DE69635940T2 - Hydrogelmatrix für Zellgewebelagerung - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Einkapselung von zellulären Komponenten, einschließlich hormonbildendem Gewebe, und insbesondere die Membran-Einkapselung von Insulin erzeugenden Langerhans-Inseln für die xenographische Transplantation bei Diabetikern. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine verbesserte Matrix für Gewebe und insbesondere für hormonbildendes Gewebe, wobei die Matrix eine Langzeitlagerung des Gewebes, eine periodische Bestimmung der Gewebefunktionalität und ein zerstörungsfreies Testen von Gewebe enthaltenden Vorrichtungen vor der Transplantation ermöglicht sowie das Wachstum von Gewebe in der Matrix fördert.
  • Diabetes mellitus ist ein Leiden, von dem allein in den Vereinigten Staaten von Amerika etwa 20 Millionen Personen betroffen sind. Dieses Leiden ist entweder durch einen nahezu vollständigen Mangel an Insulin (Diabetes Typ I) oder durch eine Resistenz gegenüber normalen Konzentrationen von im Kreislauf befindlichem Insulin (Diabetes Typ II) gekennzeichnet. Beide Zustände können derzeit in gewissem Umfang durch tägliche subkutane Injektionen von exogenem Insulin beherrscht werden. Da die Insulininjektionen in zeitlichem Abstand in vorgegebenen Dosen erfolgen, wirkt das Dosierungsschema als offener Wirkungskreis, bei dem Insulin nicht gemäß dem Stoffwechselbedarf abgegeben wird und dadurch die Glucosekonzentrationen im Blut nicht innerhalb der Bereiche geregelt werden, die von normalen nicht-diabetischen Personen erreicht werden. Demzufolge hat man erkannt, dass es mit dieser Art von Therapie nicht gelingt, die erforderliche Stoffwechselkontrolle des Blutzuckers, um mit der Krankheit verbundene Gefäßkomplikationen zu verhindern, zu erreichen. Zu diesen Komplikationen gehören Blindheit, Nierenversagen, Herzerkrankungen, Schlaganfall und Verlust an peripheren sensorischen Nervenfunktionen. Ferner ist man sich in der medizinischen Fachwelt einig, dass der Verlust des normalen Insulin-Pulsierungsrhythmus, wobei Insulin etwa alle 10 Minuten in diskreten Boli freigesetzt wird, erforderlich ist, um die normale Insulinempfindlichkeit sowohl bei Typ I als auch bei Typ II von Diabetes aufrechtzuerhalten. Dem Verlust dieses normalen Pulsierungsrhythmus und der Beeinträchtigung der Insulinresistenz wird eine besondere Bedeutung bei der Entwicklung von Erkrankungen der großen Gefäße, die bei Diabetes auftreten, zugeschrieben. Diabetes ist derzeit in den Vereinigten Staaten die dritthäufigste Todesursache, wobei die Krankheit jährliche Behandlungskosten von etwa 2 bis 3 Milliarden US-Dollar verursacht.
  • Insulin-Spenderpumpen (programmiert oder manuell betätigt) zur Abgabe von Insulin an Diabetiker werden eingesetzt, um häufigere, kleinere Insulindosen mit dem Bestreben bereitzustellen, den Blut-Glucosespiegel innerhalb engerer Bereiche zu regulieren. Derartige Pumpen wirken aber immer noch als System mit offenem Wirkungskreis, wobei lediglich versucht wird, den Stoffwechselbedarf zu antizipieren, jedoch nicht auf diesen zu reagieren. Da das Insulin aus derartigen Pumpen normalerweise durch das subkutane Gewebe resorbiert werden muss, gibt es keinen diskreten Bolus von abgegebenem Insulin. Die therapeutische Wirksamkeit der derzeitigen Pumpen im Vergleich zur herkömmlichen Injektion von Insulin ist nicht klar nachgewiesen oder klinisch anerkannt. Es gibt Versuche, die Pumpen mit Sensoren für den Blut-Glucosespiegel zu regeln, um einen geschlossenen Wirkungskreis zu erreichen, jedoch wurde bisher kein implantierbarer Sensor mit Langzeit-Bioverträglichkeit und Funktionalität entwickelt.
  • Die medizinische Forschung ist sich seit vielen Jahren bewusst, dass es wünschenswert wäre, über implantierbare Vorrichtungen mit geschlossenem Wirkungskreis zu verfügen, die lebendes, insulinbildendes Gewebe, Inseln oder isolierte beta-Zellen enthalten, die über eine selektive, permeable Membran Insulin in Übereinstimmung mit dem Stoffwechselbedarf freisetzen. Diese als "bioartifizielle Pankreasorgane" bezeichneten Vorrichtungen wurden in Bezug auf ihre funktionellen und leistungsmäßigen Restriktionen definiert. Erstens muss das Gewebe reagieren und Insulin in den erforderlichen Mengen innerhalb einer entsprechenden Zeitspanne freisetzen, um auf Erhöhungen und Verringerungen des Blut-Glucosespiegels zu reagieren. Zweitens muss die Vorrichtung die Insulinerzeugung unterstützen und darf diese nicht unterdrücken. Drittens muss die Vorrichtung einen Schutz gegen eine immunologische Abstoßung gewährleisten. Viertens müssen die Inseln funktionell überleben oder die Vorrichtung muss leicht ersetzbar sein. Fünftens muss die Membran eine entsprechende Selektivität und biologische Verträglichkeit für den Patienten aufweisen und ihre funktionellen Eigenschaften dürfen sich durch Kontakt mit Wirtsgewebe nicht verändern.
  • Verschiedene Lösungswege unter Verwendung von Kapseln wurden in Bezug auf physikalische Vorrichtungen mit einem Gehalt an Inseln eingeschlagen, wobei planare oder schlauchförmige Membranen verwendet wurden. Zu Beispielen für Membranen, die im Stand der Technik vorgeschlagen werden, gehören Amicon-Hohlfasern, Alginat-Polylysin-Kapseln, Polyacrylnitril-Folien und -Hohlfasern, Agarosegel-Kapseln, Millipore-Membranen, modifiziertes Kollodium, Celluloseacetat, Polyvinyldifluorid, Polypropylen, Polyethylen, Nuclepore-Membranen der Fa. Nuclepore Corporation, Poretic-Membranen der Fa. Poretic Corporation und dergl. Im allgemeinen haben diese Membranen versagt, und zwar aufgrund von fehlender biologischer Verträglichkeit, die zu einem Blockieren der Membran führt, sowie aufgrund der Tatsache, dass sie bei Anbringen an Inselgewebe zu dick sind, um in angemessener Weise ein physiologisches Glucosesignal aufzunehmen und Insulin auszuschütten. Bei Versuchen zur Überwindung der Abstoßung wurden hochgereinigte beta-Zellen Personen implantiert, die hohe Dosen an wirksamen Immunosuppressiva, wie Cyclosporin, erhielten. Soweit bekannt ist, gab es bisher auf diesem Wege keine erfolgreichen Langzeitimplantationen.
  • In letzter Zeit wurden Inseln in einem Hydrogel, wie Natriumalginat, makroverkapselt und in Hohlfasern, die durch eine Trockenspinntechnik unter Verwendung eines Acryl-Copolymeren hergestellt worden waren, injiziert. Obgleich die Fähigkeit zur Kontrolle der Glucosespiegel bei Mäusen gezeigt wurde, ist die Langzeit-Bioverträglichkeit der Fasern nicht erwiesen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Hydrogel-Matrix, die bei Körpertemperatur flüssig ist und ein Gemisch aus folgenden Bestandteilen umfasst
    • 0,01 bis 30 mM Gelatine; und
    • 0,01 bis 1000 μM Dextran oder sulfatiertes Dextran.
  • Zu weiteren Komponenten, die in bevorzugten Zusammensetzungen verwendet werden können, gehören zweiwertige Chelatbildner und Stickstoffoxid-Inhibitoren.
  • EP-A-865288, aus der die vorliegende Anmeldung durch Teilung hervorgegangen ist beschreibt eine implantierbare Vorrichtung, die eine Zellkomponente in einer Hydrogel-Matrix umfasst, die mit einer semipermeablen Membran mit einer Molekulargewichtsporosität von 5 000 bis 40 000 eingekapselt ist. Eine derartige Vorrichtung kann die vorstehenden Kriterien erfüllen, wobei die vorerwähnten Schwierigkeiten zur Bereitstellung eines geschlossenen Wirkungskreises der Insulinausschüttung entsprechend dem Bedarf und die vorstehenden Schwierigkeiten der Abstoßung der Langerhans-Inseln aufgrund der Immunabwehr des Wirts durch ein anerkanntes, biologisch verträgliches Material überwunden werden. Insbesondere werden die Inseln (humaner oder aufgrund der leichteren Verfügbarkeit tierischer Herkunft) entweder in zellulärer Form oder innerhalb von Einhüllvorrichtungen in ein Poly-p-xylylen umfassendes, polymeres Material mit einem Membranbereich eingeschlossen, der eine Porosität aufweist, die den Durchtritt von Nährstoffen, Glucosesignalen, Elektrolyten und Wasser sowie den Austritt von aus den Inseln freigesetztem Insulin ermöglichen, wobei alle diese Bestandteile ein Molekulargewicht von weniger als etwa 6 000 aufweisen. Die Porosität der Membran ist jedoch kleiner als die Porosität, die für die Passage von Immunoglobulinen und Antikörpern mit Molekulargewichten von 40 000 bis 500 000 erforderlich ist. Poly-p-xylylen ist in besonderer Weise als biologisch verträgliches Oberflächensubstrat für Implantationszwecke anerkannt und tritt nicht in Wechselwirkung mit Plasmafaktoren, wie Fibrin, oder mit Zellen, wie Blutplättchen. Demgemäß werden die Kapselporen nicht verstopft und eine Insulinfreisetzung als Funktion des eigenen Glucosespiegels des Wirts wird erreicht. Die Vorrichtung kann auf der Grundlage von frischen und gefrorenen Inseln verschiedenartig konzipiert sein und in verschiedenen Zellanordnungen konfiguriert sein, wobei die selektive Membranporosität des Poly-p-xylylens und dessen biologische Verträglichkeit für innere und äußere Oberflächen gewährleistet sind.
  • Die Vorrichtung kann mit einer Insel enthaltenden Hydrogel-Matrix unter Hochvakuumbedingungen ohne zelluläre Schädigung oder Erosion des Hydrogels beschichtet werden. Die anpassungsfähige Natur und die Dicke des Überzugs erlauben eine sehr rasche Insulinreaktion auf ein Glucosesignal, so dass ein physiologischer Insulin-Pulsierungsrhythmus erfolgen kann.
  • Die erfindungsgemäße Hydrogel-Matrix ermöglicht folgendes: eine Langzeitlagerung von zellulären Komponenten, einschließlich Inseln, ein periodisches Testen ihrer Funktionalität, ein verbessertes Substrat für die Anwendung der Membran, ein zerstörungsfreies Testen der zellulären Komponenten und der damit verbundenen Vorrichtungen und eine Langzeitlagerung derartiger Vorrichtungen. Ein nach der Herstellung der Vorrichtung erfolgender Funktionstest kann vor einer Transplantation vorgenommen werden. Außerdem ergibt die Matrix eine Umgebung, die die Insel-Vermehrung und die Vermehrung von anderen Zellkomponenten fördert. Bisher mussten die Fachleute auf dem Gebiet der Insel-Transplantation eine direkte Insel-Isolierung und Reinigung für die Herstellung einer Vorrichtung vornehmen, wobei alle diese Vorgänge innerhalb von wenigen Tagen erfolgen mussten. Im Anschluss an die Herstellung wurden die Vorrichtungen implantiert, ohne dass ein zerstörungsfreier Test auf die Funktionsfähigkeit der Vorrichtung möglich war. Die vorliegende Erfindung stellt eine Matrix bereit, die dem nativen pankreatischen System ähnlich ist und eine gelatinöse Grundlage umfasst, an der die Inseln anhaften und sich entwickeln. Insbesondere verwendet man bei der Matrix vorzugsweise ein einer Siedebehandlung unterzogenes Kollagen, das zusammen mit dem Medium und Additiven polymere Stränge ergibt, an die sich die Inseln, einzeln und in Clustern, anheften. Matrixzubereitungen, wie sie nachstehend ausführlicher beschrieben werden, haben die Funktionalität der Inseln bei einer Lagerung von mehr als 6 Monaten ohne Kontamination aufrechterhalten, wodurch eine Lagerung von fertiggestellten Vorrichtungen über Monate hinweg ermöglicht wird, wobei die Möglichkeit zu einem Funktionstest vor der Implantation gegeben ist. Ferner wird eine in vivo-Langlebigkeit ohne Einbuße an Leistungsfähigkeit erreicht, wobei sich Anzeichen einer sich im zeitlichen Verlauf verbesserten Insulinbildung ergeben. Außerdem hat die Matrix, die ergänzend über der transplantierten Vorrichtung eingesetzt worden ist, die Gefäßbildung in unmittelbarer Nähe der Membran gefördert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine zelluläre Matrix bereit, die sich eines Substrats für das zelluläre Anheften von Inseln, Hepatozyten oder dergl. bedient, basierend auf der wärmeabhängigen Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen und Dipolmoment-Wechselwirkungen. Bevorzugte Substrate enthalten teilweise Kollagen auf der Basis von Gelatine, das ein natürliches Milieu für das Zellwachstum ergibt und polare und unpolare Aminosäuren enthält, die bei einer Siedebehandlung oder einer anderweitigen Denaturierung leicht ein Gel bilden, und zwar auf der Basis der Bildung von Amin-, Carboxylgruppen-, Hydroxylgruppen- und Sulfhydrylgruppen-Wasserstoffbrückenbindungen und Dipolmoment-Wechselwirkungen. Die Beständigkeit der Matrix kann durch Zugabe von Chelatbildnern erhöht werden, die eine Störung der Wasserstoffbrückenbindungen und Dipolmoment-Wechselwirkungen durch zweiwertige Kationen beseitigen. Freiliegende aktive Gruppen werden zur Immobilisierung von Wasser bei niedrigeren Temperaturen über diese Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen verwendet, wodurch Wärmeschädigungen bei niedrigeren Temperaturen auf ein Minimum beschränkt werden.
  • Erfindungsgemäß wird ferner eine zelluläre Matrix bereitgestellt, die einen Schutz gegen Stickstoffoxid und dessen Metaboliten bietet, von denen bekannt ist, dass sie einen Zelltod durch Zellkernschädigung (Apoptose) und anderer damit in Zusammenhang stehenden Schädigungen hervorrufen. In der zellulären Matrix werden Aminosäuren und verwandte Verbindungen verwendet, die dazu dienen, L-Arginin an der Bildung von Stickstoffoxid durch Stickstoffoxid-synthase (entweder konstitutiv oder induzierbar) zu hindern. Insbesondere Cystein und andere verwandte Verbindungen mit Sulfhydrylgruppen, die in Kollagenmaterial auftreten, dienen ebenfalls zum Abfangen von Stickstoffoxid und schränken somit dessen schädliche (oder vorteilhafte) Eigenschaften ein.
  • Die zelluläre Matrix umfasst ein metabolisch stabiles Kryoprotektivum (Kryoschutzmittel), das ein inertes Kissen gegen eine wärmeabhängige zelluläre Expansion und Kontraktion darstellt. Ein bevorzugtes Kryoprotektivum ist ein langkettiges Kohlenhydrat auf der Basis von Zucker, vorzugsweise Dextran und insbesondere sulfatiertes Dextran, wobei die Sulfhydrylgruppen Stellen für Disulfidbindungen bereitstellen und eine erhöhte Matrixresistenz gegen Krafteinwirkungen sowie eine Hemmung der Anreicherung von Stickstoffoxid bewirken. Derartige sulfatierte Gruppen liefern ferner Stellen zur Bindung von Wachstumsfaktoren, wie IGF-I und IGF-II, die, wie der Fachmann weiß, für ein fortlaufendes Wachstum und die Aufrechterhaltung der Inseln erforderlich sind.
  • Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann für den Verdau unter Verwendung einer Enzymlösung zur Freisetzung einer erwünschten zellulären Komponente eingesetzt werden, wobei eine wirksame Menge eines Stickstoffoxid-Inhibitors der Lösung in der Weise zugesetzt wird, dass die Endothel-Steifigkeit erhöht wird und sich eine verbesserte enzymatische Spaltung ergibt.
  • Für Fachleute auf dem Gebiet biologischer Transplantationen ist es ersichtlich, dass die vorstehend kurz beschriebenen Vorrichtungen und Matrices Anwendung bei verschiedenen Transplantationstherapien finden, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) Zellen, die humane Nervenwachstumsfaktoren sezernieren, um den Verlust an degenerierenden cholinergen Neuronen zu verhindern, Satellitenzellen für die Myokardregeneration, Striatum-Hirngewebe bei der Huntington-Krankheit, Leberzellen, Knochenmarkzellen, an Dopamin reiches Hirngewebe und Zellen bei Parkinson-Krankheit, stark cholinerge Nervensysteme bei Alzheimer-Krankheit, chromaffine Nebennierenzellen zur Abgabe von Analgetika an das Zentralnervensystem, gezüchtetes Epithel für Hauttransplantate und Zellen, die den ziliaren neurotropen Faktor bei amyotropher Lateralsklerose freisetzen.
  • Die vorstehenden und weiteren Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich beim Studium der folgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen in Verbindung mit der beigefügten Zeichnung.
  • 1 ist ein Seitenquerschnitt einer bioartifiziellen endokrinen Vorrichtung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
  • 2 ist ein Seitenquerschnitt einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
  • 3 ist ein Querschnitt entlang der Linie 3-3 von 2.
  • 4 ist ein Seitenquerschnitt einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
  • 5 ist ein Querschnitt einer weiteren Ausführungsform der Erfindung.
  • 6 ist eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme zur Darstellung der Anhaftung von Clustern von Inseln an Kollagenfasern einer weiteren Matrix.
  • 7 ist eine vergrößerte Ansicht eines Teils von 6 zur Erläuterung von angehefteten und nicht-angehefteten Clustern von Inseln in der Matrix.
  • 8 ist eine vergrößerte Ansicht eines Teils von 7 zur Darstellung eines nicht-angehefteten Clusters von Inseln.
  • 9 ist eine ähnliche Ansicht wie 8 zur Darstellung eines angehefteten Clusters von Inseln.
  • 10A ist eine ähnliche Ansicht wie 6 einer einzelnen Insel unter Einschluss einer Bindungsstelle zur Anheftung an die Fasern.
  • 10B ist eine Ansicht einer einzelnen Insel, die der Zellteilung unterliegt.
  • 11 ist eine vergrößerte Ansicht eines Teils von 6 zur Darstellung eines Clusters von Inseln, die an denaturierte Kollagenstränge angeheftet sind, und einer eingefügten Vergrößerung zur Darstellung eines intakten Kollagenstrangs.
  • 12 und 13 sind lichtmikroskopische Aufnahmen von Inseln im Anschluss an die Entfernung von der Matrix.
  • 14 ist ein Diagramm, bei dem die Insulinkonzentration gegen die Zeit in Reaktion auf eine in vivo-Belastung mit 100 mg/dl Glucose für eine erfindungsgemäße Vorrichtung aufgetragen ist.
  • 15 ist ein Diagramm, bei dem die Insulinkonzentration gegen die Zeit in Reaktion auf eine in vivo-Belastung mit 50 mg/dl Glucose für die gleiche Vorrichtung wie in 14 aufgetragen ist.
  • 16 zeigt eine Draufsicht und einen Aufriss einer weiteren Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
  • 17 ist ein Diagramm, bei dem der Blut-Glucosespiegel gegen die Zeit in Tagen für einen diabetischen Hund, dem die in 16 dargestellten Vorrichtungen implantiert worden sind, aufgetragen ist.
  • 18 zeigt den Gehalt an Insel-RNA, die Insulinsekretion und die Anzahl an lebensfähigen Inseln in Abhängigkeit von der Zeit in einer Matrixkultur.
  • 19 ist ein Diagramm, bei dem Schweine-C-Peptid gegen die Zeit in Tagen im Anschluss an die Transplantation für den Hund von 17 aufgetragen ist.
  • 20 zeigt die Daten des intravenösen Glucose-Toleranztests (IVGTT) für den Hund von 17.
  • 21A und 21B zeigen die IVGTT-Daten für einen Hund 6, 40 und 57 Tage nach der Transplantation.
  • 22A und 22B zeigen die IVGTT-Daten für einen weiteren Hund 45 und 59 Tage nach der Implantation.
  • 23 ist ein Diagramm bei dem Schweine-C-Peptid gegen die Zeit in Tagen nach der Transplantation für den Hund von 21 aufgetragen ist.
  • 24 zeigt IVGTT-Daten für den Hund von 21.
  • 25 bis 30 zeigen die maximalen Serum-C-Peptid-Werte für eine Reihe von Testhunden.
  • 31 zeigt einen intravenösen Glucose-Toleranztest bei 21 Tage alten Inseln, die dem Hund AXA 14 Tage nach der Implantation und 50 Tage nach der Pankreasektomie reimplantiert worden sind.
  • 32 zeigt einen intravenösen Glucose-Toleranztest für den Hund C324 80 Tage nach der Implantation.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung eignet sich insbesondere zur Bereitstellung biologischer Substanzen, die normalerweise von zellulären Komponenten erzeugt werden, die im Normalfall im Zusammenhang mit endokrinen Drüsen, wie Pankreas, Schilddrüse, Nebenschilddrüse, Thymus, Hypophyse, Nebennierenrinde und Nebennierenmark, stehen. Zelluläre Komponenten von Pankreas und Hypophyse werden bevorzugt. Der hier verwendete Ausdruck "zelluläre Komponenten" umfasst sowohl natürlich auftretende als auch genetisch veränderte Zellen, die sowohl natürlich auftretende Substanzen als auch Analoge davon, die synthetisch oder anderweitig erhalten worden sind, sezernieren. Zu Zellen, die sich für das erfindungsgemäße Verfahren eignen, gehören (ohne Beschränkung hierauf) somatotrophe, laktotrophe, thyrotrophe, gonadotrophe und kortiko-lipotrophe Zellen.
  • Die durch die erfindungsgemäße Vorrichtung bereitgestellten biologischen Substanzen werden typischerweise als Hormone bezeichnet. Der hier verwendete Ausdruck "Hormon" ist als eine biologische Substanz definiert, die durch ein spezielles Gewebe sezerniert wird. Er umfasst Substanzen, die an der Sekretionsstelle Aktivität entfalten und gelegentlich als Autocoide bezeichnet werden, und Vorstufen davon. Zu Beispielen für Hormone gehören Peptide, Proteine, Glycoproteine, Fette, Lipide, Polysaccharide und Kohlenhydrate. Peptide werden bevorzugt, wobei der hier verwendete Ausdruck "Peptid" sich auf ein Peptid als diskretes Molekül oder auf einen Bestandteil in einem Protein bezieht.
  • Zu Hormonen, die von der Hypophyse (Hirnanhangdrüse) oder Adenohypophyse sezerniert werden, gehören die Wachstumshormone (GH), Prolactin, Gonadotropine, Thyrotropine, Corticotropine, Melanozytenstimulierende Hormone, Somatomedine und Lipotropine.
  • Gonadotropine sind Glycoproteine, die im allgemeinen von der Hypophyse sezerniert werden. Sie umfassen Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), luteinisierendes Hormon (LH oder ICSH), Chorion-gonadotropin (CG), Thyrotropin (TSH), individuelle Peptidketten davon und damit assoziierte Kohlenhydrate. Diese Hormone können sich zusammen mit Hormonen der Östrogen-, Progestin- und Androgen-Familien zur Behandlung von Infertilität eignen. Gonadotropin freisetzende Hormone, wie das Follikelstimulierendes Hormon freisetzende Hormon (FSHRH) oder das luteinisierendes Hormon freisetzende Hormon (LHRH) sind erfindungsgemäß ebenfalls vorgesehen.
  • Zu Melanozyten stimulierenden Hormonen gehören Corticotropin (ACDH), alpha-Melanozyten stimulierendes Hormon (alpha-MSH), beta-Melanozyten stimulierendes Hormon (beta-MSH), beta-Lipotropin (beta-LPH), gamma- Lipotropin (gamma-LPH) und den gemeinsamen Vorläufer davon, nämlich Proopiomelanocortin.
  • Somatomedine stellen eine Familie von Peptidhormonen dar, die im Molekulargewichtsbereich von etwa 7 000 bis 8 000 Dalton liegen. Sie sind den Wachstumsfaktoren, z. B. dem Nervenwachstumsfaktor (NGF), dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und dem Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), ähnlich. Ein beispielhaftes Somatomedin ist der insulinartige Wachstumsfaktor (IGF). Wachstumsfaktoren selbst, wie Gewebe-Wachstumsfaktoren, fallen ebenfalls unter den Umfang der Erfindung in Bezug auf das Haut/Knochen-Wachstum und die Förderung der Wundheilung. Wachstumsfaktoren werden erfindungsgemäß sowohl in kleinen als auch in großen Formen bereitgestellt.
  • Zu Beispielen für Hormone, die durch die Nebenschilddrüse sezerniert werden, gehören das Parathyroidhormon und dessen Vorläufer, nämlich Proparathyroidhormon. Die Hormone Calcitonin und Prolactin werden von der Schilddrüse, den Nebenschilddrüsen und dem Thymus sezerniert. Prolactin a tritt ähnlich wie die Wachstumsfaktoren natürlicherweise sowohl in kleinen als auch in großen Formen auf, die beide durch die zellulären Komponenten der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden. Hormone, die normalerweise durch die Nebennierenrinde sezerniert werden, können ebenfalls gemäß der erfindungsgemäßen Praxis bereitgestellt werden, einschließlich adrenocorticale Steroide, wie das adrenocorticotrope Hormon, und deren synthetische Analoge.
  • Die vorliegende Erfindung kann auch zur Bereitstellung von zellulären Komponenten herangezogen werden, die normalerweise im Hirn auftreten und die neurologisch aktive Substanzen sezernieren. Somit können nach der erfindungsgemäßen Praxis Neuropeptide bereitgestellt werden, einschließlich die Neuropeptidfamilien der Endorphine, der Glucagon-Sekretine und die Substanz P-Neuropeptide. Endorphine umfassen die Proopiomelanocortine, die Proenkephaline, die Prodynorphine und die davon abgeleiteten Hormone. Die Glucagon-Sekretine umfassen Glucagon, vasoaktives intestinales Polypeptid, die beide in den Langerhans-Inseln auftreten, Secretin und den das Wachstumshormon freisetzenden Faktor (GHRF). Die Substanz-P-Neuropeptide umfassen Vasotocin, Vasopressin und Oxytocin. Es ist speziell vorgesehen, dass Substanzen, die durch große Cluster von Neuronen sezerniert werden, wie Oxytocin, Vasopressin, LHRH, GHRH und Proopiomelanocortin, unter den Umfang der Erfindung fallen, sowie Substanzen, die durch Zellen sezerniert werden, die normalerweise im gesamten Gehirn verteilt sind, wie Somatostatin, Cholecystokinin und Enkephalin.
  • Die vorliegende Erfindung kann auch zur Bereitstellung von Mastzellen als spezielle zelluläre Komponente herangezogen werden. Von diesen Zellen sezernierte Substanzen, einschließlich Substanzen der Histaminfamilie und synthetische Analoge davon, wie Pentagastrin, können erfindungsgemäß bereitgestellt werden.
  • Weitere biologische Substanzen, die durch die erfindungsgemäßen zellulären Reste bereitgestellt werden können, umfassen (ohne Beschränkung hierauf) die nachstehenden Produkte: Polypeptid-Autocoide (z. B. Aldosteron), die Plasmakinine (z. B. Bradykinin und Kallidin), die Autoangiotensine, der eosinophile chemotaktische Faktor (ECFA), der neutrophile chemotaktische Faktor (NCFA), Immunosuppressiva auf Peptidbasis zur Behandlung von Organabstoßungen bei Transplantationen, der humane Granulozyten-Kolonienstimulationsfaktor, der sich zur Erleichterung von Knochenmarktransplantationen eignet, das T-Zellrezeptorpeptid, das sich zur Behandlung von Autoimmunstörungen und Bindegewebestörungen eignet, Disaccharidpeptid, Immunostimulantien, von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF), Amylin, Glucagon, Pramintid und Thrombopoetin.
  • Während sich die vorliegende Erfindung vorwiegend mit der Behandlung von Menschen befasst, kann sie auch zur Behandlung anderer Säugetiere, wie Kühe, Schweine, Ziegen, Katzen und Hunde, für veterinärmedizinische Zwecke herangezogen werden. Beispielsweise besteht eine Ausführungsform der Erfindung in einem Implantat zur Sekretion von Hormonen und dergl. bei Tieren für veterinärmedizinische und/oder landwirtschaftliche Zwecke, wie Somatotropin, um die Milcherzeugung von Kühen, Ziegen oder anderen milcherzeugenden Tieren zu steigern. Wachstumshormone können ebenfalls einem Tier verabreicht werden, um die Milcherzeugung zu erhöhen.
  • Die nachstehend ausführlich beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen beziehen sich vorwiegend auf bioartifizielle endokrine Vorrichtungen zur Implantation, um endokrine Mängel bei einem Empfänger zu überwinden, insbesondere auf einen bioartifiziellen Pankreas, bei dem Insulin erzeugende zelluläre Komponenten Insulin in Reaktion auf Veränderungen der Serumglucose freisetzen. Jedoch ist es für den Fachmann ersichtlich, dass Untersuchungen auf breiter Basis durchgeführt werden können, um lebende Zellen einem Empfänger mit dem Ziel zu implantieren, verschiedene Erkrankungen, bei denen Zell- und Moleküldefekte bestehen, zu behandeln. Diese implantierten Zellen sind so ausgerichtet, dass sie biologische Produkte erzeugen, die der Empfänger selbst aufgrund einer Erkrankung, verletzung oder aufgrund anderer Behinderungen nicht erzeugen kann.
  • In der Zeichnung, die lediglich zur Darstellung bevorzugter Ausführungsformen dient, zeigt 1 eine bioartifizielle endokrine Vorrichtung 10 zur wirksamen Freisetzung von Hormonen. Die Vorrichtung umfasst einen kreisförmigen Zylinder 12 mit einem Paar von selektiven permeablen Membranen 14, die mit einem bioverträglichen Klebstoff an den oberen und unteren Endflächen des Zylinders angebracht sind. Geeignete Klebstoffe zum Anbringen der Membran an den Buchsen und zum Verkleben der Buchsen untereinander sind Silicon-Klebstoffe, Silastic Typ A, Produkt der Fa. Dow-Corning, Cyanoacrylate, Prism 454, Produkt der Fa. Loctite Corporation, Epoxyklebstoffe oder andere Klebstoffe, die vorzugsweise biologisch verträglich sind und eine ausreichende Haftung unter Erzielung einer Abdichtung und einer Aufrechterhaltung des Bestands des Hohlraums gewährleisten. Das Innenvolumen der Kammer 15 wird durch die Innenwand des Zylinders 12 und die Membranen 14 festgelegt. Die Kammer 15 enthält hormonerzeugendes Gewebe, vorzugsweise Schweine-Langerhans-Inseln, oder andere hormonerzeugende Zellkomponenten 16 in einer flüssigen oder gelartigen Matrix. Der Ausdruck Matrix wird hier entsprechend der auf dem einschlägigen Gebiet anerkannten Bedeutung für Materialien verwendet, die mit Geweben beladen sind. Zusätzlich zu den hier beschriebenen Materialien kann die Matrix auf Alginat (J. Schrezenmeir et al., Transplantation, Bd. 57 (1994), S. 1308–1314), oder auf Agar oder Agarose (H. Iwata et al., Diabetes, Bd. 38 (1989), S. 224–225) beruhen.
  • Vor dem Befüllen wird die zusammengebaute Vorrichtung durch Erwärmen oder gamma-Bestrahlung sterilisiert. Die Seitenwand des Zylinders wird mit einer unteren radialen Öffnung 18 zur Einführung der zellulären Matrix in die Kammer 15 und einer oberen radialen Öffnung 20 zum Belüften der Kammer 15 während des Füllvorgangs versehen. Die Öffnungen 18, 20 werden durch sterile, biologisch verträgliche Elemente 22 verschlossen.
  • Der Zylinder 12 kann aus einem beliebigen geeigneten Material, z. B. aus Metall oder Kunststoff, gebildet sein. Bei den Membranen 14 handelt es sich um polymere Filme aus Poly-p-xylylen (Poly-p-xylylen N) oder Analoge davon, wie Poly-monochlorxylylen (Poly-p-xylylen C) und Polydichlor-xylylen (Poly-p-xylylen D), üblicherweise als Paralen bezeichnet, und Gemische davon. Die Membranen 14 weisen eine Porosität auf, die den Durchtritt von wirksamen Nährstoffen für die zelluläre Komponente und des von dieser erzeugten Hormons ermöglichen. Für eine bioartifizielle Pankreasvorrichtung gemäß der nachstehenden Beschreibung ergeben Membranen, die Poly-p-xylylen N mit einer Dicke von etwa 2 000 bis 5 000 Å und vorzugsweise von etwa 2 500 bis 3 500 Å umfassen, die angestrebten Porositätseigenschaften. Die Untergrenze kann unterhalb der vorstehenden Werte liegen, sofern die Dicke nicht zu einer unzureichenden Membranfestigkeit führt.
  • Die Membranen werden durch herkömmliche Vakuumabscheidung gebildet und weisen eine Porosität auf, die genau gesteuert werden kann, so dass sich eine selektive Membran bilden Lässt. Wie vorstehend erwähnt, kann der Paralen-Überzug unter Verwendung herkömmlicher Einrichtungen (erhältlich von der Fa. Specialty Coatings System of Indianapolis, Indiana, oder Para Tech Coating, Inc., Aliso Viejo, Kalifornien, die auch das Paralen-Dimere liefern, aufgebracht werden. Die Vorrichtung ist in verschiedenen Konfigurationen erhältlich, mit denen ein Überzug gemäß genauen Angaben aufgetragen werden kann. Eine spezielle Maschinenkonfiguration findet sich im US-Patent 4 683 143 (Riley). Im Grunde bedienen sich alle diese Systeme eines Verdampfers, der mit einer Pyrolysevorrichtung verbunden ist, die wiederum mit einer Vakuumkammer, die durch eine mit einer Kühlfalle geschützte Vakuumpumpe evakuiert wird, verbunden ist. Unter Vakuum und Erwärmen wird das Paralen-Dimere im Verdampfer verdampft und gelangt in die Pyrolysevorrichtung, wo das Dimere thermisch zu einem Monomeren gespalten wird, das in entsprechender Weise auf den Vorrichtungen in der Kammer bei Umgebungstemperatur in Form eines langkettigen Polymeren abgeschieden wird. Bekanntlich lässt sich die Dicke des Überzugs auf beschichteten Teilen bestimmen, indem man während des Beschichtungsverfahrens eine planare Messplatte in der Beschichtungsvorrichtung positioniert. Da die gesamte Kammer, die Befestigungsvorrichtung und die Teile mit einem im wesentlichen gleichmäßigen Überzug versehen werden, kann die Messplatte entfernt und mit einer herkömmlichen Dickenmessvorrichtung getestet werden, wodurch die Dicke auf dem beschichteten Teil bestimmt werden kann. Dies stellt ein zweckmäßiges Verfahren für vorgeformte Filme dar, wie in einigen der nachstehenden Ausführungsformen beschrieben wird. Wenn jedoch der Überzug auf eine Hydrogel-Matrix gemäß anderen nachstehend beschriebenen Ausführungsformen aufgebracht wird, ist festzustellen, dass während der Entgasung von Flüssigkeiten eine Abkühlung der Matrix auftritt, was zu Variationen der Dicke zwischen der Messplatte und der aufgetragenen Membran führt, wie visuell auf der Grundlage der bestehenden Farbvariationen feststellbar ist, da Paralen ein dickenabhängiges unterscheidungskräftiges Farbspektrum aufweist. Derzeit kennt die Anmelderin keine verfügbare Dickenmessvorrichtung zur Durchführung einer direkten Messung der Membrandicke unter diesen Bedingungen. Dennoch können die speziellen Merkmale der erfindungsgemäßen Membranvorrichtungen durch einen funktionellen in vitro-Test, der durch die grundlegenden Parameterbedingungen gemäß den nachstehenden Ausführungen ergänzt wird, bestimmt werden.
  • Erfindungsgemäß wird die maximale Porengröße vorzugsweise so gewählt, dass eine Passage von Immunoglobulinen und Antikörpern mit Molekulargewichten von 40 000 bis etwa 500 000 verhindert wird. Die minimale Porengröße wird so gewählt, dass sie den Durchtritt von Nährstoffmolekülen, wie Glucose, Elektrolyten und Wasser sowie des Hormons Insulin mit einem Molekulargewicht von etwa 5 600 gestattet. Für andere zelluläre Komponenten ist die vorerwähnte maximale Porosität gleichermaßen anwendbar, wobei jedoch die minimale Porosität von dem freigesetzten biologischen Produkt abhängt, wie es für den Fachmann verständlich ist. Beispielsweise erfordert eine Vorrichtung zur Behandlung der Parkinson-Krankheit mit einem Gehalt an Substantia nigra-Zellen, die aus Hirngewebe isoliert worden sind, eine Molekulargewicht-Ausschlussgrenze von mindestens 1 000, um den Durchtritt von Dopamin und verwandten Verbindungen zu ermöglichen. Dagegen ist bei der Behandlung von Hypothyroidismus durch isoliertes Schilddrüsengewebe eine Molekulargewicht-Ausschlussgrenze von nur 500 erforderlich, um den Durchtritt von Thyroidhormon zu ermöglichen.
  • Die Membran bedient sich vorzugsweise eines Polymeren, bei dem vorwiegend aromatische Ringe anstelle von aliphatischen Ketten vorliegen, da die aromatischen Ringe in vivo weniger chemische Bindungsstellen bereitstellen als Polymere mit geraden Kohlenstoffketten mit aktiven chemischen Stellen. Da aromatische Polymere, wie Paralene, keine leicht verfügbaren Bindungsstellen aufweisen, werden sie vom Immunsystem des Subjekts nicht als fremd erkannt und das Immunsystem kann keine Bindung mit den Oberflächen der Polymeren eingehen, so dass die molekularen Poren unverstopft bleiben. Zu Beispielen für derartige weitere Polymere gehören Poly-phenyloxid, Poly-phenylsulfid, Poly-phenylamin und andere Polymere mit wiederkehrenden aromatischen Resten.
  • Beispiel 1
  • Eine Membran aus Poly-p-xylylen N mit einer Dicke von 3 271 Å wurde auf einer zylindrischen Buchse befestigt und partiell in destilliertes Wasser getaucht. Eine Flüssigkeit mit einem Gehalt an Komponenten von unterschiedlichen Molekulargewichten wurde auf die obere Oberfläche der Membran aufgebracht. Anschließend wurden Proben des Wassers auf ein SDS-PAGE-Gel aufgesetzt und der Elektrophorese unterzogen, um die Proben entsprechend ihren Molekulargewichten aufzutrennen. Niedere Molekulargewichte, entsprechend Glucose, Insulin und Zellbestandteilen, wurden identifiziert. Komponenten mit höheren Molekulargewichten, d. h. über 26 000, wurden ausgeschlossen.
  • Speziell enthält bei einer implantierbaren bioartifiziellen Pankreasvorrichtung die zelluläre Komponente eine Mehrzahl von Insulin bildenden Inseln. Die Inseln werden aus Spender-Pankreasorganen (sowohl humanen als auch tierischen Ursprungs) auf herkömmliche Weise durch kollagenösen Verdau und Ficoll- oder Dextran-Gradiententrennung abgeleitet. Die Inseln werden mit herkömmlichem RPMI-Kulturmedium vermischt, um eine Matrix mit einer Konzentration von etwa 10 bis 50 Inseln pro μl zu bilden.
  • Der Zylinder kann im Hinblick auf Handhabung, Beschichtung und Implantation sowie im Hinblick auf die vom Empfänger benötigte therapeutische Insulinbildung in Bezug auf Größe und Gestalt variieren.
  • Zur Erzielung einer bioverträglichen Beschaffenheit des Implantats kann der Zylinder aus einem geeigneten Material, wie rostfreier Stahl für medizinische Zwecke, oder vorzugsweise durch entsprechende Beschichtung des Poly-p-xylylens, gebildet werden, wobei die Dicke der Beschichtung nicht besonders kritisch ist. Jedoch wird eine Überzugsdicke von etwa 0,5 μm bevorzugt. Dieser Überzug kann gemäß herkömmlichen Techniken in präziser Weise in gesteuerten Dicken aufgetragen werden. Der Überzug und die Membranmaterialien gelten als nicht-immunogene Substrate für die Implantation beim Menschen. Das Material tritt nicht in Wechselwirkung mit Plasmafaktoren, wie Fibrin, oder mit Zellen, wie Fibroblasten, Makrophagen oder Blutplättchen. Demgemäß werden die Vorrichtung und Membranporen nicht verstopft oder führen nicht zu einer Beeinträchtigung der Insulinfreisetzung als Folge von Wachstum von Wirtsgewebe.
  • Beispiel 2
  • Eine Membran aus Poly-p-xylylen N mit einer Dicke von etwa 3 100 Å wurde auf einer zylindrischen Buchse befestigt und partiell in ein Medium aus destilliertem Wasser getaucht. 75 Langerhans-Inseln eines ausgewachsenen Schweins wurden in RPMI-Kulturmedium auf die obere Oberfläche der Membran gebracht. Eine periodische Probennahme des Mediums wurde durchgeführt, wobei nach jeder Probennahme ein Austausch des Mediums vorgenommen wurde. Zwei Aliquotanteile wurden aus dem Medium nach 4 und nach 6 Tagen entnommen. Die Aliquotanteile wurden in Doppelbestimmung in einem 125I-Insulin-RIA-Test (Ventrex) getestet. Die Insulinkonzentration der Probe betrug am 4. Tag 70 + 149 μU/ml und der Probe am 6. Tag 235 + 150 μU/ml, was zeigt, dass aus den Inseln sezerniertes Insulin die Membran durchquert hatte. Es kam nicht zur Anhaftung von Fibrin oder anderen Zellen.
  • Beispiel 3
  • Eine Implantatvorrichtung wurde unter Verwendung von zwei PVC-Buchsen mit einem Außendurchmesser von 12,7 mm (1/2 Zoll), einem Innendurchmesser von 9,5 mm (3/8 Zoll) und einer Dicke von 4,8 mm (3/16 Zoll) hergestellt. Die Buchsen wurden mit Poly-p-xylylen N in einer Dicke von etwa 0,5 μm beschichtet. Kreisförmige Poly-p-xylylen-Membranen mit einer Dicke von 2 959 Å wurden an die oberen Oberflächen der Buchsen mit Silicon-Klebstoff geklebt. Die Buchsen wurden sodann durch Bestrahlung sterilisiert.
  • Eine Membranbuchse wurde mit 20 dl zellulärer Matrix gefüllt. Die Matrix enthielt etwa 5 000 Schweine-beta-Zellinseln. Die Inseln wurden durch das Kollagenase-Verdauungsverfahren hergestellt. Anschließend wurden die Buchsen mit einem Silicon-Klebstoff verbunden. Die Vorrichtung wurde in die Peritonealhöhle einer nicht-fettleibigen diabetischen Maus implantiert.
  • Drei Wochen vor der Implantation wurde der Blutglucosespiegel unter nüchternen Bedingungen (FBG) der Maus durch Glucose-oxidase-Analyse zu 760 mg/dl bestimmt. Am Tag nach der Implantation betrug der Blutglucosespiegel unter nüchternen Bedingungen 380 mg/dl. Bei Entfernung der Vorrichtung nach der Implantation wurden an der Vorrichtung oder an der Membran keine fibroiden oder lymphoblastischen Anhaftungen festgestellt.
  • Beispiel 4
  • Eine Implantatvorrichtung wurde gemäß der Ausführungsform von 1 hergestellt. Der Rand wies einen Außendurchmesser von ½ Zoll und einen Innendurchmesser von 6,35 mm (¼ Zoll) auf. Eine Membran aus etwa 3 000 Å Poly-p-xylylen N wurde mit einem Silicon-Klebstoff auf die Seiten des Halses geklebt. Durch radiale Befüllungslöcher wurde das Innenvolumen der Vorrichtung mit etwa 5 000 Inseln eines ausgewachsenen Schweins gefüllt. Das Befüllungsloch wurde mit einem Siliconstopfen verschlossen. Vier derartige Vorrichtungen wurden in den Peritonealraum einer Bastardhündin mit einem Gewicht von etwa 12 kg, die einer Pankreasektomie unterzogen worden war, implantiert. Am Tag nach der Implantation wurden Plasma-Insulinspiegel von 21,2 und 22,2 μU/ml gemessen. Am 2. Tag nach der Implantation wurden Plasma-Insulinspiegel von 21,5 und 20,5 μU/ml gemessen.
  • Gemäß den 2 und 3 wird eine Vorrichtung 30 mit einer Mehrzahl von zylindrischen Kammern 32, die durch eine Anordnung von Durchgangslöchern in einer im allgemeinen rechteckigen, mit Poly-p-xylylen beschichteten Platte 36 definiert sind, bereitgestellt. Die Oberseite und die Unterseite der Löcher 34 werden mit Poly-p-xylylen-Membranen 38 auf die vorstehend beschriebene Weise verschlossen. Zellgewebe in einer flüssigen Matrix wird durch die radialen Füllungsöffnungen 40 in die Kammern 32 gebracht. Die Öffnungen werden anschließend mit Stopfen verschlossen. Die Anordnung der Kammern 32 ergibt für die Vorrichtung eine Redundanz, sofern es zu einem Reißen oder einer Schädigung der Membran, zu einer Verringerung des zellulären Ausstoßes und dergl. kommt.
  • Gemäß 4 umfasst eine Vorrichtung eine Platte 70 mit einer Mehrzahl von zellulären Tröpfchen 72, die darauf angeordnet sind und mit einer Membran 74 aus Poly-p-xylylen auf die vorstehend beschriebene Weise bedeckt sind. Die Vorrichtung wird gebildet, indem man das Gewebemedium in flüssiger Form oder unter Makroverkapselung in einem Schutzüberzug, wie Natriumalginat, auf eine mit Poly-p-xylylen beschichtete Platte aufträgt. Nach der Abscheidung werden die Tröpfchen und die Platte in der gewünschten Dicke mit Poly-p-xylylen beschichtet. Alternativ werden die Tröpfchen und die Platte eingefroren und beschichtet. Wenn die Implantation ansteht, wird die Vorrichtung zur Rekonstitution der Zellen aufgetaut. Die Zellen können gemäß dem Verfahren von R. V. Rajotte (Cryopreservation on Isolated Islets, 2nd International Conference on Use of Human Tissues and Organs, Search In Transplant, Oktober 1985, S. 46–51) eingefroren und aufgetaut werden.
  • Die Vorrichtungen können als einzelne Tröpfchen ausgebildet sein, die mit der vorerwähnten Membran eingekapselt sind. Die einzelnen Tröpfchen können in eingefrorenem Zustand oder als Makrokapseln in herkömmlicher Weise in einem Beschichtungsverfahren unter freiem Fall beschichtet werden oder an einem eingebetteten Faden aufgehängt und beschichtet werden. Anschließend werden die Zellen rekonstituiert und mit einem geeigneten Medium vermischt. Sie können sodann durch Injektion an den gewählten Ort gebracht werden.
  • Die Vorrichtung 80 kann auch die in 5 dargestellte Form annehmen. Speziell wird eine rechteckige Platte 82 mit einer Mehrzahl von Durchgangslöchern 102 versehen. Die obere Oberfläche der Platte und die oberen Öffnungen der Löcher werden mit einem Poly-p-xylylen-Überzug 104 beschichtet und stellen die vorerwähnte Membran dar. Die untere Oberfläche der Platte und die unteren Öffnungen der Löcher werden mit Poly-p-xylylen als rückwärtige Abdeckung 106 beschichtet, die mit einem geeigneten biologisch verträglichen Klebstoff angeklebt wird. Die inneren Kammern, die durch die Seitenwände der Löcher, die Membranen und die Abdeckungen begrenzt sind, werden mit Insulin erzeugenden Zellen in einer flüssigen oder gelartigen Matrix gefüllt.
  • Die Vorrichtung von 5 wird vorzugsweise hergestellt, indem man zunächst eine Platte 82 mit Poly-p-xylylen so beschichtet, dass sich auf sämtlichen Oberflächen, einschließlich der Begrenzungswände der Öffnungen, ein durchgehender gleichmäßiger Überzug bildet. Die Unterseite wird verschlossen und die Löcher werden mit destilliertem Wasser bis zu einem Niveau, das geringfügig unter der oberen Oberfläche liegt, gefüllt. Die gefüllte Platte wird sodann eingefroren und anschließend mit Poly-p-xylylen bis zur gewünschten Membrandicke beschichtet. Nach der Beschichtung wird die Vorrichtung zum Auftauen erwärmt. Die rückwärtige Platte wird abgenommen und das Wasser durch Verdampfen entfernt. Die Vorrichtung wird gestürzt und die angestrebte zelluläre Konzentration in den Löchern und der Membran abgeschieden. Sodann wird die rückwärtige Platte auf die beschriebene Weise an der unteren Oberfläche angeklebt.
  • Alternativ kann ein zelluläres Material enthaltendes Medium in den Löchern und der Platte, die gleichmäßig bis zur gewünschten Membrandicke beschichtet sind, eingefroren werden, wonach die Zellen auf die vorstehend beschriebene Weise aufgetaut werden. In einer derartigen Vorrichtung sind in jedem Kompartiment obere und untere Membranen vorgesehen.
  • Von großer Bedeutung bei der Entwicklung von bioartifiziellen Pankreasorganen und anderen biologischen Vorrichtungen ist die Möglichkeit zur Durchführung folgender Maßnahmen: (1) Lagerung und Inventarisierung der Inseln für die zukünftige Verwendung; (2) periodisches Testen der Inseln des Lagerbestands zur Bestätigung und Quantifizierung von deren Funktionalität, um in vivo die Leistungsspezifikationen zu gewährleisten; (3) Einverleibung der Inseln in die gewünschte Matrix und in die Implantatvorrichtung; (4) Inventarisierung, Testen und Bestimmung der Funktionalität der Vorrichtungen vor der Implantation; und (besonders wichtig) (5) Ermöglichen einer angemessenen Zeitspanne zur Bestimmung der Anwesenheit von etwaigen latenten viralen oder anderen pathogenen biologischen Verunreinigungen, um die Sicherheit für die Anwendung beim Menschen zu gewährleisten. Bisher wurde nur über begrenzte Erfolge bei der in vitro-Aufrechterhaltung der Funktionalität von pankreatischen Inseln berichtet.
  • Diese Ziele werden im Hinblick auf Lagerung, Herstellung, Funktionalitätstest, Inventarisierung und Testen auf pathogene Bestandteile erreicht, indem man eine Matrix auf der Basis eines Hydrogels verwendet, die zur Spaltung von Wasserstoffbrückenbindungen verarbeitet worden ist, um im Bereich der Körpertemperatur des Patienten einen frei fließenden, mit der Spritze handhabbaren oder flüssigen Zustand zu erreichen. Insbesondere ist das Hydrogel durch ein Gerüst aus langkettigen Sequenzen von Aminosäuren mit R-Gruppen gekennzeichnet, deren intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen aufgebrochen werden können, wodurch sich eine Entspiralisierung der Tropokollagen-Struktur ergibt. Diese intramolekularen Bindungen werden durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Wasserstoff an den R-Gruppen und Wasser ersetzt. Das Hydrogel wird im Fall eines Nichtkollagenase-Hydrogels durch wirksame Mengen an nativem Kollagen und/oder eines einer Siedebehandlung unterzogenen oder denaturierten Kollagens, d. h. Gelatine, ergänzt. Beide Produkte erweisen sich als wirksam bei der Bereitstellung von Bindungsstellen, an denen die zellulären Komponenten zur Gewährleistung einer stabilen Umgebung sich anheften können. Die Verbindung auf der Basis von Kollagen wirkt als Substrat für die zelluläre Anheftung von Inseln, Hepatozyten oder dergl., basierend auf der wärmeabhängigen Wasserstoffbrückenbildung und auf Dipolmoment-Wechselwirkungen, und ergibt ein natürliches Milieu für das zelluläre Wachstum. Die Verbindung auf Kollagenbasis enthält nach der Siedebehandlung polare und nicht-polare Aminosäuren, die leicht ein Gel auf der Basis von Amingruppen-, Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen- und Sulfhydrylgruppen-Wechselwirkungen bilden. Die Beständigkeit der Matrix gegenüber Krafteinwirkungen kann durch Zugabe von Chelatbildnern erhöht werden, die die Störung von Wasserstoffbrückenbindungen und Dipolmoment-Wechselwirkungen durch zweiwertige Kationen beseitigen. Freiliegende aktive Gruppen werden zur Immobilisierung von Wasser bei niedrigeren Temperaturen über diese Wasserstoffbrückenbindung herangezogen, wodurch thermische Schädigungen bei niedrigeren Temperaturen auf ein Minimum begrenzt werden.
  • Für die Lagerung wird eine wirksame Menge eines hochmolekularen Kryoschutzmittels zugesetzt, das es der Matrix ermöglicht, bei niedrigeren Temperaturen ohne Zellschädigung gelagert zu werden, wodurch sich ein Zustand eines unterdrückten Stoffwechsels ohne die Notwendigkeit einer Kryokonservierung ergibt. Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine zelluläre Matrix bereit, die ein metabolisch stabiles Kryokonservierungsmittel enthält, das ein inertes Polster gegen eine wärmeabhängige zelluläre Ausdehnung und Kontraktion ergibt. Bei einem bevorzugten Kryokonservierungsmittel handelt es sich um sulfatiertes Dextran, bei dem die Sulfhydrylgruppen Orte für Disulfidbindungen und eine erhöhte Matrixbeständigkeit gegenüber Kräften sowie eine Hemmung der Stickoxidanreicherung ergeben. Derartige sulfatierte Gruppen ergeben Stellen für Wachstumsfaktoren, wie IGF-I und IGF-II, von denen der Fachmann weiß, dass sie für das fortgesetzte Wachstum und die Aufrechterhaltung von Inseln erforderlich sind.
  • Die Lagermatrix kann durch Zugabe eines zweiwertigen Chelatbildners, z. B. Citrat, EDTA oder EGTA, optimiert werden, die die Steifigkeit der Matrix durch Beseitigung der Hemmung von Wasserstoffbrückenbindungen von -NH2 an -COOH erhöhen, eine schädliche Hydroxylbildung aus Superoxid durch Chelatbildung der für diesen Vorgang erforderlichen Übergangs- und Schwermetalle hemmen sowie einen Schutz gegen eine mikrobielle Verunreinigung bieten. Die Flüssigkeit zur Bildung der Matrix kann die Form eines anerkanntes Wachstumsmediums zur Bereitstellung von Nährstoffquellen für die Zellen annehmen. Um einen zusätzlichen Schutz gegen eine mikrobielle Verunreinigung zu gewährleisten, können herkömmliche Antibiotika zugesetzt werden.
  • Wenn die zellulären Komponenten einer Vorrichtung kurz nach dem Ernten einverleibt werden sollen, wobei eine Transplantation ohne Erfordernis einer Lagerung bei verringerten Temperaturen stattfindet, kann das Kryokonservierungsmittel mengenmäßig verringert oder weggelassen werden. Jedoch ist es für eine verbesserte Übertragung durch die Membran erwünscht, dass die Matrix im wesentlichen bei der Körpertemperatur des Wirts oder Patienten in flüssiger Phase vorliegt. Dies kann durch eine bestimmte Menge des zweiwertigen Chelatbildners erreicht werden. Dieser ist ferner erwünscht, um Wachstumsmedien und Antibiotika zu ergänzen.
  • Sofern die Matrix und zellulären Komponenten Schädigungen, Krafteinwirkungen oder Temperaturveränderungen während der Herstellung oder Lagerung der Vorrichtung ausgesetzt werden, kann es wünschenswert sein, die Steifigkeit der Matrix zu erhöhen, ohne die Verflüssigungstemperatur zu beeinflussen. Wie vorstehend beschrieben, kann dies erreicht werden, indem man die Bindungsbildung unter Verwendung von Aminosäuren mit R-Gruppen mit unterschiedlichem Potential zu Wasserstoffbrückenbindungen verstärkt. Derartige Aminosäuren und verwandte Verbindungen ergeben einen zellulären Schutz gegen Stickstoffoxid und dessen Metaboliten, von denen bekannt ist, dass sie einen Zelltod durch Kernzerstörung und andere damit verwandte Schädigungen hervorrufen. Die zelluläre Matrix bedient sich dieser Aminosäuren und verwandter Verbindungen, um L-Arginin an der Bildung von Stickstoffoxid durch eine der Isoformen von Stickstoffoxid-synthase zu hindern. Insbesondere Cystein und andere verwandte Verbindungen mit Sulfhydrylgruppen, die im Kollagenmaterial auftreten, dienen ebenfalls zum Abfangen von bereits gebildetem Stickstoffoxid und verhindern dabei, dass Stickstoffoxid Schädigungen herbeiführt.
  • Die vorliegende Erfindung bedient sich der neuartigen Hydrogel-Matrix zur Verwendung als bioartifizieller Pankreas, wobei isolierte Schweine-Inseln über längere Zeiträume hinweg, nämlich 6 Monate und länger, bei unter der Umgebungstemperatur liegenden Temperaturen, z. B. bei Kühlschranktemperaturen von 4°C, gelagert werden können. Wie vorstehend erörtert, beruht die verbesserte Hydrogel-Matrix auf einem erwärmten oder anderweitig denaturierten tierischen Kollagen, das gegen Zustände mit verminderten Temperaturen durch ein inertes polymeres Puffersubstrat, wie Dextran, Amylopectin, Proteoglycane und ähnliche hochmolekulare Kryoschutzmittel geschützt ist. Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass die verbesserte Hydrogel-Matrix auf dem Aufbrechen von kovalenten chemischen Bindungen durch eine Siedebehandlung oder chemische Behandlung und auf einer Erhöhung der Anzahl an wärmeempfindlichen Wasserstoffbrückenbindungen und Dipolmoment-Anziehungen beruht. Durch Ersatz der kovalenten chemischen Bindungen durch derartige temperaturempfindliche Bindungen und Anziehungswirkungen, kann das gewünschte Gewebe in einer festen Matrixzubereitung bei kälteren Temperaturen für eine längere Lagerung eingebettet werden. Indem man das gewünschte Gewebe in einer festeren Matrix hält, wird eine Schädigung aufgrund einer ständigen Einwirkung von Wasser verringert. Ferner werden Stoffwechsel und Gasaustausch unterdrückt. Im Endeffekt wird erfindungsgemäß das Gewebe konserviert, ohne dass es extremen, unter dem Nullpunkt ablaufenden Kryokonservierungstechniken ausgesetzt wird. Diese Matrix kann sodann bei erwünschten höheren Temperaturen flüssig gemacht werden, um den Stoffwechsel und das Wachstum zu steigern sowie um eine Diffusion von Nährstoffen und Hormonprodukten zu erleichtern. Aufgrund der Tatsache, dass beim ursprünglichen Hydrogelsubstrat die intermolekularen kovalenten Bindungen aufgebrochen sind (z. B. Sulfhydrylbindungen), kann die Matrix gemäß den gewünschten Angaben durch Zugabe von Komponenten modifiziert werden, die Dipolmoment-Anziehungen oder Wasserstoffbrückenbindungen verstärken.
  • Es stehen zahlreiche Beispiele für Hydrogel-Substrate neben Gelatine zur Verfügung, die sich für dieses Verfahren eignen, einschließlich einer Siedebehandlung unterzogene Agarose, Alginat, Keratin und andere Aminosäuren, Aminoglycane und Proteoglycane sowie andere Gele mit einem Gerüst, das aus langkettigen Sequenzen von Aminosäuren mit R-Gruppen besteht, deren intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen aufgebrochen und durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Wasserstoff an den R-Gruppen und Wasser ersetzt werden können, wodurch man eine gut erkennbare gelatinöse Konsistenz erhält. Diesbezüglich wurden beispielsweise 20 g Agar zu 5 ml Medium 199 gegeben und der pH-Wert der erhaltenen Lösung wurde mit 1 N HCl auf 2 verringert. Sodann wurde die Lösung bei 37°C 10 Minuten gerührt, bis eine vollständige Lösung eintrat. Anschließend wurde die Lösung mit 100 mg Dextran und 1 mM ETDA versetzt. Die erhaltene Zubereitung war bei einer Körpertemperatur von 37°C flüssig und bei einer Lagertemperatur von 4°C fest oder wesentlich stärker viskos. Derartige Techniken können auch für die übrigen beschriebenen Hydrogele verwendet werden, wobei man die Additive je nach Bedarf einstellt, um die angestrebten Ziele zu erreichen.
  • Je nach den angestrebten physikalischen Eigenschaften kann bei diesen Substraten die Beständigkeit gegen Krafteinwirkungen (Festigkeit) durch Zugabe von anderen Chemikalien erhöht oder verringert werden. Wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben, wird eine derartige Festigkeit durch Zugabe von Aminosäureresten mit polaren R-Gruppen oder zugänglichen Wasserstoff/Hydroxylgruppen zur Erhöhung der Dipolmoment-Anziehungen und Wasserstoffbrückenbindungen bei Abkühlung des verstärkten Substrats erhöht. Die Zugabe von im wesentlichen intaktem Kollagen oder denaturiertem Kollagen, Gelatine, zu einem der vorstehenden Hydrogelsubstrate ergibt eine Gitterstruktur für Gewebe oder isolierte Zellen zur Verankerung. Somit können beliebige Gewebe in diesen Typ von Hydrogel-Matrix eingebettet werden und ihre Eigenschaften können je nach dem angestrebten Verhalten des isolierten Gewebes gemäß den Ausführungen in den nachstehenden Beispielen eingestellt werden.
  • Um die isolierten Langerhans-Inseln zu schützen und zu konservieren, wird gemäß einem Beispiel erwärmtes tierisches Kollagen, d. h. Gelatine, verwendet, wobei das lebende Gewebe gegen verminderte Temperaturbedingungen mit einer wirksamen Menge eines inerten polymeren Puffersubstrats, wie Dextran, Amylopectin, Proteoglycane oder andere hochmolekulare Kryokonservierungsmittel, die zur Begrenzung von Schädigungen durch thermische Veränderungen im Wasser befähigt sind, geschützt wird. Diese Substrate wirken als Puffer gegen eine thermische Ausdehnung und Kontraktion. Ohne einen derartigen Puffer besitzen die Inseln eine verminderte Überlebensfähigkeit bei physikalischen Schädigungen, die durch Ausdehnung und Kontraktion aufgrund von Temperaturveränderungen hervorgerufen werden, sowie gegen Schädigungen, die sich bei Zellmembranen als Folge einer wärmeempfindlichen Bewegung von Wasser ergeben.
  • Ferner schützt die verbesserte Hydrogel-Matrix ein derartiges Gewebe gegen starke barometrische Schädigungen, z. B. gegen Vakuumdrücke, die bei Polymerbeschichtungsverfahren auftreten. Dies wird erreicht, indem man die Beständigkeit der Gelatine gegenüber Krafteinwirkungen durch Modulation der temperatur- und substratabhängigen Wasserstoffbrücken- und Disulfidbindungen erhöht. Die Matrix für die Lagerung und Herstellung kann verfestigt werden, indem man die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen durch Zugabe von Aminosäuren mit einem Gehalt an Carboxyl- oder Amin-R-Gruppen (die in Glutaminsäure oder Arginin auftreten), von Disulfidbindungen durch Zugabe von Cystein- oder Methioninresten oder erhöhte Dipolmoment-Anziehungswirkungen durch Zugabe von Aminosäuren mit ungeladenen, jedoch polaren R-Gruppen, wie Glutamin, Threonin oder Asparagin, verstärkt. Die Wasserstoffbrückenbindungen und Dipolmoment-Anziehungswirkungen können ferner mit einem zweiwertigen Chelatbildner, wie EDTA, verstärkt werden, das auch einen Schutz gegen eine bakterielle Verunreinigung der Matrix während der Lagerung bietet.
  • Kollagen tritt in sämtlichen tierischen Geweben in Form von wiederkehrenden Tropokollagen-Polypeptid-Untereinheiten auf, die Aminosäuren enthalten, die üblicherweise in anderen Proteinen nicht auftreten, einschließlich Glycin, Hydroxyprolin und Hydroxyzin. Kollagen bildet unlösliche Fasern von hoher Zugfestigkeit, wenn kovalente Vernetzungsbindungen mit reifem Gewebe gebildet werden. Wenn jedoch Kollagen einer Siedebehandlung wie beim Verfahren zur Herstellung von herkömmlicher Gelatine, unterzogen wird, werden diese Vernetzungsbindungen aufgebrochen und die dreidimensionale Struktur wird entfaltet, wodurch sich eine Vielzahl von Polypeptiden mit loser Assoziierung ergibt.
  • Kollagen ist das hauptsächliche bindende Protein, das in verschiedenen Geweben auftritt, einschließlich (zur Verstärkung der Steifigkeit) in Bändern, Sehnen, Knorpeln, Knochen und Zähnen, was auf die Fähigkeit von Kollagen zur Erzielung eines breiten Spektrums von physikalischen Eigenschaften aufgrund von intra- und intermolekularen Bindungskräften hinweist. Intaktes Tropokollagen ist das längste bekannte Protein mit einer Länge von 3 000 Å, wobei der Durchmesser jedoch nur 15 Å beträgt. Durch Sieden von Kollagen brechen die unlöslichen, eng gewickelten, helikalen Tropokollagen-Untereinheiten auf, was eine Öffnung des unlöslichen Tropokollagen-Moleküls aus seiner ursprünglichen, eng gewickelten Kabelkonformation unter Bildung von drei separaten Peptidketten ermöglicht. Diese individuellen Peptidketten werden sodann zur Ausführung von zwei vitalen Funktionen für die eingebetteten Inseln herangezogen. Erstens bieten sie Bindungsstellen zur Anheftung des isolierten Inselgewebes und zweitens ergeben sie ein temperaturempfindliches Substrat zur Verwendung zum Schutz der Inseln während des vorstehend beschriebenen Beschichtungsvorgangs.
  • Der Verlust der eng gewickelten, dreisträngigen, helikalen Struktur zeigt, dass der Strang durch eine Summierung von schwachen einzelnen Wechselwirkungen stabilisiert wird, die gemeinsam eine gegenseitige Stärkung über zusammenwirkende Wechselwirkungen ergeben. Eine Siedebehandlung bewirkt eine Abwicklung der einzelnen Stränge, so dass ihre Seitenketten-R-Gruppen für andere Wechselwirkungen verfügbar werden. Bei dem der Siedebehandlung unterzogenen Kollagen sind mehrfache Bindungsbereiche für eine Anheftung der Inseln freigelegt. 6 ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme (3 000-fache Vergrößerung) von isolierten Inseln, die an eine der offenen Einzelpeptidstränge binden, bei denen es sich vorher um eine eng gewickelte Tropokollagen-Helix handelte. Eine unvollständig abgewickelte Helix ist noch in dem eingerahmten Bereich von 7 vorhanden, was auch darauf hinweist, dass das native Material als Ergänzung zur Verstärkung der Bindungsstellen verwendet werden kann.
  • Das Aufbrechen der quer verlaufenden Wasserstoffbrückenbindungen, die die einzelnen Kollagenstränge aneinander binden, überwindet die sterische Stabilität, die durch die Abstoßung der Pyrrolidonringe der Hydroxyprolin- und Prolinreste erzielt wird. Wenn infolgedessen eine ausreichende Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Strängen aufgebrochen wird, destabilisiert die sterische Abstoßung die superhelikale Spirale und öffnet somit die einzelnen Stränge. Durch Zugabe von ergänzenden Aminosäuren, die hochgradig geladene polare Gruppen enthalten, wie Glutaminsäure und Arginin, ergibt sich eine erhöhte Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen an umgebende Gelatinestränge, wodurch Wasser und polare Gruppen an anderen Gelatinesträngen bei Temperaturen unter 30°C angezogen und immobilisiert werden. Diese Immobilisierung von Wasser vermindert Zellmembranschädigungen durch Temperaturänderungen. Die Zugabe von Cystein ermöglicht die Bildung von starken Disulfid-Vernetzungsbindungen. Zu anderen Aminosäuren, die diese Arten der Bindungsbildung verstärken, gehören solche mit polaren Seitengruppen, sowohl geladene als auch ungeladene, und solche mit der Fähigkeit zur Bildung von Sulfidbindungen.
  • Durch Erhöhung der Anzahl an Wasserstoffbrückenbindungen und Verstärkung der Bildung von Disulfidbindungen wird die Matrix gegenüber Krafteinwirkungen bei Temperaturen unter 30°C beständiger. Intaktes Schweinehaut-Kollagen weist eine Wärmestabilitätskonstante von 65°C auf (Temperatur, bei der 50% der Tropokollagen-Stränge dissoziieren). Durch Aufbrechen der helikalen Struktur wird die Schmelztemperatur der Matrix auf Gelatinebasis auf etwa 30°C gesenkt. Dies ist kritisch, um es der Matrix zu ermöglichen, bei Körpertemperatur (37°C) in geeigneter flüssiger Form vorzuliegen, um eine rasche, physiologische Übertragung von Glucose und anderen Nährstoffen durch die p-Xylylen-Membran zu ermöglichen.
  • Die Entfernung von zweiwertigen Kationen, die die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen stören, verbessert die Beständigkeit gegen Krafteinwirkungen, d. h. die Steifigkeit der Matrix. Dies kann durch Zugabe einer großen Anzahl von Chelatbildnern, wie EDTA, EGTA, Citrat und ähnlichen Chelatbildnern für zweiwertige Kationen, erreicht werden. Die sich ergebende Zunahme der Matrixsteifigkeit bietet einen Schutz gegen zustände, denen das Matrixgewebe während des Polymer-Beschichtungsvorgangs ausgesetzt ist, d. h. Vakuumdruck und niedrige Temperaturen, die in einigen Fällen die Inseln beeinträchtigen können.
  • Um die Inselbindung zu stärken, kann intaktes Schweine-Kollagen in geringen Mengen zugesetzt werden, um ein zusätzliches Bindungsnetzwerk für die Schweine-Inseln zu schaffen. Wie vorstehend erörtert, kann die Matrix für die Lagerung und Herstellung durch Verstärkung von Wasserstoffbrückenbindungen und eine Amin-Carboxyl-Vernetzung durch einen zweiwertigen Chelatbildner, wie EDTA, verfestigt werden, wobei derartige Chelatbildner auch einen Schutz gegen eine Verunreinigung der Matrix während der Lagerung bieten. Um eine maximale in vivo-Diffusion durch die Matrix zu gewährleisten, ist die Matrix so konzipiert, dass sie bei der Körpertemperatur des Empfängers in einem frei fließenden, mit einer Spritze handhabbaren oder flüssigen Phase vorliegt, während sie bei den verringerten Temperaturen, vorzugsweise bei Temperaturen, die geringfügig unter der Temperatur des Patienten liegen, d. h. 35°C, und bei Lagerungstemperaturen in fester Phase vorliegen. Da die Inseln bei verminderten Temperaturen einen verringerten Stoffwechsel aufweisen und der Membranbeschichtungsvorgang bei dieser Temperatur oder darüber stattfinden kann, im allgemeinen bei Raumtemperatur, ist es bevorzugt, die vorerwähnte Matrix für die Beschichtung bei einer Temperatur, die geringfügig unter der Patiententemperatur liegt, zu halten.
  • Die Gelatine zur Verwendung mit Schweine-Inseln, vorzugsweise eine Gelatine auf Schweinebasis, wird mit einem flüssigen (vorzugsweise herkömmlichen) biologischen Wachstumsmedium vermischt. Auf der Grundlage der angestrebten Geltemperatur ist die Gelatine in einer Konzentration von etwa 0,01 bis 30 mM, im allgemeinen von 0,1 bis 10 mM und insbesondere im Bereich von etwa 0,5 bis 5 mM vorhanden, wobei sich jeweils bei der Lagerungstemperatur eine feste Phase und bei der Transplantationstemperatur eine flüssige Phase ergibt. Die Flüssigkeit, Wasser oder im wesentlichen inaktive Flüssigkeiten und vorzugsweise mindestens ein Teil eines Wachstumsmediums sind im allgemeinen im Bereich von 15 bis 96,5 Gew.-% der Matrix und vorzugsweise in Mengen von etwa 45 bis 84,5 Gew.-% der Matrix vorhanden. Das Puffersubstrat ist in der Gelatine und in der flüssigen Matrix in einer Menge vorhanden, die ausreicht, einen thermischen Schutz bei der gewählten Lagerungstemperatur zu ergeben, und zwar in einer Menge von 0,1 bis 30 Gew.-% der Matrix, im allgemeinen im Bereich von etwa 0,5 bis 20 Gew.-% der Matrix und vorzugsweise im Bereich von 2 bis 10 Gew.-% der Matrix. Der zweiwertige Chelatbildner kann in der Lagerungsmatrix vorhanden sein, um den angestrebten strukturellen Zusammenhalt zu erzielen, und zwar im allgemeinen im Bereich von etwa 0 bis 20 Gew.-% der Matrix und vorzugsweise im Bereich von etwa 0,05 bis 10 Gew.-% der Matrix. Das Proteinmedium kann in der Matrix zur Gewährleistung der Ernährung der Inseln in einer Menge von 0,0 bis 30,0 Gew.-% der Matrix, im allgemeinen im Bereich von etwa 0,05 bis 20 Gew.-% der Matrix und vorzugsweise im Bereich von 5 bis 15 Gew.-% der Matrix vorliegen. Ein Antibiotikum kann zur Verhinderung von Infektionen oder Kontaminationen in herkömmlichen biologischen Packungen in einer Menge von 0,0 bis 30 Gew.-% der Matrix, im allgemeinen im Bereich von 0,05 bis 10 Gew.-% der Matrix und vorzugsweise im Bereich von 1 bis 6 Gew.-% der Matrix vorhanden sein. Natives Kollagen kann im Bereich von etwa 0 bis 30 Gew.-% der Matrix, im allgemeinen im Bereich von etwa 0,1 bis 5 Gew.-% der Matrix und vorzugsweise im Bereich von etwa 1 bis 3 Gew.-% der Matrix vorhanden sein. Aminosäuren sind in einer Konzentration von 0 bis 300 mM vorhanden.
  • Beispiel 5
  • Je nach den Anforderungen, die an die Matrix in Bezug auf die Beständigkeit gegen Krafteinwirkungen gestellt werden, besteht ein breiter Konzentrationsbereich für Additive für die Lagerung von Gewebe, die Züchtung von Gewebe oder die Beschichtung von Gewebe mit dem gleichmäßigen Polymeren gemäß den vorstehenden Ausführungen. Eine geeignete Matrix lässt sich gemäß den vorstehenden Angaben unter Verwendung der folgenden Matrixgrundlagen für die Lagerung, Herstellung und Implantation herstellen:
  • Kryokonservierungsmittel
    • 0,01 bis 1 000 μM Dextran, MG 500 000, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Kat. Nr. D5251
  • Gelatine
    • 0,001 bis 100 mM Gelatine aus Schweine-Kollagen, ungefährer "Bloom"-Wert 5–300, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO
  • Proteinadditiv
    • 0 bis 30% fötales Kälberserum, Life Technologies, Gaithersburg, MD, Kat. Nr. 16010–43
  • Antibiotika
    • 0,1 bis 30% Penicillin-Streptomycin-Lösung, Irvine Scientific, Santa Ana, CA, Kat. Nr. 9366
    • 0,001 bis 30% Fungizon, Irvine Scientific, Santa Ana, CA, Kat. Nr. 9352
    • 0,001 bis 30% Collistin, 0,001 bis 30% Ceftazidim
  • Kollagen
    • 0,01 μM bis 30 mM Typ II, säurelöslich aus Kalbshaut, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Kat. Nr. 3511
  • Aminosäuren
    • 0,01 μM bis 300 mM, dl-Cystein-hydrochlorid, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Kat. Nr. 9768
    • 0,01 μM bis 300 mM, L-Glutamin, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Kat. Nr. G-7029
    • 0,01 μM bis 300 mM, dl-Arginin-hydrochlorid, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Kat. Nr. A-4881
    • 0,01 μM bis 300 mM, l-Cystein-hydrochlorid, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Kat. Nr. C-4820
    • 0,01 μM bis 10 mM, l-Glutaminsäure-hydrochlorid, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Kat. Nr. G-2128
  • Zweiwertiger Chelatbildner
    • 0,001 bis 100 mM EDTA
  • Wachstumsmedium
    • Geeignete Volumina, um weitere Bestandteile auf die gewünschten Konzentrationen zu bringen, Medium 199, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Kat. Nr. 12340–022
  • Erfindungsgemäß werden diese Bedingungen einer stabilen, festen Kollagen-Infrastruktur wiederhergestellt, indem man die Inseln in eine Matrix mit einem Gehalt an durch eine Siedebehandlung denaturiertem Kollagen in Gegenwart des vorerwähnten Puffersubstrats und auch in Gegenwart eines Chelatbildners für zweiwertige Ionen oder Calcium, wie EDTA, EGTA, Citrat oder dergl., bringt. Diese Matrix ermöglicht es den Inseln, dass sie sich wieder an das Kollagenmedium anheften, wobei die Eigenschaften der Matrix so gesteuert werden können, dass sich eine bei Körpertemperatur flüssige Phase ergibt. Ferner kann die Beständigkeit der Matrix gegen Krafteinwirkungen durch den zweiwertigen Chelatbildner so gesteuert werden, dass sich eine bei der Beschichtungstemperatur, die beim Beschichtungszyklus zum Aufbringen der Membran auftritt, feste Phase ergibt. Die feste Beschichtungsphase, die durch den thermischen Schutz des Kryokonservierungsmittels verstärkt wird, ergibt einen Schutz gegen barometrische Schädigungen, die ansonsten beim Vakuum des Beschichtungsvorgangs auftreten würden. Außerdem verstärkt diese Matrix die in vitro-Lebensfähigkeit der Inseln, ermöglicht ein Testen des Inselgewebes vor dem Aufbringen der Membran und im Anschluss daran vor Implantationsvorgängen. Bevor die vorstehende Matrix verfügbar war, lag die von der Fachwelt beschriebene und anerkannte Überlebenszeit von Inseln im Bereich von 7 bis 14 Tagen. Wie nachstehend ausführlich erörtert, überleben die Inseln in der vorliegenden Matrix in vitro ohne Beeinträchtigung ihrer Funktionalität für Zeitspannen von mehr als 174 Tagen.
  • Beim Kollagen enthaltenden Medium kann es sich um denaturiertes Kollagen oder um im wesentlichen intaktes Kollagen handeln. Ein geeignetes denaturiertes Kollagen ist eine auf herkömmliche Weise erhaltene, einer Siedebehandlung unterzogene Gelatine von Tieren, Vögeln, Fischen sowie aus menschlichen Quellen. Beispielsweise können Gelatine für Nahrungsmittelzwecke sowie einer Siedebehandlung unterzogene Kollagene für medizinische Zwecke verwendet werden, die alle einer Bearbeitung zur Erzielung einer aufgefalteten faserigen Struktur unterzogen worden sind, wobei die dreidimensionale Struktur von nativem Kollagen aufgefaltet wird und das erhaltene Kollagen Polypeptide in loser Assoziation ergibt. Die Gelatine kann mit im wesentlichen intaktem tierischem Kollagen ergänzt werden, um für native Kollagen-Bindungsstrukturen zu sorgen. Das Kollagen ist in einer ausreichenden Menge vorhanden, um die angestrebte strukturelle Steifigkeit in einer dreidimensionalen Matrix zu erzeugen und um darin Haftungsstellen für die Inseln bereitzustellen. Das Puffersubstrat zum Schutz der Inseln bei niederen Temperaturen, d. h. vorzugsweise Dextran mit einem MG von 500 000, das vorzugsweise sulfatiert ist, trägt aufgrund der Sulfat-Seitengruppen zur verstärkten Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen bei. Ein weiteres Produkt ist Amylopektin. Beim Wachstumsmedium kann es sich um ein Gewebekulturmedium, wie Medium 199, RPMI und dergl., handeln. Beim Proteinmedium kann es sich um beliebige Seren, die von humanen oder tierischen Quellen abgeleitet sind, vorzugsweise um Seren von neugeborenen Kälbern oder um fötales Schweineserum, handeln.
  • In einer Reihe von Versuchen, bei denen die gleichen Matrixbestandteile gemessen wurden, mit der Ausnahme, dass einmal weniger als 1% Dextran und das andere Mal mehr als 7% Dextran vorhanden waren, verdoppelte sich die Fähigkeit der eingebetteten Inseln zur Sekretion von Insulin in Reaktion auf eine Belastung mit 100 mg/dl Glucose in der Matrix mit dem höheren Dextrangehalt, während sich bei den Inseln in der Matrix mit einem geringen oder gar keinem Gehalt an Dextran die Fähigkeit zur Sekretion von Insulin innerhalb der gleichen Zeitspanne halbierte.
  • Beispiel 6
  • Inseln wurden aus dem Milzlappen von frischen Schweine-Pankreasorganen unter herkömmlichem Verdau mit Kollagenase und Ficoll-Abtrennung isoliert. Die Inseln wurden sodann 5 Tage im Medium 199 bei 37°C inkubiert. Die Inseln wurden auf eine Hydrogel-Matrix mit einem Gehalt an einem Kollagen enthaltenden Medium, einem Puffersubstrat, einem Wachstumsmedium, einem Proteinmedium und einem zweiwertigen Chelatbildner übertragen. Die Matrix enthielt ferner verschiedene herkömmliche Additive, wie Antibiotika und Bakteriostatika. Die Matrix war bei Raumtemperatur fest, während sie bei der Patiententemperatur von etwa 37°C in flüssiger Phase vorlag.
  • Beispiel 7
  • Eine geeignete Matrix lässt sich entsprechend den vorstehenden Ausführungen unter Verwendung der folgenden Matrixgrundlage für die Lagerung, Herstellung und Implantation zubereiten:
  • Kryokonservierungsmittel
    • 6,0 g Dextran, MG 500 000, Sigma Chemical Co., St. Louis MO, Kat. Nr. D5251
  • Gelatine
    • 14,5 g unaromatisierte Knox-Gelatine, Knox Gelatin Inc., Englewood Cliffs, NJ
  • Wachstumsmedium
    • 60 ml Medium 199, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Kat. Nr. 12340–022
  • Proteinmedium
    • 0–15% Serum von neugeborenen Kälbern, Life Technologies, Gaithersburg, MD, Kat. Nr. 16010–043
  • Antibiotika
    • 1–3% Penicillin-Streptomycin-Lösung, Irvine Scientific, Santa Ana, CA, Kat. Nr. 9366
    • 1–3% Fungizon, Irvine Scientific, Santa Ana, CA, Kat. Nr. 9352
  • Kollagen
    • 50–100 mg Typ II, säurelöslich aus Kalbshaut, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Kat. Nr. C-3511
  • Zur Herstellung der Matrixgrundlage wird das Wachstumsmedium in ein Becherglas gegeben und mit einem Rührstab unter Erwärmen auf einer Rührheizplatte bis zum gründlichen Vermischen rasch gerührt. Sodann wird das Puffersubstrat langsam zum Wachstumsmedium unter Aufrechterhaltung des Rührvorgangs zugegeben. Die vereinigte Lösung wird 1 bis 2 Minuten einer Ultraschallbehandlung unterzogen, wonach langsam die Gelatine zur Lösung unter Rühren und Erwärmen zugegeben wird. Sodann wird die Lösung 5-mal in Abständen von 10 Sekunden einer Mikrowellenbehandlung und sodann 1 bis 2 Minuten einer Ultraschallbehandlung unterzogen. Anschließend werden 2–10 mM EDTA zu der warmen Lösung gegeben. Nach gründlichem Vermischen wird die Lösung in einen auf 60–70°C erwärmten Vakuumtrockenschrank gegeben und evakuiert. Die erwärmte evakuierte Lösung wird einer mindestens 5-minütigen Äquilibrierungsbehandlung unterzogen und vor der Zugabe der Inseln auf 37°C abgekühlt.
  • Beispiel 8
  • Inseln wurden zu der Matrix des vorstehenden Beispiels 6 in einer Menge von etwa 200 Inseln/100 μl Matrix gegeben. Ein Teil der Inselmatrix wurde auf 36 mm-Polystyrol-Vertiefungen übertragen. Der Rest der Inselmatrix wurde auf 18 6,5 mm-Zylindervorrichtungen mit einem offenen Ende in einer Menge von 220 Inseln/10 ml Matrix übertragen. Die Vorrichtung wurde zur Verfestigung der Matrix abgekühlt und gleichmäßig mit Poly-p-xylylen N in einer Dicke von etwa 4 000 Å beschichtet.
  • Die Inseln in den Vertiefungen und die Vorrichtungen wurden für Zeitspannen bis zu 2 Wochen in einem Kühlschrank aufbewahrt, bevor sie für Zeitspannen von 1 bis 3 Stunden auf 37°C erwärmt wurden. Während dieser Zeitspanne wurden statische Inkubationen bei verschiedenen Glucosekonzentrationen durchgeführt.
  • Bei den Inseln in den Vertiefungen wurde das umgebende Nährmedium alle 30 Tage ausgetauscht. Eine 15-minütige Inkubation in 22,0 mM Glucose stimulierte 73 Tage nach der Isolierung 3 μU Insulin. Die Vorrichtung sezernierte 1,61 μU, 6,67 μU bzw. 15,6 μU Insulin in Reaktion auf eine 180-minütige statische Inkubation mit 2,25, 5,5 bzw. 11,0 mM Glucose 36 Tage nach der Isolierung. Die Inselstruktur blieb in sämtlichen Inseln im Großen und Ganzen 73 Tage ohne bakterielle Kontamination intakt.
  • 6–11 zeigen rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen (45–18 000 X) von 90 Tage alten Inseln. Wie in 6 dargestellt, sind Cluster von Inseln, die repräsentativ mit dem Bezugszeichen 200 bezeichnet sind, an den Kollagenfasern 202 (45 X) an verschiedenen Stellen entlang der Faserlänge angeheftet, was die Haftung des Inselgewebes an den Matrixpolymeren unter Aufrechterhaltung der groben Inselstrukturen darlegt. 7 ist eine weitere Vergrößerung von 6 und erläutert das Anhaften von Inseln entlang der Kollagenfasern (3 000 X), wobei es sich beim Einsatz von 7 gemäß der Darstellung in 8 um einen Cluster von Inseln, die noch nicht an den Fasern haften, handelt. 9 zeigt einen repräsentativen Cluster von Inseln, die am Fasernetzwerk haften (9 000 X). 10A zeigt die Bindungsstelle 204 einer einzelnen beta-Zelle (18 000 X) zum Anheften an die Kollagenfasern. 10B zeigt eine einzelne beta-Zelle zur Darstellung von Anzeichen einer Zellteilung in der Matrix. 11 zeigt einen Strang von Kollagen 206, der während der Siedebehandlung nicht aufgefaltet wurde. 12 und 13 sind lichtmikroskopische Aufnahmen von 90 Tage alten Inseln nach Entfernung aus der Matrix durch Zugabe von zweiwertigen Kationen (4 mM Calciumchlorid). Es zeigt sich eine weitgehend intakte Morphologie.
  • Derzeit anerkannte Techniken zum Ernten von Inseln beruhen auf hochgereinigten intakten vollständigen Inseln für die Transplantation. Um dieses Ergebnis zu erzielen, ist ein hoher Zeitaufwand und ein kostspieliger Materialaufwand erforderlich, wobei im allgemeinen geringe Ausbeuten erzielt werden. Wenn bisher Pankreas einem übermäßigen Verdau unter Bildung einer erheblichen Inselfragmentierung unterzogen worden war, wurde die Ernte verworfen, da es herkömmlicherweise nicht anerkannt war, dass fragmentierte Inseln ihre Funktionalität behielten. Die vorstehend beschriebene Matrix ermöglicht die Verwendung von derartigen fragmentierten Inseln mit intakter Funktionalität in herkömmlichen Lagermedien oder Matrices.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht ferner die Verwendung von übermäßig verdauten Pankreasorganen in der vorerwähnten Matrix. Insbesondere wurde Schweinepankreas auf herkömmliche Weise durch das Kollagenase-Verfahren verdaut. Anstelle der Beendigung des Verdauungsvorgangs beim Auftreten von frei schwimmenden, vollständigen Inseln wurde der Verdauungsvorgang fortgesetzt, bis eine erhebliche Fragmentierung beobachtet wurde. Anschließend wurde der Verdauungsvorgang beendet. Die Fragmente wurden wiederholt gewaschen und zentrifugiert, bis man ein Pellet von fragmentierten Inseln, die im wesentlichen frei von azinösem Gewebe waren, auftrat. Die Inseln wurden mit der Matrixzubereitung des vorstehenden Beispiels 7 in einer Menge von etwa 3 000 Inseläquivalenten/ml Matrix vermischt. Die Inselmatrix wurde sodann in einer 36 mm-Plattenvertiefung abgeschieden und gekühlt. Die Inselmatrix wurde täglich auf 37°C erwärmt, unter einem Mikroskop betrachtet und mit einer Videokamera aufgenommen. In den ersten Tagen ergaben die einzelnen Betrachtungsfelder im wesentlichen frei schwimmende Inselfragmente. In den anschließenden Tagen kam es jedoch zu einer Verringerung der Fragmente, und Cluster von anscheinend vollständigen Inseln traten auf, 14 Tage nach der Ernte waren nur Cluster von Inseln, die im wesentlichen frei von Fragmentierungen waren, sichtbar, wobei Insulinkonzentrationen von 150 μU/ml in Reaktion auf eine Reizung mit 100 mg Glucose freigesetzt wurden.
  • Die vorstehende Matrix ergibt auch mit kryokonservierten Inseln, die 18 Monate in flüssigem Stickstoff eingefroren worden sind, vorteilhafte Ergebnisse, wobei unter diesen Bedingungen bisher bei der Rekonstitution eine schlechte Funktionalität festgestellt wurde. Inseln, die kryokonserviert worden waren, wurden aufgetaut und in der vorstehenden Matrix in einer Menge von 1 000 Inseln pro 100 μl Matrix vermischt und verteilt sowie in einer Vorrichtung mit 8 Zylindern mit offenen Enden verfestigt. Anschließend wurde die Vorrichtung gleichmäßig mit Poly-p-xylylen N in einer Dicke von etwa 4 000 Å beschichtet. Die maximale Sekretion aus der Vorrichtung betrug 2 Tage nach der Beschichtung 2,2 μU/ml. Nach jeweils weiteren 3–4 Tagen verdoppelte sich die maximale Sekretion auf etwa 4,4, 8,3, 19,0 bzw. 33,0 μU/ml in Reaktion auf eine Belastung mit einer normalen Blut-Glucosekonzentration von 100 mg. Da die durchschnittliche Serum-Insulinkonzentration bei einer nüchternen, nichtdiabetischen Person 5 bis 20 μU/ml beträgt, ist ersichtlich, dass die kryokonservierten Inseln nach dem Auftauen eine therapeutische Funktionalität zeigten.
  • Die Matrix fördert ferner bei in vivo-Anwendung außerhalb der Vorrichtung die Vaskularisierung und die Lipidbildung in Nachbarschaft zur Membran an intramuskulären Transplantationsstellen, bei denen man bisher der Ansicht war, dass eine Sauerstoffversorgung und ein Gefäßzugang nicht in ausreichendem Maße vorhanden waren, um eine Langlebigkeit der Inseln zu fördern. Ferner wurden speziell etwa 32 gefüllte und beschichtete Zylinder mit offenem Ende gemäß 5 intramuskulär einem ausgewachsenen Beagle-Hund von 15 kg Gewicht zwischen den breitesten Rückenmuskeln implantiert. Zu weiteren Stellen gehören leicht zugängliche Bereiche, wie subkutanes Fett, intraperitoneale Orte oder Orte in der Nähe des portalen Kreislaufs. Die Operationsstelle wurde nach Einsetzen der Vorrichtung mit etwa 20 ml Matrix gefüllt. Die Zylinder enthielten insgesamt etwa 30 000 Inseln. Der Hund wurde einer Pankreasektomie unterzogen und in Bezug auf seine Blut-Glucosespiegel und Schweine-C-Peptid-Spiegel überwacht. Positive Beiträge der Vorrichtung zu den Glucosespiegeln und C-Peptidspiegeln wurden festgestellt. Jedoch wurde am 17. Tag eine schwere Organfehlfunktion aufgrund der Pankreasektomie festgestellt. Das Tier wurde getötet. Bei Entnahme der Vorrichtungen ergab eine pathologische Prüfung eine erhebliche Bildung von Mikrogefäßen und ein Lipidwachstum in der Matrix über den Membranen, beides Voraussetzungen für die Aufrechterhaltung und Langlebigkeit von Inseln.
  • Ferner setzt die Matrix in Kombination mit der Membran Insulin innerhalb eines anerkannten Zeitrahmens in Reaktion auf eine Glucosebelastung frei und hört nach Wegfall der Belastung mit der Freisetzung auf, was ein Anzeichen für eine rasche Übertragung des Glucosesignals auf die Inseln unter Stimulation der Insulinfreisetzung und Diffusion des freigesetzten Insulins durch die Membran bei Wegfall des Signals darstellt. Außerdem könnte die Unfähigkeit der Vorrichtung zum Abschalten rasch nach der Normalisierung der Glucosespiegel zu einer fortgesetzten Bildung von Insulin nach der Normalisierung und somit zu potentiell drohenden hypoglykämischen Zuständen führen. Die Fähigkeit der vorliegenden Vorrichtung wird folgendermaßen klar dargelegt. Die Matrix wurde in eine Vorrichtung mit 18 Zylindern, die gleichmäßig mit etwa 4 000 Å Poly-p-xylylen N beschichtet waren, eingebettet. Die Vorrichtungen wurden sodann an den Tagen 3, 8 und 12 getestet. Wie in 14 dargestellt ist, zeigte die Vorrichtung in Reaktion auf eine Belastung mit 100 mg/dl Glucose innerhalb von 15 Minuten des Reizes eine erhöhte Insulinbildung und erreichte einen Peak von 300 μU/ml Insulin. Sodann wurde die Vorrichtung entfernt und in eine 50 mg/dl-Glucoselösung gebracht. Wie in 15 dargestellt ist, wurde ein Peak von 130 μU/ml Insulin erreicht, was im Vergleich zum vorstehenden Wert eine erhebliche Verringerung darstellte. Durch weiteres Testen wurden festgestellt, dass die Insulinbildung innerhalb von 10 bis 20 Minuten auf Ruhewerte zurückkehrte. Ferner wurde die Vorrichtung einer Belastung mit 400 mg/dl Glucose ausgesetzt. Dabei ergaben sich ähnliche Tendenzen in Bezug auf Reiz und Abschalten. Außerdem zeigte sich keine Verringerung der Inselsekretion in Reaktion auf Glucose über die Testdauer hinweg, was zeigt, dass die Inseln erhalten blieben und ihre Funktionalität innerhalb der beschichteten Vorrichtung verbessern konnten.
  • Beispiel 9
  • Eine geeignete Vorrichtung zur Aufnahme der zellulären Matrix ist ein Polyethylenstreifen mit 8 Vertiefungen der Fa. CoStar Inc., Cambridge, MA, die eine Mehrzahl von Inseln enthaltenden Kapseln bereitstellt. Wie in 16 dargestellt ist, wurden in jede Kapsel oder Vertiefung 240 des Streifens 242 etwa 20 dl Matrix 244 injiziert. Jeder Streifen enthielt etwa 30 000 bis 100 000 Inseln, die im wesentlichen gleichmäßig in den Vertiefungen verteilt waren. Die obere Oberfläche der Matrix weist unterhalb der oberen Oberfläche des Streifens eine Ausnehmung auf. Die Streifen und die obere Oberfläche der Matrix sind gleichmäßig mit Poly-p-xylylen N in einer Dicke von etwa 4 000 Å beschichtet. Die Matrix mit der Ausnehmung bietet eine Membranoberfläche 246, die auf diese Weise bei der Implantation gegen einen direkten Gewebekontakt geschützt ist. Ferner führen etwaige Fluidkräfte, die vom Empfänger erzeugt werden, nur zu Druckkräften auf die Membran und die Matrix, wodurch die Gefahr eines Reißens der Membran vermindert wird.
  • Einem ersten Hund (Dog ASY), einer zu diesem Zweck gezüchteten Beagle-Hündin mit einem Gewicht von 9 kg, wurde das Äquivalent von 3 Streifen mit einem Gehalt an etwa 30 000 Inseln durch einen intramuskulären Einschnitt entlang des linken dorsalen Thorax hinter der Schulter eingesetzt. Anschließend wurde an der Schnittstelle eine Infiltration mit etwa 20 ml einer nicht-zellulären Matrix vorgenommen und der Schnitt wurde verschlossen. 7 Tage später wurde an dem Hund ASY eine vollständige Pankreasektomie vorgenommen. Die Blutglucosewerte wurden täglich unter Verwendung eines OneTouch Meter-Geräts der Fa. Lifescan sowie mit üblichen klinischen Analysenautomaten bestimmt. Die täglichen Blutglucoseablesungen im nüchternen Zustand sind in 17 dargestellt. Um den Blutglucosespiegel unter etwa 150 mg/dl zu halten, erhielt der Hund ASY eine Kombination von humanem Ultra-Lente-Insulin und regulärem Insulin in der angegebenen Gesamtmenge bei einer im wesentlichen gleichmäßigen Aufteilung. Die Verabreichung des normalen Insulins erfolgte zur Kontrolle der Blutglucosespiegel und die Verabreichung des Ultra-Lente erfolgte zur Aufrechterhaltung der Glucosespiegel, jeweils gemäß üblicher Praxis. Die Anzahl der Inseln in den Vorrichtungen lag deutlich unter der von anderen Forschungsgruppen für eine glykämische Steuerung ermittelten Anzahl, d. h. etwa 8 000 Inseln pro kg oder etwa 120 000 Inseln für einen Hund der vorliegenden Größe.
  • Im Hinblick auf den Mangel an Inseln ist die Feststellung dennoch wichtig, dass die Vorrichtung innerhalb des Empfängers funktioniert. Dies kann erreicht werden, indem man die C-Peptid-Spiegel durch einen für Schweine spezifischen Radioimmunoassay (RIA) bestimmt. Bei diesem Test wird ein "C"-förmiges Peptid gemessen, das vom Proinsulin-Molekül durch Peptidasen vor dem Verlassen der Insel abgespalten wird, wodurch das biologisch aktive Insulinmolekül entsteht. C-Peptid ist Speziesspezifisch. Hochspezifische RIA-Testpackungen (erhältlich von der Fa. Linco Inc., St. Louis, MO) unterscheiden leicht zwischen Hunde-C-Peptid und Schweine-C-Peptid, wobei ein Nachweis des letztgenannten Produkts ein Anzeichen für die Insulinbildung durch die implantierten Vorrichtungen darstellt. Beim Hund ASY wurden periodisch Blutproben entnommen und auf Schweine-C-Peptid getestet. Die Ergebnisse sind in 19 dargestellt. Dabei wurden die Vorrichtungen am Tag 1 implantiert. Der Pankreas wurde am Tag 8 entfernt. Während der Zeitspanne vor der Pankreasentfernung wurde Schweine-C-Peptid in den Blutproben nachgewiesen, was darauf hinweist, dass die Vorrichtung Schweineinsulin erzeugte. Während des gesamten Versuchs wurden nachweisbare Konzentrationen festgestellt, ausgenommen offensichtliche Ruhezeiten.
  • In vitro-Versuche wurden durchgeführt, um den Einfluss der beschriebenen Matrix auf den RNA-Gehalt, ein Maß für die zelluläre genetische Codierung der Proteinbildung, und auf das Sekretionsvermögen für Insulin festzustellen. 18 zeigt, dass 5 000 Inseln, die vor 7 Tagen isoliert worden waren, eine maximale Insulinsekretion zeigten, bei einem Nadir von gemessener gesamter RNA. Gleichermaßen erreichte die gesamte RNA am Tag 21 maximale Konzentrationen, obgleich nur eine minimale Insulin-Sekretionsfunktion vorlag. Während der Messzeiten blieb die Lebensfähigkeit der Inseln konstant. Diese Daten lassen auf ein gegenläufiges Pendeln der RNA-Bildung in Bezug zum Insulin-Sekretionsvermögen im Laufe der Zeit schließen, so dass bei zunehmender mRNA die Insulinsekretion steigt und umgekehrt. Diese in vitro-Daten werden durch eine IVGTT-C-Peptid-Messung an Versuchstieren gemäß den folgenden Angaben gestützt. Nach derartigen Ruheperioden erreichte die Bildung von C-Peptid im wesentlichen die gleichen Werte oder höhere Werte, verglichen mit den Konzentrationen vor dem Test. Während einer derartigen Ruheperiode (Tag 15) wurde ein herkömmlicher intravenöser Glucose-Toleranztest (IVGTT) am Hund ASY durchgeführt. Die in 20 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Vorrichtung zur Erzeugung großer Mengen von Schweineinsulin in Reaktion auf eine Glucosebelastung befähigt war.
  • Ein zweiter Hund (Hund ABJ), eine gezüchtete Beagle-Hündin mit einem Gewicht von 10 kg, erhielt das Äquivalent von 4 Streifen mit einem Gehalt an etwa 200 000 Inseln durch einen intramuskulären Einschnitt entlang des linken dorsalen Thorax hinter der Schulter eingesetzt. Anschließend wurden in den Schnitt etwa 20 ml einer nicht-zellulären Matrix infiltriert. Der Schnitt wurde verschlossen. 7 Tage später wurde am Hund ABJ eine vollständige Pankreasektomie vorgenommen. Die Blutglucosewerte wurden täglich bestimmt. Die Werte der Blutglucose sind in 24 dargestellt. Wie beim Hund ASY erhielt der Hund HBJ zur Aufrechterhaltung des Blutglucosespiegels unter etwa 150 mg/dl im wesentlichen während des gesamten Tags Ultra-Lente-Insulin und normales Insulin in den angegebenen Gesamtmengen.
  • Ferner wurden die C-Peptid-Spiegel periodisch bestimmt. Die Ergebnisse sind in 23 und in den 21A und 21B aufgeführt. Die Vorrichtungen wurden am Tag 1 implantiert. Die Pankreasentfernung erfolgte am Tag 8. Während des Zeitraums vor der Pankreasentnahme wurde Schweine-C-Peptid in den Blutproben nachgewiesen, wobei die Konzentrationen von 0,04 auf 0,18 ng/ml in Reaktion auf den üblichen 0,5 g/kg-i.v.-Glucosebolus stieg. Während des Versuchs wurden nachweisbare Konzentrationen festgestellt, ausgenommen die Ruhezeiten. Nach derartigen Ruhezeiten erreichte die Bildung von C-Peptid im wesentlichen die gleichen Werte wie vor dem Test oder höhere Werte. 21B zeigt die Werte für IVGTT-Glucose, C-Peptid und gesamtes Insulin für den Hund ABJ 40 und 57 Tage nach der Implantation (31 und 48 Tage nach der Pankreasentnahme). Am Tag 40 betrug der maximale Glucosespiegel 692 und am Tag 57 690 mg/dl 1 Minute nach Gabe des Glucosebolus. Jedoch erreichte am Tag 57 das C-Peptid nach 1 Minute eine maximale Freisetzungskonzentration einer ersten Phase, ohne signifikante Verringerung (0,14 mg/ml) in Bezug zu den Anfangswerten.
  • Ein dritter Beagle-Hund (ABM) wies 21 Tage nach der Implantation und 2 Wochen nach der Pankreasentnahme eine maximale Konzentration an C-Peptid von 0,14 mg/ml auf. Die IVGTT-Daten vor der Pankreasektomie sind in 22A dargestellt. Nach 45 Tagen zeigte eine Wiederholung des IVGTT eine maximale Schweine-C-Peptid-Konzentration von 0,28 mg/ml und nach 59 Tagen von 0,48 mg/ml (22B). Ferner fielen die maximalen Blutglucosewerte des Hundes ABM von 1 740 mg/dl auf 790 mg/dl in Reaktion auf den IVGTT-Glucosebolus.
  • Wie vorstehend erwähnt, ist es ersichtlich, dass die Inseln in der Matrixzubereitung gedeihen und sich vermehren. Um die Art dieser Besserung zu bestimmen, wurde eine elektronenmikroskopische Bewertung der Matrix und eine mRNA-Bestimmung durchgeführt. Aus den 6–11 ist ersichtlich, dass Cluster von Inseln nach 74 Tagen an und entlang der Kollagenstränge haften, während anfängliche Beobachtungen nur eine minimale Haftung ergaben. Eine Besserung bezüglich der gebildeten Mengen von C-Peptid wird im Laufe der Zeit sowohl in vivo als auch in vitro in der vorerwähnten Matrix festgestellt. Damit verbunden ist eine Inselbindung an die Kollagen-Infrastruktur, die in vivo erfolgt, bevor derartige Zellen zur Herstellung von Insulin stimuliert werden können. Die Depression in der äußeren Oberfläche der Insel stellt eine der beiden Orte dar, von denen angenommen wird, dass sie an der Bindung der Inseln an die Kollagenstränge beteiligt sind.
  • Um ferner festzustellen, ob sich das Inselgewebe vermehrte, wurde ein üblicher Einbauversuch mit tritiertem Thymidin an isolierten Schweineinseln bei Züchtung in Medium 199 unter Vergleich mit Inseln durchgeführt, die in der vorerwähnten Matrix mit einem Gehalt an sulfatiertem Dextran (5% Gew./Vol.) Medium 199, 5% fötales Kälberserum, Kalbshaut- und Schweinehaut-Kollagen, DL-Cystein, L-Glutaminsäure, DL-Arginin und L-Arginin-Analoge (50–100 μM), einschließlich Aminoguanidin, M-Monomethyl-L-arginin, N-Nitro-L-arginin, die als Stickstoffoxid-Inhibitoren dienen, gezüchtet wurden. Vorstufen (tritiertes Thymidin, 1 μCi/ml) wurden innerhalb einer Inkubationsdauer von 3 Tagen in die DNA-Markierung eingebaut und anschließend aus dem Gewebe extrahiert. Das Verfahren beruht auf dem Verfahren von Levya und Kelley (Analytical Biochemistry, Bd. 62 (1974), S. 173–179). Zellen wurden durch wiederholte Einfrier/Auftauvorgänge in Tris-Puffer lysiert. Die gesamten Nucleinsäuren wurden ausgefällt und in Perchlorsäure hydrolysiert. Eine Aliquotmenge der Zubereitung wurde dazu herangezogen, den Thymidin-Einbau in Form von durch Szintillationszählung erfasster Radioaktivität zu bestimmen. Ein weiterer Teil wurde zur quantitativen Bestimmung der gesamten vorhandenen DNA unter Verwendung von Diphenylamin und Acetaldehyd zur Bildung einer bei 600 nm nachweisbaren Färbung verwendet.
  • Diese Untersuchungen zeigten einen verstärkten Thymidineinbau in Inseln, die sich 3 Tage in der Matrix befanden, verglichen mit einer herkömmlichen Oberflächenkultur bei 4 oder 37°C. Ferner zeigten Vergleiche von Inseln, die bis zu 30 Tagen unter diesen beiden Bedingungen gehalten wurden, einen drastischen Unterschied des Vermehrungsverhaltens, wobei in die Matrix eingebettete markierte Inseln nahezu die 30-fache Menge der Mediumkontrollen einbauten. Bei Kulturen im Doppelversuch ergab eine Analyse eine sehr enge Übereinstimmung der Mengen an eingebauter Markierung, sowohl für Matrix- als auch für Mediumkulturen. Der Einbau von tritiertem Thymidin im Laufe der Zeit wurde geprüft. Die Ergebnisse von zwei Versuchen zeigten eine Abnahme der Aktivität in der frühen Züchtungsperiode, was auf eine zyklische Natur dieses Vorgangs in der Periode vor 30 Tagen schließen lässt, wie es früher für die Genexpression und Insulinsekretion in den Inselkulturen festgestellt wurde. Die Ergebnisse einer quantitativen DNA-Bestimmung ergaben, dass mehr als 300 μg DNA aus 28 000 Inseln in die vorstehende Matrix eingebettet wurden und dass dieser Anteil über 30 Tage stabil blieb. Diese Daten bestätigen ferner die Fähigkeit der Matrix zur Verstärkung der Lebensfähigkeit der Inseln sowie die Funktionsfähigkeit der Inseln, gemessen durch die Insulinsekretion.
  • Die Zugabe der vorerwähnten Stickstoffoxid-Inhibitoren und -Fänger, d. h. L-Arginin-Analoge und sulfatierte Verbindungen, wie Dextran, Heparin, Cystein, Cystin und dergl., verbessert die Insel-Überlebensfähigkeit und die Sekretionsfunktion. Einige der vorerwähnten Substrate dienen, wie vorstehend erwähnt, zweifachen Aufgaben, indem sie für einen erhöhten Strukturzusammenhalt sorgen, jedoch auch eine Hemmung der Bildung von Stickstoffoxid bewirken, was zu einem relativen Zustand der Insel-Hypoxie führt. Somit weisen Inseln, die in die vorerwähnte Matrix eingebettet sind, aufgrund der Hemmung von Stickstoffoxid auch nach monatelanger Lagerung im Zustand relativ geringer Sauerstoffmengen keine zentrale Nekrose auf. Stickstoffoxid übt eine Schutzrolle bei Ischämie-Hyperperfusionsschädigungen durch eine Bindung von Übergangs- oder Schwermetallen, wie Eisen oder Zink, aus, die die Umwandlung von Superoxid (O2 –) zum stark toxischen und reaktiven Hydroxylradikal (OH–) begünstigen. Stickstoffoxid kann an Metallbindungsstellen binden und somit die Bildung des stärker toxischen Hydroxylradikals hemmen. Es wirkt somit als Antioxidationsmittel wie Metallchelatbildner oder Superoxiddismutase. Die Zugabe von EDTA zu der Matrix dient zur Hemmung des Hydroxylradikals anstelle des gebundenen Stickstoffoxids, das diese Funktion nicht mehr ausüben kann.
  • Wenn eine Lagerung in der Kälte nicht erforderlich ist, kann die vorerwähnte Matrix ohne Zugabe von einer Siedebehandlung unterzogenem Kollagen zubereitet werden und die Inseln können über Wochen in einer gebräuchlicheren flüssigen Umgebung bei 37°C gehalten werden. Die Zugabe verschiedener sulfatierter Verbindungen und von L-Arginin-Analogen erhöht die Lebensfähigkeit der auf diese Weise gehaltenen Inseln unter sterilen Kulturbedingungen über Wochen.
  • Ferner führt die Verwendung dieser Stickstoffoxid-Inhibitoren und -Fänger bei Zugabe zu einer enzymatischen Lösung zur Verdauung von Organen und Gewebe, wie Pankreas zur Freisetzung von Inseln, Leber zur Freisetzung von Hepatozyten, Haut zur Präparation von Adipozyten und Milz zur Präparation von Splenozyten, zu verbesserten Ausbeuten. Beispielsweise verstärken die Stickstoffoxid-Inhibitoren und -Fänger bei Zugabe zum herkömmlichen Kollagenase-Verdauungsmedium zum Zeitpunkt der Inselisolierung aus Pankreasorganen die Endothel-Steifigkeit und verhindern dadurch eine Dehnung des Bindegewebes. Somit ergibt sich eine saubere enzymatische Spaltung, was zu einer Verbesserung der Größe und der Anzahl der Inseln führt. Zu geeigneten Stickstoffoxid-Inhibitoren und -Fängern gehören die vorerwähnten Produkte, einschließlich Dextran, Heparin, Cystein und Cystin sowie L-Arginin-Analoge, einschließlich Aminoguanidin, N-Monoethyl-L-arginin, N-Nitro-L-arginin oder D-Arginin. Akzeptable Enzymlösungen enthalten Kollagenase, Trypsin, Liberase (Boehringer-Mannheim) und proteolytische Enzyme. Die wirksame Menge hängt vom verdauten Gewebe oder Organ und von den Komponenten der Verdauungslösung ab, jedoch soll die eingesetzte Menge ausreichen, um eine Endothel-Steifigkeit, die zu einer saubereren Endothel-Spaltung führt, zu erreichen. Im allgemeinen beträgt für Organe und Gewebe und insbesondere bei Schweinepankreas die Menge an Stickstoffoxid-Inhibitor und -Fänger etwa 0,001 bis 20 Gew.-%.
  • Bei sämtlichen Hunden zeigte das C-Peptid im Laufe der Zeit gemäß dem vorstehenden Zyklus eine Tendenz zur Zu- und Abnahme, wobei aber die Tendenz im Laufe der Zeit nach oben gerichtet war (25–30). wie in vitro festgestellt, zeigten die meisten Hunde ein Maximum an C-Peptid am Tag 6, sodann ein Nadir am Tag 21, was ein Anzeichen für das vorstehend beschriebene Pendeln darstellt. 31 zeigt eine lebhafte Reaktion auf C-Peptid beim Hund AXA, wenn man die Inseln 21 Tage vor der Implantation unter Kulturbedingungen hielt. Von kritischer in vivo-Bedeutung ist die Fähigkeit der implantierten Vorrichtungen zur raschen Reaktion auf Insulin (C-Peptid) bei einer Glucosebelastung, getestet durch den intravenösen Glucose-Toleranztest. Gemäß 31 zeigten die gealterten Vorrichtungen (120 000 Inseläquivalente) nicht nur eine gute maximale Reaktion auf C-Peptid, sondern auch eine Normalisierung von Blutglucose in einem Hund, dem 50 Tage vorher der Pankreas entnommen worden war (die früheren Vorrichtungen des Versuchstiers wurden zum Test der Lebensfähigkeit von gealterten Vorrichtungen entnommen). Die Figur zeigt klar die biphasische Freisetzung von C-Peptid (A und B) in Reaktion auf Spitzen der Glucosekonzentration. Dies wird erneut beim Versuchstier C324 (32) gezeigt, bei dem die Implantate 80 Tage alt waren, wobei sich Peaks von C-Peptid auf eine Reizung durch einen Glucosepeak innerhalb von 90 Minuten ergaben. Diese Daten belegen die normale in vivo-Insulin-Pulsierungsfrequenz, die bei Patienten mit Diabetes vom Typ II von Vorteil wäre.
  • Während die vorerwähnte Verkapselung zur Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die xenographische Transplantation von Schweine-Inseln beschrieben wurde, erkennt der Fachmann auf dem Gebiet der Zelltransplantation, dass die vorliegende Erfindung in wirksamer Weise auch auf andere Anwendungsmöglichkeiten hormonerzeugender oder gewebebildender Implantationen bei Individuen mit endokrinen Mangelzuständen ausgedehnt werden kann, z. B. bei Schilddrüseninsuffizienz, Wachstumshormoninsuffizienz, angeborener Nebennierenrinden-Hyperplasie, Parkinson-Krankheit und dergl., und gleichermaßen für therapeutische Zustände, bei denen implantierbare Abgabesysteme für biologisch aktive und gentherapeutische Produkte zur Behandlung von Erkrankungen des Zentralnervensystems und anderer chronischer Störungen günstig sind. Insbesondere finden die beschriebenen Vorrichtungen und Matrices Anwendung bei verschiedenen Transplantationstherapien, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) Zellen, die humane Nervenwachstumsfaktoren sezernieren, um den Verlust oder die Degeneration von cholinergen Neuronen zu verhindern, Satellitenzellen für die Myokardregeneration, Striatum-Hirngewebe bei Huntington-Krankheit, Leberzellen, Knochenmarkzellen, an Dopamin reiches Gehirngewebe und Zellen für Parkinson-Krankheit, stark cholinerges Nervensystem für Alzheimer-Krankheit, chromaffine Nebennierenrinden-Zellen zur Abgabe von Analgetika an das Zentralnervensystem, gezüchtetes Epithel für Hauttransplantate und Zellen, die den ziliären neurotropen Faktor freisetzen, bei amyotropher Lateralsklerose.

Claims (10)

  1. Hydrogel-Matrix, die bei Körpertemperatur flüssig ist, umfassend ein Gemisch aus: 0,01 bis 30 mM Gelatine; und 0,01 bis 1000 μM Dextran oder sulfatiertes Dextran.
  2. Hydrogel-Matrix nach Anspruch 1, wobei die Gelatine denaturiertes Kollagen umfasst.
  3. Hydrogel-Matrix nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner umfassend eine Aminosäure als Stickoxid-Inhibitor.
  4. Hydrogel-Matrix nach Anspruch 3, wobei der Stickoxid-Inhibitor ein L-Arginin-Analoges umfasst.
  5. Hydrogel-Matrix nach Anspruch 4, wobei das L-Arginin-Analoge ausgewählt ist aus Aminoguanidin, N-Monomethyl-L-arginin, N-Nitro-L-arginin und D-Arginin.
  6. Hydrogel-Matrix nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner umfassend ein chelatbildendes Mittel.
  7. Hydrogel-Matrix nach Anspruch 6, wobei es sich beim chelatbildenden Mittel um EDTA handelt.
  8. Hydrogel-Matrix nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner umfassend eine oder mehrere Aminosäuren mit polaren Seitengruppen oder eine oder mehrere Aminosäuren mit der Fähigkeit zur Bildung von Sulfidbindungen.
  9. Hydrogel-Matrix nach einem der vorstehenden Ansprüche, ferner umfassend mindestens eine Aminosäure, die ausgewählt ist aus Cystein, Glutaminsäure, Arginin, Methionin, Glutamin, Threonin und Asparagin.
  10. Hydrogel-Matrix nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Verwendung bei der Behandlung zur Verstärkung der Vaskularisation.
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