DE69534865T2

DE69534865T2 - Makroeingekapselte sekretorische Zellen

Info

Publication number: DE69534865T2
Application number: DE69534865T
Authority: DE
Inventors: Kanti New York Jain; Albert L. Englewood Rubin
Original assignee: Rogosin Institute Inc
Current assignee: Rogosin Institute Inc
Priority date: 1994-01-13
Filing date: 1995-01-12
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2015-01-13
Also published as: AU1526795A; JP2006345875A; AU681240B2; CN1141650A; AU681240C; FI962841A; JP4435134B2; NZ278809A; HK1084693A1; NO324570B1; JP2005137376A; PT742818E; DK1666585T3; ES2260568T3; CA2181156C; KR100474803B1; EP1418228A1; DE69534865D1; USRE38027E1; EP0742818B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Makroeinkapselung von sezernierenden Zellen in einem hydrophilen Gelmaterial, therapeutische Verfahren unter Verwendung der makroeingekapselten sezernierenden Zellen, und das Konservieren von sezernierenden Zellen durch Makroeinkapselung.
Hintergrund der Erfindung
Sezernierende Zellen sind Zellen, welche dadurch gekennzeichnet sind, dass sie biologische Produkte wie etwa, aber nicht beschränkt auf Hormone (z.B. Insulin), Wachstumsfaktoren, Zytokine und so weiter sezernieren. Ihre Rolle in biologischen Vorgängen ist gut bekannt und muss hier nicht ausgeführt werden. Eine Reihe von Erkrankungen und pathologischen Zuständen stehen in Zusammenhang mit einem Versagen der sezernierenden Zellen, korrekt zu arbeiten, wie etwa eine defiziente Produktion der sezernierten Produkte, z.B. Hypothyreose und Kretin-Zwergwuchs, beide aufgrund von Thyroidhormon-Defizienz, Hypophyse-Zwergwuchs aufgrund von Hypophyse-Wachstumshormon-Defizienz, Lesch-Nyhan-Syndrom aufgrund von Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-Defizienz, fulminantes Leberversagen aufgrund einer Defizienz an hepatotropem Faktor, Erkrankung der extrazellulären Matrix aufgrund von Chondrozyten-Defizienz, und Insulin-abhängiger Diabetes aufgrund von Insulin-Defizienz.
Ein Ansatz um derartige Zustände zu behandeln ist es, die sezernierenden Zellen in den Patienten zu transplantieren. Das transplantierte Material muss, um klinisch sicher und wirksam zu sein, (1) nicht immunogen, nicht thrombogen, biologisch stabil und für Zellen und Gewebe des Wirts vollkommen untoxisch sein, (2) die Lebensfähigkeit von Zellen über einen ausgedehnten Zeitraum aufrecht halten, (3) die freie Passage von Nährstoffen, Sekretagoga (Substanzen, welche die Sekretion stimulieren) und Zellprodukten gestatten, (4) chirurgische Implantation und erneutes Animpfen mit Zellen erleichtern, und (5) in einfacher Weise an Ort und Stelle fixiert, und umgekehrt, entfernt werden können.
Transplantation von Pankreasinseln zur Behandlung von Insulin-abhängigem Diabetes war der Gegenstand von erneutem Interesse, aufgrund von technologischen Fortschritten bei der Isolierung von Langerhans-Inseln. Als eine Erläuterung, der humane Pankreas enthält Langerhans-Inseln (nachfolgend hierin "Pankreasinseln"), die über den gesamten exokrinen Pankreas verstreut sind, mit gewissen Konzentrationsspitzen in Nähe der Pankreasgänge. Zusammen genommen kann man sich die Pankreasinseln als ein einziges endokrines Organ vorstellen, welches etwa 1% des Volumens des Pankreas einnimmt. Innerhalb des Pankreas sind tendenziell kleine Inseln (bis zu einem Durchmesser von 160 μm) über das gesamte exokrine Gewebe verteilt. Diese kleinen Inseln stellen 75% der Inseln, bezogen auf die Anzahl, aber nur etwa 15%, bezogen auf Volumen, dar. Inseln mit einem Durchmesser von mehr als 250 μm machen lediglich 15% der gesamten Anzahl von Inseln, aber 60% des Volumens aus. Diese Inseln sind in der Nähe von größeren Gängen und Blutgefäßen lokalisiert und sind nicht von azinösem Gewebe umgeben. Ein humaner Pankreas kann über 1 Million Inseln enthalten, und jede Insel besteht typischerweise aus mehreren tausend Zellen. Jede Insel umfasst einen zentralen Kern von Insulin-produzierenden beta-Zellen (B-Zellen) und einen umgebenden Mantel aus Glukagon-enthaltenden alpha-Zellen (A-Zellen), Somatostatin-sezernierenden delta-Zellen (D-Zellen) und Pankreas-Polypeptidenthaltenden Zellen (PP-Zellen). Insulin-produzierende B-Zellen machen die Mehrheit der Zellen aus, und machen bis zu etwa 80% der Inseln in einem Menschen aus.
Die klinischen Anwendungen einer Transplantation von Pankreasinseln wurden eingeschränkt durch das Unvermögen, die Insel-Allotransplantat-Xenotransplantat-Abstoßung zu verhindern, d.h. eine Abstoßung der transplantierten Pankreasinseln durch das Immunsystem des Wirts, welches die transplantierten Pankreasinseln angreift. Um dieser Abstoßung entgegenzuwirken, wurden die Pankreasinseln transplantiert in Kombination mit der Verabreichung von Immunsuppressiva.
Immunsuppressive Therapie hat sich jedoch als ein zweischneidiges Schwert herausgestellt; während sie das Risiko einer Abstoßung verringert, beeinträchtigt sie die Immunabwehr des Körpers insgesamt. Von vielen Forschern wurden verschiedene Methoden untersucht, um das transplantierte Gewebe vor der Immunreaktion des Wirts zu schützen. Wie nachstehend diskutiert, müssen, obwohl vorübergehende Erfolge publiziert wurden (siehe Lacy, Diabetes Reviews 1 (1):76 (1993)), wirksame Langzeitverfahren erst noch erreicht werden.
Die fünf Hauptansätze, um das transplantierte Gewebe vor der Immunreaktion des Wirts zu schützen, umfassen alle Versuche, das transplantierte Gewebe vor dem Immunsystem des Wirts zu isolieren. Die bis heute verwendeten Immunisolationstechniken umfassen: extravaskuläre Diffusionskammern, intravaskuläre Diffusionskammern, intravaskuläre Ultrafiltrationskammern, Mikroeinkapselung und Makroeinkapselung. Alle diese Methoden haben jedoch aufgrund eines oder mehrerer der nachfolgenden Probleme versagt; fibrotische Reaktion des Wirts gegen das Implantatmaterial, Instabilität des Implantatmaterials, begrenzte Diffusion von Nährstoffen über semi-permeable Membranen, Permeabilität von Sekretagoga und Produkt, und zeitlich verzögerte Diffusion über semi-permeable Membranbarrieren.
Beispielsweise wurde 1978 von Lim (Lim, Research Report to Damon Corporation (1978)) ein Mikroeinkapselungsverfahren zum Einschließen von lebensfähigen Zellen, Geweben und anderen labilen biologischen Membranen innerhalb einer semipermeablen Membran entwickelt. Lim verwendete Mikrokapseln aus Alginat und poly-L-Lysin, um die Langerhans-Inseln einzukapseln. Die erste erfolgreiche in vivo Anwendung dieser neuen Technik in der Diabetesforschung wurde 1980 veröffentlicht (Lim et al., Science 210:908 (1980)). Die Implantation dieser mikroeingekapselten Langerhans-Inseln führte dazu, einen euglykämischen Zustand in diabetischen Tieren lange Zeit aufrecht zu erhalten. Andere Forscher, welche diese Experimente wiederholten, fanden jedoch heraus, dass Alginat eine Gewebereaktion hervorruft, und waren nicht in der Lage, die Ergebnisse von Lim et al. zu reproduzieren (Lamberti et al., Applied Biochemistry and Biotechnology 10:101 (1984); Dupuy et al., Jour. Biomed. Material and Res. 22:1061 (1988); Weber et al., Transplantation 49:396 (1990); und Soon-Shiong et al., Transplantation Proceedings 22:754 (1990)). Es wird derzeit davon ausgegangen, dass die Wasserlöslichkeit dieser Polymere für die begrenzte Stabilität und Biokompatibilität dieser Mikrokapseln in vivo verantwortlich ist (Dupuy et al., a.a.O., Weber et al., a.a.O., Soon-Shiong et al., a.a.O., und Smidsrod, Faraday Discussion of Chemical Society 57:263 (1974)).
Vor kurzem verwendeten Iwata et al. (Iwata et al., Jour. Biomedical Material and Res. 26:967 (1992)) Agarose zur Mikroeinkapselung von allogenen Pankreasinseln und entdeckten, dass sie als ein Medium für die Herstellung von Mikrokügelchen verwendet werden könnte. In ihrer Untersuchung wurden 1500–2000 Inseln individuell in 5% Agarose mikroeingekapselt und in Streptozotozin-induzierte diabetische Mäuse implantiert. Das Implantat überlebte für einen langen Zeitraum, und die Empfänger behielten einen normalen glykämischen Zustand ohne Zeiteinschränkung bei.
Ihre Methode weist jedoch eine Reihe von Nachteilen auf. Sie ist umständlich und ungenau. Beispielsweise bleiben viele Kügelchen partiell beschichtet und es bilden sich mehrere hundert Kügelchen aus leerer Agarose. Somit ist zusätzliche Zeit erforderlich, um eingekapselte Inseln von leeren Kügelchen abzutrennen. Darüber hinaus sammeln sich die meisten der implantierten Mikrokügelchen in der Beckenhöhle, und es ist eine große Anzahl von Inseln in vollständig beschichteten, individuellen Kügelchen erforderlich, um einen normalen glykämischen Zustand zu erreichen. Darüber hinaus sind die transplantierten Kügelchen schwierig wieder herauszuholen, neigen zum Zerbrechen, und setzen bei leichter Beschädigung leicht Inseln frei.
Ein Makroeinkapselungsverfahren ist ebenfalls getestet worden. Makrokapseln von verschiedenen unterschiedlichen Materialien, wie etwa Poly-2-hydroxyethylmethacrylat, Polyvinylchlorid-Coacrylsäure und Celluloseacetat wurden für die Immunisolierung von Langerhans-Inseln hergestellt (siehe Altman et al., Diabetes 35:625 (1986); Altman et al., Transplantation American Society of Artificial Internal Organs 30:382 (1984); Ronel et al., Jour. Biomedical Material Research 17:855 (1983); Klomp et al., Jour. Biomedical Material Research 17:865–871 (1983)).
In allen diesen Studien wurde eine nur vorübergehende Normalisierung der Glykämie erreicht.
Archer et al., Journal of Surgical Research 28:77 (1980), verwendete Acrylsäurecopolymer-Hohlfasern, um vorübergehend eine Abstoßung von Insel-Xenotransplantaten zu verhindern. Sie berichteten ein Langzeit-Überleben von dispergierten neonatalen Maus-Pankreas-Transplantaten in Hohlfasern, welche in diabetische Hamster transplantiert worden waren. Vor kurzem bestätigten Lacy et al., Science 254:1782–1784 (1991) deren Ergebnisse, fanden aber heraus, dass der euglykämische Zustand eine vorübergehende Phase ist. Sie fanden heraus, dass wenn die Inseln in die Faser injiziert werden, diese innerhalb der Hohlröhre aggregieren, was im zentralen Bereich der Insel-Massen in einer Nekrose resultiert. Die zentrale Nekrose schloss eine längere Lebensdauer des Transplantats aus. Um dieses Problem zu lösen, verwendeten sie Alginat, um die Inseln in der Faser zu dispergieren. Unter Verwendung dieses Verfahrens waren sie in der Lage, ein Überleben des Transplantats über einen langen Zeitraum zu erreichen. Dieses Experiment ist jedoch nicht extensiv wiederholt worden. Deshalb ist die Funktion der Membran als ein Transplantationsmedium für Inseln in Menschen fraglich.
Es besteht somit ein Bedarf, eine Transplantation von sezernierenden Zellen zu erreichen, und insbesondere das Überleben von Pankreasinsel-Allotransplantaten und Xenotransplantaten, ohne die Verwendung von chronischen Immunsuppressiva.
Die Erfinder haben überraschenderweise aufgedeckt, dass eine Makroeinkapselung von sezernierenden Zellen in einem hydrophilen Gelmaterial in einem funktionalen, nicht-immunogenen Makrokügelchen resultiert, das in Tiere transplantiert werden kann und lange Zeiträume aufbewahrt werden kann. Die Makroeinkapselung der sezernierenden Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung stellt eine effektivere und beherrschbarere Technik für die Transplantation von sezernierenden Zellen bereit. Die Makroeinkapselungstechnik kann auch verwendet werden, um andere biologische Agenzien, wie etwa Enzyme, Mikroorganismen, trophische Mittel, umfassend rekombinant hergestellte trophische Agenzien, zytotoxische Agenzien und chemotherapeutische Agenzien, makroeinzukapseln. Die makroeingekapselten biologischen Agenzien können verabreicht werden, um Zustände zu behandeln, die bekanntermaßen auf das biologische Agens ansprechen.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist somit ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein sezernierende Zelle-Makrokügelchen bereitzustellen, welches in Tiere transplantiert werden kann, um Zustände zu behandeln, die durch eine beeinträchtigte Funktion von sezernierenden Zellen des Wirts hervorgerufen sind.
Es ist ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung, ein sezernierende Zelle-Makrokügelchen bereitzustellen, welches über lange Zeiträume aufbewahrt werden kann.
In Erfüllung dieser und anderer Gegenstände, wurde ein Verfahren, gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung, zur Herstellung eines Agarose-beschichteten Agarose-sezernierende Zelle-Makrokügelchens bereitgestellt, umfassend:

(a) suspendieren sezernierender Zellen in Agarose,
(b) bilden eines Makrokügelchens aus den suspendierten sezernierenden Zellen von Schritt (a)
(c) inkubieren der Makrokügelchen von Schritt (b) in befeuchteter Luft,
(d) beschichten des Makrokügelchens von Schritt (c) mit Agarose, um ein Agarose-beschichtetes Agarose-sezernierende Zelle-Makrokügelchen zu bilden.

Zudem ist ein Agarose-beschichtetes Agarose-sezernierende Zelle-Makrokügelchen erhaltbar durch ein Verfahren gemäß der Erfindung vorgesehen.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Agarose-beschichteten Agarose-sezernierende Zelle-Makrokügelchens, erhaltbar durch ein Verfahren gemäß der Erfindung, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Patienten mit einem Zustand, welcher durch beeinträchtigte Funktion sezernierender Zellen verursacht ist, bereitgestellt.
In einem nochmals weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Konservieren von sezernierenden Zellen bereitgestellt, umfassend das Bilden von Agarose-beschichteten Agarose-sezernierende Zelle-Makrokügelchen, erhaltbar durch ein Verfahren gemäß der Erfindung und inkubieren der sezernierende Zelle-Makrokügelchen.
Andere Gegenstände, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung ersichtlich werden. Es sollte jedoch verstanden werden, dass die ausführliche Beschreibung und die spezifischen Beispiele, obwohl sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung anzeigen, lediglich aus Gründen der Veranschaulichung angegeben sind, da dem Fachmann aus dieser ausführlichen Beschreibung verschiedene Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Grundgedankens und des Schutzumfangs der Erfindung ersichtlich sein werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 und 2 zeigen Agarose-beschichtete Kollagen-Agarose-Pankreasinsel-Makrokügelchen.
3 zeigt die Glucosegehalte von diabetischen Mäusen, denen Agarose-beschichtete Kollagen-Agarose-Pankreasinsel-Makrokügelchen transplantiert wurden.
4 zeigt die Glucosegehalte von diabetischen Mäusen, denen Agarose-beschichtete, Gelschaum Pankreasinsel-Makrokügelchen transplantiert wurden.
5 zeigt die Glucosegehalte von diabetischen Mäusen, denen Agarose-beschichtete Agarose-Makrokügelchen transplantiert wurden.
6 zeigt die Glucosegehalte von diabetischen Mäusen, denen freie Pankreasinseln transplantiert wurden.
7 zeigt die Glucosegehalte von diabetischen Mäusen, denen Agarose-beschichtete Kollagen-Agarose-Makrokügelchen und freie Pankreasinseln transplantiert wurden.
8 zeigt einen Glucosetoleranztest für normale Mäuse, Streptozotozin-induzierte diabetische Mäuse, Streptozotozin-induzierte diabetische Mäuse, welche ein Allotransplantat in der Nierenkapsel empfangen hatten ("KTC-Mäuse"), und Streptozotozin-induzierte diabetische Mäuse, welche Agarose-beschichtete Agarose-Kollagen-Pankreasinsel-Makrokügelchen; Agarose-beschichtete Gelschaum-Pankreasinsel-Makrokügelchen; und Agarose-beschichtete Agarose-Pankreasinsel-Makrokügelchen empfangen hatten (insgesamt bezeichnet als "Kügelchen-Mäuse").
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Makroeinkapselung von biologischen Agenzien, und bevorzugt von sezernierenden Zellen in einem hydrophilen Gelmaterial, therapeutische Verfahren unter Verwendung der makroeingekapselten biologischen Agenzien, und bevorzugt von sezernierenden Zellen, und die Konservierung von biologischen Agenzien, bevorzugt sezernierenden Zellen, durch Makroeinkapselung. Das hydrophile Gelmaterial umfasst Agarose und Kombinationen von Kollagen-Agarose und Gelatine Schwamm-Agarose. Gelatineschwamm wird nachstehend als Gelschaum bezeichnet.
Der Begriff biologisches Agens bezeichnet einen lebenden Organismus und dessen Produkte, z.B. Proteine, Enzyme, Hormone, Polypeptide, Serum, Antikörper und Antibiotika, und auch gentechnisch konstruierte Zellen. Biologische Agenzien umfassen Enzyme, z.B. Glucoseoxidase, Lactasekomplex, Mikroorganismen, z.B. Klebsiella aerogenes zur Entfernung von Ammoniak und Harnstoff, trophische Agenzien, umfassend rekombinant hergestellte trophische Agenzien, z.B. rekombinant hergestelltes Wachstumshormon, und zytotoxische Agenzien.
Der Begriff sezernierende Zelle umfasst eine Pankreasinsel, obwohl eine Pankreasinsel technisch gesehen keine sezernierende Zelle ist, sondern vielmehr ein Cluster von sezernierenden Zellen, welche über den gesamten Pankreas verstreut sind, einschließlich dessen endokrinen Abschnitts. In Menschen sind sie aus mindestens vier verschiedenen Typen von sezernierenden Zellen zusammengesetzt: alpha-Zellen, welche den hyperglykämischen Faktor Glucagon sezernieren, beta-Zellen, welche die häufigsten sind (70%–80%) und Insulin sezernieren, delta-Zellen, welche Somatostatin sezernieren, und Polypeptidzellen, welche Polypeptidhormon sezernieren.
Wie vorstehend erläutert, muss transplantiertes Material mit dem Wirt kompatibel sein. Agarose hat eine lange Verwendungsgeschichte in biologischer Forschung und ihre Qualität ist gut kontrolliert. Kollagen ist das häufigste Protein in Säugern, stellt eine feste mechanische Unterstützung bereit und dient als der biologische Raum für Zellreplikation, Differenzierung, Organogenese, individuelles Wachstum und Wundheilung. Kollagen weist auch eine gute Biokompatibilität auf. Gelschaum ist nicht immunogen und wurde schon umfangreich in chirurgischen Verfahren verwendet. Es wird zudem von sezernierenden Zellen gut toleriert.
Die biologischen Agenzien, und bevorzugt die sezernierenden Zellen werden zunächst unter Verwendung von Vorgehensweisen, die in der Technik gut bekannt sind, isoliert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Pankreasinseln bei entweder 4°C, 24°C oder 37°C kultiviert, bevor sie makroeingekapselt werden. Diese Methode ermöglicht, nur überlebende Inseln nach dem Isolationstrauma auszuwählen. Die Inseln werden auch weniger immunogen, was einen Schutz von Makrokügelchen vor Fibrose zur Folge hat.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein biologisches Agens, bevorzugt Pankreasinseln und stärker bevorzugt etwa 50.000–700.000 Pankreasinseln in einer wässrigen Kollagenlösung, bevorzugt einer Lösung von etwa 0,5%–2% Atelokollagen suspendiert. Atelokollagen wird erhalten durch Behandeln von Kollagen mit Pepsin, welches antigene Telopeptide entfernt, welche für eine intermolekulare Quervernetzung von Kollagen verantwortlich sind. Danach werden etwa 0,5%–5% Agarose, bevorzugt etwa 1% zu den suspendierten Pankreasinseln zugegeben, wobei Pankreasinseln gebildet werden, die in einem Gemisch von Kollagen und Agarose suspendiert sind. Das die Pankreasinseln enthaltende Gemisch wird danach unter Verwendung bekannter Techniken, in ein semifestes Kügelchen überführt, bevorzugt durch Tropfen des Gemisches auf Mineralöl oder ein Teflon^® Blatt. Das semifeste Kügelchen wird danach in ein antibiotisches Medium transferiert, gewaschen, und danach unter Standardbedingungen inkubiert, um das Kollagen zu polymerisieren, bevorzugt bei 37°C in einer angefeuchteten 5% CO₂-Atmosphäre, wobei ein festes Kollagen-Agarose-Makrokügelchen gebildet wird.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein biologisches Agens, vorzugsweise Pankreasinseln, und besonders bevorzugt etwa 50.000–700.000 Pankreasinseln auf der Oberfläche (3–5 cm) eines Gelatineschwamms verteilt. Der Gelatineschwamm wird dann zu einer Kugel gerollt. Agarose, 3%–5%, wird auf die Kugel gegossen, um ein Kügelchen zu bilden.
In einer noch weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein biologisches Agens, vorzugsweise Pankreasinseln und besonders bevorzugt etwa 50.000–700.000 Pankreasinseln, in eine Agaroselösung eingebracht, die von etwa 0.5%–5% Agarose reicht, bevorzugt 1% Agarose aufweist. Die Mischung wird dann in ein Makrokügelchen transformiert durch in Kontakt bringen der Mischung mit Mineralöl oder Teflon. Das Kügelchen wird dann in ein antibiotisches Medium transferiert, gewaschen und über Nacht, vorzugsweise bei 37°C in befeuchteter 5% CO₂ Atmosphäre, inkubiert.
In all den vorstehend genannten Ausführungsformen werden die Makrokügelchen gleichförmig mit Agarose beschichtet, bevorzugt durch Rollen des Kügelchens 3–4 mal auf einem Teflonlöffel, der etwa 500–2.000 μl 5%–10% Agarose enthält. In ähnlicher Weise bezeichnet der Begriff biologisches Agens-Makrokügelchen, wie hierin verwendet, makroeingekapselte biologische Agenzien in Form eines Kügelchens.
Die Makrokügelchen können als ein Vehikel verwendet werden, um das biologische Agens an den Körper abzugeben, wo das Agens seine bekannte Funktion ausführen wird. in einem Kügelchen können mehr als ein Typ an biologischem Agens eingekapselt sein. Beispielsweise kann ein Makrokügelchen mehrere Enzyme, wie etwa Hämoglobin und Glucoseoxidase enthalten. Ein derartiges Kügelchen kann verabreicht, werden um Bilirubin zu entfernen. Diese Kügelchen können entweder für eine orale Verabreichung von Verdauungsenzymen (Lactasekomplex) oder für die selektive Entfernung von unerwünschten Aminosäuren aus dem Körper verwendet werden. Eine Einkapselung der Enzyme wird auch den Abbau des Enzyms im Lumen verhindern. Weiterhin können unter Verwendung von Einkapselung als dem Medium rekombinante Genprodukte sicher abgeliefert werden. Beispielsweise kann ein K. aerogenes-Gen zur Entfernung von Harnstoff und Ammoniak in Makrokügelchen makroeingekapselt werden. Wenn das biologische Agens für den Wirt immunogen ist, ermöglicht das Makrokügelchen die Verabreichung des biologischen Agens ohne die Verwendung von Immunsuppressiva oder mit verringerten Mengen an Immunsuppressiva.
Die sezernierenden Makrokügelchen können verwendet werden, um Zustände zu behandeln, welche durch eine beeinträchtigte Funktion von sezernierenden Zellen des Patienten hervorgerufen werden, z.B. Insulin-abhängige Diabetes, Störungen in Zusammenhang mit einer Defizienz an Wachstumsfaktor, und hormonelle Störungen, durch Transplantieren der sezernierende Zelle-Makrokügelchen in den Patienten. Für diese besondere Behandlung können die Makrokügelchen an den geeigneten Einsatzort gebracht werden. Beispielsweise können Makrokügelchen, die Hepatozyten enthalten, in die Bauchhöhle implantiert werden, um Krankheiten zu behandeln, welche mit einem Nichtfunktionieren der Leber in Zusammenhang stehen. Eine bevorzugte Anwendung ist, 5–10 Pankreasinsel-Makrokügelchen, von denen jedes 50.000–700.000 Pankreasinseln enthält, in einen Patienten zu transplantieren, um Insulin-abhängige Diabetes zu behandeln. Die Makrokügelchen können in die Bauchfellhöhle eingebracht werden.
Die sezernierende Zelle-Makrokügelchen werden in einer Menge in einen Patienten transplantiert, die ausreichend ist, um den Zustand zu behandeln. Eine adäquate Menge um dies zu bewirken, wird als eine "therapeutisch wirksame Menge" oder "effiziente Menge" definiert. Wirksame Mengen für diese Verwendung hängen ab von der Schwere des Zustands, dem allgemeinen Zustand des Patienten, dem Verabreichungsweg, der Platzierung der Makrokügelchen, und davon, ob die sezernierende Zelle-Makrokügelchen in Kombination mit anderen Arzneimitteln verabreicht werden.
Die sezernierenden Makrokügelchen können für allogene und xenogene Transplantation in Kombination mit Immunsuppressiva oder bevorzugt ohne Immunsuppressiva verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Patienten mit chronischer oder akuter Insulin-abhängiger Diabetes behandelt, indem Pankreasinseln aus einem Tier, z.B. Schwein, Rind, Maus, Ratte, Fisch oder jeder anderen geeigneten Spezies ohne die Verwendung von Immunsuppressiva in den Patienten xenotransplantiert werden. Die sezernierende Zelle-Makrokügelchen können auch in Kombination mit anderen therapeutischen Agenzien verabreicht werden, z.B. der häufig verwendeten Dreifacharzneimittel-Therapie (Cyclosporin, Azathioprin und Hydrocortison), Rapamycin, Deoxyspergualin oder Antikörpern, um den Zustand zu behandeln.
Die Makrokügelchen können auch als ein Mittel zur Aufbewahrung der biologischen Agenzien und bevorzugt von sezernierenden Zellen über lange Zeiträume verwendet werden. Um die Lebensfähigkeit der biologischen Agenzien und bevorzugt von sezernierenden Zellen aufrecht zu halten, werden die biologischen Agenzien und bevorzugt sezernierende Zelle-Makrokügelchen inkubiert, bis sie in das Tier transplantiert werden.
Wenn die sezernierenden Zellen Pankreasinseln sind, werden die Pankreasinsel-Makrokügelchen bei einer Temperatur von 24°C oder 37°C inkubiert.
BEISPIELE
Beispiel I
Isolierung von Pankreasinseln
Pankreasinseln wurden aus Ratten isoliert durch eine Modifikation der in Gotoh et al., Transplantation 40:437 (1985), offenbarten Methode.
Kollagenase-Lösung (Kollagenase Typ XI, Sigma Chemical, St. Louis, MO; 1 mg/ml, enthaltend 2 mg/ml Sigma Typ V Rinderserumalbumin und 1 mg/ml CaCl₂) wurde über den gewöhnlichen Gallengang in den Pankreas injiziert (Gotoh et al., Transplantation 40:437 (1985), a.a.O.). Der Pankreas wurde entfernt und in einem auf Eis gehaltenen Kolben gesammelt. Nachdem die Bauchspeicheldrüsen von 4 Ratten gesammelt worden waren, wurde der Kolben 30 Minuten in ein Wasserbad mit 38°C gestellt. Das resultierende verdaute Gewebe wurde viermal in kaltem (8°C) HBSS (Hank's Balanced Salts Solution) gewaschen.
Unverdautes Gewebe, große Lymphknoten, und anderes Fremdmaterial wurde durch wiederholte Mobilisierung des Gewebes, gefolgt von Entfernung des Überstands, entfernt. Gereinigte Inseln wurden auf einem diskontinuierlichen Ficoll-Gradienten, bestehend aus 25%, 23%, 21% und 11% Ficoll-Schichten, hergestellt in Euro-Collins-Lösung (Frescenius AG, Gluchen, Steinweg, Homburg, V.D.H.), isoliert und 16 Minuten bei 2.000 UpM zentrifugiert. Die Inseln wurden von der Grenzfläche zwischen den 11% und 21% Ficoll-Schichten und der Grenzfläche zwischen den 21% und 23% Ficoll-Schichten gesammelt. Inseln aus jeder Fraktion wurden gepoolt und viermal in HBSS-Lösung, enthaltend 10% fötales Kälberserum, gewaschen.
Die gepoolten Inselzellen wurden danach auf Petri-Schalen transferiert, enthaltend RPMI Komplettmedium, d.h. kaltes RPMI 1640 Medium (GIBCO, Grand Island, NY), ergänzt mit 25 mM HEPES, Hitze-inaktiviertem fötalen Rinderserum (10%) und einer Antibiotikum/Antimykotikum-Lösung (1 ml/100 ml), welche enthält: 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycinsulfat, und 25 μg/ml Amphotericin B. Alles restliche nicht zu Inseln gehörige azinöse, vaskuläre Gewebe, Ductus-Gewebe oder Lymphknotengewebe wurde mit Hilfe eines Seziermikroskops identifiziert und sorgfältig mit einer sterilen Pipette mit feiner Spitze entfernt. Endgültige Reinheit wurde durch Anfärben der Insel-Präparation mit Diphenylthiocarbazon bewertet.
Nach der Isolierung wurden die Inseln in bakteriologischen Kunststoffschalen (100 mm), enthaltend 10 ml RPMI Medium, 4 Tage in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5% CO2 bei 37°C inkubiert. Das Medium wurde jeden Tag gewechselt, und die Inseln wurden entweder direkt transplantiert oder makroeingekapselt.
Beispiel II
A. Herstellung von Agarose-beschichteten Agarose-Kollagen-Pankreasinsel-Makrokügelchen
1000 Pankreasinseln, erhalten durch die Methode von Beispiel I, wurden viermal in RPMI Komplettmedium wie in Beispiel I beschrieben, aber ohne fötales Kälberserum, gewaschen. Die Pankreasinseln wurden danach in ein Röhrchen, enthaltend 50 μl 1% Atelokollagenlösung in Phosphat-gepufferter Salzlösung gegeben, um die Pankreasinseln zu suspendieren. 100 μl einer 1% Lösung von Agarose (Sigma Typ XII) mit niedriger Viskosität, hergestellt entweder in RPMI oder MEM (Minimal-Essential-Medium), und bei 60°C gehalten, wurden danach zu der Kollagen-Pankreasinsel-Suspension zugegeben. Der Inhalt des Röhrchens wurde danach sofort als ein einziger großer Tropfen entweder auf bei Raumtemperatur gehaltenes sterilisiertes Mineralöl oder auf ein Teflon^® Blatt transferiert. Nach einer Minute wurde der Tropfen zu einem semifesten Makrokügelchen, welches danach in antibiotisches RPMI Medium bei 37°C transferiert wurde. Die Makrokügelchen wurden dreimal mit dem gleichen Medium gewaschen, um alles Öl zu entfernen. Schließlich wurden sie zweimal mit Komplettmedium (37°C) gespült und über Nacht bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ inkubiert. Während dieses Zeitraums polymerisierte das Kollagen und die Pankreasinseln blieben auf der Kollagenfaser.
Am nächsten Tag wurden die festen Makrokügelchen auf einen Teflon^® Löffel transferiert, der annähernd 1 ml 5% Agarose in RPMI oder MEM Medium enthielt. Die festen Makrokügelchen wurden danach 2–3 mal in dieser Lösung gerollt, um sie gleichmäßig zu beschichten. Bevor die Agarose fest wurde, wurden die Makrokügelchen in Mineralöl in einer Teflon^® Schale transferiert, um Makrokügelchen mit glatter Oberfläche zu erhalten. Nach 60 Sekunden wurden die Makrokügelchen aus dem Mineralöl entfernt und dreimal mit antibiotischem RPMI Medium gewaschen, und danach zweimal mit RPMI Komplettmedium. Sie wurden danach über Nacht bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ inkubiert. Agarose-beschichtete Agarose-Kollagen-Pankreasinsel-Makrokügelchen sind in den 1 & 2 gezeigt.
B. Herstellung von Agarose-beschichteten Gelatineschwamm-Pankreasinsel-Makrokügelchen
Ein kleines Stück des Gelatineschwamms (Gelschaum), 3 mm², wurde zuerst in RPMI Komplettmedium eingetaucht. Das Medium wurde ausgepresst und der Gelschaum durfte 1 Minute ruhen. Ein tausend Pankreasinseln, vorbereitet gemäß Beispiel I, wurden viermal mit antibiotischem RPMI Medium gewaschen. Sie wurden dann in 10 μl antibiotischem RPMI Medium suspendiert. Sie wurden mittels einer Plastikpipette mit feiner Spitze transferiert und auf der Oberfläche des Gelschaums verteilt. Nach 20 Sekunden wurde der Gelschaum zu einer kleinen Kugel gerollt. 50μl 5% Agarose wurde auf die Oberfläche der Kugel gegossen, um ein Pankreasinsel-Makrokügelchen zu erzeugen.
Um das Makrokügelchen gleichmäßig mit 5% Agarose zu bedecken, wurden 500μl 5% Agarose zu dem Makrokügelchen auf einem Teflon^® Löffel zugegeben und 3–4 mal gerollt. Bevor sich die Agarose verfestigte, wurde das Makrokügelchen in Mineralöl transferiert und die Schüssel wurde gedreht, um eine glatte Oberfläche des Makrokügelchens zu erhalten. Das Makrokügelchen wurde 3–4 mal in antibiotischem RPMI Medium gewaschen und dann 2 mal mit RPMI Komplettmedium gespült. Es wurde über Nacht inkubiert, bevor es für eine Transplantation verwendet wurde.
C. Herstellung von Agarose-beschichteten Agarose-Pankreasinsel-Makrokügelchen
Ein tausend Pankreasinseln, erhalten durch das Verfahren von Beispiel I, wurden zuerst 4 mal mit antibiotischem RPMI Medium gewaschen. Die Pankreasinseln wurden in ein Röhrchen transferiert, das 50μl antibiotisches RPMI Medium enthielt, und darin suspendiert. 100μl einer 1% Agaroselösung wurden dann zu dem Röhrchen zugegeben. Der gesamte Inhalt des Röhrchens wurde sofort als ein einziger großer Tropfen entweder in sterilisiertes Mineralöl oder auf ein Teflonblatt transferiert. Nach einer Minute verfestigte sich der Tropfen zu einem Makrokügelchen. Das Makrokügelchen wurde in antibiotisches RPMI Medium transferiert und bei 37°C gehalten. Das Öl wurde dann durch 3 maliges Waschen des Makrokügelchens mit dem gleichen Medium und dann durch 2 maliges Spülen mit RPMI Komplettmedium entfernt. Die Kügelchen wurden über Nacht bei 37°C in befeuchteter Atmosphäre mit 5% CO₂ inkubiert.
Am nächsten Tag wurden diese Kügelchen auf einen Teflon^® Löffel transferiert, der 1 ml 5% Agarose in entweder RPMI oder MEM Medium enthielt. Um die Makrokügelchen gleichmäßig mit Agarose zu überziehen, wurden die Kügelchen dann 2–3 mal behutsam in Agarose gerollt. Sie wurden dann in Mineralöl in einer Telfonschale transferiert, bevor sich die Agarose verfestigte. Nach 60 Sekunden wurden die Kügelchen aus dem Mineralöl entfernt und 3 mal in antibiotischem RPMI Medium und 2 mal in RPMI Komplettmedium gewaschen. Die Kügelchen wurden dann über Nacht inkubiert.
Beispiel III
Transplantation der Pankreasinsel-Makrokügelchen in Mäuse
A. Empfänger-Mäuse und Donor-Ratten
Die verwendeten Mäuse waren männliche Mäuse der Stämme C57BL/6 und BALB/c. Empfängermäuse wurden durch eine einzelne intravenöse Injektion von Streptozotozin (170–200 mg/kg) diabetisch gemacht.
Vor der Induktion von Diabetes wurden Plasmaglucosegehalte im nicht-fastenden Zustand bestimmt. Alle Blutzuckergehalte in den Empfängermäusen wurden über Blutproben der Schwanzvene mit einem ExacTec Pen Sensor überwacht. Es wurden nur diejenigen Mäuse mit einem Serumglucosegehalt > 400 mg/dl am Tag der Transplantation verwendet.
Wistar Furth-Ratten wurden als Donoren für Xenotransplantation verwendet.
B. Xenotransplantation von Pankreasinsel-Makrokügelchen in die Bauchfellhöhle
Zum Zeitpunkt der Xenotransplantation wurden Pankreasinsel-Makrokügelchen aus Beispiel II(A), II(B) bzw. II(C) behutsam auf separate Platten transferiert, welche antibiotisches RPMI Medium enthielten. Um alle Serumproteine zu entfernen, wurde das Medium dreimal gewechselt. Diabetische Empfängermäuse wurden mit Avertin anästhetisiert. Es wurde ein Mittenlinie-Einschnitt ausgeführt, um ein einzelnes Pankreasinsel-Makrokügelchen in die freie Bauchfellhöhle einzubringen. Mit absorbierbarem Nähmaterial wurde ein zweilagiger Verschluss des Einschnitts ausgeführt. Kontrollmäuse empfingen entweder ein leeres Makrokügelchen i.p. (intraperitoneal), freie Pankreasinseln i.p. oder ein leeres Makrokügelchen zusammen mit freien Donor-Pankreasinseln.
Nach der Transplantation wurde die Blutglucose jedes Empfängers täglich oder jeden zweiten Tag überprüft bis sie den Normalbereich erreichte, danach wurde die Blutglucose nur 2–3 mal wöchentlich überprüft. Transplantate wurden als technisch erfolgreich erachtet, wenn die Serumglucose < 200 mg/dl betrug und während aufeinanderfolgenden Blutabnahmen dort blieb. Ein Transplantat wurde als abgestoßen erachtet, wenn die Serumglucosekonzentration nach einem Zeitraum eines vorübergehend normalen glykämischen Zustands des Blutes auf über 200 mg/dl anstieg. Transplantate wurden erachtet, versagt zu haben oder "primär nicht-funktional" geworden zu sein, wenn die Blutglucose niemals normal geworden war (d.h. konsistent > 200 mg/dl geblieben war).
C. Intraperitonealer Glucosetoleranztest
Etwa 70–84 Tage nach der Implantation wurden Glucosetoleranztests durchgeführt. Mäusen, die 6 Stunden (9:00 bis 15:00) gefastet hatten, wurde intraperitoneal Glucoselösung (1,0 g/kg Körpergewicht) injiziert. Sowohl vor als auch nach der Injektion (0, 30, 60 und 120 Minuten) wurden Blutproben entnommen, um Plasmaglucosegehalte zu bestimmen unter Verwendung des ExacTec Pen Sensors.
Zum Vergleich wurden Glucosetoleranztests mit normalen C57BL/6 und BALB/c Mäusen, mit Streptozotozin-induzierten C57BL/6 und BALB/c Mäusen, in die keine Pankreasinseln transplantiert worden waren, und mit Streptozotozin-induzierten diabetischen BALB/c Mäusen, bei denen freie Pankreasinseln in die Nierenkapsel transplantiert worden waren ("KCT"-Mäuse) durchgeführt.
Es wurden Kontrollexperimente durchgeführt, um sicherzustellen, dass der euglykämische Zustand in diabetischen Mäusen über die makroeingekapselten Pankreasinseln erreicht wurde, und nicht durch die Makrokügelchen an sich. Leere Agarose-beschichtete Agarose-Kollagen-Makrokügelchen und Agarose-beschichtete Gelschaum-Makrokügelchen wurden deshalb auf die gleiche Weise hergestellt wie die Kügelchen der Beispiele II(A) und (B).
D. Ergebnisse der intraperitonealen Xenotransplantation und des Glucosetoleranztests
Die nach Implantation von Pankreasinsel-Makrokügelchen beobachteten Veränderungen im Plasmaglucosegehalt im nicht-fastenden Zustand von STZ-diabetischen Streptozotozin-induzierten C57BL/6 Mäusen sind in den 3 & 4 gezeigt. Die Empfänger von Agarose-beschichteten Agarose-Kollagen-Pankreasinsel-Makrokügelchen und Agarose-beschichteten Gelschaum-Pankreasinsel-Makrokügelchen hielten einen normalen glykämischen Zustand für mehr als 60 Tage, wobei das Körpergewicht dieser Mäuse während dieses Zeitraums um 3 g im Mittel zunahm. Wenn Agarose-beschichtete Agarose-Pankreasinsel-Makrokügelchen transplantiert wurden, erreichten 2–6 Tiere einen normalen glykämischen Zustand nach 21–33 Tagen nach der Transplantation (5) und blieben danach euglykämisch. Alle anderen transplantierten Tiere erreichten keinen euglykämischen Zustand. Leere Makrokügelchen (n = 6) beeinflussten die Blutglucose nicht.
Wenn freie Pankreasinseln intraperitoneal transplantiert wurden, wurden 6 von 7 Tieren, welche ein Transplantat erhalten hatten, 1 Tag nach der Transplantation normal glykämisch; sie hielten diesen Zustand jedoch nur für 3–10 Tage (6). Wenn freie Pankreasinseln zusammen mit leeren Kügelchen Agarose-beschichteter Agarose-Kollagen-Makrokügelchen oder Agarose-beschichteter Gelschaum-Makrokügelchen transplantiert wurden, wurden alle Tiere innerhalb von 24 Stunden normal glykämisch und blieben mehr als 12 Tage so (7). Danach wurden alle Tiere hyperglykämisch. Tiere, die leere Makrokügelchen enthielten, zeigten während der 90 Tage, die verfolgt wurden, keine Gewebereaktion.
Die nach Durchführung der Glucosetoleranztests erhaltenen Ergebnisse sind in 8 gezeigt. In normalen BALB/c und C57BL/6 Mäusen und in "KCT"-Mäusen erreichte die Plasmaglucose bei 30 Minuten einen Peak-Wert und kam bei 120 Minuten zu einem Basislinie-Gehalt zurück.
Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn makroeingekapselte Pankreasinseln und nicht-eingekapselte, in die Nierenkapsel transplantierte Pankreasinseln getestet wurden.
Die Ergebnisse dieser Experimente zeigen, dass die Agarose-beschichteten Agarose-Kollagen-Insel-Makrokügelchen, die Agarose-beschichteten Agarose-Gelschaum Pankreasinsel-Makrokügelchen und die Agarose-beschichteten Agarose-Insel-Makrokügelchen die Eigenschaften aufweisen, welche für ein künstliches Hybridorgan erforderlich sind. Obwohl alle drei Typen erfolgreich Insulin sezernieren, sind Agarose-beschichtete Agarose-Kollagen und Agarose-beschichtete Agarose-Gelschaum Makrokügelchen als biohybride, künstliche Organe geeigneter aufgrund der Einheitlichkeit der Ergebnisse, die bei der minimalen Zahl transplantierter Tiere erhalten wurde. Darüber hinaus zeigten alle drei Typen von Kügelchen keine beeinträchtigenden Wirkungen. Die Makrokügelchen blieben frei im Peritoneum, wobei sie weder eine Gewebereaktion noch eine Adhäsion zu irgendeinem Organ zeigten. Somit erfüllen diese biohybriden Pankreasinseln in den makroeingekapselten Kügelchen ihre Funktion genauso effizient wie in ihrer natürlichen Umgebung, dem Pankreas.
In allen Mäusen erreichte die Plasmaglucose bei 30 Minuten einen Peak-Wert und kehrte nach 120 Minuten zu einem Basislinie-Gehalt zurück.
Beispiel IV
Verlängerte Aufbewahrungsdauer von Pankreasinseln
Makroeingekapselte Kügelchen, hergestellt gemäß der Beispiele I(A), (B) und (C), welche 4 Wochen bei 37°C in RPMI Komplettmedium inkubiert worden waren, wurden hinsichtlich ihrer Langzeit-Konservierungseigenschaften in vivo und in vitro getestet. Es wurde herausgefunden, dass die makroeingekapselten Pankreasinseln, die 4 Wochen inkubiert worden waren, zu denjenigen, die einen Tag inkubiert worden waren, funktional ähnlich waren.
Dieses Beispiel zeigt, dass das Makroeinkapselungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung für eine Konservierung von sezernierenden Zellen, und bevorzugt für eine Konservierung von Pankreasinseln verwendet werden kann.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Agarose-beschichteten Agarose sezernierende Zelle-Makrokügelchelns, umfassend: a) Suspendieren sezernierender Zellen in Agarose, b) Ausbilden eines Makrokügelchen aus den suspendierten sezernierenden Zellen von Schritt (a), c) Inkubieren des Makrokügelchens von Schritt (b) in befeuchteter Luft, d) Beschichten des Makrokügelchens von Schritt (c) mit Agarose um ein Agarose-beschichtetes Agarose sezernierende Zelle-Makrokügel-chen auszubilden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (d) Rollen des festen Makrokügelchens von Schritt (c) in 5% Agarose, in Kontakt bringen des gerollten festen Makrokügelchens mit Mineralöl und Waschen des gerollten Makrokügelchens um das Agarose-beschichtete, Agarose sezernierende Zelle-Makrokügelchen auszubilden, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die sezernierenden Zellen Langerhans-Inseln sind, wobei die Langerhans-Inseln vorzugsweise humane Langerhans-Inseln, Langerhans-Inseln aus Rind oder Langerhans-Inseln aus Schwein sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Makrokügelchen von etwa 50.000 bis etwa 700.000 Langerhans-Inseln enthält.
Agarose-beschichtetes, Agarose sezernierende Zelle-Makrokügelchen erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Agarose-beschichtetes, Agarose sezernierende Zelle-Makrokügelchen nach Anspruch 5, wobei die sezernierende Zelle eine Langerhans-Insel ist.
Agarose-beschichtetes, Agarose sezernierende Zelle-Makrokügelchen nach Anspruch 6, wobei die sezernierende Zelle eine humane Langerhans-Insel, eine Langerhans-Insel aus Rind oder eine Langerhans-Insel aus Schwein ist.
Verwendung einer therapeutisch effektiven Menge eines Agarose-beschichteten, Agarose sezernierende Zelle-Makrokügelchens erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten mit einem durch eine beeinträchtigte Funktion von sezernierenden Zellen hervorgerufenen Zustand.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei der Zustand Insulin-abhängiger Diabetes ist.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die sezernierende Zelle eine Langerhans-Insel ist, vorzugsweise eine humane Langerhans-Insel, eine Langerhans-Insel aus Rind oder eine Langerhans-Insel aus Schwein.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei etwa 5 bis etwa 10 Makrokügelchen verwendet werden und jedes Makrokügelchen von etwa 50.000 bis etwa 700.000 Langerhans-Inseln enthält.
Verfahren zur Konservierung sezernierender Zellen, umfassend: a) Ausbilden Agarose-beschichteter, Agarose sezernierende Zelle-Makrokügelchen erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und b) Inkubation der sezernierenden Zelle-Makrokügelchen.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die sezernierende Zelle eine Langerhans-Insel ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Langerhans-Insel bei 24°C oder 37°C inkubiert wird.