseeland von Roche erhalten) als mit Collagenase erhalten werden können. Zwar gibt es die Veröffentlichungen „Improved Pig Islet Yield and Post-Culture Recovery Using Liberase P1 Purified Enzyme Blend", T.J. Cavanagh et al. Transplantation Proceedings 30, 367 (1998) und „Significant Progress In Prorcine Islets Mass Isolation Utilizing Liberase^® HI For Enzymatic Low-Temperature Pancreas Digestion", H. Brandhorst et al. Transplantation Bd. 68, 355–361, Nr. 3, 15. August 1999, doch sind deshalb die darin erhaltenen Ausbeuten im Vergleich zu denjenigen, die wir festgestellt haben, gering. Falls zum Beispiel mit dem Verfahren nach Brandhorst et al. eine höhere Ausbeute an Inseln verglichen zu Collagenase von 400 auf angenommene 800 mit diesem Verfahren unter Verwendung von humaner Liberase^® (z.B. Liberase^® H) erzielt wird, wie bei dem Verfahren nach Brandhorst et al., doch beschränkt auf neonatale porzine Inseln, wie auf solche vom Tag 7 nach der Geburt, so sind außerordentlich viel größere Ausbeuten möglich, nämlich von der äquivalenten Menge von 400, wie es mit unbehandelter Collagenase der Fall wäre, auf 30.000, das als sehr viel mehr erkannt werden kann, als was mit dem Verfahren nach Brandhorst et al. mit Schweinen zu erwarten wäre.
3d. Waschen und Kultivieren
Das verdaute Gewebe wird dreimal gewaschen und dann in Zellkulturmedium RPMI 1640 ausgesät, zu dem 2% humanes Serumalbumin (HSA), 10 mmol/l Nicotinamid und ein Antibiotikum (Ciproxin) gegeben worden ist.
3e. Qualitätskontrollen
Um jegliche Kontamination des Gewebes auszuschließen, werden Qualitätskontrollen von Zellkulturproben nach der Isolierung und vor der Einkapselung vorgenommen. Drei Tage nach der Isolierung wird die Zellkultur auf eine mikrobielle Kontamination durch zugelassene Laboratorien getestet. Das Testen auf porzinen endogenen Retrovirus (PERV) wird vom Virology Laboratory, Auckland Hospital, vorgenommen.
Die Insel-Ausbeute wird mit einer Färbung der Zellen mit Dithizon (DTZ) bestimmt. Dithizon ist ein Zinkchelator und eine supravitale Färbung, die Zink in den Langerhans Inseln selektiv färbt und eine der Unterscheidung dienenden Rotfärbung hervorruft.
Die Viabilität der Inselzellen wird mit Hilfe von Acridinorange und Propidiumiodid bestimmt. Acridinorange ist ein fluoreszierender Farbstoff, der ohne weiteres alle Zellmembranen durchdringt und Cytoplasma sowie Nukleus färbt. Eine leuchtend grüne Fluoreszenz sowohl im Nukleus als auch im Cytoplasma bei Exposition an ultraviolettem Licht (UV) zeigt intakte lebende Zellen an. Dagegen ist Propidiumiodid eine fluo reszierender Farbstoff, der eine intakte Membran nicht durchdringen kann. Er emittiert eine leuchtend rote Fluoreszenz, wenn er an UV-Licht exponiert wird, und das Vorhandensein von Propidiumiodid in einem Zellnukleus weist auf schwere Schäden oder Zelltod hin.
3f. Bestimmung der in vitro Insulinsekretionskapazität
Die statische Glucosestimulation (SGS) wird für eine Bewertung der in vitro Funktion der porzinen Inseln eingesetzt, bei der die Inseln niederen und hohen Konzentrationen an Glucose und Theophyllin ausgesetzt werden. Die Bestimmung der in vitro Insulinsekretionskapazität erfolgt sowohl mit freien Inseln (nach dreitägiger Kultur) als auch nach ihrer anschließenden Einkapselung.
4. Xenotransplantation
4a. Die Viabilität der Inseln für eine Xenotransplantation
Die Verfahren, mit denen die Inseln vor der Transplantation gereinigt werden, führen zu Verletzungen dieser hoch spezialisierten Gewebe. Derartige Verletzungen können eine Nekrose oder Apoptose auslösen, wobei das letztere sehr verzögert auftreten kann.
Weitere Verletzungen können aus der Einkapselung entstehen. Die von uns sowohl bei der Präparierung der Inseln als auch bei ihrer Einkapselung angewandten Verfahren sind optimiert worden, um nur minimale Schäden für die Inseln zu gewährleisten. Derartige Verfahren haben eine wärmefreie Ischämie garantiert (verglichen mit Stunden bei den meisten Präparationen für humane Inseln), haben die Verwendung von Nicotinamid umfasst, um eine erfolgreiche in vitro Explantierung zu verbessern, haben eine minimale Inkubationszeit mit Collagenase oder Liberase umfasst, haben eine schnelle nicht verletzende Einkapselungstechnologie umfasst, haben die Verwendung von IgF-1 (oder des GPE-Tripeptids davon) umfasst, haben die Verwendung eines Anästhetikums, wie Lignocain, und eines Antibiotikums, wie Ciproproxin, etc. umfasst.
Bei unserer bevorzugten Präparation werden vorzugsweise neonatale (7 Tage alte) Inseln verwendet, was sowohl für eine Begrenzung der Verletzungen von Inseln während der Reinigung als auch zur Gewährleistung einer hinreichenden Reifung der Inseln für eine stimulierte Insulinproduktion entscheidend ist.
Der IgF-1 (humaner Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor I) wird verwendet, um die Reifung der unreifen porzinen Inseln zu ihrer Insulin-produzierenden Form zu induzieren. IgF-1 ist ein potenter mitogener Wachstumsfaktor, der die wachstumsfördernden Aktivitäten vom Wachstumshormon postnatal vermittelt. Sowohl IgF-1 als auch IgF-2 werden in vielen Zelltypen exprimiert und können zahlreiche endokrine, autokrine und parakrine Funktionen erfüllen. Von der bevorzugten Form von IgF-1 haben wir festgestellt, dass sie das Amino-terminale Tripeptid Glycin-Prolin-Glutamat von IgF-1 (GPE) ist.
4b. Einkapselungsverfahren mit Alginat
Das für dieses Verfahren verwendete Natriumalginat wird aus Rohmaterial (Meeresalgen) extrahiert und in einer pulverisierten ultrareinen Form hergestellt. Die sterile Natriumalginat-Lösung (1,6%) wird dann am Diatranz Islet Transplant Centre verwendet, um eingekapselte Inseln herzustellen.
Allgemein umfasst jede Einkapselung ein Präsentieren der Inseln und einer geeigneten Alginatlösung (normalerweise Natriumalginat) in einer Quelle kompatibler Kationen, um die Inseln in einem Kation-Alginat-Gel (normalerweise Calcium-Alginat-Gel) einzufangen.
Das Einkapselungsverfahren umfasst das Extrudieren eines Gemisches aus Inseln und Natriumalginat-Lösung (1,6% w/w) durch eine Tröpfchen-erzeugende Nadel hindurch in ein Bad von gelbildenden Kationen (Calciumchlorid). Die in dem Calcium-Alginat-Gel eingefangenen Inseln werden dann mit positiv geladenem Poly-L-Ornithin und danach mit einer äußeren Schicht aus Alginat (0,05%) beschichtet. Der innere Alginatkern wird dann durch Zugabe von Natriumcitrat verflüssigt. Die meisten Kapseln enthalten 3 Inseln und besitzen einen Durchmesser von 300 bis 400 μm.
Nach Verflüssigung des die Inseln einfangenden Alginats werden die „Kapseln" gewaschen und wiederum mit Alginat beschichtet, das jede verbleibende Änderung auf der Poly-L-Ornithin-Schicht neutralisiert und einen direkten Kontakt des Poly-L-Ornithins mit Geweben verhindert, wenn die ganze Kapsel implantiert wird.
Die eingekapselten Inseln werden in Zellkultur gehalten und dann auf eine Kontaminierung, Insulinabgabe und Viabilität vor einer Transplantation kontrolliert. Sie werden nur dann für eine Transplantation freigegeben, wenn alle Tests der Qualitätskontrolle negativ verlaufen sind.
Idealerweise umfasst das Produktionsverfahren die folgenden Schritte:
Meeresalgen-Ernte → Waschen → Algenextraktion → Filtration (vorzugsweise mit einem 0,2 μm Filter) → Fällung → Trocknung.
Das verwendete ultrareine Alginat ist idealerweise Kelco LV, das von Monsanto-Kelco, U.S., hergestellt wird und die folgenden Spezifizierungen besitzt:

1. Viskosität: 2% – 100–300 cps (Brookfield 25°C, Geschwindigkeit 3,60 rpm)
2. pH: 6,4–8,0
3. Proteingehalt < 0,5%
4. Filtration: durch 0,2 μm
5. Chemische Analyse:
6. Endotoxingehalt – gemessen mit LAL-Test (an der Universität Perugia): 39 EU/g [Übrigens: Jeglicher Gehalt unter 100 EU/g wird in diesem Test als frei von Toxin erachtet]
7. Molekulargewicht: 120.000–190.000 kD
8. Mannuronsäure-Gehalt (M): M-Fraktion (F_m) 61%
9. Glucuronsäure-Gehalt (G): G-Fraktion (F_G) 39%

Idealerweise erfolgte die Filtration in einem Mehrfachfilterprozess, bei dem positiv geladene Filter verwendet werden, die jeglichen Lipopolysaccharid-Gehalt entfernen.
4c. Im Empfänger verwendete Medikamente
Die Transplantation erfordert keine Verwendung cytotoxischer Agenzien für eine Suppression des Immunsystems und vermeidet somit deren Verwendung. Derartige Agenzien sind in der Lage, in die Alginat-Mikrokapsel einzudringen und verursachen eine Inseltoxizität, ebenso wie sie eine systemische Toxizität hervorrufen. Stattdessen werden Nicotinamid und eine spezielle Diät genutzt (für eine Erklärung siehe Abschnitt 1.4 unten).
Die Transplantationsverfahren unserer früheren Patentbeschreibung sind in der Lage, in einem Zeitraum vor der Abstoßung porzines Insulin bereitzustellen. Bezüglich dessen führten wir selbst klinische Versuche durch.
Vier jugendliche Typ 1-Diabetiker erhielten 10.000 freie Inseln/kg Körpergewicht mittels intraperitonealer Injektion. Die Inseln wurden von ausgetragenen Ferkeln mit Hilfe von Collagenase-Standardverdau, Reinigungs- und Kultivierungsverfahren präpariert, die in Abschnitt 3.2 beschrieben sind. Alle vier Empfänger erhielten oral Nicotinamid (1,5 g/Tag) und eine wie hier definierte caseinfreie Diät vor und nach der Transplantation. Eine umgehende Verringerung des Insulinbedarfs, die nicht eindeutig Dosis-abhängig war, wurde in der ersten Woche nach der Transplantation festgestellt. Die Verringerung der Insulindosierung lag im Bereich von 21 bis 32% und die Reaktion dauerte bis zu 14 Wochen an. Danach mussten allerdings die Insulindosen wieder auf ihre früheren Werte erhöht werden.
Der wahrscheinlichste Grund, warum die Transplantation bei diesen Patienten fehlschlug, war die chronische Abstoßung. Allerdings wurden keine nachteiligen Wirkungen festgestellt.
Wir haben jetzt gezeigt, dass Alginat-eingekapselte porzine Inselzelltransplantate in zwei humanen Diabetes-Patienten die Funktionsfähigkeit der Transplantate verlängerten. Die Inseln wurden mittels intraperitonealer Injektion transplantiert, wobei ein Patient 15.000 IEQ/kg (insgesamt 1.300.000 Inseln) und der andere Patient 10.000 IEQ/kg (insgesamt 930.000 Inseln) erhielt. Beide Patienten erhielten vor und nach der Transplantation oral Nicotinamid und eine, wie hierin definierte, auf Soja basierende caseinfreie Diät.
Das bevorzugte Verfahren, wie es in 1 gezeigt ist, wurde für die oben erwähnte Präparierung und die Einkapselung angewandt. Es wurden Inselzellen von Tag –7 bis +10 der vollen Gestation verwendet.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Bevorzugte Formen der vorliegenden Erfindung oder der Versuchsbeispiele werden nun unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, in denen:
1 ein bevorzugtes Verfahren zum Ernten, Isolieren und Präparieren von Inselzellen (entweder mit Einschluss oder Einkapselung) und den damit verbundenen Behandlungsplan für einen diabetischen Humanpatienten zeigt, um einen dauerhaften Nutzen aus der Xenotransplantation zu ziehen,
2 die Wirkung von Collagenase aus verschiedenen Quellen auf die Ausbeute und Funktion der Inseln zeigt,
3 den Stimulationsindex von Liberase^® versus Collagenase zeigt, der eindeutig zeigt, dass Liberase^® Präparate (sowohl humane als auch porzine bei geeigneten Konzentrationen) bessere Ausbeuten und Funktion in vitro als eine optimierte Konzentration von Collagenase P ergeben,
4 den Stimulationsindex freier Inseln zeigt, wenn die Verwendung von Ciproxin mit einer Penicillin/Streptomycin-Mischung und mit einer Kontrolle ohne Antibiotika verglichen wird,
5 die Ergebnisse der GPE-Exposition neonataler porziner Inseln in Kultur im Vergleich zu Kontrollzellen zeigt.
5. Beispiele
5a. Beispiele für eine Verwendung von IgF-1

*Anmerkung: In den folgenden verschiedenen Versuchen werden verschiedene Insel-Präparate eingesetzt, weshalb die Kontrollwerte variieren.

– porzine Inseln in Kultur, die IgF-1 ausgesetzt waren, erhöhten ihre Insulinantwort auf Glucose um das Dreifache.
– Eine Konzentration von 0,1 μg/ml IgF-1 in Kultur ist ausreichend, um eine optimale Insulinsekretion während einer Glucosebelastung hervorzurufen. Kein weiterer Nutzen wurde durch eine Erhöhung der IgF-1 Konzentration erzielt.
– Variationen der IgF-1 Expositionsdauer wurden mit porzinen Inselzellen durchgeführt. Allerdings wurde kein erhöhter Nutzen bei einer Kultivierung der Inseln mit IgF-1 über eine Dauer von 24 h hinaus nach Isolierung festgestellt.
– Diese erhöhte Insulinproduktion dauerte 14 Tage nach IgF-1 Exposition an. Längere Zeiträume sind noch zu untersuchen.
– Die Entfernung von Nicotinamid aus den Kulturmedien schaltete den Nutzen von IgF-1 für die Insulinproduktion aus.
– Eine Konzentration von 0,1 μg/ml IgF-2 während der Kultivierung schien die Insulinproduktion von porzinen Inseln nach einer anfänglichen Exposition von 24 h zu erhöhen. Allerdings war dieser Anstieg bis 3 Tage nach Exposition nur vorübergehend.

5b. Wirkung vom N-terminalen Tripeptid (GPE) des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors auf die Funktion von neonatalen porzinen Inselzellen.
GPE ist ein von IgF-1 abstammendes Tripeptid (gly-pro-glu). Es ist ein neuartiges neuroreaktives Peptid mit einer potenten Wirkung auf die Acetylcholin- und Dopaminfreisetzung in Gehirnschnitten. Früher unternommene Untersuchungen mit GPE unterstützen die Vorstellung, dass die proteolytischen Produkte des IgF-1-Vorläufers eine Rolle bei der Regulation von Gehirnfunktionen spielen.
Das Ziel dieses Beispiels war, die Wirkung von GPE auf die Funktion von isolierten porzinen Inseln in vitro aufzuzeigen.
Methode

–Isolierung der Inselzellen von zwei Pankreata;
– Isolierung nach dem bereits diskutierten Protokoll;
– RPMI-Medien mit zugefügtem Ciproxin, Nicotinamid, humanen Serumalbumin;
– GPE, IgF-1 (1-3), Bachem AG, Lot Nr. 0538925, Stammlösung 100 μg/ml (in Wasser); weiteres Verdünnen in RPMI-Medium auf die Endkonzentrationen: 1 μg/ml (1:100), 0,1 μg/ml (1:1000), und 0,01 μg/ml (1:10.000)
1. GPE 0,01 μg/ml
2. GPE 0,1 μg/ml
3. GPE 1,0 μg/ml

Vor der statischen Glukosestimulierung (SGS) werden die Zellen drei Tage in Kultur gehalten. SGS umfasst das Aussetzen der Zellen niederen und hohen Glucosekonzentrationen, um die Insulinproduktion zu überprüfen. Je 0,1 μg/ml GPE wurde zu zwei Platten 24 Stunden vor der SGS (Tag 2 nach Isolierung) gegeben.
Ergebnisse von Beispiel 5b
Eine GPE-Exposition neonataler porziner Inseln in Kultur verstärkte die Insulinreaktion auf Glucose um bis zu 11,5 im Vergleich zu den Kontrollzellen. (Stimulationsindex-Kontrolle 13,3 verglichen mit 24,8, wenn GPE eingesetzt war). Die Viabilität der Zellen lag bei > 85% DTZ, AO/PI-Färbung).
Eine Konzentration von 0,01 μg/ml GPE in Kultur ist für die Erzeugung einer optimalen Reaktion während der Glucosebelastung ausreichend. Ein weiterer Nutzen wurde durch eine Erhöhung der GPE-Konzentration in der Kultur nicht erzielt. Siehe 5 unten.
Die Ergebnisse lassen vermuten, dass GPE während der Kultivierung der porzinen Inselzellen verwendet werden könnte, um die Qualität und Funktion der Zellen vor der Transplantation zu verbessern. Außerdem ist GPE ein neuartiges neuroreaktives Protein, das im menschlichen Gehirn gefunden wurde.
5c. Beispiele für die Wirkung von Lignocain auf die Ausbeute und Viabilität der Inseln, wenn es während des porzinen pankreatischen Verdaus verwendet wird.
Lignocain ist ein Membranstabilisator und Phospholipase A2-Inhibitor. Wird es mit einer Konzentration von 1 mM während des Collagenase-Verdaus eines 7 Tage alten porzinen Pankreas verwendet, so wird eine Verdoppelung der Inselausbeute erhalten.
Die endokrine Funktion der Inseln wurde nach 3 Kultivierungstagen mit Hilfe einer statischen Glucosestimulation bewertet. Die während des Verdaus mit Lignocain isolierten Inseln zeigten eine Verdreifachung der Insulinsekretion als Antwort auf eine Glucosebelastung.

Schlussfolgerung: Die Verwendung von Lignocain während des Pankreasverdaus erhöht die Insulinproduktion/g Pankreas um das 6-fache.

5d. Beispiele für die Wirkungen von Ciproxin auf die Inselfunktion, die mit der statischen Glucosestimulation bewertet wird.
Frisch präparierte neonatale porzine Inseln wurden mit Standardisolierungsverfahren präpariert und zwei Tage in RPMI-Medium mit Standardzugaben kultiviert. Streptomycin (100 mcg/ml) und Penicillin (100 U/ml) wurden in ein Kölbchen und Ciproxin in ein anderes Kölbchen (3 mcg/ml) gegeben.
Die Inseln wurden geerntet und ein Aliquot wurde einer Stimulation mit Theophyllin und viel Glucose unterzogen.
Der Vergleich der Insulinfreisetzung von den Inseln, ein Maß für die Viabilität, ist in 4 gezeigt.
5e. Beispiele für die Wirkungen von Collagenase aus unterschiedlichen Quellen auf die Ausbeute und Funktion der Inseln.
Pankreata von neonatalen, 7 Tage alten Ferkeln wurden, wie oben beschrieben, erhalten, und die Inseln wurden mit dem gleichen Verfahren extrahiert, nur Quelle und Menge der Collagenase variierten. Die Ausbeute/Gramm Pankreas ist in der Figur gezeigt.
Die mit Hilfe verschiedener Collagenquellen und -mengen extrahierten Inseln wurden auf ihre Viabilität unter Verwendung von Propidiumiodid und Dithizon für den Insulingehalt getestet.
DTZ-Färbung > 85%
AO/PI > 85%
Die Inseln wurden dann mit der statischen Glucosestimulation auf ihre Funktionsfähigkeit getestet, wie oben beschrieben. Die Ergebnisse sind in der Figur unten gezeigt.
Es ist offensichtlich, dass Liberase^® Präparate bei geeigneten Konzentrationen höhere Ausbeuten liefern und in vitro besser funktionieren als die früher optimierten Konzentrationen von Collagenase P.
5f. Beispiele für den Vergleich der Wirksamkeit von mit Liberase P oder H präparierten Inseln in vivo
Inseln, die mit den optimalen Konzentrationen an Liberase^® P und H auf diese Weise präpariert worden waren, wurden in CD1-Mäuse, die durch intravenöses Streptozotocin diabetisch gemacht worden waren, intraperitoneal injiziert. Die eingesetzte Dosis betrug 10 Inseln/g Körpergewicht der Maus. Zehn Tage nach dieser Behandlung wurde die Zahl der Mäuse bestimmt, die nicht mehr diabetisch waren.
1 von 7 Mäusen, die mit Liberase^® P isolierten Inseln behandelt worden waren, und 4 von 7 Mäusen, die mit Liberase H isolierten Inseln behandelt worden waren, waren nicht diabetisch.
Ähnliche Versuche wurden mit spontan diabetischen NOD-Mäusen durchgeführt. Von den überlebenden Mäusen waren an Tag 10 nach der Transplantation 3 von 7 mit den Liberase P isolierten Inseln und 3 von 3 mit den Liberase H isolierten Inseln nicht mehr diabetisch.
5g. Beispiel für ein Insel-Einkapselungsverfahren
Die neuartigen Mikrokapseln mittlerer Größe (300–400 μm MSM) werden durch Zerstäuben der Insel-Alginat-Suspension durch einen speziellen Mikrotröpfchen-Generator hergestellt.
Das für dieses Verfahren eingesetzte Natriumalginat wird aus Rohmaterial (Meeresalgen) extrahiert und in pulverisierter ultrareiner Form hergestellt (Keltone LVCR).
Das Einkapselungsverfahren umfasst das Extrudieren eines Gemisches aus Inseln und Natriumalginat-Lösung (1,6%) durch eine Tröpfchen-erzeugende Nadel in ein Bad von gelbildenden Kationen (Calciumchlorid). Die in dem Calcium-Alginat-Gel eingefangenen Inseln werden dann mit positiv geladenem Poly-L-Ornithin und anschließend mit einer äußeren Schicht aus Alginat (0,05%) beschichtet. Der innere Alginatkern wird dann durch Zugabe von Natriumcitrat verflüssigt. Die meisten Kapseln enthalten drei Inseln und besitzen einen Durchmesser von 300 bis 400 μm.
Die eingekapselten Inseln werden in Zellkultur gehalten und auf Kontamination, Insulinfreisetzung und Viabilität vor der Transplantation geprüft.
DEFINITIONEN
Hierin verwendete Begriffe:

– „Verabreichung" umfasst Selbstverabreichung;
– „Caseinfrei", wenn der Begriff, wie er hier verwendet ist, auf Milch bezogen ist, dann bezieht er sich auf Milch, die keinen Diabetesfaktor enthält, insbesondere auf Milch, die keine β-Casein-Variante enthält, die eine diabetogene Aktivität im Menschen stimuliert. Unter Bezugnahme auf die Internationale PCT-Anmeldung WO 96/14577 kann eine nichtdiabetogene Variante zum Beispiel die A2-Variante von β-Casein sein. Die vollständigen Inhalte von PCT/NZ/95/00114 (WO 96/14577) und PCT/NZ/96/00039 (WO 96/36239) sind hier durch die Quellenangabe eingefügt.
– „Caseinfrei", wie hier mit Bezug auf diätetische Gesichtspunkte verwendet, bedeutet wenigstens eine substanzielle Vermeidung (vorzugsweise Totalvermeidung) einer solchen Milch, die Diabetesfaktoren oder abgeleitet Diabetesfaktoren enthält.
– IgF-1 ist der humane Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor I und ist ein potenter mitogener Wachstumsfaktor, der die wachstumsfördernden Aktivitäten von Wachstumshormon postnatal vermittelt. Sowohl IGF-1 als auch IGF-2 werden in vielen Zelltypen exprimiert und können endokrine, autokrine und parakrine Funktionen erfüllen.
– Das N-terminale Tripeptid von IGF-1 oder „GPE" ist das Amino-terminale Tripeptid Glycin-Prolin-Glutamat von IGF-1.
– „Säugeralbumin", wie hier verwendet, bedeutet Serumalbumin für Säuger, vorzugsweise humanes Serumalbumin (HSA).
– „Geeignete Collagenase" bedeutet vorzugsweise Liberase^®, idealerweise humane oder porzine Liberase^®, idealerweise Liberase H^®.
– „Mechanisch reduziert", wie hier verwendet, umfasst jedes beliebige Verfahren, mit Hilfe dessen die Oberfläche des Pankreasgewebes vergrößert wird, z.B. mechanisch oder Zerstückelung im Wasserstrahl, Zerreiben, Zerschneiden, etc.

Claims

Verfahren zum Präparieren eines xenotransplantierbaren porzinen Inselpräparats, das auf die Xenotransplantation hin zum Produzieren von Schweineinsulin in einem geeigneten Empfänger-Säugetier fähig ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte einbezieht oder umfasst: (i) Herstellen einer Kultur von geerntetem Pankreas, welches Pankreas von Ferkeln einer voll ausgetragenen oder einer nahezu voll ausgetragenen Trächtigkeit geerntet worden ist; (ii) gleichzeitig mit Schritt (i) und/oder nach Schritt (i) Extrahieren von pankreatischen β aus der Kultur des geernteten Pankreas; und (iii) Aussetzen des Pankreas oder der Inselzellen einem Anästhetikum; wobei die Inseln (zumindest in irgendeinem Stadium der Ausführung des Verfahrens) Nicotinamid ausgesetzt werden und wobei die Extraktion unter Verwendung einer geeigneten Collagenase vorgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ferkel im Bereich von –20 bis +10 Tage einer voll ausgetragenen Trächtigkeit liegen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ferkel im Bereich von –7 bis +10 Tage einer voll ausgetragenen Trächtigkeit liegen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Collagenase humane oder porzine Liberase^® ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Kultur außerdem geernteten Pankreas in einem supportiven Säuger-Albumin umfasst, das im wesentli chen frei von nicht-menschlichen mikrobiologischen Agenzien ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Säuger-Albumin menschliches Serumalbumin (HSA) ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Inseln mit Nicotinamid behandelt werden nach ihrer Extraktion aus dem Pankreas.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, außerdem umfassend den Schritt des Behandelns der Inseln mit einem von IgF-1 oder dem N-terminalen Tripeptid von IgF-1 (GPE).
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Schritt des Behandelns der Inseln ihre Behandlung mit GPE umfasst.
Verfahren nach Ansprüchen 8 und 9, wobei das Aussetzen entweder dem IgF-1 oder GPE für jene Zellen von Ferkeln größer ist, die am weitesten von einer Vollzeit-Gestation entfernt sind.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei ein Aussetzen dem IgF-1 für alle extrahierten Zellen stattfindet, unabhängig von ihrer Beziehung zur Vollzeit-Gestation.
Verfahren nach jedem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Anästhetikum Lignocain ist.
Verfahren nach jedem der vorangehenden Ansprüche, wobei Schritt (ii) des Verfahrens das mechanische Reduzieren des geernteten Pankreas in Gegenwart des Anästhetikums umfasst.
Verfahren nach jedem der vorangehenden Ansprüche, wobei ein Antibiotikum mit den Inselzellen assoziiert ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Antibiotikum Ciprofloxacin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, außerdem umfassend den Schritt des Einkapseln der Inselzellen mit einem biokompatiblen xenotransplantierbaren Material, welches Material in vivo sowohl für Glucose als auch für Insulin porös ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das biokompatible Material ein geeignetes Alginat ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Alginat in ultrareiner Form vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei jede Insel oder Gruppe von Inseln in einer in vivo für Insulin und Glucose porösen biokompatiblen Alginat- oder alginatartigen Umhüllung eingefangen ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Einkapselung eine Umhüllung bietet, welche, einmal implantiert, den direkten Gewebekontkat mit den Inseln verhindert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei der Schritt des Einkapselns der Inselzellen das Präsentieren der Inseln und einer geeigneten Alginatlösung in einer Quelle von kompatiblen Kationen beinhaltet, um dadurch die Inseln in einem Kation-Alginat-Gel einzufangen.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Kation-Alginat-Gel Calciumalginat-Gel ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Alginat in ultrareiner Form Natriumalginat umfasst, und die Insel- und Natriumalginat-Lösung als ein Tröpfchen in einem Bad von geeigneten Kationen präsentiert wird.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Insel- und Natriumalginat-Lösung zu 1,6% w/w vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die geeigneten Kationen Calciumchlorid sind.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Gel-umfangenen Inseln mit einem positiv geladenen Material beschichtet werden und danach mit einer äußeren Schicht eines geeigneten Alginats versehen werden.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei das positiv geladene Material ein Poly-L-Ornithin ist.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei das Gel, das die Inseln innerhalb der äußeren Beschichtung einfängt, dann verflüssigt wird.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Verflüssigung die Zugabe von Natriumcitrat einbezieht oder dadurch zustande kommt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 29, wobei die Einkapselung Kapseln produziert.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Kapseln ein Vielzahl von Inselzellen enthalten.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Kapseln drei Inselzellen enthalten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 31 oder 32, wobei die Kapseln einen Durchmesser von etwa 300 bis 400 Mikronen aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 33, wobei nach der Verflüssigung des Alginats, das die Inseln einfängt, die folgenden weiteren Schritte folgen: (i) Waschen der Kapseln; und (ii) außerdem Beschichten der Kapseln mit einem geeigneten Alginat.