KR20050005235A - 거대캡슐화 분비세포 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 친수성 겔물질내 분비세포의 거대캡슐화, 거대캡슐화된 분비세포를 사용하는 치료방법 및 거대캡슐화에 의한 분비세포를 보존하는 방법에 관한 것이다.

Description

거대캡슐화 분비세포{MACROENCAPSULATED SECRETORY CELLS}
발명의 분야
본 발명은 친수성 겔물질내 분비세포의 거대캡슐화, 거대캡슐화된 분비세포를 사용하는 치료방법 및 거대캡슐화에 의하여 분비세포를 보존하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
분비세포는 한정하는 것은 아니지만 호르몬 (예를들면, 인슐린), 성장인자, 시토킨등과 같은 생물학적 산물을 분비하는 것을 특징으로 하는 세포이다. 그것의 생물학적 과정의 역할은 널리 알려져 있으며 여기서 설명할 필요는 없다. 여러가지 질환 및 병리학적 상태는 분비산물의 결핍된 생산, 예를들면 갑상선 호르몬 결핍에 기인한 갑상선 기능저하증과 크레틴 왜소발육증, 뇌하수체 성장호르몬 결핍에 기인한 하수체성 왜소발육증, 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 결핍에 기인한 Lesch-Hyhan 증후군, 간 친화성 (hepatotrophic)인자 결핍에 기인한 돌발성 간 장애, 연골세포 결핍에 기인한 세포외 매트릭스 질환 및 인슐린 결핍에 기인한 인슐린 의존성 당뇨병과 같은 분비세포가 정상적으로 작동하지 않는 것에 관련된다.
그러한 상태를 치료하기 위한 한가지 접근법은 분비세포를 환자에게 이식하는 것이다. 임상적으로 안전하고 효과적이기 위하여, 이식물질은 (1) 숙주의 세포와 조직에 비면역원성, 비응괴형성성, 생안정성 및 완전히 비독성이어야 하고, (2) 장기간동안 세포 생존능력을 유지하고, (3) 영양분, 분비촉진물질 (분비를 자극하는 물질) 및 세포산물의 자유로운 통과를 허용하고, (4) 외과이식 및 세포자생을 촉진하고, (5) 용이하게 적소에 고정될 뿐만 아니라 제거되어야 한다.
인슐린-의존성 당뇨병을 치료하기 위한 췌장도 이식은 랑게르한스섬의 분리에 있어서 기술진보로 인하여 새롭게 관심을 끄는 주제가 되고 있다. 사람 췌장은 췌장관 근처에서 어떤 농도로 외분비선 췌장에 걸쳐서 산포된 랑게르한스섬(이하, "췌장도"라고 함)을 함유하는 것으로 알려져 있다. 일괄적으로, 췌장도는 췌장부피의 약 1%를 점유하는 단일 내분비 기관으로 생각될 수 있다. 췌장내에서 소(小)췌장도 (직경 100㎛까지)는 외분비 조직 전체에 분포하는 경향이 있다. 이런 소(小)췌장도는 수에 있어서 췌장도의 75%이지만 부피면에서는 단지 약 15%만을 나타낸다. 직경이 250㎛ 보다 더 큰 췌장도는 췌장도 전체수의 단지 15%이지만 부피의 60%를 구성한다. 이들 췌장도는 큰 관 및 혈관 근처에 집중되지만 포도상선 조직에 의해 둘러싸이지 않는다. 사람 췌장은 1백만 이상의 췌장도를 함유할 수 있고, 보통 각각의 췌장도는 수천개의 세포로 이루어진다. 각각의 췌장도는 인슐린 생산 베타세포(B-세포)의 중심코어와, 글루카곤 함유 알파세포(A-세포), 소마토스타틴 분비 델타세포(D-세포) 및 췌장폴리펩티드 함유 세포(PP-세포)의 외투막으로 구성된다. 인슐린 생산 B-세포는 세포의 대부분이며 사람의 경우 췌장도의 약 80%까지를 이룬다.
췌장도 이식의 임상적용은 췌장도 동종이식편-이종이식편 거부반응, 즉 이식된 췌장도를 공격하는 숙주의 면역 시스템에 기인하는 이식된 췌장도의 거부반응을 방지할 수 없다는 것으로 제한되고 있다. 거부반응을 없애기 위하여 췌장도는 면역억제제를 투여하면서 이식되고 있다.
그러나, 면역억제요법은 거부반응의 위험을 감소시키는 반면에 체내 전체적인 면역방어 수단에 손상을 주는 상반된 것으로 판명되었다. 숙주면역 반응으로부터 이식된 조직을 보호하기 위한 여러 가지 방법이 많은 연구자들에 의해 조사되었다. 이하 논의되는 바와 같이, 일시적인 성공은 보고되었지만 (Lacy,Diabetes Reviews1(1):76(1993) 참조), 효과적인 장기간 방법은 아직까지도 달성되지 않았다.
숙주의 면역응답으로부터 이식된 조직을 보호하기 위한 다섯가지 주요접근법은 모두 숙주의 면역시스템으로부터 이식된 조직을 분리하는 시도가 수반된다. 지금까지 사용된 면역분리기술은 맥관외 확산챔버, 맥관내 확산챔버, 맥관내 한외여과 챔버, 미세캡슐화 및 거대캡슐화를 포함한다. 그러나 이들 방법은 모두 하나이상의 다음 문제점들 즉, 이식물에 대한 숙주피브린반응, 이식물의 불안정성, 반투과막에 대한 제한된 영양확산, 분비촉진물질 및 산물투과성 및 반투과성 배리어에 대한 확산지연시간에 기인하여 실패하였다.
예를들면, 반투과막내에 생존성 세포, 조직, 및 기타 불안정한 생물막을 밀봉하기 위한 미세캡슐화 과정은 1978년에 Lim (Research report to Damon Corporation(1978))이 개발하였다. Lim은 랑게르한스섬을 캡슐화하기 위하여 알긴산염 및 폴리 L-리신의 미세캡슐을 사용하였다. 1980년에는 당뇨병 연구에서 이 신규한 기술의 첫번째 성공적인 생체내 적용이 보고되었다 (Lim, et al.,Science210:908(1980)). 이들 랑게르한스섬의 이식으로 당뇨병 동물에게서 진정 혈당증 상태를 지속하게 되었다. 그러나, 이들 실험을 반복한 다른 연구자들은 알긴산염이 조직반응을 야기시키는 것을 발견하였으며 Lim 등의 결과를 재현할 수 없었다 (Lamberti, et al.,Applied Biochemistry and Biotechnology10:101(1984); Dupuy, et al.,Jour Biomed. Material and Res.22:1061(1988); Weber, et al.,Transplantation49:396(1990); 및 Soon-Shiong, et al.,Transplantation Proceedings22:754(1990)). 현재 이들 폴리머의 수용성은 생체내 이들 거대 캡슐의 제한된 안정성과 생적합성에 기인하는 것으로 생각된다 (Dupuy, et al., 상기참조, Weber, et al., 상기참조, Soon-Shiong, et al., 상기참조, 및 Smidsrod,Faraday Discussion of chemical society57:263(1974)).
최근에 Iwata 등 (Iwata, et al.,Jour Biomedical Material and Res.26:967(1992))은 동종 췌장도의 미세캡슐화를 위해 아가로스를 이용하였으며 미세비드의 제조를 위한 배지로서 사용될 수 있음을 발견하였다. 그들의 연구에서 1500내지 2000개의 췌장도가 5% 아가로스내에서 개별적으로 미세캡슐화 되었으며 스트렙토조토신-유발 당뇨병 마우스로 이식하였다. 이식편은 장기간 생존하였으며, 수용자는 무기한으로 정상 혈당증을 유지하였다.
그러나, 그 방법은 몇가지 결점이 있다. 그것은 성가시고 부정확하다. 예를들면, 대부분의 비드가 부분적으로 코팅되고 아가로스가 없는 수백개의 비드가 형성된다.
따라서, 아가로스가 없는 비드와 캡슐화된 췌장도를 분리하는데 추가적인 시간이 요구된다. 더욱이, 대부분의 이식된 미세비드는 골반강에서 모아지고 코팅된 개별비드로 완전히 정상 혈당을 얻기 위하여는 많은 췌장도가 요구된다. 또한, 이식된 비드는 회수하기가 어렵고 깨지기 쉬우며 약간의 손상에도 췌장도를 쉽게 방출하게 된다.
거대캡슐화 과정도 테스트되었다. 폴리-2-히드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리염화비닐-공-아크릴산 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 여러 가지 다른 물질로 된 거대 캡슐을 랑게르한스섬의 면역분리를 위해 제조되었다 (Altman, et al.,Diabetes35:625(1986); Altman. et al.,Transplantation American Society of Artificial Internal Organs30:382(1984); Ronel, et al.,Jour. Biomedical Material Research17:855(1983); Klomp, et al.,Jour. Biomedical Material Research17;865-871(1983)참조). 모든 이들 연구에서, 단지 일시적 혈당 정상화를 달성하였다.
Archer 등 (Journal of Surgical Research, 28:77(1980))은 췌장도 이종이식편의 거부반응을 일시적으로 방지하기 위하여 아크릴 코폴리머 중공섬유를 사용하였다. 그들은 당뇨병 햄스터로 이식된 중공 섬유내에 분산된 신생쥐 췌장 이식편의 장기간 생존을 보고하였다. 최근에 Lacy 등 (Science254: 1782-1784(1991))은 그 결과를 확인하였지만 진정 혈당증상태가 일시적 상태인 것으로 발견하였다. 그들은 췌장도가 섬유로 주사되었을 때, 그것이 중공관내에서 응집하고 췌장도 덩어리의중심부에서 괴사를 가져온다는 것을 발견하였다. 중심괴사는 이식편의 증식을 방해했다. 이 문제점을 해결하기 위하여 그들은 췌장도를 섬유에 분산시키기는데 알긴산염을 사용하였다. 이 방법을 사용하여 그들은 장기간 이식편 생존에 도달할 수 있었다. 그러나, 이 실험은 광범위하게 반복되지는 않았다. 그러므로, 사람의 췌장도 이식 매체로서 막의 기능은 의문이다.
따라서, 분비세포 이식, 특히 만성 면역억제제의 사용없이 췌장도 동종이식편 및 이종이식편 생존을 성취할 필요성이 존재한다. 본 발명자들은 놀랍게도 친수성 겔물질로 분비세포를 거대캡슐화하는 것이 동물에 이식될 수 있고 장기간 보존될 수 있는 기능적, 비면역원성 거대비드를 가져온다는 것을 발견하였다. 본 발명의 분비세포의 거대캡슐화는 분비세포 이식에 더 효과적이고 다루기 쉬운 기술을 제공한다. 또한 거대캡슐화 기술은 효소, 미생물, 재조합 생성된 영양제를 포함하는 영양제, 세포 독성화제 및 화학요법 약제와 같은 다른 생물학적 약제를 거대 캡슐화하는데 사용될 수 있다. 거대캡슐화된 생물학적 약제는 생물학적 약제에 반응하는 것으로 알려진 상태를 치료하기 위해 투여될 수 있다.
그러므로 본 발명의 목적은 숙주의 분비세포의 손상된 기능으로 야기된 상태를 치료하기 위해 동물로 이식될 수 있는 분비세포 거대비드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 장기간 보존될 수 있는 분비세포 거대비드를 제공하는 것이다.
이들 및 다른 목적을 달성하는데 있어서, 본 발명의 한가지 양태에 따라서아가로스 코팅된, 아가로스-콜라겐 분비세포 거대비드; 아가로스 코팅된, 겔폼 분비세포 거대비드; 및 아가로스 코팅된, 아가로스 분비세포 거대비드를 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양태에서, 아가로스 코팅된, 아가로스-콜라겐 분비세포 거대비드; 아가로스 코팅된, 겔폼 분비세포 거대비드; 및 아가로스 코팅된, 아가로스 분비세포 거대비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 분비세포 거대비드의 치료학적 유효량을 환자에게 이식하는 것으로 이루어진, 분비세포 산물이 불충분한 것을 특징으로 하는 상태의 환자를 치료하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 아가로스 코팅된, 아가로스-콜라겐 분비세포 거대비드; 아가로스 코팅된, 겔폼 분비세포 거대비드; 및 아가로스 코팅된, 아가로스 분비세포 거대비드로 이루어진 군으로부터 선택되는 거대비드를 형성하는 것으로 이루어진, 분비세포를 보존하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 목적, 양태 및 이점은 다음 상세한 설명으로부터 명백하게 될 것이다.
그러나, 상세한 설명과 특정 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 나타내지만 단지 예시로서 주어지는데, 왜냐하면 본 발명의 사상과 범주내에서 여러 가지 변형 및 개량이 본 상세한 설명으로부터 이 분야의 전문가에게 명백하게 될 것이기 때문임을 이해해야 한다.
제 1도 및 제 2도는 아가로스 코팅된, 콜라겐-아가로스 췌장도(pancreatic islet) 거대 비드를 나타내며,
제 3도는 아가로스 코팅된, 콜라겐-아가로스 췌장도 거대비드가 이식된 당뇨병 마우스의 글루코스 레벨을 나타내며,
제 4도는 아가로스 코팅된, 겔폼(gelfoam) 췌장도 거대비드가 이식된 당뇨병 마우스의 글루코스 레벨을 나타내며,
제 5도는 아가로스 코팅된, 아가로스 거대비드가 이식된 당뇨병 마우스의 글루코스 레벨을 나타내며,
제 6도는 유리 췌장도가 이식된 당뇨병 마우스의 글루코스 레벨을 나타내며,
제 7도는 아가로스 코팅된, 콜라겐-아가로스 거대비드 및 유리 췌장도가 이식된 당뇨병 마우스의 글루코스 레벨을 나타내며,
제 8도는 정상 마우스, 스트렙토조토신-유발 당뇨병 마우스, 신장 캡슐내 동종 이식편을 수용한 스트렙토조토신-유발 당뇨병 마우스 ("KCT 마우스") 및 아가로스 코팅된, 아가로스-콜라겐 췌장도 거대비드; 아가로스 코팅된, 겔폼 췌장도 거대비드; 및 아가로스 코팅된, 아가로스 췌장 거대비드를 수용한 스트렙토조토신-유발 당뇨병 마우스 (총체적으로 "비드마우스"로 언급함)에 대한 글루코스 내성시험을나타낸다.
본 발명은 친수성 겔 물질내 생물학적 약제, 바람직하게는 분비세포의 거대캡슐화, 거대캡슐화된 생물학적 약제, 바람직하게는 분비세포를 사용하는 치료방법 및 거대캡슐화에 의해 생물학적 약제, 바람직하게는 분비세포를 보존하는 방법에 관한 것이다. 친수성 겔물질은 아가로스와, 콜라겐-아가로스 및 젤라틴 스폰지-아가로스의 조합으로 이루어진다. 이하, 젤라틴 스폰지는 겔폼으로 언급한다.
용어, 생물학적 약제는 생기관 및 그것의 산물, 예를들면, 단백질, 효소, 호르몬, 폴리펩티드, 혈청, 항체 및 항생물질과 또한 유전공학세포를 가리킨다. 생물학적 약제는 효소, 예를들면, 글루코스 옥시다제, 락타제 복합체, 암모니아 및 요소의 제거를 위한 미생물, 예를들면Klebsiella aerogenes, 재조합 영양제를 포함하는 영양제, 예를들면 재조합 생산된 성장호르몬, 및 세포독성제를 포함한다.
용어, 분비세포는 췌장도를 포함하는데, 비록 학술적으로는 췌장도는 분비세포가 아니지만 대부분 분비세포의 클러스터는 췌장 전체에 산포되고 그것의 내분비 부분으로 이루어졌기 때문이다.
사람에서 그것들은 적어도 4가지 다른 유형의 분비세포로 이루어진다: 과혈당인자인 글루카곤을 분비하는 알파세포; 가장 풍부하고 (70%∼80%)인슐린을 분비하는 베타세포; 소마토스타틴을 분비하는 델타세포; 및 폴리펩티드 호르몬을 분비하는 폴리펩티드세포.
상기와 같이, 이식물질은 숙주와 적합성이어야 한다. 아가로스는 생물학적 연구에 사용된 오랜 역사를 가졌고, 그것의 재질은 잘 제어된다. 콜라겐은 포유동물에서 가장 풍부한 단백질이고, 견고한 기계적 지지체를 제공하며, 세포복제, 분화, 기관생성, 개체성장 및 상처치료를 위한 생물학적 공간으로 작용한다. 콜라겐은 또한 좋은 생체적합성을 가진다. 겔폼은 비면역원성이고, 외과수술에 광범위하게 사용되어 왔다. 그것은 또한 분비세포에 의해 좋은 내성을 보인다.
우선 생물학적 약제 및 바람직하게는 분비세포를 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 분리한다. 바람직한 구체예에서 췌장도를 4℃, 24℃ 또는 37℃에서 배양한 후 거대캡슐화한다. 이 방법은 분리외상후에 오직 생존하는 췌장도만을 선택할 수 있도록 해준다. 또한 췌장도는 덜 면역원성이 되어 결과적으로 거대비드 형성섬유증을 방지한다.
본 발명의 한 구체예에서, 생물학적 약제, 바람직하게는 췌장도와 더 바람직하게는 약 50,000 내지 700,000개의 췌장도를 콜라겐의 수용액, 바람직하게는 약 0.5% 내지 2% 아텔로콜라겐 용액에 현탁한다. 아텔로콜라겐은 콜라겐의 분자간 가교결합을 책임지는 항원성 텔로펩티드를 제거하는 펩신으로 콜라겐을 처리함으로써 얻는다. 그 다음 약 0.5 내지 5%의 아가로스, 바람직하게는 약 1%를 현탁된 췌장도에 첨가하여 콜라겐 및 아가로스의 혼합물에 현탁된 췌장도를 형성한다. 그 다음 췌장도를 함유하는 혼합물을 당업계에 잘 알려진 기술을 사용하여, 바람직하게는 혼합물을 미네랄 오일 또는 Teflon쉬트상에 적하함으로써 반고체 비드로 변환시킨다. 그 다음 반고체 비드를 항생 배지에 옮기고, 세척한 후, 콜라겐을 중합화하는 표준조건하에, 바람직하게는 가습된 5% CO2분위기하에 37℃에서 배양함으로써 고체 콜라겐-아가로스 거대비드를 형성한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 생물학적 약제, 바람직하게는 췌장도와 더바람직하게는 약 50,000 내지 700,000개의 췌장도를 젤라틴 스폰지의 표면(3∼5㎝)상에 도포한다. 그 다음 젤라틴 스폰지를 굴려서 구체로 만든다. 아가로스 3% 내지 5%를 구체상에 부어서 비드를 형성한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 생물학적 약제, 바람직하게는 췌장도와 더 바람직하게는 약 50,000 내지 700,000개의 췌장도를 약 0.5% 내지 5%아가로스, 바람직하게는 약 1% 아가로스 범위의 아가로스 용액에 놓는다. 그 다음 혼합물을 미네랄오일 또는 테플론에 접촉시켜서 거대비드로 변환시킨다. 그 다음 비드를 항생배지로 옮기고, 세척하고, 바람직하게는 가습된 5% CO2분위기에서 37℃에서 하룻밤 배양한다.
모든 상기 구체예에서, 거대비드를 바람직하게는 약 500 내지 2,000ul의 5% 내지 10% 아가로스를 함유하는 테플론 스푼에서 비드를 3∼4회 굴림으로써 아가로스로 균일하게 코팅한다. 유사하게 여기서 사용된 생물학적 약제 거대비드라는 용어는 비드형태의 거대캡슐화된 생물학적 약제를 의미한다.
거대비드는 약제가 그것의 알려진 기능을 수행할 신체에 생물학적 약제를 전달하기 위한 부형제로서 사용될 수 있다. 한가지 이상의 유형의 생물학적 약제를 한 개의 비드에 캡슐화할 수 있다. 예를들면 거대비드는 헤모글로빈 및 글루코스 옥시다제와 같은 다중 효소들을 함유할 수 있다. 그러한 비드는 빌리루빈을 제거하기 위해 투여될 수 있다. 이들 비드는 소화효소(락타제 복합체)의 경구투여 또는 신체로부터 원하지 않는 아미노산의 선택적 제거를 위해 사용될 수 있다. 효소의캡슐화는 또한 관강내에서 효소의 분해를 방지할 수 있다. 더욱이, 재조합 유전자 산물을 배지로서 캡슐화를 사용하여 안전하게 전달할 수 있다. 예를들어K. aerogenes유전자는 요소 및 암모니아의 제거를 위해 거대비드에 거대캡슐화될 수 있다. 생물학적 약제가 숙주에 면역원성일 경우, 거대비드는 면역억제제의 사용없이 또는 감소된 양의 면역억제제로 생물학적약제를 투여하도록 해준다.
분비 거대비드는 분비세포 거대비드를 피험자에 이식시킴으로써 피험자의 분비세포의 손상된 기능에 의해 유발되는 상태, 예를들어 인슐린 의존성 당뇨병, 성장인자 결핍장애 및 호르몬 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 거대비드는 그러한 특정 치료를 위해 적당한 위치에 삽입시킬 수 있다. 예를 들어 간세포를 함유하는 거대비드는 비정상적인 간기능에 관련된 질병을 치료하기 위해 복강내로 이식될 수 있다. 바람직한 적용으로는 인슐린-의존성 당뇨병을 치료하기 위해 환자에게 각각 50,000 내지 700,000 개의 췌장도를 함유하는 5 내지 10개의 췌장도 거대비드를 이식하는 것이다. 거대비드는 복막강에 삽입될 수도 있다.
분비세포 거대비드는 상태를 치료하기에 충분한 양으로 환자에게 이식된다. 이것을 달성하기에 충분한 양을 "치료적 효과량" 또는 "유효량"이라고 정의한다. 이 용도를 위한 효과량은 상태의 중증도, 환자의 일반상태, 투여경로, 거대비드의 위치와 분비세포 거대비드가 다른 약품과 조합하여 투여되는지 여부에 의존할 것이다.
분비 거대비드는 면역억제제와 조합하여 또는 바람직하게는 면역억제제 없이 동종 및 이종이식을 위해 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 만성 또는 급성인슐린 의존성 당뇨병 환자는 이 면역억제제의 사용없이 환자에게 동물 췌장도, 예를들어 돼지, 소, 쥐, 래트, 피신 또는 다른 어떤 적합한 종을 이종이식시킴으로써 치료한다. 분비세포 거대비드는 또한 상태를 치료하기 위해 다른 치료약제, 예를들어 통상 사용 되는 3중 약품요법(시클로스포린, 아자티오프린 및 히드로코르티손) 라파마이신, 데옥시스페르구알린 또는 항체와 조합하여 투여될 수 있다.
또한 거대비드는 장기간동안 생물학적 약제, 바람직하게는 분비세포를 저장하는 수단으로서 사용될 수 있다. 생물학적 약제, 바람직하게는 분비세포의 생존성을 유지하기 위해, 생물학적 약제, 바람직하게는 분비세포 거대비드를 그것들이 동물에 이식될 때까지 인큐베이션한다.
분비세포가 췌장도일 때, 췌장도 거대비드는 24℃ 또는 37℃의 온도에서 인큐베이션한다.
실시예
실시예 Ⅰ
췌장도 분리
췌장도를 Gotoh et al.,Transplantation40: 437(1985)에 개시된 방법의 변형에 의해 래트로부터 분리했다. 콜라겐아제 용액 (콜라겐아제타입 XI, Sigma Chemical, St. Louis, MO; 2㎎/㎖의 Sigma, 타입Ⅴ, 소 혈청 알부민 및 1㎎/㎖ CaCl2를 함유하는 1㎎/㎖)을 통상의 담관을 통해 췌장내로 주사했다 (Gotoh et al.,Transplantation40:437(1985), 상기 참조).
췌장을 제거하고, 빙상에 유지된 플라스크에 수집했다. 일단 4마리의 래트로부터 췌장이 수집되면, 플라스크를 30분동안 38℃에서 수욕에 놓는다. 생성된 분해조직을 차가운(8℃) HBSS(행크스 균형염용액)에 4회 세척했다.
조직의 반복된 가동화에 의하여 비분해된 조직, 거대림프절 및 다른 외래물질을 제거했고, 이어서 상청액을 제거했다. 정제된 췌장도를 25%, 23%, 21% 및 11% Ficoll 층으로 구성된 불연속 Ficoll 구배상에서 분리하고, Euro-Collins용액 (Frescenius AG, Gluchen Steinweg, Homburg V.D.H)에서 제조하고, 16분동안 2000 r.p.m으로 원심분리했다. 췌장도를 11% 및 21% 사이의 경계면과 21% 및 23% Ficoll층 사이의 경계면으로부터 수집했다.
각각의 분획으로부터의 췌장도를 모으고, 10% 태아소혈청을 함유하는 HBSS용액에서 4회 세척했다. 그 다음 모은 췌장도를 RPMI 완전배지, 즉 차가운 RPMI 1640배지 (GIBCO, Grand Island, NY)를 함유하고 25mM HEPES, 열-불활성화된 태아소혈청(10%)과 100㎍/ml의 페니실린, 100㎍/ml의 스트렙토마이신 황산염 및 25㎍/ml의 암포테리신 B를 함유하는 항생-항진균성용액(1ml/100ml)으로 보충된 페트리 접시에 옮겼다. 어떤 나머지 비췌장도 포도상, 맥관, 도관 또는 림프절 조직을 해부현미경의 도움으로 동정하고, 미세팁 살균 피펫으로 조심스럽게 제거했다. 최종순도를 디페닐티오카르바존으로 췌장도제제를 염색함으로써 측정했다.
분리후에, 췌장도를 4일간 5% CO2를 갖는 가습된 분위기에서 37℃에서 10ml의 RPMI배지를 함유하는 세균학적 플라스틱 접시(100mm)에서 배양했다. 배지를 매일 교체하고, 그다음 췌장도를 직접 이식하거나 거대캡슐화했다.
실시예 II
A. 아가로스 코팅된 아가로스-콜라겐 췌장도 거대비드의 제조
실시예 1의 방법에 의해 얻어진 1000개의 췌장도를 태아소혈청을 덜 갖는 실시예 1에 기술된 RPMI 완전배지에서 4회 세척했다. 그다음 췌장도를 인산 완충 염수중 1% 아텔로콜라겐 용액 50㎕를 함유하는 튜브에 첨가하여 췌장도를 현탁했다. 100㎕의 1% 저점도 아가로스(Sigma 타입XII)용액을 RPMI 또는 MEM(최소 필수배지)에서 제조하고, 60℃에서 유지한 다음 콜라겐-췌장도현탁액에 첨가했다. 그다음 튜브의 내용물을 실온에 유지된 살균 미네랄 오일상에 또는 Teflon쉬트상에 단일 큰방울로서 즉시 옮겼다. 1분후, 방울은 반고체 거대비드가 되고, 그 다음 그것을 37℃에서 RPMI 항생배지로 옮겼다. 거대비드를 동일 배지로 3회 세척하여 모든 오일을 제거했다. 마지막으로 그것들을 완전배지(37℃)로 2회 헹구고, 5% CO2를 갖는 가습된 분위기에서 37℃에서 하룻밤 인큐베이션했다. 이 기간동안 콜라겐을 중합하고, 췌장도를 콜라겐 섬유상에 방치했다.
다음날, 고체 거대비드를 RPMI 또는 MEM배지중 5% 아가로스 약 1ml를 함유하는 Teflon스푼에 옮겼다. 그다음 고체 거대비드를 이 용액에서 2-3회 굴려서 그것들을 균일하게 코팅시켰다. 아가로스 고화전에, 거대비드를 Teflon접시중 미네랄 오일에 옮겨서 평활면 거대비드를 얻었다. 60초후에 거대비드를 미네랄 오일로부터 제거하고, RPMI항생배지로 3회 세척한 다음, RPMI완전배지로 2회 세척했다. 그다음 그것들을 5% CO2를 갖는 가습 분위기에서 37℃에서 하룻밤 배양했다. 아가로스 코팅된 아가로스-콜라겐 췌장도 거대비드는 제 1도 및 제 2도에 보여진다.
B.아가로스 코팅된 젤라틴 스폰지 췌장도 거대비드의 제조
우선 작은 조각의 젤라틴 스폰지(겔폼) 3㎟를 RPMI완전배지에 침지시켰다. 배지를 압착하고, 겔폼을 1분동안 방치시켰다. 실시예 1에 따라 제조된 천개의 췌장도를 RPMI항생배지로 4회 세척했다. 그 다음 그것들을 10㎕의 RPMI항생배지에 현탁했다. 그것들을 미세팁 플라스틱 피펫에 의해 옮기고, 겔폼의 표면상에 도포했다. 20초후에 겔폼을 굴려서 작은 구체를 만들었다. 50㎕의 5%아가로스를 구체의 표면상에 부어서 췌장도 거대비드를 생성했다.
거대비드를 5% 아가로스로 균일하게 피복하기 위해, 500㎕의 5% 아가로스를 Teflon 스푼중 거대비드에 첨가하고, 3-4회 굴렸다. 아가로스 고화전에, 거대비드를 미네랄오일에 옮기고, 접시를 회전시켜 거대비드상의 평활면을 얻었다. 거대비드를 RPMI항생배지로 3-4회 세척한 다음, RPMI완전배지로 2회 헹구었다. 그것을 하룻밤 배양한후, 이식을 위해 사용했다.
C.아가로스 코팅된 아가로스 췌장도 거대비드의 제조
우선 실시예의 방법에 의해 얻은 천개의 췌장도를 RPMI항생배지에서 4회 세척했다. 췌장도를 50㎕ RPMI항생배지를 함유하는 튜브에 옮기고, 거기서 현탁했다. 그 다음 100㎕의 1%아가로스 용액을 튜브에 첨가했다. 튜브의 전체 내용물을 살균미네랄오일 또는 테플론쉬트에 단일 큰방울로 즉시 옮겼다. 1분후에 방울을 거대비드로 고화되었다. 거대비드를 RPMI항생배지로 옮기고 37℃에서 유지했다. 그 다음 동일배지로 거대비드를 3회 세척한다음 RPMI완전배지로 2회 헹구어서 오일을 제거했다. 비드를 5% CO2를 갖는 가습 분위기에서 37℃에서 하룻밤 인큐베이션했다.
다음날 이들 비드를 RPMI 또는 MEM배지중 5% 아가로스 1㎖를 함유하는 Teflon스푼상에 옮겼다. 거대비드를 아가로스로 균일하게 코팅하기 위하여, 그다음 비드를 아가로스에서 2-3회 부드럽게 굴렸다. 그 다음 아가로스가 고화되기전에 그것들을 테플론 접시중 미네랄오일에 옮겼다. 60초후에 비드를 미네랄오일로부터 제거하고, RPMI항생배지에서 3회, 그리고 RPMI완전배지에서 2회 세척했다. 그다음 비드를 하룻밤 인큐베이션했다.
실시예 III(마우스로의 췌장도 거대비드의 이식)
A.수용마우스 및 공여래트
사용된 마우스는 수컷 C57BL/6 및 BALB/c 변종이었다. 수용마우스를 스트렙토조토신(170-200mg/kg)의 단일 정맥내 주사에 의해 당뇨병에 걸리게 만들었다. 비단식 플라즈마 글루코스 레벨을 당뇨병의 유발전에 결정했다. 수용마우스에서의 모든 혈당레벨을 Exac Tech Pen Sensor로 꼬리정맥혈액샘플을 통해 모니터했다. 오직 이식당일에 400mg/㎗초과의 혈청 글루코스 레벨을 갖는 마우스만을 사용했다.
위스터 퍼스래트를 이종이식에 대한 공여자로서 사용하였다.
B.복막강으로의 췌장도 거대비드의 이종이식
이종이식시, RPMI 항생 배지를 함유하는 플레이트를 분리하기 위하여 실시예 Ⅱ(A), Ⅱ(B), 및 Ⅱ(C) 각각의 췌장도 거대비드를 서서히 이식하였다. 모든 혈청 단백질을 제거하기 위해, 배지를 세 번 교환하였다. 당뇨병 수용마우스를 애버틴으로 마취시켰다. 중선절개를 실시하여 자유복막강으로 단일췌장도 거대비드를 넣었다. 흡수 봉합실로 절개부위를 두층으로 봉합하였다. 대조마우스에 빈 거대비드를 복강내로, 유리췌장도를 복강내로, 또는 유리 공여자 췌장도와 함께 빈 거대비드를 수용시켰다.
이식후, 각 수용자의 혈당을 정상범위에 다다를 때까지 매일 또는 격일로 체크하였고; 그 후 혈당을 단지 매주 2-3번 체크하였다. 혈청 글루코스가 200㎎/㎗이하이면, 이식이 기술적으로 성공적이라 간주하고 연속적으로 채혈하였다. 혈청글루코스농도가 일시적인 정상 혈당증기간 후 200㎎/㎗ 이상으로 상승하면, 이식이 거부되었다고 간주하였다. 혈당이 전혀 정상이 되지 않는다면 (즉, 200㎎/㎗이상이 계속 유지), 이식이 실패하였거나, '1차 비기능적'으로 되었다고 간주하였다.
C.복막내 글루코스 내성시험
이식 후, 약 70∼84일에, 글루코스 내성시험을 실시하였다. 글루코스용액 (1.0g/㎏체중)을 6시간 (오전 9시∼오후 3시) 단식시킨 마우스에 복강내 주사하였다. 주사 전후 (0, 30, 60 및 120분); 혈액샘플을 취하여 ExacTech Pen Sensors를 사용하여 혈장글루코스 레벨을 측정하였다.
비교하기 위해, 정상 C57BL/6 및 BALB/c마우스, 췌장도를 이식하지 않은 스트렙토조토신 유발된 C57BL/6 및 BALB/C마우스와 유리 췌장도가 신장캡슐로 이식된스트렙토조토신 유발 당뇨병 BALB/c마우스 ("KCT"마우스)에 대해 글루코스 내성시험을 실시하였다.
거대비드 자체가 아닌 거대 캡슐화된 췌장도를 통하여 당뇨병 마우스가 진정 혈당증 상태로 되도록 대조 실험을 행하였다. 그러므로 빈 아가로스 코팅된 아가로스-콜라겐 거대비드 및 아가로스 코팅된 겔폼거대비드를 실시예 Ⅱ(A) 및 (B)의 비드와 같은 방법으로 제조하였다.
D.복막내 이종이식 및 글루코스 내성시험결과
췌장도 거대비드의 이식시, STZ-당뇨병 스트렙토조토신 유발 C57BL/6마우스의 단식시키지 않은 혈장글루코스 레벨에서 관찰된 변화를 제 3도 및 제 4도에 도시하였다. 아가로스 코팅된 아가로스-콜라겐 췌장도 거대비드 및 아가로스 코팅된 겔폼 췌장도 거대비드의 수용자를 60일 이상동안 정상 혈당증 상태로 유지하였고, 이 기간동안 마우스의 체중은 평균 3g 증가하였다. 아가로스 코팅된 아가로스 췌장도 거대비드를 이식할 때, 6마리 동물중 2마리가 이식 21∼33일 후에 정상혈당증이 되었고(제 5도) 그 이후 진정 혈당증을 유지하였다. 다른 모든 이식된 동물들은 정상 혈당증 상태를 달성하는데 실패하였다. 빈 거대비드(n=6)는 혈당에 영향을 미치지 않았다.
유리 췌장도를 복강내 이식할 때, 7마리의 이식된 동물중 6마리는 이식 1일 후 정상혈당증이 되었으나, 그들은 이 상태를 단지 3∼10일 유지하였다(제 6도). 유리 췌장도를 아가로스 코팅된 아가로스-콜라겐 거대비드나 아가로스 코팅된 겔폼 거대비드로 제조된 빈 비드로 이식할 때, 모든 동물이 24시간이내 정상 혈당증이되었고, 12일 이상 그렇게 유지되었다(제 7도). 뒤이어, 모든 동물은 과혈당증이 되었다. 빈 거대비드를 함유하는 동물들은 이후 90일동안 조직반응에 흥분하지 않았다.
글루코스 내성시험을 수행한 후 얻은 결과를 제 8도에 나타낸다. 정상 BALB/c 및 C57BL/6마우스와 "KCT"마우스에서, 혈장 글루코스는 30분에 최고점에 달하였고 120분 경과되어 베이스라인으로 되돌아 갔다. 신장 캡슐에서 거대 캡슐화된 췌장도 및 비캡슐화된 췌장도 이식실험때 같은 결과를 얻었다.
이들 실험결과는 아가로스 코팅된 아가로스 콜라겐 췌장도 거대비드; 아가로스 코팅된 아가로스 겔폼 췌장도 거대비드; 및 아가로스 코팅된 아가로스 췌장도 거대비드는 혼성의 인공기관에 대하여 필요한 성질을 나타내는 것을 증명한다. 모두 세가지 유형들은 성공적으로 인슐린을 분비하지만, 최소 수의 이식된 동물에서 얻은 결과의 균일성으로 인해, 아가로스 코팅된 아가로스 콜라겐 및 아가로스 코팅된, 아가로스 겔폼 거대비드가 혼성의 인공기관으로서 더욱 더 적합하다. 더우기, 비드의 세유형 모두는 역효과를 나타내지 않았다. 거대비드는 조직반응도 나타내지 않고 어떠한 기관에 어떤 부착도 나타내지 않고 복막내에서 유리되어 유지되었다. 따라서, 이들 생물 혼성의 췌장도는 거대 캡슐화된 비드를 그들의 자연환경, 췌장으로 하여 그들의 기능을 효과적으로 수행한다.
모든 마우스에서, 혈장 글루코스는 30분에 최고점에 도달하였고, 120분을 지나 베이스라인 레벨로 되돌아 갔다.
실시예 Ⅳ
췌장도의 연장된 보존수명
완전 RPMI 배지에서 4주동안 37℃에서 인큐베이션한 실시예 I(A),(B) 및 (C)에 따라 제조된 거대 캡슐화된 비드를 그들의 장기간 보존성에 대하여 생체내 및 시험관내 시험하였다. 4주동안 인큐베이션한 거대캡슐화된 췌장도가 1일동안 배양시킨 것과 기능적으로 동일한 것을 발견하였다.
이 예는 본 발명에 따르는 거대캡슐화방법이 분비기관 세포보존 및 바람직하게는 췌장도 보존에 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
본 발명의 분비세포 거대비드는 숙주의 분비세포의 손상된 기능으로 야기된 상태를 치료하기 위해 동물로 이식될 수 있으며, 숙주내에서 장기간 보존될 수 있다.

Claims (27)

  1. (a) 콜라겐을 함유하는 용액중에 분비세포를 현탁시키고,
    (b) 단계(a)의 상기 현탁된 분비세포에 아가로스를 가하여 아가로스와 콜라겐의 혼합물에 현탁된 분비세포를 생성하고,
    (c) 단계(b)의 상기 현탁된 분비세포로부터 콜라겐-아가로스 반고체 거대비드를 생성하고,
    (d) 단계(c)의 상기 콜라겐-아가로스 반고체 거대비드를 처리하여 상기 반고체 거대비드에 함유된 콜라겐을 중합시킴으로써 고체 콜라겐-아가로스 거대비드를 생성하고,
    (e) 단계(d)의 상기 고체 거대비드를 아가로스로 코팅하여 아가로스 코팅된 아가로스-콜라겐 분비세포 거대비드를 얻는 것으로 이루어지는 아가로스 코팅된, 아가로스-콜라겐 분비세포 거대비드의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계(e)는 단계(d)의 상기 고체 거대비드를 5% 아가로스중에서 굴리고, 상기 굴린 고체 거대비드를 미네랄오일에 접촉시키고, 상기 굴린 거대비드를 세척하여 상기 아가로스 코팅된, 아가로스-콜라겐 분비세포 거대비드를 얻는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 분비세포는 췌장도인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 췌장도는 사람 췌장도인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 췌장도는 소 췌장도인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 췌장도는 돼지 췌장도인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 거대비드는 50,000 내지 700,000개의 췌장도를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. (a) 겔폼상에 분비세포를 현탁시키고,
    (b) 상기 현탁된 분비세포를 함유하는 상기 겔폼을 굴려서 구체로 만들고,
    (c) 상기 구체를 아가로스로 코팅하여 아가로스 코팅된 겔폼 분비세포 거대비드를 얻는 것으로 이루어지는 아가로스 코팅된, 겔폼 분비세포 거대비드의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 단계(c)는
    (1) 상기 구체의 표면에 아가로스를 부어 거대비드를 생성하고,
    (2) 상기 거대비드를 5% 아가로스중에서 굴리고,
    (3) 단계(2)에서 생성된 상기 굴린 거대비드를 미네랄오일에 접촉시키고,
    (4) 단계(3)의 거대비드를 세척하여 상기 아가로스 코팅된, 겔폼 분비세포 거대비드를 생성하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 분비세포는 췌장도인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 췌장도는 사람 췌장도인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 췌장도는 소 췌장도인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 췌장도는 돼지 췌장도인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 거대비드는 50,000 내지 700,000개의 췌장도를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 기재된 방법에 따라 제조된, 아가로스 코팅된, 아가로스-콜라겐 분비세포 거대비드.
  16. 제15항에 있어서, 상기 분비세포는 췌장도인 것을 특징으로 하는 아가로스 코팅된, 아가로스-콜라겐 분비세포 거대비드.
  17. 제16항에 있어서, 상기 췌장도는 사람 췌장도인 것을 특징으로 하는 아가로스 코팅된, 아가로스-콜라겐 분비세포 거대비드.
  18. 제16항에 있어서, 상기 췌장도는 소 췌장도인 것을 특징으로 하는 아가로스 코팅된, 아가로스-콜라겐 분비세포 거대비드.
  19. 제16항에 있어서, 상기 췌장도는 돼지 췌장도인 것을 특징으로 하는 아가로스 코팅된, 아가로스-콜라겐 분비세포 거대비드.
  20. 제8항에 기재된 방법에 따라 제조된, 아가로스 코팅된, 겔폼 분비세포 거대비드.
  21. 제20항에 있어서, 상기 분비세포는 췌장도인 것을 특징으로 하는 아가로스 코팅된, 겔폼 분비세포 거대비드.
  22. 제21항에 있어서, 상기 췌장도는 사람 췌장도인 것을 특징으로 하는 아가로스 코팅된, 겔폼 분비세포 거대비드.
  23. 제21항에 있어서, 상기 췌장도는 소 췌장도인 것을 특징으로 하는 아가로스 코팅된, 겔폼 분비세포 거대비드.
  24. 제21항에 있어서, 상기 췌장도는 돼지 췌장도인 것을 특징으로 하는 아가로스 코팅된, 겔폼 분비세포 거대비드.
  25. (a) 제1항에 기재된 방법에 따라 제조된 아가로스 코팅된, 아가로스-콜라겐 분비세포 거대비드 또는 제8항에 기재된 방법에 따라 제조된 아가로스 코팅된, 겔폼 분비세포 거대비드를 생성하고,
    (b) 상기 분비세포 거대비드를 인큐베이션하는 것으로 이루어지는 분비세포의 보존방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 분비세포는 췌장도인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 췌장도는 24℃ 또는 37℃에서 인큐베이션하는 것을 특징으로 하는 방법.
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