ES2260568T3 - Celulas secretoras macroencapsuladas. - Google Patents
Celulas secretoras macroencapsuladas.Info
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Abstract
Un método de producir una macrogota de célula secretora de agarosa recubierta de agarosa que comprende: (a) suspender células secretoras en agarosa, (b) formar una macrogota a partir de dichas células secretoras suspendidas del paso (a), (c) incubar dicha macrogota de la etapa (b) en aire humidificado, (d) recubrir dicha macrogota del paso (c) con agarosa para formar una macrogota de célula secretora de agarosa recubierta de agarosa.
Description
Células secretoras macroencapsuladas.
La presente invención se refiere a la
macroencapsulación de células secretoras en un material de gel
hidrofílico, a métodos terapéuticos que emplean las células
secretoras macroencapsuladas, y a la conservación de las células
secretoras mediante macroencapsulación.
Las células secretoras son células que se
caracterizan por secretar productos biológicos, tales como, pero no
limitados a, hormonas (p. ej., insulina), factores de crecimiento,
citoquinas, etcétera. Su papel en procesos biológicos es bien
conocido, y no se necesita explicar aquí. Un número de enfermedades
y afecciones patológicas se relacionan con un fallo de las células
secretoras para trabajar adecuadamente, tal como una producción
deficiente de los productos secretores, p.ej. hipotiroidismo y
enanismo cretino, ambos debidos a la deficiencia de la hormona
tiroidea, enanismo hipofisial debido a la deficiencia de la hormona
pituitaria del crecimiento, Síndrome de Lesch-Hyhan
debido a la deficiencia de hipoxantina-guanina
fosforribosiltransferasa, fallo hepático fulminante debido a la
deficiencia del factor hepatotrófico, enfermedad de la matriz
extracelular debido a la deficiencia de condrocitos, y diabetes
dependiente de insulina debido a la deficiencia de insulina.
Un enfoque para tratar tales afecciones es
transplantar las células secretoras al paciente. El material
transplantado, para ser clínicamente seguro y eficaz, debe (1) ser
no inmunogénico, no trombogénico, bioestable, y completamente no
tóxico para las células y tejidos del hospedador, (2) mantener la
viabilidad de la célula durante un periodo prolongado de tiempo, (3)
permitir el libre paso de nutrientes, secretagogos (una sustancia
que estimula la secreción), y productos de la célula, (4) facilitar
la implantación quirúrgica y resiembra de la célula, y (5) ser
fácilmente fijado en el lugar y asimismo, retirado.
El transplante de islote pancreático para tratar
la diabetes dependiente de insulina ha sido tema de renovado interés
debido a los avances tecnológicos en aislamiento de islotes de
Langerhans. A modo de antecedente, el páncreas humano contiene
islotes de Langerhans (de aquí en adelante "islotes
pancreáticos") que se dispersan por todo el páncreas exocrino con
algunas concentraciones cerca de los conductos pancreáticos. Los
islotes pancreáticos, en conjunto, se pueden considerar como un
órgano endocrino único que ocupa alrededor del 1% del volumen del
páncreas. Dentro del páncreas, los islotes pequeños (hasta 160
\mum de diámetro) tienden a distribuirse por todo el tejido
exocrino. Estos islotes pequeños representan el 75% en número de los
islotes pero sólo aproximadamente el 15% en volumen. Los islotes
mayores de 250 \mum de diámetro constituyen sólo el 15% del número
total de islotes pero el 60% del volumen. Estos islotes se localizan
cerca de los conductos más grandes y de los vasos sanguíneos y no
están rodeados por tejido acinar. Un páncreas humano podría contener
alrededor de 1 millón de islotes y cada islote consta típicamente de
varios miles de células. Cada islote comprende un núcleo central de
células beta (células-B) que producen insulina y una
capa circundante de células alfa (células-A) que
contienen glucagón, células delta (células-D) que
secretan somatostatina y células (células-PP) que
contienen polipéptidos pancreáticos. Las células-B
que producen insulina componen la mayoría de las células y
comprenden hasta aproximadamente el 80% de los islotes en un
humano.
Se han limitado las aplicaciones clínicas del
transplante de islote pancreático por la incapacidad de evitar el
rechazo aloinjerto-xenoinjerto, i.e., un rechazo de
los islotes pancreáticos transplantados debido al sistema inmune del
hospedador que ataca a los islotes pancreáticos transplantados. Para
contrarrestar el rechazo, los islotes pancreáticos se han
transplantado en combinación con la administración de agentes
inmunosupresores.
La terapia inmunosupresora, sin embargo, ha
demostrado ser un arma de doble filo; si bien reduce el riesgo de
rechazo, perjudica en general las defensas inmunológicas del cuerpo.
Varios métodos de protección del tejido transplantado a la respuesta
inmune del hospedador se han investigado por muchos investigadores.
Como se discute posteriormente, aunque se ha dado a conocer éxito
temporal (Ver Lacy, Diabetes Reviews 1 (1):76 (1993)), aún se
tienen que conseguir métodos eficaces duraderos.
Los cinco enfoques más importantes para proteger
el tejido transplantado de la respuesta inmune del hospedador
suponen intentar aislar el tejido transplantado del sistema inmune
del hospedador. Las técnicas de inmunoaislamiento usadas hasta la
fecha incluyen: cámaras de difusión extravascular, cámaras de
difusión intravascular, cámaras de ultrafiltración intravascular,
microencapsulación, y macroencapsulación. Todos estos métodos, sin
embargo, han fracasado debido a uno o más de los siguientes
problemas: una respuesta fibrótica del hospedador al material
implantado, inestabilidad del material implantado, difusión limitada
de nutriente a través de las membranas semipermeables, permeabilidad
de secretagogo y producto y difusión rezagada a través de barreras
de membrana semipermeable.
Por ejemplo, se desarrolló por Lim en 1978 (Lim,
Research report to Damon Corporation (1978)) un procedimiento de
microencapsulación para encerrar células viables, tejidos y otras
membranas biológicas lábiles dentro de una membrana semipermeable.
Lim usó microcápsulas de alginato y poli L-lisina
para encapsular los islotes de Langerhans. En 1980, se dio a conocer
el primer éxito de aplicación in vivo de esta novedosa
técnica en investigación de diabetes ((Lim, et al.,
Science 210:908 (1980)). La implantación de estos islotes de
Langerhans microencapsulados dio como resultado el mantenimiento de
un estado euglicémico en animales diabéticos. Sin embargo, otros
investigadores repitiendo estos experimentos, encontraron que el
alginato causaba una reacción tisular y fueron incapaces de
reproducir los resultados de Lim et al (Lamberti, et
al., Applied Biochemistry and Biotechnology 10:101
(1984); Dupuy, et al., Jour. Biomed. Material and
Res. 22:1061 (1988); Weber, et al.,
Transplantation 49:396 (1990); y Soon-Shiong,
et al., Transplantation Proceedings 22:754 (1990)). La
solubilidad en agua de estos polímeros se considera ahora
responsable de la estabilidad limitada y biocompatibilidad de estas
microcápsulas in vivo ((Dupuy, et al. supra,
Weber, et al. supra, Soon-Shiong,
et al., supra, y Smidsrod, Faraday Discusión of
Chemical Society 57:263 (1974)).
Recientemente, Iwata et al., (Iwata,
et al. Jour. Biomedical Material and Res. 26:967
(1992)) utilizaron agarosa para microencapsulación de islotes
pancreáticos alogénicos y descubrieron que se podría usar como un
medio para la preparación de microgotas. En su estudio, se
microencapsularon individualmente 1500-2000 islotes
en agarosa al 5% y se implantaron en ratones diabéticos inducidos
con estreptozotocina. El injerto sobrevivió durante un largo periodo
de tiempo y los destinatarios mantuvieron indefinidamente
normoglicemia.
Sin embargo, su método adolece de un número de
desventajas. Es incómodo e impreciso. Por ejemplo, muchas gotas
permanecen parcialmente recubiertas y varios cientos de gotas en
forma de agarosa vacía. Así, se requiere tiempo adicional para
separar islotes encapsulados de gotas vacías. Es más, la mayoría de
las microgotas implantadas se acumulan en la cavidad pélvica y se
requiere un gran número de islotes en gotas individuales
completamente recubiertas para conseguir normoglicemia. Además, las
gotas transplantadas son difíciles de recuperar, tienden a ser
frágiles, y fácilmente liberarán islotes al más mínimo daño.
Se ha ensayado también un procedimiento de
macroencapsulación. Se hicieron macrocápsulas de varios materiales
diferentes, tales como
poli-2-hidroxietil-metacrilato,
copolímero de poli(cloruro de vinilo) y ácido acrílico, y
acetato de celulosa para el inmunoaislamiento de islotes de
Langerhans. (Ver Altman, et al., Diabetes 35:625
(1986); Altman, et al., Translation American Society of
Artificial Internal Organs 30:382 (1984); Ronel, et al.,
Jour. Biomedical Material Research 17:855 (1983); Klomp,
et al., Jour. Biomedical Material Research
17:865-871 (1983)). En todos estos estudios, sólo se
consiguió una normalización transitoria de la glicemia.
Archer et al., en Journal of Surgical
Research, 28:77 (1980), usaron fibra hueca de copolímero
acrílico para evitar temporalmente el rechazo de xenoinjertos de
islote. Dieron a conocer supervivencia duradera de injertos
pancreáticos de murino neonatal dispersados en fibras huecas que se
transplantaron en hamsters diabéticos. Recientemente Lacy et
al., Science 254:1782-1784 (1991)
confirmaron sus resultados, pero encontraron que el estado
euglicémico es una fase transitoria. Encontraron que cuando los
islotes se inyectan en la fibra, estos se agregan dentro del tubo
hueco y dan como resultado necrosis en la porción central de las
masas de islote. La necrosis central impidió la prolongación del
injerto. Para solventar este problema, usaron alginato para
dispersar los islotes en la fibra. Usando este método fueron capaces
de conseguir supervivencia duradera del injerto. Sin embargo, este
experimento no se ha repetido mucho. Por tanto, es cuestionable la
función de la membrana como un medio de transplante de islote en
humanos.
Así, existe una necesidad de conseguir el
transplante de células secretoras, y en particular, la supervivencia
de aloinjerto y xenoinjerto de islote pancreático sin el uso de
agentes inmunosupresores crónicos.
Sorprendentemente, los inventores han
descubierto que las células secretoras macroencapsuladas en un
material de gel hidrofílico dan como resultado una macrogota
funcional, no inmunogénica, que se puede transplantar en animales y
se puede almacenar durante largos periodos de tiempo. La
macroencapsulación de las células secretoras de la presente
invención proporciona una técnica más eficaz y manejable para el
transplante de células secretoras. La técnica de macroencapsulación
también se puede usar para macroencapsular otros agentes biológicos,
tales como enzimas, microorganismos, agentes tróficos que incluyen
agentes tróficos producidos recombinantemente, agentes citotóxicos,
y agentes quimioterapéuticos. Los agentes biológicos
macroencapsulados se pueden administrar para tratar afecciones que
se sabe que responden al agente biológico.
Es por tanto un objetivo de la presente
invención proporcionar una macrogota de célula secretora que se
pueda transplantar en animales para tratar afecciones causadas por
un problema de funcionamiento de las células secretoras del
hospedador.
Es un objetivo más de esta invención
proporcionar una macrogota de célula secretora que se pueda
almacenar durante largos periodos de tiempo.
Para lograr estos y otros objetivos, se
proporciona, conforme a un aspecto de la presente invención, un
método de producir una macrogota de célula secretora de agarosa
recubierta de agarosa, que comprende:
- (a)
- suspender células secretoras en agarosa;
- (b)
- formar una macrogota a partir de dichas células secretoras suspendidas de la etapa (a);
- (c)
- incubar dicha macrogota de la etapa (b) en aire humidificado;
- (d)
- recubrir dicha macrogota de la etapa (c) con agarosa para formar una macrogota de célula secretora de agarosa recubierta de agarosa.
Además, se proporciona también una macrogota de
célula secretora de agarosa recubierta de agarosa obtenible por un
método acorde con la invención.
En otro aspecto de la presente invención, se
proporciona un uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de una
macrogota de célula secretora de agarosa recubierta de agarosa
obtenible por un proceso de acuerdo con la invención para la
preparación de un medicamento para tratar un paciente que tiene una
afección causada por un mal funcionamiento de las células
secretoras.
Aún en un aspecto más de la presente invención,
se proporciona un método para conservar células secretoras que
comprende formar macrogotas de células secretoras de agarosa
recubiertas de agarosa obtenibles por un método acorde con la
invención, e incubar dichas macrogotas de células secretoras.
Otros objetivos, características y ventajas de
la presente invención se harán patentes de la siguiente descripción
detallada. Sin embargo, se debería entender que la descripción
detallada y los ejemplos específicos, si bien indican realizaciones
preferentes de la invención, se dan sólo a modo de ilustración, ya
que de esta descripción detallada se harán patentes varios cambios y
modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención para
aquellos expertos en la técnica.
Las Figuras 1 y 2 muestran macrogotas de islote
pancreático de colágeno-agarosa recubiertas de
agarosa.
La Figura 3 muestra los niveles de glucosa de
ratones diabéticos transplantados con macrogotas de islote
pancreático de colágeno-agarosa recubiertas de
agarosa.
La Figura 4 muestra los niveles de glucosa de
ratones diabéticos transplantados con macrogotas de islote
pancreático en espuma de gel recubiertas de agarosa.
La Figura 5 muestra los niveles de glucosa de
ratones diabéticos transplantados con macrogotas de agarosa
recubiertas de agarosa.
La Figura 6 muestra los niveles de glucosa de
ratones diabéticos transplantados con islotes pancreáticos
libres.
La Figura 7 muestra los niveles de glucosa de
ratones diabéticos transplantados con macrogotas de
colágeno-agarosa recubiertas de agarosa e islotes
pancreáticos libres.
La Figura 8 demuestra un ensayo de tolerancia de
glucosa para ratones normales, ratones diabéticos inducidos con
estreptozotocina, ratones diabéticos inducidos con estreptozotocina
que reciben alotransplante en la cápsula renal "(ratones KCT)"
y ratones diabéticos inducidos con estreptozotocina que reciben
macrogotas de islote pancreático de agarosa-colágeno
recubiertas de agarosa; macrogotras de islote pancreático en espuma
de gel recubiertas de agarosa, y macrogotas de islote pancreático de
agarosa recubiertas de agarosa (referidos colectivamente como
"ratones de gota").
La presente invención se refiere a la
macroencapsulación de agentes biológicos, y preferiblemente, células
secretoras en un material de gel hidrofílico, métodos terapéuticos
que emplean los agentes biológicos macroencapsulados, y
preferiblemente, células secretoras, y a la conservación de los
agentes biológicos, preferiblemente células secretoras, mediante
macroencapsulación. El material de gel hidrofílico comprende
agarosa, y combinaciones de colágeno-agarosa y
esponja de gelatina-agarosa. La esponja de gelatina
será denominada de aquí en adelante "espuma de gel".
El término agente biológico denota un organismo
vivo y sus productos, p. ej. proteínas, enzimas, hormonas,
polipéptidos, suero, anticuerpos, y antibióticos y también células
de ingeniería genética. Los agentes biológicos incluyen enzimas, p.
ej., glucosa oxidasa, complejo lactasa, microorganismos, p. ej.,
klebsiella aerogenes para la eliminación de amoniaco y urea,
agentes tróficos, incluyendo agentes tróficos producidos
recombinantemente, p. ej., hormona del crecimiento producida
recombinantemente, y agentes citotóxicos.
El término célula secretora incluye un islote
pancreático, aunque técnicamente, un islote pancreático no es una
célula secretora, sino, mayormente, un grupo de células secretoras
dispersadas por todo el páncreas y que comprende su porción
endocrina. En humanos, está compuesto de al menos cuatro tipos
diferentes de células secretoras: células alfa que secretan el
factor hiperglicémico, glucagón; células beta que son las más
abundantes (70%- 80%) y secretan insulina; células delta que
secretan somatostatina, y células de polipéptidos que secretan
hormona de polipéptidos.
Como se explicó previamente, el material
transplantado debe ser compatible con el hospedador. La agarosa
tiene una larga historia de uso en investigación biológica, y su
calidad está bien controlada. El colágeno es la proteína más
abundante en mamíferos, proporciona apoyo mecánico firme y sirve de
espacio biológico para la replicación de la célula, diferenciación,
organogénesis, desarrollo individual y reparación de heridas. El
colágeno tiene también buena biocompatibilidad. La espuma de gel es
no inmunogénica y ha sido utilizada extensamente en procedimientos
quirúrgicos. También es bien tolerada por las células
secretoras.
Los agentes biológicos, y preferiblemente, las
células secretoras, se aislan primero usando procedimientos bien
conocidos en la técnica. En una realización preferida, los islotes
pancreáticos se cultivan tanto a 4ºC, 24ºC, como a 37ºC antes de ser
macroencapsulados. Este método le permite a uno seleccionar sólo
islotes sobrevivientes tras el trauma del aislamiento. También, los
islotes se hacen menos inmunogénicos lo que da como resultado la
protección de las macrogotas a formar fibrosis.
En una realización de la invención, un agente
biológico, preferiblemente islotes pancreáticos, y más
preferiblemente aproximadamente 50.000-700.000
islotes pancreáticos, se suspenden en una solución acuosa de
colágeno, preferiblemente solución de atelocolágeno aproximadamente
al 0,5%-2%. El atelocolágeno se obtiene mediante el tratamiento del
colágeno con pepsina, que elimina telopéptidos antigénicos
responsables del entrecruzamiento intermolecular del colágeno.
Aproximadamente 0,5%-5% de agarosa, preferiblemente aproximadamente
1% se añade entonces a los islotes pancreáticos suspendidos para
formar islotes pancreáticos suspendidos en una mezcla de colágeno y
agarosa. La mezcla que contiene los islotes pancreáticos se
transforma entonces en una gota semisólida usando técnicas bien
conocidas en la técnica, preferiblemente mediante el goteo de la
mezcla en aceite mineral o en una capa de Teflon®. La gota
semisólida se transfiere entonces a un medio antibiótico, se lava, y
entonces se incuba bajo condiciones estándar para polimerizar el
colágeno, preferiblemente a 37ºC en una atmósfera de CO_{2}
humidificada al 5%, por lo cual se forma una macrogota de
colágeno-agarosa sólida.
En otra realización de la invención, un agente
biológico, preferiblemente islotes pancreáticos, y más
preferiblemente alrededor de 50.000-700.000 islotes
pancreáticos, se extienden sobre la superficie (3-5
cm) de un esponja de gelatina. La esponja de gelatina es entonces
enrollada en una esfera. Se vierte agarosa, 3%-5%, sobre la esfera
para formar una gota.
En aún otra realización de la invención, un
agente biológico, preferiblemente islotes pancreáticos, y más
preferiblemente alrededor de 50.000-700.000 islotes
pancreáticos, se colocan en una disolución de agarosa que contiene
alrededor de 0,5%-5% de agarosa, preferiblemente alrededor de 1% de
agarosa. La mezcla entonces se transforma en una macrogota poniendo
en contacto la mezcla con aceite mineral o teflón. La gota se
transfiere entonces a un medio antibiótico, se lava, y se incuba
durante la noche, preferiblemente a 37ºC en una atmósfera de 5%
CO_{2} humidificada.
En todas las realizaciones mencionadas, las
macrogotas se recubren uniformemente con agarosa, preferiblemente
mediante el rodamiento de la gota 3-4 veces en una
cuchara de Teflón que contiene aproximadamente
500-2.000 \mul de agarosa al 5%-10%. Similarmente,
el término macrogotas de agente biológico, como se usa aquí, denota
agentes biológicos macroencapsulados en forma de una gota.
Las macrogotas se podrían usar como un vehículo
para entregar el agente biológico al cuerpo donde el agente llevará
a cabo su conocida función. Más de un tipo de agente biológico se
podría encapsular en una gota. Por ejemplo, una macrogota puede
contener múltiples enzimas, tales como hemoglobina y glucosa
oxidasa. Tal gota puede ser administrada para eliminar bilirrubina.
Estas gotas se pueden usar tanto para la administración oral de
enzimas digestivas (complejo lactasa) como para la retirada
selectiva de aminoácidos indeseables del cuerpo. La encapsulación de
las enzimas también impedirá la degradación de la enzima en el
lumen. Además, los productos de genes recombinantes se pueden
entregar sin ningún problema usando la encapsulación como medio. Los
genes de K. aerogenes, por ejemplo, se pueden macroencapsular
en macrogotas para la eliminación de urea y amoniaco. Donde el
agente biológico es inmunogénico al hospedador la macrogota permite
la administración del agente biológico sin el uso de inmunosupresor
o con cantidades reducidas de inmunosupresor.
Las macrogotas secretoras se pueden usar para
tratar afecciones causadas por un problema de funcionamiento de las
células secretoras del sujeto, p.ej. diabetes dependiente de
insulina, desorden de deficiencia del factor de crecimiento, y
desórdenes hormonales, mediante el transplante de las macrogotas de
célula secretora en el sujeto. Las macrogotas se pueden insertar en
la localización apropiada para ese tratamiento particular. Por
ejemplo, las macrogotas que contienen hepatocitos se pueden
implantar en la cavidad abdominal para tratar enfermedades
relacionadas con hígado no funcional. Una aplicación preferida es
transplantar de 5-10 macrogotas de islote
pancreático, conteniendo cada una 50.000-700.000
islotes pancreáticos, en un paciente para tratar la diabetes
dependiente de insulina. Las macrogotas se pueden insertar en la
cavidad peritoneal.
Las macrogotas de célula secretora se
transplantan en un paciente en una cantidad suficiente para tratar
la afección. Una cantidad adecuada para realizar esto se define como
una "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad
eficaz". Las cantidades eficaces para este uso dependerán de la
gravedad de la afección, del estado general del paciente, de la ruta
de administración, del emplazamiento de las macrogotas y de si las
macrogotas de célula secretora se están administrando en combinación
con otros fármacos.
Las macrogotas secretoras se pueden usar para el
transplante alogénico y xenogénico en combinación con
inmunosupresores o, preferiblemente, sin inmunosupresores. En una
realización preferida, pacientes que tienen diabetes dependiente de
insulina crónica o aguda se tratan mediante xenotransplante de
islotes pancreáticos de animal, p.ej. porcino, bovino, murino, rata,
píceo, o cualquier otra especie apropiada en el paciente sin el uso
de inmunosupresores. Las macrogotas de célula secretora también se
pueden administrar en combinación con otros agentes terapéuticos,
p.ej. la comúnmente usada terapia de triple fármaco (ciclosporina,
azatioprina e hidrocortisona), rapamicina, desoxispergualina o
anticuerpos, para tratar la afección.
Las macrogotas también se pueden usar como un
medio para almacenar los agentes biológicos y preferiblemente
células secretoras durante prolongados períodos de tiempo. Para
mantener la viabilidad de los agentes biológicos, y preferiblemente
células secretoras, los agentes biológicos y preferiblemente
macrogotas de célula secretora se incuban hasta que se transplantan
en el animal.
Cuando las células secretoras son islotes
pancreáticos, las macrogotas de islote pancreático se incuban a una
temperatura de 24ºC o 37ºC.
Ejemplo
I
Los islotes pancreáticos se aislaron de ratas
mediante una modificación del método descrito en Gotoh et
al., Transplantation 40:437 (1985).
La solución de colagenasa (colagenasa Tipo XI,
Sigma Chemical, St. Luis, MO; 1 mg/ml que contiene 2 mg/ml de Sigma,
Tipo V, albúmina de suero bovino y CaCl_{2} 1 mg/ml) se inyectó en
el páncreas vía el conducto biliar común. (Gotoh et al.,
Transplantation 40:437 (1985), supra). El páncreas se
retiró y se recogió en un matraz mantenido en hielo. Una vez se
recogió el páncreas de 4 ratas, el matraz se colocó en un baño de
agua a 38ºC, durante 30 minutos. El tejido digerido resultante se
lavó 4 veces en HBSS (Solución Salina Balanceada de Hank) fría
(8ºC).
El tejido no digerido, nodos linfáticos grandes,
y otro material extraño se eliminaron mediante movilización repetida
del tejido, seguido de la retirada del sobrenadante. Los islotes
purificados se aislaron en un gradiente de Ficoll discontinuo
consistente en capas de Ficoll al 25%, 23%, 21% y 11%, preparadas en
solución Euro-Collins (Frescenius AG, Gluchen
Steinweg, Homburg V.D.H) y se centrifugaron a 2000 r.p.m. durante 16
minutos. Los islotes se recogieron de la interfase entre las capas
de Ficoll al 11% y al 21% y de la interfase entre las capas al 21% y
al 23%. Los islotes de cada fracción se agruparon y se lavaron
cuatro veces en solución HBSS que contiene suero de ternera fetal
al 10%.
Las células de islotes agrupados se
transfirieron entonces a placas petri que contienen medio completo
RPMI. i.e., medio 1640 RPMI frío (GIBCO, Grand Island, NY),
completado con HEPES 25 mM, suero de bovino fetal inactivado (al
10%), y solución antibiótica-antimicótica (1 ml/100
ml) que contiene: 100 \mug/ml de penicilina, 100 \mug/ml de
sulfato de estreptomicina, y 25 \mug/ml de anfotericina B. Se
identificó cualquier tejido restante acinar sin islote, vascular,
tubular, o nodo linfático con objeto de una disección al microscopio
y se eliminó cuidadosamente con una pipeta estéril de punta fina. Se
calculó la pureza final mediante tinción de la preparación del
islote con difeniltio-
carbazona.
carbazona.
Tras el aislamiento, los islotes se incubaron en
placas de plástico bacteriológicas (100 mm) que contienen 10 ml de
medio RPMI, a 37ºC, en una atmósfera humidificada que contiene
CO_{2} al 5%, durante 4 días. El medio se cambió cada día, y los
islotes entonces o bien se transplantaron directamente o se
macroencapsularon.
Ejemplo
II
1000 islotes pancreáticos obtenidos mediante el
método del Ejemplo I se lavaron cuatro veces en medio completo RPMI
como se describe en el Ejemplo I, menos el suero de ternera fetal.
Los islotes pancreáticos entonces se añadieron a un tubo que
contiene 50 \mul de solución atelocolágeno al 1% en fosfato
tamponado salino, para suspender los islotes pancreáticos. Se
añadieron entonces a la suspensión de islote
pancreático-colágeno 100 \mul de solución de
agarosa de baja viscosidad (Sigma Tipo XII) al 1% preparada o bien
en RPMI o en MEM (medio esencial mínimo), mantenida a 60ºC. El
contenido del tubo entonces se transfirió inmediatamente, como una
gota grande única; o bien a aceite mineral esterilizado, mantenido a
temperatura ambiente o a una capa de Teflón® . Tras un minuto, la
gota se hizo una macrogota semisólida que se transfirió entonces a
un medio antibiótico RPMI, a 37ºC. Las macrogotas se lavaron tres
veces con el mismo medio para eliminar todo el aceite. Finalmente,
se aclararon dos veces con medio completo (37ºC) y se incubaron toda
la noche a 37ºC en una atmósfera humidificada que tiene CO_{2} al
5%. Durante este período, el colágeno polimerizó y los islotes
pancreáticos reposaron sobre la fibra de colágeno.
Al día siguiente, las macrogotas sólidas se
transfirieron a una cuchara de Teflon® que contenía aproximadamente
1 ml de agarosa al 5% en RPMI o en medio MEM. Las macrogotas sólidas
entonces se rodaron en esta solución 2-3 veces para
recubrirlas uniformemente. Antes de que la agarosa solidificara, las
macrogotas se transfirieron a aceite mineral en una placa de Teflon®
para obtener macrogotas lisas. Tras 60 segundos, las macrogotas se
retiraron del aceite mineral y se lavaron 3 veces con medio
antibiótico RPMI y entonces dos veces con medio completo RPMI. Se
incubaron entonces toda la noche a 37ºC en una atmósfera
humidificada que tiene CO_{2} al 5%. Las macrogotas de islote
pancreático agarosa-colágeno recubiertas de agarosa
se muestran en las figuras 1 y 2.
Una pequeña pieza de esponja de gelatina (espuma
de gel), 3 mm^{2}, se empapó primero en medio completo de RPMI. El
medio fue escurrido y se dejó que la espuma de gel reposara durante
1 minuto. Mil islotes pancreáticos, preparados de acuerdo con el
Ejemplo 1, fueron lavados cuatro veces con medio antibiótico RPMI.
Entonces fueron suspendidos en 10 \mul de medio antibiótico RPMI.
Fueron transferidos mediante una pipeta de plástico de punta fina y
extendidos sobre la superficie de la espuma de gel. Tras 20
segundos, la espuma de gel fue enrollada en una esfera pequeña. Se
vertieron 50 \mul de agarosa al 5% sobre la superficie de la
esfera para crear una macrogota de islote pancreático.
Para cubrir uniformemente la macrogota con
agarosa al 5%, se añadieron 500 \mul de agarosa al 5% a la
macrogota en una cuchara de Teflón© y se enrrolló
3-4 veces. Antes de que la agarosa solidificara, la
macrogota se transfirió sobre aceite mineral, y el platillo se hizo
rotar para obtener una superficie lisa en la macrogota. La macrogota
se lavó 3-4 veces en medio antibiótico RPMI y
entonces se enjuagó 2 veces con medio completo RPMI. Se incubó
durante la noche antes de ser usado para el transplante.
Mil islotes pancreáticos obtenidos por el método
del Ejemplo I se lavaron primero 4 veces en medio antibiótico RPMI.
Los islotes pancreáticos se transfirieron a un tubo que contenía 50
\mul de medio antibiótico RPMI y se suspendieron en él. Se
añadieron entonces al tubo 100 \mul de solución de agarosa al 1%.
El contenido completo del tubo se transfirió inmediatamente, con una
gran gota única, a o bien aceite mineral esterilizado o a una hoja
de teflón. Tras 1 minutos, la gota solidificó en una macrogota. La
macrogota se transfirió a medio antibiótico RPMI y se mantuvo a
37ºC. El aceite se retiró entonces lavando la macrogota 3 veces con
el mismo medio, y a continuación enjuagando 2 veces con medio
completo RPMI. Las gotas se incubaron durante la noche a 37ºC en una
atmósfera humidificada que tenía CO_{2} al 5%.
Al día siguiente, estas gotas fueron
transferidas a una esponja de Teflón© que contenía 1 ml de agarosa
al 5% en o bien RPMI o en medio MEM. Para recubrir las macrogotas
uniformemente con agarosa, las gotas se hicieron entonces rodar
suavemente en agarosa 2-3 veces. Entonces fueron
transferidas a aceite mineral, en un platillo de teflón, antes de
que la agarosa solidificara. Tras 60 segundos, las gotas fueron
retiradas del aceite mineral y lavadas 3 veces en medio antibiótico
RPMI y 2 veces en medio completo RPMI. Las gotas fueron entonces
incubadas durante la noche.
Ejemplo
III
Los ratones usados eran machos de razas C57BL/6
y BALB/c. Los ratones destinatarios se hicieron diabéticos mediante
una inyección i.v. única de estreptozotocina
(170-200 mg/kg).
Los niveles de glucosa en plasma sin ayunar se
determinaron antes de la inducción de diabetes. Todos los niveles de
azúcar en sangre en los ratones destinatarios se monitorizaron vía
muestras de sangre de vena de cola con un ExacTech Pen Sensor. Sólo
se usaron aquellos ratones con nivel de glucosa en suero >400
mg/dl el día del transplante.
Se usaron como donantes para el xenotransplante
ratas Furth Wistar.
En el momento del xenotransplante, las
macrogotas de islote pancreático del Ejemplo II se transfirieron
suavemente a placas separadas que contienen medio antibiótico RPMI.
Para eliminar todas las proteínas del suero, el medio se cambió tres
veces. Los ratones destinatarios diabéticos se anestesiaron con
avertina. Se hizo una incisión lineal central para introducir una
macrogota de islote pancreático única en la cavidad peritoneal
libre. Se hizo un cierre de doble capa de la incisión con una sutura
hidrófila. Los ratones de control recibieron o bien una macrogota
vacía i.p. (intraperitonealmente), islotes pancreáticos libres i.p.,
o una macrogota vacía junto con islotes pancreáticos donantes
libres.
Tras el transplante, se chequeó diariamente o en
días alternos cada glucosa en sangre de los destinatarios hasta que
alcanzó el intervalo normal; después de eso la glucosa en sangre se
chequeó sólo 2-3 veces cada semana. Los transplantes
se consideraron técnicamente satisfactorios si la glucosa en suero
era < 200 mg/dl y se mantenía así en sangrados consecutivos. Un
transplante se consideró rechazado si la concentración de glucosa en
suero subía por encima de 200 mg/dl tras un período de normoglicemia
transitoria. Los transplantes se consideraron fallidos o llegados a
"primario no funcional" si la glucosa en sangre nunca se hizo
normal (p. ej., permaneció regularmente > 200 mg/dl).
Aproximadamente a los 70-84 días
de postimplantación, se llevaron a cabo ensayos de tolerancia de
glucosa. Se inyectó intraperitonealmente solución de glucosa (1,0
g/kg de peso del cuerpo) en ratones que habían estado ayunando
durante 6 horas (9 am-3 pm). Se tomaron muestras de
sangre antes y después de la inyección (0, 30, 60, y 120 minutos)
para determinar los niveles de glucosa en plasma usando los ExacTech
Pen Sensor.
Para la comparación, se llevaron a cabo ensayos
de tolerancia de glucosa en ratones C57BL/6 y BALB/c normales, en
ratones C57BL/6 y BALB/c inducidos con estreptozotocina en los que
no se habían transplantado islotes pancreáticos, y en ratones BALB/c
diabéticos inducidos con estreptozotocina en los que se habían
transplantado islotes pancreáticos libres en la cápsula renal
(ratones "KCT").
Los experimentos de control se llevaron para
asegurar que el estado euglicémico en ratones diabéticos se estaba
consiguiendo vía los islotes pancreáticos macroencapsulados y no vía
las propias macrogotas. Se prepararon, por lo tanto, macrogotas
vacías de agarosa-colágeno recubiertas de agarosa de
la misma manera que las gotas del Ejemplo II.
Tras la implantación de las macrogotas de islote
pancreático, los cambios observados en el nivel de glucosa en plasma
sin ayunar de ratones C57BL/6 inducidos con estreptozotocina,
STZ-diabéticos, se muestran en las figuras 3 y 4.
Los destinatarios de las macrogotas de islote pancreático de
agarosa-colágeno recubiertas de agarosa y las
macrogotras de islote pancreático de espuma de gel mantuvieron un
estado normoglicémico durante más de 60 días y, durante este
período, el peso del cuerpo de estos ratones aumentó una media de 3
gramos. Cuando se transplantaron las macrogotas de islote
pancreático de agarosa recubiertas de agarosa, 2 de 6 animales se
convirtieron en normoglicémicos tras 21-33 días
después del transplante (Figura 5) y permanecieron euglicémicos
después. Todos los otros animales transplantados no consiguieron un
estado euglicémico. Las macrogotas vacías (n=6) no afectaron a la
glucosa en sangre.
Cuando los islotes pancreáticos libres se
implantaron intraperitonealmente, 6 de 7 animales transplantados se
hicieron normoglicémicos 1 día después del transplante; sin
embargo, mantuvieron este estado durante sólo 3-10
días (figura 6). Cuando los islotes pancreáticos libres se
transplantaron con gotas vacías hechas de macrogotas de
agarosa-colágeno recubiertas de agarosa o macrogotas
de espuma de gel recubiertas de agarosa, todos los animales se
hicieron normoglicémicos en 24 horas y permanecieron así durante más
de 12 días (figura 7). Posteriormente, todos los animales se
hicieron hiperglicémicos. Los animales que contenían macrogotas
vacías no provocaron ninguna reacción tisular durante los 90 días de
seguimiento.
Los resultados obtenidos tras llevar a cabo los
ensayos de tolerancia de glucosa se presentan en la figura 8. En
ratones BALB/c y C57BL/6 normales y ratones "KCT", la glucosa
en plasma alcanzó su nivel máximo en 30 minutos y volvió a niveles
de línea base cerca de 120 minutos.
Similares resultados se obtuvieron cuando se
ensayaron los islotes pancreáticos macroencapsulados y los islotes
pancreáticos no encapsulados transplantados en la cápsula renal.
Los resultados de estos experimentos demuestran
que las macrogotas de islote de agarosa-colágeno
recubiertas de agarosa, las macrogotas de islote pancreático de
espuma de gel-agarosa recubiertas de agarosa y las
macrogotras de islote de agarosa recubiertas de agarosa, muestran
las propiedades requeridas para un órgano artificial híbrido. Aunque
los tres tipos secretaron insulina con éxito, las macrogotas de
colágeno-agarosa recubiertas de agarosa y las de
espuma de gel-agarosa recubiertas de agarosa son más
adecuadas como órganos artificiales biohíbridos debido a la
uniformidad de resultados obtenida en el mínimo número de animales
transplantados. Es más, ninguno de los tres tipos de gotas
mostraron efectos adversos. Las macrogotas permanecieron libres en
el peritoneo sin mostrar reacción tisular ni adhesión a órgano
alguno. Así, estos islotes pancreáticos biohíbridos llevan a cabo su
función tan eficazmente en las gotas macroencapsuladas como en su
hábitat natural, el páncreas.
En todos los ratones, la glucosa en plasma
alcanzó su nivel máximo en 30 minutos y volvió a niveles de línea
base cerca de 120 minutos.
Ejemplo
IV
Las gotas macroencapsuladas preparadas según los
Ejemplos I(A), (B) y (C), que se incubaron durante 4 semanas
a 37ºC en medio RPMI completo, se ensayaron para evaluar sus
propiedades de conservación duradera in vivo e in
vitro. Se encontró que los islotes pancreáticos
macroencapsulados que se incubaron durante 4 semanas eran similares
funcionalmente a los que se incubaron durante un día.
Este ejemplo demuestra que el método de
macroencapsulación según la presente invención se puede usar para la
conservación de células secretoras, y preferiblemente para la
conservación de islote pancreático.
Claims (14)
1. Un método de producir una macrogota de célula
secretora de agarosa recubierta de agarosa que comprende:
(a) suspender células secretoras en agarosa,
(b) formar una macrogota a partir de dichas
células secretoras suspendidas del paso (a),
(c) incubar dicha macrogota de la etapa (b) en
aire humidificado,
(d) recubrir dicha macrogota del paso (c) con
agarosa para formar una macrogota de célula secretora de agarosa
recubierta de agarosa.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
el paso (d) comprende hacer rodar dicha macrogota sólida del paso
(c) en agarosa al 5%, poner en contacto dicha macrogota sólida
rodada con aceite mineral, y lavar dicha macrogota rodada para
formar dicha macrogota de célula secretora de agarosa recubierta de
agarosa.
3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el
que dichas células secretoras son islotes pancreáticos,
preferiblemente en el que dichos islotes pancreáticos son islotes
pancreáticos humanos, islotes pancreáticos bovinos o islotes
pancreáticos porcinos.
4. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha macrogota contiene desde
aproximadamente 50.000 a aproximadamente 700.000 islotes
pancreáticos.
5. Una macrogota de célula secretora de agarosa
recubierta de agarosa, obtenible por un método según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4.
6. La macrogota de célula secretora de agarosa
recubierta de agarosa de acuerdo con la reivindicación 5, en la que
dicha célula secretora es un islote pancreático.
7. La macrogota de célula secretora de agarosa
recubierta de agarosa de acuerdo con la reivindicación 6, en la que
dicha célula secretora es un islote pancreático humano, un islote
pancreático bovino o un islote pancreático porcino.
8. Uso de una cantidad terapéuticamente eficaz
de una macrogota de célula secretora de agarosa recubierta de
agarosa, obtenible por un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, para la preparación de un medicamento para
tratar un paciente que tiene una afección causada por un problema de
funcionamiento de células secretoras.
9. El uso de la reivindicación 8, en el que
dicha afección es diabetes dependiente de insulina.
10. El uso de la reivindicación 9, en el que
dicha célula secretora es un islote pancreático, preferiblemente un
islote pancreático humano, un islote pancreático bovino o un islote
pancreático porcino.
11. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
8 a 10, en el que se usan de aproximadamente 5 a aproximadamente 10
macrogotas, y cada macrogota contiene desde aproximadamente 50.000 a
aproximadamente 700.000 islotes pancreáticos.
12. Un método para conservar células secretoras,
que comprende:
(a) formar macrogotas de célula secretora de
agarosa recubiertas de agarosa, obtenibles por un método según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y
(b) incubar dichas macrogotas de célula
secretora.
13. El método según la reivindicación 12, en el
que dicha célula secretora es un islote pancreático.
14. El método según la reivindicación 13, en el
que dicho islote pancreático se incuba a 24ºC o 37ºC.
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