-
GEBIET DER
ERFINDUNG
-
Die
Erfindung ist auf die Verwendung von Gelatine und Dextran in der
Herstellung einer Matrix zur Verwendung in der Wundheilung bezogen.
-
HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
Blutgefäße werden
durch zwei Prozesse aufgebaut, die als Vaskulogenese und Angiogenese
bekannt sind. In der Vaskulogenese wird ein primitives vaskuläres Netzwerk
während
der embryonalen Entwicklung aus Endothelzell-Präkursoren, die Angioblasten
genannt werden, begründet.
Die Angiogenese bezieht vorher bestehende Gefäße ein, die Kapillarknospen
oder -keime zur Erzeugung neuer Gefäße aussenden. Angiogenese ist
ein wichtiger Prozess, der für
chronische Entzündung
und Fibrose, für
Tumorzellwachstum und für
die Bildung des Kollateralkreislaufs kritisch ist. Angiogenese ist
am normalen Prozess der Gewebewiederherstellung beteiligt.
-
Eine
Gewebezerstörung
mit Schädigung
von sowohl Parenchymzellen als auch des Stromagerüsts tritt
bei einer Entzündung
auf. Eine Wiederherstellung des Gewebes kann nicht allein durch
Regeneration von Parenchymzellen, sogar in denjenigen Organen, deren
Zellen zur Regeneration in der Lage sind, bewerkstelligt werden.
Versuche zur Wiederherstellung bei einer Gewebeschädigung treten
beim Ersatz nicht-regenerierter Zellen durch Bindegewebe auf, was
zu gegebener Zeit Fibrose und Narbenbildung verursacht.
-
Nach
einer Entzündung
setzt unmittelbar die Wiederherstellung des Gewebes ein. Fibroblasten
und vaskuläre
Endothelzellen beginnen unter Bildung von Granulationsgewebe zu
proliferieren. Granulationsgewebe ist durch die Bildung neuer kleiner
Blutgefäße und die
Proliferation von Fibroblasten gekennzeichnet. Die neuen Gefäße sind
undicht und ermöglichen
die Passage von Proteinen und Erythrozyten in den extravaskulären Raum.
-
Die
Entzündungsreaktion
ist eng mit dem Prozess der Wiederherstellung verflochten. Eine
Entzündung
dient zur Zerstörung,
Verdünnung
oder zum Abhalten des schädigenden
Stoffes. Eine Entzündung
setzt wiederum eine Reihe von Ereignissen in Gang, die das geschädigte Gewebe
heilen und neu herstellen. Während
die Wiederherstellung während
der frühen
Phasen der Entzündung
einsetzt, erreicht sie ihren Abschluss nur, nachdem der schädigende
Einfluss neutralisiert worden ist. Während der Wiederherstellung
wird das verletzte Gewebe durch Regenerierung nativer Parenchymzellen
ersetzt, indem die geschädigte
Stelle mit fibroblastischem Gewebe gefüllt wird, was allgemein als
Narbenbildung bekannt ist.
-
Die
Entzündungsreaktion
tritt in dem vaskularisierten Bindegewebe auf. Zirkulierende Zellen,
wie Neutrophile, Monozyten, Eosinophile, Lymphozyten, Basophile
und Blutplättchen
sind beteiligt. Bindegewebezellen sind die Mastzellen, die Blutgefäße umgeben,
die Bindegewebefibroblasten und gelegentliche residente Makrophagen
und Lymphozyten.
-
Ein
Fortschritt ist auf dem Gebiet der Transplantattechnologie erzielt
worden. Sich abzeichnende neue Strategien beinhalten die Schaffung
von künstlichen
Geweben und Organen. Jedoch erfordert das transplantierte Gewebe
oder Organ eine Blutzufuhr. Somit werden Verfahren zur Förderung
der Vaskularisierung an den betreffenden Stellen benötigt.
-
Die
WO 97/20569 beschreibt Hydrogelmatrixformulierungen, die Gelatine
und einen Stickstoffoxidinhibitor zur Verwendung bei der Stimulierung
der Vaskularisierung umfassen. Die EP-A-0 564 786 beschreibt ein
Verfahren zur Bearbeitung und Konservierung von Geweben auf Kollagenbasis
zur Transplantation.
-
Die
US-A-5 645 591 beschreibt eine synthetische Knochenmatrix, die dazu
in der Lage ist, die Knochenbildung zu induzieren.
-
Die
EP-A-0 526 756 beschreibt eine Zusammensetzung zur Revitalisierung
von Narbengewebe. Die Zusammensetzung beinhaltet eine bioaktive
Substanz, wie einen Wachstumsfaktor, die in einer Matrix zur kontrollierten
Freisetzung immobilisiert ist.
-
Die
US-A-4 950 483 beschreibt eine Kollagen-Wundheilungsmatrix, wobei
die Matrix Kollagen beinhaltet, wobei das Kollagen nicht durch die
Zugabe eines Aldehyds oder anderer chemischer Additive chemisch vernetzt
ist. Wachstumsfaktoren oder andere bioaktive Mittel und/oder Heparin
können
zu der Kollagenmatrix gegeben werden.
-
ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines Gemisches von
Gelatine und Dextran zur Herstellung einer Matrix zur Behandlung
einer Wunde zur Verfügung.
Die Matrix ist in der Wundheilung nützlich.
-
KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
1 zeigt
die Blutgefäßbildung
um eine Vorrichtung 6 Wochen nach der Implantation;
-
2 zeigt
eine vaskularisierte Vorrichtungshülle 16 Wochen nach der Implantation
in einen diabetischen Hund;
-
3 stellt
einen Graphen, der die Kapseldicke nach 21 und 50 Tagen nach der
Implantation angibt, zur Verfügung;
und
-
4 stellt
einen Graphen, der die vaskuläre
Dichte nach 21 und 50 Tagen nach der Implantation angibt, zur Verfügung.
-
DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Die
Matrix, welche ein Gemisch aus Gelatine und Dextran umfasst, ist
zur Förderung
der Vaskularisierung nützlich.
-
Die
Matrix ist vorher in der US-Anmeldung Serien-Nr. 09/113 437 und
der US-PS Nr. 5 824 331 beschrieben worden. Die Matrix ist zur Immobilisierung
von Wasser bei geeigneter Lagerungstemperatur und zur Bereitstellung
von Bindungsstellen für
Zellen, die das Wachstum bei terminalen Zelltypen, wie beta-Zellen,
stimulieren, in der Lage. Dextran ist als ein Stickstoffoxidfänger von
Nutzen.
-
Die
Matrix stimuliert das lokale Blutgefäßwachstum in einer dünnen Faserkapsel
oder -folie. Während die
Erfindung nicht durch einen Wirkungsmechanismus gebunden ist, vermutet
man, dass die Matrix-Kollagenfragmente sowohl als ein Gerüst als auch
als ein Stimulus für
Fibroblasten und die neue physiologische Blutgefäßerweiterung dienen, ohne eine
Immunzellreaktion zu stimulieren. Beim Bruch der inneren Basismembran eines
Gewebes werden polare Aminosäuresequenzen
freigesetzt. Beispielsweise erzeugt eine Injektion in einen Muskel
mit einer Nadel dieses Abreißen.
Die Matrix enthält
denaturierte Kollagenfragmente, die lose an Dextran gebunden sind,
welches an die freigesetzte polare Oberfläche der Basismembran bindet.
Hochgradig polare Aminosäureadditive
können
in der Matrix enthalten sein, was die Bindung der Kollagenfragmente
an die polare Oberfläche
der Membran unterstützt.
Innerhalb von ein paar Stunden wird der wässrige Anteil der Matrix durch
das umgebende Gewebe absorbiert, wobei nur die Peptidfragmente zurückgelassen
werden, die an die freigesetzten polaren Oberflächen gebunden sind. Die in
der Matrix vorliegenden Stickstoffoxidinhibitoren und -fänger inhibieren
die Anziehung und Aktivierung von Immunzellen an die Fläche. Die
denaturierten Bindegewebemonomere, die mit der Dextrankomponente
der Matrix copolymerisiert sind, erzeugen ein Gerüst, das
für eine
Endothelproliferation erforderlich ist.
-
Die
Bindegewebefragmente ähneln
unreifem Kollagen dahingehend, dass sie nicht in der großen standardmäßigen Dreifachhelix
vernetzt sind, die man in reifem Kollagen findet. In utero werden
Einzelstrang-Kollagenmonomere zuerst abgelegt, dann mit anderen
Monomeren unter Bildung von reifem Kollagen vernetzt. Diesem Prozess
folgt eine celluläre
Bindung und Differenzierung sowie eine neue Blutgefäßversorgung.
Da Kollagensequenzen in Säugetierspezies
konserviert werden, glaubt man, dass die Matrixcollagenfragmente sowohl
als ein Gerüst
als auch als ein Stimulus für
Fibroblasten und eine neue physiologische Blutgefäßerweiterung
dienen, ohne die Immunzellreaktion zu stimulieren.
-
Die
erfindungsgemäße Matrix
ist eine Kombination einer Gelatinekomponente und einer flüssigen Zusammensetzung.
Die Gelatine fungiert als ein Substrat für ein celluläres Anfügen. Die
bevorzugte Gelatinekomponente ist denaturiertes Kollagen. Denaturiertes
Kollagen enthält
polare und nicht-polare Aminosäuren, die
leicht auf Basis von Wechselwirkungen zwischen Amingruppen, Carboxylgruppen,
Hydroxylgruppen und Sulfhydrylgruppen ein Gel bilden. Die Matrix
ist so ausgebildet, dass sie bei Körpertemperatur des Wirts in
freiem Fluss oder flüssiger
Phase vorliegt, um eine maximale Diffusion durch die Membran in
vivo zu liefern. Die Matrix bleibt bei den niedrigeren Lagerungstemperaturen,
wie 4°C,
in fester Phase.
-
Kochen
oder anderweitiges Behandeln von intaktem Kollagen unter Bildung
von denaturiertem Kollagen bricht covalente chemische Bindungen
und erhöht
die Anzahl an wärmeempfindlichen
Wasserstoffbindungen und Dipolmoment-Anziehungskräften. Durch
Ersetzen der covalenten chemischen Bindungen durch temperaturempfindliche
Bindungen und Anziehungskräfte
können
die gewünschten
Zellen in eine feste Matrixformulierung bei kälteren Temperaturen für eine anhaltende
Lagerung eingebettet werden. Kochen oder anderweitiges Behandeln
von intaktem Kollagen bricht die eng aufgespulten helikalen Tropocollagen-Untereinheiten auf
und bewirkt, dass sich die Untereinheiten in getrennte Peptidketten öffnen. Diese
entknäulten
Stränge
bieten mehrfache Bindungsflächen
zur Anlagerung von Zellen.
-
Die
Gelatine liegt in einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 40
mM, vorzugsweise etwa 0,05 bis etwa 30 mM, am stärksten bevorzugt etwa 1 bis
5 mM, vor. Vorteilhafterweise beträgt die Gelatinekonzentration
ungefähr
1,6 mM. Die voranstehend genannten Konzentrationen sorgen für eine feste
Phase bei Lagerungstemperatur und eine flüssige Phase bei Transplantations-
oder Injektionstemperatur.
-
Die
Gelatinekomponente der erfindungsgemäßen Matrix wird mit einer flüssigen Zusammensetzung gemischt.
Die flüssige
Zusammensetzung basiert vorzugsweise auf einem Standardkulturmedium,
wie z.B. Medium 199, das mit Additiven und zusätzlichen Mengen von einigen
Mediumkomponenten, wie z.B. ergänzenden
Mengen an polaren Aminosäuren,
wie voranstehend beschrieben, supplementiert worden ist.
-
Die
erfindungsgemäße Matrix
enthält
Dextran, einen Stickstoffoxidfänger.
Ein weiterer Fänger
kann enthalten sein. Beispielsweise fungiert L-Cystein als ein Stickstoffoxidfänger und
scheint Immunerkennungsstellen durch Binden oder Andocken an die
Oberfläche
der Zellen zu verschleiern. L-Cystein liefert auch Disulfid-Verknüpfungen,
was die Widerstandsfähigkeit
der Matrix gegenüber
einer Krafteinwirkung erhöht
und schützt
des Weiteren die darin enthaltenen Zellen. Stickstoffoxid (NO) ist
ein pleiotroper Entzündungsmediator. NO
spielt eine wichtige Rolle in der vaskulären Funktion während Entzündungsreaktionen.
NO ist ein lösliches Gas,
das durch Endothelzellen, Makrophagen und spezielle Neuronen im
Gehirn erzeugt wird. NO ist in der Induktion der Entzündungsreaktion
aktiv.
-
Die
Endkonzentration an L-Cystein beträgt etwa 5 bis etwa 5000 μM, vorzugsweise
etwa 10 bis etwa 800 μM,
am stärksten
bevorzugt etwa 100 bis etwa 800 μM.
In einer Ausführungsform
beträgt
die Endkonzentration etwa 20 μM.
-
Die
erfindungsgemäße Matrix
umfasst vorzugsweise einen Stickstoffoxidinhibitor. Beispielsweise
ist Aminoguanidin ein L-Argininanalogon und fungiert als ein Stickstoffoxidinhibitor.
Andere L-Argininanaloga, die als Stickstoffoxidinhibitoren fungieren,
könnten
in der vorliegenden Erfindung ebenfalls
verwendet werden. Die Endkonzentration an Aminoguanidin beträgt etwa
5 bis etwa 500 μM,
vorzugsweise etwa 10 bis etwa 100 μM, am stärksten bevorzugt etwa 15 bis
etwa 25 μM.
In einer Ausführungsform
beträgt
die Endkonzentration etwa 20 μM.
-
Zur
Erhöhung
der Zellbindung kann intaktes Kollagen in kleinen Mengen zugegeben
werden, um ein zusätzliches
Bindungsnetzwerk für
die in der Matrix enthaltenen Zellen zu liefern. Die Endkonzentration
an intaktem Kollagen beträgt
etwa 0 bis etwa 5 mM, vorzugsweise 0 bis etwa 2 mM, am stärksten bevorzugt
etwa 0,05 bis etwa 0,5 mM. In einer Ausführungsform beträgt die Konzentration
an intaktem Kollagen etwa 0,11 mM.
-
Die
erfindungsgemäße Matrix
kann gegebenenfalls einen bivaleten Chelatbildner enthalten, der
die Starrheit der Matrix durch Aufheben der Inhibierung einer Wasserstoffbrückenbin dung
von -NH2 nach -COOH- erhöht. Der bivalente Chelatbildner
schützt
auch gegen eine mikrobielle Verunreinigung der Matrix. Ein bevorzugter
bivalenter Chelatbildner ist EDTA. Der Konzentrationsbereich für den Chelatbildner
beträgt
etwa 0 bis etwa 10 mM, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 8 mM, am stärksten bevorzugt
etwa 2 bis etwa 6 mM. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt EDTA in einer
Konzentration von etwa 4 mM vor. Herkömmliche Antibiotika können auch
zum weiteren Schutz gegen mikrobielle Verunreinigung zugesetzt werden.
-
Während die
erfindungsgemäße Matrix
das Vorhandensein von Seren nicht erfordert. können der Matrix erforderlichenfalls
Albumin oder andere Nährstoffquellen
zugesetzt werden. Vorzugsweise ist das verwendete Albumin von derselben
Spezies wie die in der Matrix enthaltenen Zellen. Wie voranstehend
beschrieben, fördert
die Verwendung derselben Spezies von Albumin eine erhöhte Robustheit
in den in der Matrix enthaltenen Zellen. Die Konzentration an Albumin
beträgt
etwa 0 bis etwa 2 Vol.-%, vorzugsweise 0 bis etwa 0,5 Vol.-%, am
stärksten
bevorzugt etwa 0 bis etwa 0,1 Vol.-%. In einer bevorzugten Ausführungsform
beträgt
die Konzentration an Albumin etwa 0,05 Vol.-%.
-
Die
Matrix kann eine effektive Menge an polaren Aminosäuren darin
enthalten. Die polaren Aminosäuren
können
aus der Gruppe, bestehend aus Arginin, Lysin, Histidin, Glutaminsäure und
Asparaginsäure
oder aus anderen Aminosäuren
oder anderen polaren Chemikalien ausgewählt sein. Eine wirksame Menge
ist diejenige Menge, die zur Erhöhung
der Starrheit der Matrix notwendig ist und des Weiteren die Bindung
des Kollagenfragments an die polare Oberfläche der Basismembran verbessert.
In einer Ausführungsform
wird die Konzentration an polaren Aminosäuren auf eine Endkonzentration
zwischen etwa 3 bis etwa 150 mM, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 65
mM und stärker
bevorzugt etwa 15 bis etwa 40 mM erhöht.
-
Vorteilhafterweise
umfassen die zugesetzten polaren Aminosäuren L-Glutaminsäure, L-Lysin und Arginin.
Die Endkonzentration an L-Glutaminsäure beträgt etwa 2 bis etwa 60 mM, vorzugsweise
etwa 5 bis etwa 40 mM, am stärksten
bevorzugt etwa 10 bis etwa 20 mM. In einer Ausführungsform beträgt die Konzentration an
L-Glutaminsäure
etwa 15 mM. Die Endkonzentration an L-Lysin beträgt etwa 0,5 bis etwa 30 mM,
vorzugsweise etwa 1 bis etwa 15 mM, am stärksten bevorzugt etwa 1 bis
etwa 10 mM. In einer Ausführungsform
beträgt
die Konzentration an L-Lysin etwa 5,0 mM. Die Endkonzentration an
Arginin beträgt
etwa 1 bis etwa 40 mM, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 30, am stärksten bevorzugt
etwa 5 bis etwa 15 mM. In einer Ausführungsform beträgt die Endkonzentration
an Arginin etwa 10 mM.
-
Zur
Langzeitlagerung von Zellen kann eine wirksame Menge eines Kälteschutzmittels
zugesetzt werden, das es ermöglicht,
dass die Matrix bei tieferen Temperaturen ohne Zellschaden gelagert
wird. Vorzugsweise ist das Kälteschutzmittel
metabolisch stabil und dazu in der Lage, ein inertes Polster zur
Verhinderung einer thermischen Ausdehnung und Kontraktion der Zellen
zu schaffen. Ein bevorzugtes Kälteschutzmittel
ist sulfatiertes Dextran. Das Kälteschutzmittel
liegt in einer Konzentration von etwa 0 bis etwa 2 mM, vorzugsweise
0 bis etwa 1 mM, am stärksten
bevorzugt etwa 0 bis etwa 0,1 mM, vor. In einer Ausführungsform
liegt das Kälte schutzmittel
in einer Konzentration von etwa 0,086 mM vor. Dextran ist auch als
Stickstoffoxidfänger
nützlich.
-
Nachstehende
Tabelle 1 listet besonders bevorzugte Schlüsselkomponenten der erfindungsgemäßen Matrix
zusammen mit geeigneten Konzentrationen sowie bevorzugten Konzentrationen
für jede
Komponente auf.
-
-
Die
Matrix kann zur Stimulierung oder Verstärkung der Vaskularisierung
bei einem Säugetier
an einer anatomischen Stelle ohne Immunzellstimulierung an der Stelle
verwendet werden, was zu einer funktionellen Langzeitvaskularität führt. Nach
Einführen
der Matrix in ein Säugetier
wird nämlich
die Vaskularisierung in dem Gewebe stimuliert, das die Matrix umgibt.
Eine „anatomische
Stelle" ist eine
vorher bestimmte Stelle in einem Säugetier, an der eine Vaskularisierung
erforderlich ist.
-
Anatomische
Stellen beinhalten Stellen einer Erkrankung in einem Organismus,
wie Stellen von einer chronischen Entzündung, Atherosklerose, Stellen,
die auch Stellen beinhalten, an denen ein Transplantat, einschließlich Zellen
und/oder Organe, in ein Säugetier
eingesetzt werden. Im Wesentlichen kann allgemein eine beliebige
Stelle bei einem Säugetier
eine geeignete Stelle sein. Insbesondere Muskeln, Körperhöhlen, speziell die
Abdominalhöhle
oder die Peritonealhöhle,
sind bevorzugte Stellen.
-
Der
Begriff „Vaskularisierung" bezieht sich auf
die Bildung und Aufrechterhaltung von Blutgefäßen. Die Stimulierung oder
Verbesserung der Vaskularisierung wird als Erhöhung der Blutgefäßbildung
und der resultierenden Blutzirkulation über das hinaus, was natürlich auftreten
würde,
definiert.
-
Die
durch die Matrix erhöhte
Vaskularisierung wird in dem Organismus aufrechterhalten. Dies steht
im Gegensatz zu temporären
vaskulären Änderungen,
die während
einer Immunreaktion beobachtet werden. Eine Entzündung wird von der Proliferation
kleiner Blutgefäße (Angiogenese)
begleitet. Jedoch folgt einer Angiogenese häufig eine Regression oder ein
Verlust an Gefäßstruktur.
Die Gefäßintegrität wird nämlich auf
eine Entzündung
folgend nicht aufrechterhalten. Im Gegensatz dazu resultiert die
Vaskularisierung oder Blutgefäßbildung
gemäß der Erfindung
in reifen Gefäßen, die
die Gefäßintegrität aufrechterhalten
und die als reife Gefäße fortbestehen.
Der Prozess ahmt die Vaskulogenese nach, in der ein vaskuläres Netzwerk
während
der Embryogenese aufgebaut wird. So ist die Vaskularisierung gemäß der Erfindung
durch ein Netzwerk an reifen Blutgefäßen gekennzeichnet, das im
Wirt aufrechterhalten wird.
-
Eine
wirksame Menge der Matrix wird an einer Stelle bei einem Säugetier
appliziert, an der Vaskularisierung gewünscht wird. Eine wirksame Menge
ist eine Menge, die dazu notwendig ist, den Blutfluss an der gewünschten
anatomischen Stelle zu stimulieren.
-
Die
erfindungsgemäßen Verfahren
können
zur Erhöhung
der Vaskularisierung bei einem beliebigen Säugetier, das der Vaskularisierung
bedarf, verwendet werden. Säugetiere
von Interesse beinhalten Menschen, Hunde, Kühe, Schweine, Katzen, Schafe,
Pferde usw., insbesondere Menschen.
-
Beliebige
Maßnahmen
können
zur Applikation oder Verabreichung der Matrix an die gewünschte anatomische
Stelle verwendet werden. Die applizierte Menge der Matrix wird von
der Menge der erforderlichen Zirkulation, dem Gewicht und der Größe des Empfängers, dem
zu behandelnden Zustand und dergleichen abhängen. Eine wirksame Menge der
Matrix ist eine Menge, die die gewünschte Menge an Vaskularisierung
oder Blutfluss fördert
und eine Immunreaktion und die Bildung von Narbengewebe verhindert.
-
Da
die Matrix offenbar die Vaskularisierung durch physikalischen Kontakt
mit Gewebe stimuliert, kann die zu injizierende Menge durch (i)
die lineare Länge
eines Geweberisses unter Freisetzung polarer Basismembranstellen
und (ii) das Volumen des gerissenen Trakts oder der gerissenen Fläche, der/die
mit Matrix zu füllen
ist, ermittelt werden.
-
Die
Matrix kann zur Erhöhung
der Vaskularisierung bei Patienten, die einer bedürfen, verwendet
werden. Somit sind die erfindungsgemäßen Verfahren zur Förderung
der Wundheilung, zur Abnahme der Narbengewebebildung, d.h. infolge
einer Verletzung oder Operation, und dergleichen nützlich.
-
Die
in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung hergestellte Matrix ist zur Stimulierung
neuer Blutgefäße ohne
das Vorliegen von Immunzellen und der charakteristischen Immunreaktion
nützlich.
Somit führt
die Verwendung der erfindungsgemäßen Matrix
zu einer Vaskularisierung ohne die Bildung von Narbengewebe. Daher
kann die Matrix in einem beliebigen physiologischen Szenario verwendet
werden, in dem die Bildung von Blutgefäßen gewünscht wird.
-
Wie
vorher angedeutet, ermöglicht
die Matrix eine Vaskularisierung ohne ein Stimulieren von Immunzellen.
Somit findet die Matrix Anwendung zur Förderung der Wundheilung. Die
Matrix sorgt für
neues Blutgefäßwachstum
und Fibroblasten an den Stellen ohne die Anziehung von Immunzellen.
Die Matrix verhindert eine Entzündung,
während
die Wundheilung gefördert wird.
Beliebiges Gewebe oder eine beliebige Stelle, die der Wiederherstellung
oder der Heilung bedarf, kann von der Applikation der Matrix an
diese Stelle profitieren. Die Stellen beinhalten solche, die von
einer Verletzung oder Operation herrühren. Die Matrix kann an internen oder
externen Operations- oder Verletzungsstellen appliziert werden,
um den Schmerz zu reduzieren, der eine klassische Entzündungsreaktion
begleitet und um eine Bildung von Narbengewebe zu reduzieren.
-
Die
Matrix ist auch für
die oberflächliche
Wundheilung förderlich.
Damit kann sie zur Anwendung bei Hautulzera, Verbrennungsbereichen,
Ulzera, die eine sekundäre
bis periphere vaskuläre
Erkrankung bilden, oder einer anderen Gewebeschädigung nützlich sein.
-
Die
folgenden Beispiele sind als Veranschaulichung und nicht als Einschränkung angeboten.
-
EXPERIMENTELLES
-
Matrixherstellung
-
835
ml Medium 199 wurden in einen gerührten Becher eingebracht. Während des
Rührens
wurde die Lösung
auf 50°C
erwärmt.
Unter Verwendung einer Spritze wurden 20 ml Albumin zur gerührten Lösung gegeben.
63,28 μl
Cystein, 1 ml L-Glutamin und 200 μl
Aminoguanidin wurden in den gerührten
Becher pipettiert. Es wurden die folgenden gamma-bestrahlten trockenen
Rohmaterialien zugesetzt: 120 Gramm denaturiertes Kollagen, 50 Gramm
Dextran und 0,1 Gramm intaktes Kollagen. Zur Förderung des Einmischens der
trockenen Materialien in die Lösung
wurde ein Glasrührstab
verwendet. 8 ml EDTA wurden in die Lösung pipettiert. 5 ml L-Glutaminsäure, 5 ml
L-Lysinacetat und 5 ml Arginin-HCl wurden in den gerührten Becher
pipettiert. Es ist anzumerken, dass sich die Lösung gelb färben wird. 10%ige NaOH wurde
zur Einstellung des pH-Werts der Matrixlösung auf einen End-pH-Wert
von 7,40 ± 0,05
verwendet.
-
Zellen
können
in die erfindungsgemäße Matrix
unter Verwendung der folgenden Vorgehensweise eingebettet werden.
Der Überstand
wurde von den zentrifugierten Zellpellets abgesaugt. Ein Volumen
an Zellkulturmedium und Matrix wurde zu den Zellpellets gegeben.
Ein Volumen an Matrix, das etwa dem 4fachen des Pelletvolumens glich,
wurde zugesetzt. Ein Volumen an Zellkulturmedium wurde den Zellpellets
zugesetzt, das etwa dem 0,05fachen des zugesetzten Matrixvolumens
glich. Die eingeschlossenen Zellen wurden bei gekühlten Temperaturen
gelagert, wenn sie nicht sofort verwendet wurden.
-
Beispiel 1
-
Normalen
Ratten mit 200 bis 300 Gramm wurde verstärkte Matrix intramuskulär injiziert.
Die Tiere wurden 4 bis 6 Tage und 21 Tage danach euthanasiert. Histologische
Schnitte zeigten reichlich Fibroblasten und neue Blutgefäßbildung
an der Injektionsstelle. In merklicher Weise lagen keine Immunzellen
oder inflammatorische Zellen vor. Nach Anbringen um ENCELLIN XP-Vorrichtungen,
hergestellt von Encelle, Inc., bildete sich eine dünne Faserkapsel
um die Vorrichtung, die für
die Dauer der Implantation (bis zu vier Monate bei Hunden und sechs
Monate bei Kaninchen) vaskularisiert bleibt. Eine nicht-adhärente Faserhülle mit
Blutge fäßen war zum
Zeitpunkt der Explantation vier Monate nach operativer Implantation
in den Hund ersichtlich. 1 zeigt die Blutgefäßbildung
6 Wochen nach der Implantation, wobei ein biologisch-künstliches
Pankreas, das eine bioaktive Oberfläche besaß (Gewebe, das in eine Matrix
in mit Parylen N-bedeckten Vertiefungen eingebracht worden war),
zwischen Muskelschichten implantiert wurde, wobei eine Matrix großzügig über die
Vorder- und Rückseite
appliziert worden war. 2 zeigt eine vaskularisierte
Vorrichtungshülle
16 Wochen nach der Implantation bei einem diabetischen Hund.
-
Beispiel 2
-
Die
Fähigkeit
der erfindungsgemäßen Matrix,
Blutgefäße in einer
Faserkapsel zu stimulieren, wurde mit Matrigel mit oder ohne bFGF
oder VEGF verglichen, wenn dieses um Polycarbonatvorrichtungen bei
Ratten intramuskulär
appliziert wurde. Von diesen Materialien oder von keinem Material
umgebene Vorrichtungen wurden aus einigen Ratten nach 21 Tagen und
aus einigen nach 50 Tagen entfernt. bFGF und VEGF sind zwei angiogene
Wachstumsfaktoren, die sich gegenwärtig in klinischen Studien
am Menschen befinden. Polycarbonatscheiben wurden bei Ratten submuskulär implantiert.
Die Implantate wurden nach 21 und 50 Tagen entfernt, mit H&E und Masson's Trichrome gefärbt. Die
Kapseldicke und die vaskuläre
Dichte der Kapsel wurden beurteilt.
-
-
Nur
die erfindungsgemäße Matrix
stimulierte das Wachstum neuer Blutgefäße zwischen 21 und 50 Tagen
nach der Injektion. Während
alle anderen Gruppen das anfängliche
Wachstum neuer Blutgefäße bis zu
21 Tage lang stimulierten, wurde eine Beeinträchtigung sowohl hinsichtlich
Blutgefäßanzahl
als auch Faserkapseldicke dokumentiert, weil reifes Narbengewebe
gebildet wurde. Zusätzlich
dazu zeigten die Matrix-behandelten Tiere nicht die Immunzellen/Entzündungsreaktion,
die bei den bFGF- und VEGF-behandelten Tieren beobachtet worden
war. Dazu sei auf die 3 und 4 verwiesen.
-
3 zeigt,
dass 21 Tage nach der Implantation die Kapseldicke um die implantierten
Vorrichtungen signifikant (p < 0,05)
niedriger bei den mit EM+, RS und RS+ behandelten Proben im Vergleich
zu den beschichteten Polycarbonatscheiben (Kontrolle) waren. Allein
mit Matrigel beschichtete Scheiben zeigten auch eine signifikant
(p < 0,05) geringere
Kapseldicke als die Kontrolle. Das Vorliegen von Wachstumsfaktoren scheint
jede Verringerung der Kapseldicke mit reinem Matrigel auszuschließen. 50
Tage nach der Implantation traten keine signifikanten Unterschiede
hinsichtlich der Kapseldicke in einer beliebigen Behandlungsgruppe auf.
-
4 zeigt,
dass 21 Tage nach der Implantation die beobachtete vaskuläre Dichte
um die implantierten Scheiben herum im Wesentlichen für alle Behandlungen
mit Ausnahme von denjenigen, bei denen Wachstumsfaktoren vorlagen,
dieselbe war. 50 Tage nach der Implantation verschwindet die zusätzliche
vaskuläre Dichte,
die bei den mit Wachstumsfaktoren verbesserten Matrigel-Implantaten
beobachtet worden ist. Die vaskuläre Dichte der Implantate ohne
Matrix und der Matrigel-bedeckten Implantate nahm von 21 bis 50
Tage ab. Andererseits blieb die vaskuläre Dichte, die durch die erfindungsgemäßen Matrices
(EM, EM+, RS und RS+) erzeugt worden war, dieselbe oder nahm zu.
-
Die
Matrix kann auf einen beliebigen Bereich, bei dem eine neue, physiologische
Vaskularisierung erforderlich ist, appliziert werden. Sie kann als
ein für
Vaskularisierung sorgender Zusatz zu einem implantierten Wirkstoffabgabe
oder -zellsystem dienen.
-
Die
Matrix kann sich auch als für
operative Anwendungen nützlich
erweisen, bei denen eine Minimierung von Narbengewebe erwünscht ist.
Da eine dünne
Faserkapsel gebildet wird, die vaskularisiert bleibt, kann die Matrix
bei operativen Brustimplantaten angewendet werden, um schmerzvolle
Adhäsionen
zu minimieren.
-
Sämtliche
in der Beschreibung erwähnten
Veröffentlichungen
und Patentanmeldungen sind für
den Kenntnisstand des Fachmanns auf dem Gebiet Indikativ, zu dem
die vorliegende Erfindung gehört.
-
Obwohl
die vorstehende Erfindung in bestimmten Details durch Veranschaulichung
und Beispiel zum Zwecke eines klaren Verständnisses beschrieben worden
ist, ist es offensichtlich, dass bestimmte Änderungen und Modifizierungen
innerhalb des Rahmens der beigefügten
Ansprüche
durchgeführt
werden können.
