JPH11508477A - 新規の人工膵臓 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 寒天ゲルを含む長球形の半透性膜内にカプセル化した、インスリンを生成する能力を持つ一つまたはそれより多くの生理的に活性な生きたランゲルハンス島細胞を含む人工膵臓を、ここに記載する。さらに、寒天ミクロビーズの製造方法、組織の移植方法および人工膵臓のための再植え付け方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 新規の人工膵臓 発明の背景 本発明は、人工臓器、より具体的には、寒天ミクロビーズを含む人工膵臓装置 に関する。 従来技術では、カプセル化技術は豊富にあるが、置換を意図した生体内臓器の 機能に似せたカプセル化技術は未だにない。このように、インスリン配送の場合 、存在するカプセル化技術は、アルギネート半透性膜にカプセル化したランゲル ハンス島細胞を用いている。そのような技術の欠点は、以下の通りである。 第一に、アルギネートは、イオン化メカニズムによってゲル状になる。ポリマ ーは、二価または三価のカチオンと反応し、ポリマー構造がイオン架橋してゲル 構造を構成する。このようにして形成されたゲルは熱に安定であるが、それらの イオン性のため、架橋イオンを隔絶する物質によって、不安定になる可能性があ る。 第二に、アルギネートビーズは、通常、ポリ−Ｌリジンでコーティングするこ とによってさらに加工して、アルギネートそれ自身の回りに、カプセル化物質を 免疫分離するための半透性の殻を形成させる。ほとんどの場合、アルギネートの 芯は、その後、溶かされ、その結果、アルギネートビーズは、実質上ポリ−Ｌ− リジンカプセルとなる。しかしながら、ポリ−Ｌ−リジンの使用は、甚だしい凝 集およびビーズの密集の原因となり、細胞が機能を停止する原因となることが分 かっている。さらに、ポリ−Ｌ−リジンは、それ自身が反応性を持ち、結果とし て宿主の拒絶反応を引き起こす免疫学的拒絶反応および生体不適合性、ならびに 繊維組織の過増殖および所望されないビーズの凝集による細胞機能の減少を招く 。 第三に、アルギネートビーズは、カルシウムまたはバリウムを隔離する物質を 含む環境内では溶解する可能性がある。 第四に、アルギネートビーズは、所望されない生物応答、とりわけ、サイトカ インの遊離および繊維組織の増殖を促進することが報告されている。とりわけ、 これらの応答がアルギネート自体によるのか、アルギネートの特定の型によるも のか、上に指摘したようにコーティングされたポリ−Ｌ−リジンによるものか、 またはその他の要因によるものかは、目下検討中である。 第五に、前述の問題とは別に、アルギネートビーズが長期間安定であることは 、疑問を生み出す。 最後に、移植されたアルギネートビーズが一旦機能を停止するまたは医療的に 逆効果を導き始めても、それらを回収することはできない。 それ故、今なお、宿主の免疫システムに注意しながら、インスリンの生成の可 能な生きた膵臓細胞をカプセル化する方法が必要である。発明の概要 前述された必要性を満足させるものとして、寒天ゲルを含む長球形の半透性膜 内にカプセル化した、インスリンの生成が可能な一つまたはそれより多くの生理 的に活性な生きたランゲルハンス島細胞を含む人工腎臓を提供することによって 、エレガントで新しい方法が見いだされた。該人工膵臓は、中空繊維を含む拡散 チャンバーまた灌流チャンバー内に据え付けることができる。 さらに、本発明は、溶融した寒天内にランゲルハンス島細胞を懸濁し、さらに この溶液を疎水性の相内に乳化させて、疎水性の相内に懸濁させた小さな液体小 滴の乳濁液を形成する段階を含む、カプセル化法を提供する。その後、油を冷却 するとゲルに小滴化し、結果として寒天ゲルのミクロビーズが形成される。 最後に、本発明は、前述のカプセル化段階、次に哺乳動物の体内に該カプセル 化ビーズを導入する段階を含む、組織の移植方法を提供する。図面の簡単な説明 図１は、新しい寒天ミクロビーズカプセル化方法の概略図を示す。発明の詳細な説明 本発明は、一つの主な態様において、従来技術を転換する、即ちアルギネート ビーズではなく寒天を使用する。本発明では、純粋な即ちアガロースから純粋で ない種類までの範囲の種類またはグレードの異なるの寒天すべてを想定している 。異なるタイプの寒天は、それらのゲル化温度およびその結果得られるゲル強度 が、互いに異なる。海草から抽出された場合、寒天は、ゲル化フラクションであ るアガロース、およびアガロペクチン、その他に不純な混合物を含む非ゲル化フ ラクションからなる。次に、さらなる加工を行うことによって、寒天を分離、抽 出または精製することができる、即ちアガロペクチンおよびその他の不純物から アガロースを分離することができる。本発明は、すべてのタイプの寒天を包含し 、そのゲル化温度またはゲル強度によって制限されない。 寒天ビーズは、前述したような従来技術の問題を解決したばかりでなく、それ らは、以下に記載するような数多くの利点をもたらす。 寒天は、アルギネートビーズのようなイオンのメカニズムではなく、熱のメカ ニズムによってゲル化する。特定のイオン溶液に溶けないと言う点で、この相違 は、寒天ビーズに化学的安定性を与える。また、前述の相違は、寒天の加熱溶液 の水中での冷却が、ポリマーの螺旋状のコイルセグメントをからみ合わせる原因 となり、結果として三次元のゲル構造を形成させることになると言う点で、熱安 定性を与える。また、非常に特別な三次元構造は、ヒステリシスという有利な性 質を与える、即ち、融解温度がゲル化温度よりかなり高くなる場合である。例え ば、細胞は、摂氏約４０度で溶液内に入れることができ、そして、この溶液は、 摂氏３７度以下になるまでゲル化せず、また摂氏約８０度以上になるまで溶解し ないであろう。このように、寒天という環境は、アルギネートよりも化学的によ り安定している。 本発明の新しいカプセル化方法は、一般的には、ランゲルハンス島細胞を溶解 した寒天に懸濁する段階、および該溶液を疎水性の相に乳化させて、疎水性の相 に懸濁された微小液体小滴の乳濁液を形成させる段階を含む。次に、油を冷却す ると、ゲルが小滴化され、結果として寒天ゲルミクロビーズが形成される。この 形状では、寒天ミクロビーズは、疎水性の相から容易に収集され、洗浄すること ができる。この方法では、都合良く、比較的大きなゲルビーズを比較的大量に製 造することが可能である。例として、これらに限定されるわけではないが、新し い方法では、直径約５０から約１００ミクロンの範囲のミクロビーズが約５から 約５０ｍｌ得られる。 この新しい方法を、図１に図示する。最初に、寒天溶液、ランゲルハンス島細 胞、および必須ではないが望ましくは界面活性剤を、混合する。寒天は、摂氏８ ０度以上、溶解するまで加熱されるが、ランゲルハンス島を加える前に、摂氏約 ３５度から約４５度にまで冷却される。その結果得られた寒天、細胞および所望 であれば界面活性剤の混合液を、疎水性の相に加える。疎水相の温度は、乳化さ せている間中、寒天の混合液を液体に維持するために十分暖められねばならない が、細胞を傷つけるほど熱くしてはならない。今日の方法での望ましい温度の範 囲は、摂氏約４２度から約４３度である。得られた混合液を乳化し、冷却する。 乳化およびビーズに形成されたサンプルが混和しない状態ならば、任意の乳化媒 質を用いることができる。例として、これらに限定されるわけではないが、シリ コーン流体、植物油、鉱物油等を上げることができる。シリコーン流体の内では 、ポリジメチルシロキサンが最も望ましい。乳化は、寒天のゲル化点より低い温 度、数値で言えば、純粋でない寒天では摂氏約３５度から約３９度であり、純粋 な寒天、即ちアガロースでは摂氏約８から約４２度である、で小滴化することに よって得られる。シリコーン流体は細胞の生命を約１０から３０分間維持する酸 素のような栄養を含まないため、今日の方法では、細胞をシリコーン流体に晒す 時間が制限される。乳濁液を、摂氏約１−１０度に冷却する。次に、ビーズを収 集し、洗浄する。ビーズは、油相からゲル化ビーズを分離するために十分な速度 で遠心分離される。この段階は、望ましくは、細胞が栄養培地外にある時間を可 能な限り最少にするように迅速に行うのが望ましい。例として、限定するわけで はないが、約７００から約１５００ｒｐｍの範囲の速度、約２から約１０を想定 している。個々の速度および時間は、用いられる遠沈管の大きさおよび作り出さ れるビーズの大きさによるであろう。収集および相の洗浄中、培養液を加えるこ とができる。 具体的には、新規のカプセル化方法は、以下の予備段階を含む。最初に、無菌 のお湯中に無菌の寒天粉末を溶解することによって、１−３％の組織培地グレー ドの寒天溶液を調製する。得られた寒天溶液を、二倍濃度の培養液で５０％に希 釈し、そして、用いるまで摂氏約４２度に保つ。別の方法として、寒天溶液が等 張であるならば、寒天溶液を培養液中に調合することもでき、そうすることによ って細胞は死滅しない。乳化媒質は無菌ろ過され、水浴中で摂氏約４２−４３度 に前もって暖められる。例として、限定するわけではないが、乳化媒質は、シリ コーン、鉱物油または植物油等を含むことができる。 寒天ビーズ中に閉じこめられた膵臓細胞を、集めて遠心分離すると、小さい組 織ペレットが形成される。とりわけ、本発明では、カプセル化は任意の細胞の型 について想定しており、以下の細胞の型：ランゲルハンス島、肝細胞、ドーパミ ン分泌細胞、抗体分泌細胞、ハイブリドーマ細胞および治療薬を分泌する能力を 持つその他の細胞の型：を用いることに、本発明を限定するものではない。 細胞をカプセル化する、即ち乳化段階での小滴の崩壊を促進するために、任意 の生理的に耐えうる界面活性剤を用いることができる。特に、熱で不活性化した ウマおよび子牛血清が最も望ましいが、その場合でさえ、任意の型の血清を用い ることができる。界面活性剤を用いるならば、使用前、摂氏約４２度に保ってお かねばならない。 氷浴を準備し、準備状態に保つ。同様に、ビーズ洗浄段階で用いるために、培 養液または等張の塩水を、室温に保っておく。例として、限定するわけではない が、以下の培養液：塩水、最小必須培地（Ｍｉｎｉｍｕｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ダルベッコの修正イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍ ｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）、１９９培地（Ｍｅｄｉｕｍ １ ９９）、ロスウェルパーク記念研究所培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍ ｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍｅｄｉｕｍ）、クレブス／リンゲルス（Ｋ ｒｅｂｓ／Ｒｉｎｇｅｒｓ）溶液：が挙げられ、これらはすべて「細胞培養科学 者のためのカタログとハンドブック（Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏ ｋ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ）」と題されたＪ ＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ’Ｉｎｃ．のカタログに記載されている。最も望 ましいのは、等張の塩水および上記カタログ中に記載されているアルファ最小必 須培地である。 設備に関しては、攪拌翼、望ましくは２枚羽根の攪拌翼においては、空気の流 入を防止しつつ、液体寒天を乳化させるのための適切な流れの場を引き起こすた めに用いられる。望ましい２枚羽根の攪拌翼に加えて、二枚の羽根は、一つの攪 拌翼がシャフトの端にあり、もう一つが最初の攪拌翼の長さの約半分の距離だけ 上方にあるように、互いに直角に攪拌翼シャフトに取り付けられている。組み立 てられた攪拌翼は、使用前に殺菌されることが好ましいため、ステンレススチー ルの駆動軸および加熱殺菌できる攪拌翼の羽根を用いることが、推奨される。 さらに、本発明では、攪拌翼の運転を約６０から約２３００ＲＰＭ、 望まし くは約３８０から約８００ＲＰＭの範囲の好ましい速度に制御できるミキサーの 使用を、計画している。望ましくは、該ミキサーには、デジタルのＲＰＭディス プレーもまた、取り付けられるであろう。ミキサー頭部は、頑丈なレトルトスタ ンドに垂直に載せられていることが望ましい。 攪拌翼の羽根のおおよそ１．５−２．０倍の直径の乳化容器が推奨される。氷 ／水浴には、乳化容器より直径で３−４ｃｍ大きい容器が推奨される。両容器は 、ミキサー頭部と同じレトルトスタンドにリング留め金で取り付けられることが 望ましい。このような方法で、攪拌翼を乳化容器内に取り付け、さらに、乳化容 器を取り囲むように氷／水浴を取り付けることができる。 カプセル化法それ自体に目を転ずると、カプセル化は、無菌状態の下で行われ るのが望ましい。あくまで、設備の部品すべてが、殺菌されねばならず、細胞、 装置および試薬を取り扱う場合も、標準的な無菌技術を適用しなければならない 。 乳化媒質は、摂氏４２度で乳化容器に移される。攪拌翼の組立は、空気の流入 を防ぐために油脂表面から充分な隙間があり、また容器の底から約１−１．５ｃ ｍの隙間があるように、油脂相内に沈めた形で行う。攪拌翼の回転が開始される 。回転速度は、約３８０から約８００ＲＰＭに設定され、安定した流れパターン を発生させる。包埋される細胞を、約５から約５０ｍｌの溶けた寒天と、摂氏４ ２度で混合する。約０から約２０％の範囲の血清、２０％が最も好ましい、を界 面活性剤として加える。得られた液体の寒天／細胞懸濁液を、乳濁液に形成する 。ひとたび均質の乳濁液が得られたならば、油脂相全体を埋没させるように、氷 ／水浴を乳化容器の回りに固定する。その後、乳化容器を約１０−２０分間、ま たは質的に言えば、寒天／細胞小滴が固体ゲルビーズを形成するまで、冷却する 。 ひとたびビーズがゲル化してきたならば、冷却期間中に、完全ではないが安定な ゲル化ビーズが形成されてきたら、細胞またはビーズへの剪断損傷を防御するた めに、攪拌翼の回転速度を約３００ＲＰＭに減少させると良い、が必ずしもそう しなけらばならないわけではない。いったんビーズが完全にゲル化されたならば 、攪拌翼を停止させ、さらに乳化容器から取り外す。 油および寒天／細胞の懸濁液を遠沈管にデカントし、懸濁液容量全体の約２５ から約７５％の容量の培養液または等張の塩水を加える。その後、水相が油脂相 から分離されるまで、質的に言えば、約３から５分間、約８００から約１０００ ＲＰＭで、懸濁液を遠心分離する。ビーズは、水相内、遠沈管の底に濃縮される ので、それらをピペットで集めることができる。その後、ビーズは、培養液また は塩水での希釈、さらに約２分から約４分間、約５００から約１０００ＲＰＭで の遠心分離を繰り返すことによって、数回より多い回、洗浄される。得られた洗 浄ビーズは、生体内または生体外での適用に用いるために準備される。 前述の方法は、生存細胞を含む球形の寒天ビーズを製造する。ビーズのサイズ およびサイズ分布は、次の運転パラメーター：攪拌翼回転速度、攪拌翼および容 器の幾何学的関係、疎水相および粘度、寒天の濃度および粘度、界面活性剤濃度 、温度／時間のプロトコール等：を制御することによって調節することができる 。このように、例えば、より速く回転させると、サイズ分布がより狭い、より小 さいビーズがえられ、これに対して、より遅く回転させると、より大きなビーズ が得られるであろう。攪拌翼および容器の幾何学的関係は、剪断力によって細胞 が傷つけられるので、剪断される可能性の高い領域が最小限になるようにするこ とが重要である。二枚刃の攪拌翼は、乳濁液内への空気の侵入を防ぐので、望ま しい。丸形容器もまた、剪断領域を最小にするために、望ましい。攪拌翼の直径 と容器の直径との比率は、適当な流れのパターンを確保するために重要である。 寒天の濃度および種類は、得られたビーズの強度および透過選択性を決定するで あろう。さらに、寒天濃度は、如何に簡単に寒天が乳濁液内で個々の小滴に分散 するかに影響する粘度を決定するであろう。界面活性剤は、液体寒天の表面張力 を小さくし、従って、個々の小滴への分散を促進する。界面活性剤の濃度が高く なるほど（界面活性剤の濃度の増加による影響がなくなる以上の濃度のある点ま で） 、小滴はより簡単に形成される。温度および時間のパラメータは、カプセル化の 過程を通して細胞の生存を確保するために重要である。用いる温度は、乳濁液を 寒天のゲル化温度以下に冷却するために必要とされる時間を決定するであろう。 しかしながら、前述したのは、運転パラメータを制御する場合に考慮される、こ の技術分野で良く知られている数多くの因子の内のわずかな例示である。 人工臓器または薬剤の配送装置に用いるための、細胞を包埋する寒天ビーズの 最も広く用いられる大きさは、直径約５０から約１０００μｍの範囲である。前 述の方法では、この範囲のビーズが一貫して製造される。 前述の方法によって収集されたビーズは、哺乳動物体内に注射によって直接移 植される、またはさらに免疫分離用膜内にカプセル化することができる。ビーズ を直接移植するか、またはさらに膜内にカプセル化するかのいずれかによって、 異なる免疫分離用予備措置が必要となる。ビーズを直接移植するならば、免疫抑 制療法を用いない限り、ゲルの分子量カット値を制御する必要がある。免疫抑制 療法を用いないならば、免疫攻撃を避けるために、１００，０００ダルトンより 小さい分子量カット値が望ましい。このような分子量カット値の調整は、ビーズ を作るために用いる寒天の濃度を調節することによって、行うことができる。よ り高い濃度は、より固い膜を与える。本発明では、約０．２から約５．０％重量 ／容量の範囲の寒天濃度を計画している。特に、低い寒天濃度で作られたビーズ は、浸透選択性膜によって取り囲まれるカプセルに似せるために、より高い濃度 の寒天で再度コートすることができる。そうする場合には、外側コーティングは 、前述の寒天濃度の範囲内にするべきである。 もし、寒天ミクロビーズを、免疫分離膜でさらにカプセル化する予定であるな らば、その後、免疫応答は、第二の膜の性質によって制御される、即ち、ビーズ の分子量カット値は、１００，０００ダルトンに限定されず、より高くすること 、またはより低くすることもできる。例として、これらに限定するわけではない が、次の免疫分離膜：例えばストローまたはポーチの形状を持つ機械膜；ポリア クリロニトリル／ポリビニルクロリド、ポリスルホン、酢酸セルロース、ヒドロ キシエチルメタクリレート／メチルメタクリレート等のような合成膜：で作られ る。拡散チャンバーまたは灌流チャンバーのような機械装置内に注入した場合、 装置 を外科的に体内に移植する。特に、植え付けは、装置移植の前または後いずれに 行うこともできる。 本発明は、任意の一つの装置に限定されるわけではないが、出願人は、特に、 拡散、灌流および灌流／限外ろ過装置を計画している。拡散装置では、出願人は 、体内に移植した場合に、拡散によるインスリン、グルコースおよび栄養素の輸 送を可能にするために、体組織と接触する半透性膜内に入れられた寒天ビーズを 含む装置を想定している。該膜は、ストロー、ディスク、ポーチ等の形状であっ て良い。より具体的には、以下の参照論文に記載された装置を限定する目的では なく例示する目的で挙げることができ、該論文は、参照として取り入れられる： Ｌａｎｚａ ＲＰ，Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＳＪ，Ｃｈｉｃｋ ＷＩ，「免疫分離を 伴うランゲルハンス島の移植（Ｉｓｌｅｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｏｉｓｏｌａｔｉｏｎ）」、Ｄｉａｂｅｔｅｓ，４１，１ ５０３−１５１０，１９９２．；Ｇｕ ＹＪ，Ｉｎｏｕｅ Ｋ，Ｓｈｉｎｏｈａ ｒａ Ｓ，Ｄｏｉ Ｒ，Ｋｏｇｉｒｅ Ｍ，Ａｕｎｇ Ｔ，Ｓｕｍｉ Ｓ，Ｉｍ ａｍｕｒａ Ｍ，Ｆｕｊｉｓａｔｏ Ｔ，Ｍａｅｔａｎｉ Ｓ，Ｉｋａｄａ Ｙ ，「メッシュ−補強ポリビニルアルコールバックを用いた人工腎臓の移植（Ｘｅ ｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｐ ａｎｃｒｅａｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｅｓｈ−ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ ｐｏｌｙ ｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｂａｇ）」、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａ ｔｉｏｎ、３（増補１）、Ｓ１９−Ｓ２１、１９９４；Ａｕｎｇ Ｔ，Ｋｏｇｉ ｒｅ Ｍ，Ｉｎｏｕｅ Ｋ，Ｆｕｊｉｓａｔｏ Ｔ，Ｇｕ Ｙ，Ｂｕｒｃｚａｋ Ｋ，Ｓｈｉｎｏｈａｒａ Ｓ，Ｍｉｔｓｕｏ Ｍ，Ｍａｅｔａｎｉ Ｓ，Ｉｋ ａｄａ Ｙ，Ｔｏｂｅ Ｔ、「メッシュ−補強ポリビニルアルコールヒドロゲル チューブを用いた人工腎臓からのインスリンの放出（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｌｅ ａｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｐａｎｃｒｅａｓ ｕｓ ｉｎｇ ａ ｍｅｓｈ ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏ ｈｏｌ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｔｕｂｅ）」、ＡＳＡＩＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，３９ ，９３−９６，１９９３；Ｃｏｌｔｏｎ ＣＫ，「移植可能なバイオハイブリッ ド人工臓器（Ｉｍｐｌａｎｔａｂｌｅ ｂｉｏｈｙｂｒｉｄ ａｒｔｉｆｉｃｉ ａｌ ｏｒｇａｎｓ）」、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，４（４），４ １５−４３６，１９９５；およびＨｉｌｌ ＲＳ，Ｓｃｈａｒｐ ＤＷ，Ｊｏｈ ｎｓｏｎ ＲＣ，Ｎｅｕｅｕｎｆｅｌｄｔ Ｓ，Ｈａｇｅｒ ＳＲ，Ｈｅｇｒｅ ＯＤ，Ｌａｃｙ ＰＥ、「巨大カプセル化した異種のラットランゲルハンス島 の移植の後に起こるマウスでの糖尿病の回復（Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｄｉａ ｂｅｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｒａｎｓｐｌ ａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｘｅｎｏｇｅ ｎｅｉｃ ｒａｔ ｉｓｌｅｔｓ）」、Ｆｉｆｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ ｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｐａｎｃｒｅａｓ ａｎｄ Ｉｓｌｅｔ Ｔｒａ ｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，Ｐ．９３，１９９５。 出願人が計画した典型的な灌流装置は、アクリルの囲いの内側が膜からなる。 血液は膜の中を軸方向に流れ、そしてインスリンは、ランゲルハンス島によって 、膜を通って血液内へ、放射状に分泌される。この灌流／限外ろ過装置は、装置 の外側、腹膜内へのインスリンの拡散を可能にするように、装置の囲い内にさら なる膜の開口部または窓を含む改良型灌流装置である。 灌流装置の詳細な例は、「新規の人工膵臓」と題された出願人の同時係属特許 出願、出願番号０８／４８８，０３３であり、ここに参照として取り入れられ、 特別な適用性を提供する。該人工膵臓灌流装置は、多孔性、または分子量カット 値が約２０，０００ダルトンから約２００，０００ダルトンの範囲である中空繊 維を含む。中空繊維は、一方の端が血液を受け取るための血管につながれており 、さらにもう一方の端が患者に該血液を戻すための血管につながれている。ラン ゲルハンス島細胞を中空繊維の回りに植え付ける。ランゲルハンス島および宿主 を免疫反応物質から守るに充分小さい穴の大きさを持つアクリルの囲いの中に、 繊維およびランゲルハンス島を閉じこめる。 使用時、新規の腎臓灌流装置は、限外ろ過および対流輸送が可能である。中空 繊維は限外ろ過に提供され、そして半透性の囲いは対流に提供される。このよう に、中空繊維を通る血流は、流れがランゲルハンス島のチャンバーから腹腔内お よび／または腹腔からランゲルハンス島のチャンバーに還流している間中、ラン ゲルハンス島への栄養素の定常供給を確実なものとし、それによってインスリン の輸送およびランゲルハンス島の応答が改善される。本発明の一つの実施態様で は、装置は、腹腔内に移植される。こうすることによって、インスリンは血液内 に分泌され、全身的に配達される、さらに、インスリンは肝静脈システム内に分 泌され、それによって肝臓に直接インスリンが配達されるであろう。そのような 二重の分泌経路の利点は、より良いインスリン／グルコース調節機構を確立する ことであり、このことは、次に、結果として起こる副合併症を減少させる。 この新規の機械的人工膵臓は、以下の方法で、本発明の新規のミクロビーズを 植え付ける、または再植え付けすることができる。再植え付けとは、機械装置が 、ひとたびインスリンを生成する能力を失っても外科的に除去する必要がなく、 新しいミクロビーズを該装置に再注入することができるので、外科的除去の必要 性を緩和することができることを意味する。 前述の機械的人工膵臓には、固体ゲルまたはゲルミクロビーズのスラリーを植 え付けることができる。固体ゲルを植え付ける場合、ランゲルハンス島細胞は、 摂氏約４０度で液体寒天内に懸濁させる。該寒天／細胞懸濁液は、装置の植え付 け部を通して注入される。その後、寒天がゲル化するまで、装置を摂氏３７度以 下に冷却し、チャンバーに満たす寒天プラグを形成させる。該寒天プラグは、有 利なことに、寒天の物理的性質故に安定である、即ち、生理的にありそうもない 摂氏８０度を越えるまで熱さない限り溶解しない。 ミクロビーズのスラリーを植え付ける場合、ビーズは直接に植え付け部内に注 入される。パックした状態の量でおおよそ１０−２０ｍｌのビーズを装置に植え 付ける必要がある。 再植え付けを所望する場合、チャンバーは、最初に塩水おおよそ１５０−３０ ０ｍｌで洗い流し、ビーズを取り除き、さらに新しいビーズを注入する。ビーズ は、一方の口に塩水を注入し、もう一方の口を通してビーズをチャンバーの外に 洗い流すことによって、装置から取り除かれる。おおよそ１５０から約３００ｃ ｃの塩水を用いると、９０％より多くのビーズが洗い流される。ひとたび装置が 空になったならば、最初の植え付けと同じ方法で、再植え付けを行う。 ここに記載されたように、本発明の範囲から離れることなく、ある種の変化を 作ることができるので、例を含む前記の明細書に記載されたすべての内容は、例 として解釈され、制限の意味で解釈されるものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 マロン，クローディ・ジーン・ポール アメリカ合衆国マサチューセッツ州01701, フラミンガム，プロスペクト・ストリート 163

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 寒天ゲルを含む長球形の半透過性膜の中にカプセル化された、インスリ ンを生成する能力を持つ一つまたはそれより多くの生理的に活性な生きたランゲ ルハンス島細胞を含む人工膵臓。 ２． 寒天がアガロースである、請求１記載の人工腎臓。 ３． ミクロビーズが直径約５０から約１０００ミクロンの範囲である、請求 項２記載の人工膵臓。 ４． 寒天ゲルの分子量カット値が１００，０００ダルトンより小さい、請求 項１記載の人工膵臓。 ５． 寒天ゲルを含む第一の長球形の半透性膜内にカプセル化され；該第一の 長球形の寒天膜が第二の免疫分離膜内にカプセル化される；インスリンを生成す る能力を持つ一つあるいはそれより多くの生理的に活性な生きたランゲルハンス 島細胞を含む人工膵臓。 ６． 第二の免疫分離膜が機械的または合成の膜である、請求項５記載の人工 膵臓。 ７． 機械的膜が拡散チャンバーの一部分である、請求項６記載の人工膵臓。 ８． ａ．約２５Ｋｄから約２００Ｋｄの範囲の穴を持つ中空繊維であって； 一方の端が血液を受けるための血管と結びつけられ、さらにもう一方の端が該血 液を戻すための血管と結びつけられる該中空繊維； ｂ．該中空繊維を取り囲む寒天ゲルを含む長球形の半透性膜内にカプセ ル化された、インスリンを生成する能力を持つ一つまたはそれより多くの生理的 に活性な生きたランゲルハンス島細胞；および ｃ．ランゲルハンス島および宿主を免疫反応物質から防御するのに充分 小さい穴の大きさを持つ半透性膜を含む、該中空繊維およびランゲルハンス島の ための囲い： を含む、人工腎臓灌流装置。 ９． ａ．溶かした寒天内に細胞を懸濁する； ｂ．疎水性の相内に懸濁された液体小滴の乳濁液を形成させるために、 疎水性の相内に該溶液を乳化する；および、 ｃ．小滴をゲル化させ、そして寒天ゲルミクロビーズを形成させるため に、油を冷却する： 段階を含む、寒天ミクロビーズの製造方法。 １０． 細胞がランゲルハンス島細胞、肝細胞、ドーパミン分泌細胞、抗体分泌 細胞またはハイブリドーマ細胞である、請求項９記載の寒天ビーズの製造方法。 １１． 細胞がランゲルハンス島細胞である、請求項９記載の寒天ビーズの製造 方法。 １２． さらに、ランゲルハンス島細胞および寒天懸濁液に界面活性剤を加える ことを含む、請求項１１記載の寒天ビーズの製造方法。 １３． 乳化媒質がシリコーン流体、植物油または鉱物油である、請求項９記載 の寒天ビーズの製造方法。 １４． ａ．ランゲルハンス島細胞および界面活性剤を、摂氏約４１から約４３ 度の範囲の温度で溶けた寒天内に懸濁する； ｂ．油に懸濁した液体小滴の乳濁液を形成するために、油相内に約１０ −３０分間該溶液を乳化する； ｃ．小滴をゲル化して寒天ゲルミクロビーズを形成させるために、油を 冷却する；および ｄ．該寒天ゲルミクロビーズを収集し洗浄する： 段階を含む、寒天ミクロビーズの製造方法。 １５． 収集および洗浄段階の間に培養液を加える、請求項１４記載の寒天ミク ロビーズの製造方法。 １６． 培養液が、塩水、最小必須培地、ダルベッコの修飾イーグル培地、１９ ９培地、ロスウェルパーク記念研究所培地、またはクレブス／リンゲルス溶液で ある、請求項１４記載の寒天ミクロビーズの製造方法。 １７． ａ．寒天ミクロビーズ内に一つまたはそれより多くの生理的に活性な生 きた細胞をカプセル化する；および ｂ．該ミクロビーズを哺乳動物の体内に導入する； 段階を含む、組織移植法。 １８． 細胞が、寒天ミクロビーズ内でインスリンを生成する能力を持つ活性な ランゲルハンス島細胞である、請求項１７記載の組織移植法。 １９． ａ．寒天ミクロビーズを含む第一の長球形の半透性膜内に一つまたはそ れより多くの生理的に活性な生きた細胞をカプセル化する； ｂ．第二の免疫分離膜内に第一の該半透性膜をカプセル化する；および ｃ．二度カプセル化した該細胞を哺乳動物体内に導入する； 段階を含む、組織移植法。 ２０． 細胞が、インスリンを生成する能力を持つ寒天ミクロビーズ内の活性な ランゲルハンス島細胞である、請求項１９記載の組織移植法。 ２１． ａ．寒天ミクロビーズ内にインスリンを生成する能力を持つ一つまたは それより多くの生理的に活性な生きたランゲルハンス島細胞をカプセル化する； ｂ．ｉ．約２５Ｋｄから約２００Ｋｄの範囲の穴を持つ中空繊維であっ て；一方の端が血液を受け取るために血管に結び付けられ、さらにもう一方の端 が該血液を戻すための血管に結び付けられる該中空繊維； ii．該中空繊維を取り囲むランゲルハンス島；および iii．免疫反応物質からランゲルハンス島および宿主を防御するた めの充分小さい穴の大きさを持つ半透性膜を含む、該中空繊維およびランゲルハ ンス島の囲い； を含む、免疫分離膜内に該ミクロビーズをカプセル化する；ならびに ｃ．二度カプセル化した該細胞を哺乳動物の体内に導入する； 段階を含む、組織移植法。 ２２． ａ．ｉ．約２５Ｋｄから約２００Ｋｄの範囲の穴を持つ中空繊維であっ て；一方の端が血液を受け取るために血管に結び付けられ、さらにもう一方の端 が該血液を戻すための血管に結び付けられる該中空繊 維； ii．該中空繊維を取り囲むランゲルハンス島細胞；ならびに iii．免疫反応物質からランゲルハンス島および宿主を防御するた めに充分小さい穴の大きさを持つ半透性膜を含む、該中空繊維およびランゲルハ ンス島の囲い； を含む免疫分離膜内から、ミクロビーズ内にカプセル化された生理的に 不活性なランゲルハンス島細胞を、すべてのミクロビーズが洗い流されるまで該 装置内に塩水を注入することによって、取り除く； ｂ．該チャンバー内に寒天ミクロビーズにカプセル化された生理的に活 性なランゲルハンス島を注入する；および ｃ．寒天ミクロビーズがゲル化して寒天プラグを形成するまで、装置を 冷却する； 段階を含む、再植え付け方法。