DE60115433T2

DE60115433T2 - Verfahren zur behandlung von chronischen geschwüren

Info

Publication number: DE60115433T2
Application number: DE60115433T
Authority: DE
Inventors: Anton-Lewis Usala
Original assignee: Encelle Inc
Current assignee: Encelle Inc
Priority date: 2000-05-31
Filing date: 2001-05-30
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2021-05-31
Also published as: AU2001265151A1; WO2001091773A3; EP1289537A2; US6992062B2; NZ523461A; AU6349501A; CA2410968C; WO2001091774A3; WO2001091774A2; DE60115433D1; EP1289537B1; AU2001263495B2; WO2001091773A2; US20020077277A1; US7700660B2; CA2410968A1; US20020065222A1; ATE311192T1; CA2410965A1; CA2410965C

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf die Verwendung einer Hydrogelgrundsubstanz für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Geschwürs.
Hintergrund der Erfindung
Es gibt über 15 Millionen diagnostizierter Fälle von Diabetes allein in den Vereinigten Staaten. Der American Diabetes Associate zufolge haben etwa 60–70% der Menschen mit Diabetes milde bis ernste Formen einer mit Diabetes im Zusammenhang stehenden Nervenschädigung. Eine diabetische Neuropathie ist ein Zustand, der einen weiten Bereich von Funktionsstörungen umfaßt. Neuropathische Geschwüre oder Läsionen des Fußes, die von einer diabetischen Neuropathie herrühren, sind ein Hauptgrund von Amputationen des unteren Beines. Tatsächlich ist das Fortschreiten von diabetischen Fußgeschwüren der Hauptgrund für nichttraumatische Amputationen der unteren Extremitäten in den Vereinigten Staaten. Das Risiko einer Beinamputation ist für eine Person mit Diabetes 15–40 mal höher.
Ein Verlust der schützenden Sensibilität und ein wiederholtes Trauma (z.B. Laufen) sind die Hauptgründe solcher Geschwüre. Ein Verlust des Tonus der kleinen Muskeln der Füße verursacht Änderungen in der Architektur des Fußes, die schließlich zu einem erhöhten Druck auf den Ballen des Fußes führen. Dieser erhöhte Druck verursacht Schwielen und schließlich die Entwicklung eines Geschwürs.
Diese Läsionen sind mit einer Mikrozirkulationsbeeinträchtigung verbunden, die zu einem Zusammenbruch der Hautintegrität führt. Es wird vermutet, daß die Ätiologie eine fortschreitende Endothelgefäßverletzung ist, die durch eine chronische Hyperglykämie verursacht wird. Während eine Neuropathie, ein Trauma und eine Infektion sekundär die Ausbreitung der Fußläsion fördern, ist die zugrundliegende Pathologie für diese Bedingungen und das Geschwür selbst die chronische Hyperglykämie, die zu einem beeinträchtigten vaskulären Fluß zur Haut führt. Sobald sie sich einmal entwickelt haben, werden diese Geschwüre zu chronischen Zuständen, die unbegrenzt dauern. Es ist für Geschwüre dieser Art nicht unüblich, daß sie für viele Jahre andauern. Im Gegensatz zu üblichen traumainduzierten oberflächlichen Wunden dringen chronische diabetische Geschwüre tief in das Gewebe des Patienten ein, wobei sie häufig eine vollständige Durchdringung der Dermis zeigen, die das Geschwür offen lassen und darunterliegende Strukturen wie Sehnen, Muskeln oder Knochen freilegen.
Die gegenwärtige Therapie für diabetische Fußgeschwüre ist inadäquat, wie durch die hohe Häufigkeit eines Heilungsversagens bewiesen wird (siehe Ramsey u.a., Diabetes Care 22: 382–387, 1999); Herkömmliche Therapien umfassen die Reinigung von nekrotischem Gewebe, wiederholte sterile Verbände, Verwendung von orthopädischen Vorrichtungen, um den Druck zu reduzieren, Bettruhe und die aggressive Verwendung von Antibiotika, um Infektionen zu bekämpfen. Die herkömmliche Therapie wendet sich nicht der zugrundeliegenden Pathologie der Mikroangiopathie in den unteren Extremitäten zu, sondern versucht, eine ausreichende Bedeckung bereitzustellen, um die Ausbreitung des Geschwürs und eine mögliche Amputation zu vermeiden. Es werden manchmal auf Zellen beruhende Abdeckungen verwendet, um Ge schwüre zu behandeln, wobei solche Abdeckungen autogenische Hautlappen, Hauttransplantate oder kultivierte Hautschichten wie APLIGRAF^TM umfassen. Jedoch tut die Bereitstellung einer Abdeckung, die den Verschluß unterstützen kann oder nicht, nichts dafür, die zugrundliegende Pathologie zu unterstützen, die aus einem beeinträchtigten Blutkreislauf in Kombination mit einer beeinträchtigten Sensibilität besteht. Daher ist die Häufigkeit des erneuten Auftretens geheilter Geschwüre etwa so hoch wie 80%. Es bleibt ein Bedarf in der Technik nach therapeutischen Verfahren zur Behandlung von chronischen Geschwüren, wie von mit Diabetes im Zusammenhang stehenden Geschwüren.
Inhalt der Erfindung
Es ist entdeckt worden, daß die hierin beschriebene Grundsubstanz zur erfolgreichen Behandlung und Heilung chronischer Geschwüre imstande ist, wie Geschwüre, die von einer mit Diabetes im Zusammenhang stehenden vaskulären Neuropathie herrühren. Obwohl Geschwüre dieser Art häufig herkömmlichen Wundbehandlungen widerstehen, kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung chronische Läsionen oder Geschwüre innerhalb von Tagen oder Wochen heilen. Die vorliegende Erfindung umfaßt die Anwendung einer therapeutischen Menge einer Hydrogelgrundsubstanz auf die Geschwüre in einer Weise, die polare Gruppen der Basalmembran des Gewebes des Patienten den Komponenten der Grundsubstanz (z.B. durch Injektion) aussetzt.
Gemäß eines ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung wird eine Hydrogelgrundsubstanz bereitgestellt, wobei die Grundsubstanzzusammensetzung Gelatine und ein langkettiges Kohlenhydrat mit einem Molekulargewicht von 20.000 bis 1.000.000 Da enthält, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Geschwürs, wobei die Hydrogelgrundsubstanz dazu bestimmt ist, in mehreren oberflächlichen Injektionen an beabstandeten Stellen um den Rand eines Geschwürs, in ein Geschwür oder beides injiziert zu werden, und wobei die oberflächlichen Injektionen dazu bestimmt sind, in einem Bereich der dermalen/subdermalen Gewebeverbindung vorgenommen zu werden.
Die Grundsubstanz der Erfindung enthält vorzugsweise eine Gelatinekomponente wie denaturiertes Kollagen mit einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 40 mM. Die Grundsubstanz enthält außerdem ein langkettiges Kohlenhydrat wie Dextran. Die bevorzugte Konzentration des Dextrans beträgt etwa 0,01 bis etwa 10 mM. Bevorzugte Ausführungsformen der Grundsubstanz enthalten ferner eine effektive Menge von polaren Aminosäuren, einen oder mehrere Stickstoffmonoxidhemmstoffe, wie L-Cystein oder zu L-Arginin analoge Substanzen, und einen Peroxidhemmstoff, wie EDTA oder Salze davon. Typischerweise umfaßt die gesamte therapeutische Menge etwa 1 bis etwa 60 ml.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Nachdem die Erfindung so in allgemeiner Form beschrieben worden ist, wird nun auf die beigefügten Zeichnungen bezug genommen, wobei:
1 die Bildung von offenen Alphaketten darstellt, die von Kollagenmonomeren abgeleitet werden;
2A und 2B die Wirkung der Verbindung der Alphaketten mit Dextran darstellt;
3 die Wirkung von anderen Grundsubstanzadditiven darstellt;
4 die Bindung der Grundsubstanz an die Basalmembran (BM) eines Patienten darstellt; und
5 graphisch die Wirkung der Grundsubstanz der Erfindung auf die Größe von diabetischen Fußgeschwüren darstellt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird nun im folgenden unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen vollständiger beschrieben, in denen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung gezeigt werden. Diese Erfindung kann jedoch in vielen anderen Formen ausgeführt werden und sollte nicht so aufgefaßt werden, daß sie auf die Ausführungsformen beschränkt ist, die hierin angegeben werden; vielmehr werden diese Ausführungsformen bereitgestellt, damit diese Offenbarung gründlich und vollständig sein wird und den Rahmen der Erfindung Fachleuten vollständig mitteilen wird.
Frühzeitig in der Fötalentwicklung ist eine (verglichen mit dem eng gebundenen reifen Kollagen) offenere Form von Kollagen mit großen Kohlenhydratmolekülen verbunden und dient als ein vorherrschendes Gewebegerüst. Es wird angenommen, daß eine Anhaftung von differenzierten oder unvollständig differenzierten Zellen mescenchymalen Ursprungs an dieses polare proteoglykanähnliche Kollagengerüst zu einer spezifischen Wirtsgewebeantwort führt. Diese Antwort dient dazu, die Differenzierung des mesenchymalen Gewebe in Endothelzellen zu leiten, die sich anschließend zu Blutgefäßen organisieren, und sich schließlich vor der Differenzierung des Knochenmarks zu primitiven Blutzellen differenzieren.
Obwohl sie nicht an irgendeine bestimmte Theorie gebunden ist, ist die vorliegende Erfindung dazu bestimmt, ein Grundsubstanzgerüst bereitzustellen, das dazu bestimmt ist, die polaren Aminosäure-Wasserstoffbrückenbindungsstellen zu maximieren, die in Alphaketten zu finden sind, die von Kollagen abgeleitet werden. Diese Alphaketten oder Gelatine werden vorzugsweise von Schweinegelatine abgeleitet, und durch Dextran mit einem Molekulargewicht von 500.000 oder andere langkettige Kohlehydrate stabilisiert, die hinzugegeben werden, während die Alphaketten erwärmt werden. Die positiv geladenen polaren Gruppen der von Kollagen abgeleiteten Alphaketten sind dann imstande, sich mit den negativ geladenen -OH Gruppen der sich wiederholen Glukoseeinheiten zu verbinden, die im Dextran zu finden sind. Die Gelatine und das Dextran bilden eine Proteoglykanstruktur. Die 1–4 stellen die Wechselwirkung zwischen den verschiedenen Komponenten der bevorzugten Ausführungsform der Grundsubstanz der Erfindung und die Wechselwirkung zwischen der Grundsubstanz und dem Gewebe eines Patienten dar.
1 stellt die Bildung von polaren Alphaketten 15 aus Tropokollagen 10 dar, das aus reifem Kollagen abgeleitet wird. Die Erwärmung von Tropokollagen 10 zerreißt die Wasserstoffbrückenbindungen, die die dreifach verflochtenen Monomere in reifem Kollagen eng einschließen. Durch Brechen dieser Wasserstoffbrückenbindungen stehen die polaren Amin- und Karbonsäuregruppen nun zur Bindung an polare Gruppen aus anderen Quellen oder sich selbst bereit.
Die 2A–2B stellen die Stabilisierung des monomeren Gerüstes der Grundsubstanz durch die Einführung eines langkettigen Kohlenhydrats 20 wie Dextran dar. Wie in 2B gezeigt, wird ohne das langkettige Kohlenhydrat 20 die Alphakette 15 Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Amino- und Karbonsäuregruppen im linearen Abschnitt des Monomers bilden und sich zusammenfalten, wodurch die verfügbaren Stellen zur zellulären Anhaftung eingeschränkt werden. Wie in 2A gezeigt, dient das langkettige Kohlenhydrat 20 dazu, die Alphakette 15 offen zu halten, indem sie diesen Faltungsprozeß stört.
3 veranschaulicht den Effekt von polaren Aminosäuren und/oder L-Cystein, das hinzugegeben wird, um die Monomer-/Kohlenhydrateinheiten 25 durch Vernetzung der freilegenden monomeren polaren Stellen mit zum Beispiel Amingruppen des Arginins oder Karbonsäuregruppen der Glutaminsäure zu stabilisieren. Ferner können Disulfidbindungen zwischen L-Cysteinmolekülen gebildet werden (wodurch Cystin gebildet wird), was wiederum Wasserstoffbrückenbindungen zu den monomeren Alphaketten 15 bildet. Die Wasserstoffbrückenbindungen, die zwischen diesen zusätzlichen Aminosäuren und Monomer-/Dextraneinheiten 25 gebildet werden, werden gebrochen, wenn die Grundsubstanz beim Erwärmen verflüssigt wird, und die polaren Gruppen werden freigelegt, um die Monomer-/Dextraneinheiten bei der Injektion an freiliegende Patientengewebeoberflächen zu heften. In bevorzugten Ausführungsformen ist auch EDTA oder ein Salz davon vorhanden, um mit divalenten Kationen eine Chelatbindung einzugehen und dadurch zu verhindern, daß divalente Kationen unter Ausschluß der polaren Aminosäuren vorzugsweise an die freiliegenden polaren Gruppen der Monomer-/Kohlenhydrateinheiten 25 angezogen werden.
4 zeigt die Anhaftung der Grundsubstanz am Patientgewebe durch Wasserstoffbrückenbindung an freiliegende Gewebeaminosäuren. Die Freilegung dieser Aminosäuren wird leicht durch Reißen des Gewebes mit einer Nadel zur subkutanen Injektion zur Zeit der Injektion erreicht. Die freiliegenden polaren Gruppen der Basalmembran (BM) des Gewebes des Patienten binden sich leicht an den festen Gerüstabschnitt der Grundsubstanz, der durch die polaren Aminosäuren verstärkt wird. Es wird angenommen, daß der wässerige Anteil bei normaler Körpertemperatur über einen Zeitraum von Minuten bis Stunden absorbiert wird.
Normalerweise stimuliert das Reißen des Gewebes neben dem Injektionstrauma die Erzeugung und Freisetzung von Stickstoffmonoxid, wobei die Rekrutierung von Immun- und Entzündungszellen eingeleitet wird, die Fremdstoffe phagozytieren oder Chemikalien freisetzen, um sie zu zerstören. Durch Bereitstellen einer lokalen und zeitlichen Hemmung der Stickstoffmonoxid- und Peroxidfreisetzung und -Erzeugung ermöglichen es Stickstoffmonoxidhemmstoffe, wie Aminoguanidin und Cystein, und Peroxidhemmstoffe, wie EDTA, daß sich die vom Kollagen abgeleiteten Alphaketten/Dextraneinheiten 25 binden und in die freiliegende Gewebeoberfläche integriert werden. Die Alphaketten/Dextraneinheiten 25 dienen dann als das Gerüst, an dem sich vorher differenzierte Wirtszellen zu einer „Mesenchym"-Morphologie entdifferenzieren. Diesem Entdifferenzierungsprozeß schließt sich die Integration dieser unvollständig differenzierten Zellen in das Wirtsgewebe an. Diese Mesenchymzellen sind dann imstande, Bereiche ihres Genoms zu fördern, die zu einer Differenzierung zu Fibroblasten, Endothelzellen und primitiven Blutformen führen, was zu einer Gewebeheilung und -Regeneration führt.
Durch Bereitstellung eines proteoglykanartigen Gerüstes, das ähnlich zu jenem ist, das in den frühen Stadien der fötalen Entwicklung zu finden ist, und Verwendung von Gefügestabilisierungsmitteln, die einem sekundären Zweck der Verbesserung der Wirtsantwort auf das Gerüst bei der Injektion dienen, dient die Grundsubstanz als eine bio kompatible Vorrichtung, die zur Erhöhung der Vaskularisation und zur Unterstützung der Wundheilung und lokalen Geweberegeneration imstande ist, selbst im Fall von diabetischen Fußgeschwüren, die für herkömmliche Geschwürbehandlungen unempfänglich sind. Da die Grundsubstanz die Geweberegeneration unterstützt, wie sie während der Embryogenese und Fötogenese stattfindet, wo ähnliche Gerüsttypen vorhanden sind, ist es nun entdeckt worden, daß die Grundsubstanz der Erfindung verwendet werden kann, um erfolgreich chronische Geschwüre zu behandeln, die nicht auf eine herkömmliche Wundtherapie ansprechen, wie Geschwüre, die durch Diabetes verursacht werden, Geschwüre, die durch chronischen Druck (Druckgeschwüre) verursacht werden, Venostasegeschwüre oder traumainduzierte Geschwüre, die mit einer umgebenden vaskulären Schädigung verbunden sind.
Komponenten der Grundsubstanz
Die Grundsubstanz enthält eine Gelatinekomponente. Obwohl denaturiertes Kollagen die bevorzugte Gelatinekomponente ist, können andere gelatinöse Komponenten verwendet werden, die durch ein Rückgrat gekennzeichnet sind, das aus langkettigen Sequenzen von Aminosäuren besteht, die polare Gruppen aufweisen, deren intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen gebrochen werden können, um die polaren Gruppen einer Wechselwirkung mit anderen Moleküle auszusetzen. Zum Beispiel könnten gekochte Agarose, Alginat, Keratin, Aminoglykane, Proteoglykane und dergleichen als die Gelatinekomponente verwendet werden. In einer Ausführungsform besteht die Gelatine aus Schweinegelatine aus teilweise hydrolysiertem Kollagen, das von Hautgewebe abgeleitet ist.
Die Gelatine ist in einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 40 mM, vorzugsweise etwa 0,05 bis etwa 30 mM, am bevorzugtesten etwa 1 bis etwa 5 mM vorhanden.
Vorteilhafterweise beträgt die Gelatinekonzentration annähernd 1,6 mM. Die obigen Konzentrationen stellen bei Lagertemperatur (unter etwa 33°C) eine feste Phase und bei Behandlungstemperatur (etwa 35 bis etwa 40°C) eine flüssige Phase bereit. Es kann intaktes Kollagen in kleinen Mengen hinzugegeben werden, um ein zusätzliches Bindungsnetzwerk bereitzustellen. Die Endkonzentration des intakten Kollagens beträgt etwa 0 bis etwa 5 mM, vorzugsweise 0 bis etwa 2 mM, am bevorzugtesten etwa 0,05 bis etwa 0,5 mM.
Es ist ein langkettiges Kohlenhydrat mit einem Molekulargewicht von etwa 20.000 bis etwa 1.000.000 Dalton zur Gelatinekomponente hinzugefügt. Obwohl Dextran ein bevorzugtes Kohlenhydrat ist, können andere Kohlenhydrate mit hohem Molekulargewicht verwendet werden, wie Amylopektin. Das Dextran polymerisiert locker um die Gelatinekomponente, wodurch die Zellanhaftung durch Verhindern einer Faltung des Gelatinegerüstes erleichtert wird. Das langkettige Kohlenhydrat ist in einer Konzentration von etwa 0,01 bis etwa 10 mM, vorzugsweise etwa 0,01 bis etwa 1 mM, am bevorzugtesten etwa 0,01 bis etwa 0,1 mM vorhanden. In einer Ausführungsform ist Dextran in einer Konzentration von etwa 0,086 mM vorhanden.
Die Gelatine/langkettige Kohlenhydrat-Komponente der Grundsubstanz der vorliegenden Erfindung ist mit einer flüssigen Zusammensetzung gemischt. Die flüssige Zusammensetzung beruht vorzugsweise auf einem Standardkulturmedium, wie dem Medium 199, das mit Additiven ergänzt wird, wie im folgenden beschrieben.
Die Grundsubstanz enthält vorzugsweise eine effektive Menge polarer Aminosäuren wie Arginin, Lysin, Histidin, Glutaminsäure und Asparaginsäure, die die Biohaftfähigkeit der Grundsubstanz weiter verbessern. Eine effektive Menge ist die Menge, die notwendig ist, um die Steifigkeit der Grundsubstanz zu erhöhen und eine direkte Injektion der Grundsubstanz in den Patienten zu ermöglichen. In einer Ausführungsform beträgt die Konzentration der polaren Aminosäuren etwa 3 bis etwa 150 mM, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 65 mM, und bevorzugter etwa 15 bis etwa 40 mM.
Vorteilhafterweise umfassen die hinzugefügten polaren Aminosäuren L-Glutaminsäure, L-Lysin, L-Arginin oder Mischungen davon. Die Endkonzentration von L-Glutaminsäure beträgt etwa 2 bis etwa 60 mM, vorzugsweise etwa 5 bis etwa 40 mM, am bevorzugtesten etwa 10 bis etwa 20 mM. In einer Ausführungsform beträgt die Konzentration von L-Glutaminsäure etwa 15 mM. Die Endkonzentration von L-Lysin beträgt etwa 0,5 bis etwa 30 mM, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 15 mM, am bevorzugtesten etwa 1 bis etwa 10 mM. In einer Ausführungsform beträgt die Konzentration von L-Lysin etwa 5 mM. Die Endkonzentration von L-Arginin beträgt etwa 1 bis etwa 40 mM, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 30, am bevorzugtesten etwa 5 bis etwa 15 mM. In einer Ausführungsform beträgt die Endkonzentration von L-Arginin etwa 10 mM.
Zusätzlich enthält die Grundsubstanz vorzugsweise einen oder mehrere Stickstoffmonoxidhemmstoffe. Ein Stickstoffmonoxidhemmstoff ist als irgendeine Zusammensetzung oder irgendein Mittel definiert, das die Erzeugung von Stickstoffmonoxid hemmt oder vorhandenes Stickstoffmonoxid fängt oder entfernt. Stickstoffmonoxid, ein pleiotroper Entzündungsvermittler, ist ein lösliches Gas, das durch Endothelzellen, Makrophagen und spezifische Neuronen im Gehirn erzeugt wird, und ist beim Bewirken einer Entzündungsantwort aktiv. Es ist bekannt, daß Stickstoffmonoxid und seine Metaboliten bei nuklearer Zerstörung und verwandten Verletzungen den Zelltod verursachen. Bevorzugte Stickstoffmonoxidhemmstoffe umfassen L-Cystein, ein L-Arginin-Analogon (wie Aminoguanidin, N-monomethyl-L-Arginin, N-nitro-L-Arginin, D-Arginin und dergleichen), Cystin, Heparin und Mischungen davon.
In einer Ausführungsform enthält die Grundsubstanz L-Cystein. L-Cystein dient als ein Stickstoffmonoxidfänger und stellt Disulfidbindungen bereit, die die Steifigkeit der Grundsubstanz und deren Kraftfestigkeit erhöhen. Die Endkonzentration von L-Cystein beträgt etwa 5 bis etwa 500 μM, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 100 μM, am bevorzugtesten etwa 15 bis etwa 25 μM. In einer Ausführungsform beträgt die Endkonzentration etwa 20 μM.
Vorteilhafterweise wird außerdem Aminoguanidin zur Grundsubstanz der vorliegenden Erfindung hinzugefügt. Wie oben angegeben, ist Aminoguanidin ein L-Arginin-Analogon und dient als ein Stickstoffmonoxidhemmstoff. Die Endkonzentration von Aminoguanidin beträgt etwa 5 bis etwa 500 μM, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 100 μM, am bevorzugtesten etwa 15 bis etwa 25 μM. In einer Ausführungsform beträgt die Endkonzentration etwa 20 μM.
Zusätzlich kann die Grundsubstanz der vorliegenden Erfindung einen Peroxidhemmstoff enthalten. Ein bevorzugter Peroxidhemmstoff ist Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder ein Salz davon. Peroxid ist ein hoch toxische, reaktionsfähige Sauerstoffart, deren Bildung durch divalente Übergangsmetalle wie Eisen, Mangan, Cobalt und manchmal Kalzium katalysiert wird. Hoch reaktionsfähige Sauerstoff arten wie Peroxid (O₂ ^–) können ferner in der Gegenwart von Eisen in das hoch toxische Hydroxylradikal (OH^–) umgewandelt werden. Durch Chelatbildung dieser Metallkatalysatoren dient EDTA als ein Antioxidationsmittel. EDTA ist außerdem eine divalente chelatbildende Kationenverbindung, die die Steifigkeit der Grundsubstanz durch Entfernen der Hemmung der Wasserstoffbrückenbindung von -NH₂ an -COOH erhöht. Der Konzentrationsbereich des Peroxidhemmstoffs beträgt etwa 0,01 bis etwa 10 mM, vorzugsweise 1 bis etwa 8 mM, am bevorzugtesten etwa 2 bis etwa 6 mM. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Peroxidhemmstoff in einer Konzentration von etwa 4 mM vorhanden.
Die folgende Tabelle listet besonders bevorzugte Schlüsselkomponenten der Grundsubstanz der vorliegenden Erfindung zusammen mit geeigneten Konzentrationen als auch bevorzugten Konzentrationen für jede Komponente auf.
Tabelle 1
Grundsubstanzherstellung
Bringe 835 ml des Mediums 199 in einen Rührbecher. Unter Rühren erwärme die Lösung auf 50°C. Pipettiere 63,28 μl Cystein, 1 ml L-Glutamin und 200 μl Aminoguanidin in den Rührbecher. Füge die folgenden gammabestrahlten trockenen Ausgangsstoffe hinzu: 120 Gramm denaturiertes Kollagen, 50 Gramm Dextran und 0,1 Gramm intaktes Kollagen. Verwende einen Glasrührstab, um das Mischen der trockenen Stoffe in die Lösung zu unterstützen. Pipettiere 8 ml EDTA in die Lösung. Pipettiere 5 ml L-Glutaminsäure, 5 ml L-Lysinacetat und 5 ml Arginin-HCl in den Rührbecher. Beachte, daß die Lösung gelb wird. Verwende 10% NaOH, um den pH der Grundsubstanzlösung auf einen End-pH von 7,40 ± 0,1 einzustellen. Die Osmolalität wird vorzugsweise mit Natriumchlorid und/oder sterilem Wasser falls notwendig auf eine Endosmolalität von etwa 200 bis etwa 400 mOsm eingestellt.
Behandlungsverfahren
Vorzugsweise wird eine therapeutische Menge der Grundsubstanz der Erfindung einem Patienten verabreicht, der an einem Geschwür wie einem chronischen Fußgeschwür leidet, das durch eine mit einer Diabetes zusammenhängenden vaskulären Neuropathie verursacht wird. Der Patient kann jedes Tier sein, einschließlich Säugetiere wie Hunde, Katzen und Menschen. Der Ausdruck „therapeutische Menge" bezeichnet die Menge, die benötigt wird, um die Geschwürheilung über eine Geweberegeneration zu unterstützen, was zum Beispiel durch eine Reduzierung der Größe des Geschwürs bewiesen wird. Die therapeutische Menge wird hauptsächlich durch die Größe der chronischen Läsion bestimmt. Typischerweise beträgt das Grundsubstanzvolumen, das für das Geschwür appliziert wird, etwa 1 bis etwa 60 ml. Anders aus gedrückt beträgt die therapeutische Menge annähernd 0,1 bis etwa 5 ml/2,5 cm der „Injektionsbahn", die die gesamte lineare Distanz ist, die während der Grundsubstanzverabreichung durchquert wird. Vorzugsweise reicht die therapeutische Menge aus, um ein einheitliches Gerüst zur zellulären Anhaftung und Differenzierung in der subdermalen/subkutanen Grenzfläche unter dem Geschwürkrater und unter dem Geschwürrand bereitzustellen. Im Fall eines diabetischen Fußgeschwürs, in dem sich das beeinträchtigte Mikrogefäßsystem zum zusammenhängenden Gewebe unter dem Geschwür erstreckt, muß der Arzt klinisches Augenmaß verwenden, um in subdermale oder subkutane Gewebe unter dem Geschwür zu injizieren, von denen er empfindet, daß sie aus der Regeneration von gesundem Gewebe Nutzen ziehen werden. Die Grundsubstanz wird vor der Verabreichung auf eine Temperatur von etwa 35 bis etwa 40°C erwärmt, um die Grundsubstanz zu verflüssigen.
Das Verfahren der Applikation der Grundsubstanz sollte zu einem Kontakt zwischen der Grundsubstanz und freiliegenden polaren Gruppen der Basalmembran des Gewebes des Patienten führen. Ein bevorzugtes Verfahren der Verabreichung der Grundsubstanz geschieht mittels Injektion, wobei die Nadel selbst das notwendige Durchstoßen des Gewebes liefert, das zelluläre Anhaftungsstellen zeigt, die zur Integration mit der injizierten Grundsubstanz imstande sind.
Die Grundsubstanz soll intradermal oder subdermal und ringsum den Umkreis der Läsion (Hautseite) als auch in die Läsion hinein über die Läsionsbreite hinweg in parallelen Bahnen injiziert werden, die durch etwa 1 cm getrennt sind. Folglich besteht eine typische Dosis aus mehreren oberflächlichen Injektionen an beabstandeten Stellen um und/oder in die Läsion. Der Zielort der oberflächlichen Injektionen ist der Bereich der Verbindung des dermalen/subdermalen Gewebes, die typischerweise etwa 0,5 bis etwa 2,0 mm unter der Oberfläche liegt. Die Haut wird oberflächlich durchstochen, als würde beabsichtigt, eine intradermale Injektion zu verabreichen, wobei Druck auf den Kolben ausgeübt wird. Die Grundsubstanz wird an dieser Verbindungsstelle nicht fließen, daher sollte die Nadel langsam in einem weiteren Winkel tiefer bewegt werden, bis die Grundsubstanz bei einem sanften Kolbendruck fließt. An diesem Punkt sollte sich die Nadel im erwünschten subdermalen Raum befinden. Der Kolben sollte zurückgezogen werden, um sicherzustellen, daß die Nadel nicht direkt in eine Vene oder eine Arterie eindringt. Wenn das Geschwür ein Geschwür dritten Grades ist, das heißt, wenn kein dermales Gewebe in der Wundenmitte freiliegt, dann sollten die Grundsubstanzinjektionen in die Läsion mit dem höchstmöglichen oberflächlichen Winkel injiziert werden, um es zu ermöglichen, daß die Grundsubstanz das Oberflächengewebe berührt. Bei diesem Verfahren wird die Nadel sichtbar sein, wenn sie genau unter die freiliegende Geschwüroberfläche vorgeschoben wird, und die Oberfläche wird sichtbar ausgedehnt werden, wenn das Grundsubstanzvolumen injiziert wird. Wie oben angegeben, kann es zusätzlich zu den oberflächlichen Injektionen um und in das Geschwür angebracht sein, ein zusätzliches Volumen der Grundsubstanz unter das Geschwür zu injizieren.
Wenn die Anfangsinjektion die Läsion nicht vollständig heilt, können weitere Injektionen vorgenommen werden, falls notwendig. Beispiele von Grundsubstanz-Injektionsdosierungsmengen für die oberflächlichen Injektionen (sichtbare Oberfläche des Geschwürs) werden in der folgenden Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2
Experimentelles
Beispiel 1
Zwei diabetische vaskuläre Läsionen an einem spontan diabetischen, hyperlipidämischen Hundes wurden mit einer einzigen Injektion der Grundsubstanz (die die annähernden Konzentrationen und Bestandteile aufwies, die in Tabelle 1 aufgelistet sind) um den Umkreis und zentral in die Läsion behandelt. Das Gesamtvolumen der injizierten Grundsubstanz betrug etwa 5–10 ml in jeder Läsion. Eine Läsion war am rechten hinteren Ellbogen lokalisiert, und die andere befand sich an der rechten hinteren Pfote. Zwei Tage nach der Injektion war eine Hyperämie in beiden Läsionen offenkundig, jedoch keine Schwellung oder Entzündung.
Die Läsion am Ellbogen wurde in 6 Tagen vollständig geschlossen, mit einem neuen Haut- und Haarwachstum über der Stelle der Läsion. Es wurde sieben Monate nach der Behandlung eine Biopsie der Stelle vorgenommen. Histologische Ansichten der Stelle zeigten eine intakte Epidermis, Dermis, Haarfollikel und Vaskularisation im Behandlungsbereich. Bemerkenswerterweise erschien kein Narbengewebe, wie es bei einer normalen Heilung erscheint, und die Regeneration der „retikulären" (amorphen) Morphologie der dermalen extrazellulären Gerüstflächen war deutlich. Von Interesse war das Vorhandensein von Rete-Leisten an der Epidermis-Dermis-Grenzfläche, die auf eine vollständige Heilung hindeuten. Diese Daten zeigen die Langzeitwirkung einer einzigen Injektion der Grundsubstanz und die Integration der Grundsubstanz in Wirtsanwortmechanismen.
Die Läsion an der Pfote war nach sechs Tagen deutlich kleiner. Von Bedeutung war, daß in den Bereich, der nach sechs Tagen nicht geheilt war, nicht injiziert worden war, da die Nadel distal in die Mitte der Wunde eingeführt wurde. Diese Daten zeigen ferner, daß die durch die Grundsubstanz bewirkte schnelle Geweberegeneration von der Bindung der Grundsubstanz an Wirtsgewebe abhängig ist. Das Geschwür schloß sich nach 21 Tagen.
Beispiel 2
In einer anderen Studie erhielten zwei von drei Kaninchen mit Hautgeschwüren zweiten Grades am Rücken, die sich aus einem chirurgischen Abbinden der peripheren Blutgefäße ableiteten, Grundsubstanzinjektionen (die die annähernden Konzentrationen und Bestandteile aufwies, die in Tabelle 1 aufgelistet sind) um den Umfang und zentral in das Geschwür. Nach vier Tagen hatten sich die beiden behandelten Läsionen verkleinert und waren am Tag 21 vollständig geheilt. Von besonderer Bedeutung ist die Haarregeneration, die bei den behandelten Kaninchen auftrat. Das dritte Kaninchen mit einem Geschwür, das nicht mit der Grundsubstanz behandelt wurde, zeigte eine unvollständige Heilung der ursprünglichen Läsion nach 21 Tagen mit dem Auftreten eines neuen Geschwürs und kein Haarwachstum. Der Geschwürverschluß der Kaninchen, die die Grundsubstanz erhielten, ist mit der erhöhten Vaskularisation und der Behandlung der zugrundeliegenden vaskulären Beeinträchtigung konsistent. Die neue Geschwürbildung bei dem Kaninchen, das die übliche Behandlung erhielt, resultierte aus dem Fehlen einer adäquaten Vaskularisation, wie sie bei einer diabetischen Fußgeschwürerkrankung auftritt.
Beispiel 3
Die Grundsubstanz der Erfindung wurde durch Injektion sechs menschlichen Patienten mit chronischen Läsionen verabreicht, die für sechs Monate bis zu zwölf Jahren vorhanden waren. Es wurde eine einzelne Dosis der Grundsubstanz (die die annähernden Konzentrationen und Bestandteile aufwies, die in Tabelle 1 aufgelistet sind) an mehreren Stellen um den Rand des Geschwürs und in einem Fall auch in das Geschwür appliziert. Der Menge der applizierten Grundsubstanz wurde durch die Geschwürgröße bestimmt, wie oben beschrieben. Es wurde vor der Behandlung eine EMLA^®-Creme aufgetragen, um die Injektionsstellen zu betäuben. Nach der Behandlung wird ein herkömmlicher Geschwürverband aufgebracht, und es wurden üblichen Geschwürbehandlungsprozeduren gefolgt. Wenn klinisch angezeigt, wurde eine Gewebereinigung vor der Injektion durchgeführt. Die Läsionsgröße und ihr Aussehen wurden an periodischen Intervallen nach der Behandlung ausgemessen. Wie in 5 gezeigt, wurde nach der Behandlung die Größe der Läsion bei jedem Patienten merklich reduziert. Die Resultate für jeden Patienten werden unten beschrieben.
Patient 103: Dies war der erste Studienpatient, dem die Grundsubstanz injiziert wurde. Das behandelte Geschwür war für vier Jahre vorhanden, gegenüber einer aggressiven herkömmlichen Behandlung ebenso wie DERMAGRAFT refraktär. Dies war das einzige Geschwür in der Studie, in das oberflächlich unter die Geschwüroberfläche injiziert wurde. Der Krankenhausarzt zog es vor, etwas der Grundsubstanz unter die Läsion zu injizieren, auch in der Hoffnung, das gesunde Gefäßsystem im Stützgewebebett zu regenerieren. Das Geschwür wurde am Tag 14 geschlossen, mit einer fortgesetzten Reifung des Äußeren des neuen Gewebes bis zum Tag 84.
Patient 104: Das Geschwür dieses Patienten war für annähernd zwei Jahre vorhanden, gegenüber einer aggressiven herkömmlichen Therapie refraktär. In dieses Geschwür wurde unter die Oberfläche des Geschwürs nur an seinen Rändern injiziert. Während es schien, daß die Wunde sich füllte und gut heilte, blieb die Mitte am Tag 56 offen. Wiederum unterstützte dies die Annahme, daß die Grundsubstanz das Gewebe durch direktem Kontakt heilt. Der Patient starb am Tag 72, wobei der Tod offensichtlich durch die Komplikationen verursacht wurde, die sich aus einer Geschichte einer chronischen Hypertonie und Diabetes ergaben (diese Bedingungen hatten vorher zur Krankenhauseinweisung geführt).
Patient 105: Dieser Patient hatte das kleinste chronische Geschwür in der Studie, wobei dessen Existenz für nur sechs Monate vor dem Eintritt in die Studie dokumentiert worden war. Wiederum wurde die Geschwüroberfläche während der Verabreichung der Grundsubstanz nicht durchbrochen. Stattdessen wurde an den Rändern unter die Geschwüroberfläche in das Geschwür injiziert. Während dieses Geschwür im wesent lichen heilte (eine Reduzierung der Oberflächengröße um 65% am Tag 28), blieb es am Tag 84 offen.
Patient 106: Das Geschwür dieses Patienten war gegenüber mehreren Therapien für über ein Jahr refraktär. Die Injektionen durchstachen nicht die Geschwüroberfläche, sondern bestanden aus oberflächlicheren Injektionen längs des Geschwürumkreises, was zu einem „weißen Halo"-Aussehen führte. Es wird vermutet, daß das weiße Aussehen mit der vorübergehenden lokalen Vasokonstriktion zusammenhängt, die durch Stickstoffmonoxidhemmstoffe und -Fänger bewirkt wird. Dieser Patient hatte eine unkontrollierte Hypertonie, und verletzte sein Bein während eines damit nicht in Beziehung stehenden Sturzes. Während die Ränder des Geschwürs näher zusammenkamen, wobei sich die freilegende Oberflächengröße in vier Wochen um 40% reduzierte, schien sie beim weiteren Verschluß stehenzubleiben, was wiederum damit zusammenhing, daß nicht in die Geschwüroberfläche injiziert wurde.
Patient 108: Das Geschwür dieses Patienten war das chronischste in dieser Studie, das für 12 Jahre offen war. Während wiederum die Mitte des Geschwürs nicht durchbrochen wurde, wurde in den Umkreis des Geschwürs oberflächlicher injiziert, mit der Bildung des „weißen Halos" innerhalb von Minuten nach der Injektion. Da das Geschwür kleiner war, wobei die Ränder näher zusammen waren, ermöglichte es dies, daß die Ränder, in die oberflächlich injizierten wurde, unter Nutzung der normalen Wundheilungsmechanismen des Verschlusses zusätzlich zu der durch die Grundsubstanz bewirkten Geweberegeneration zusammenkamen. Das Geschwür war am Tag 56 mit offenkundig neuem Gewebe vollständig geschlossen.
Patient 109: Dieser Patient hatte die am besten dokumentierte Geschichte einer Geschwürbehandlung. Das Geschwür war zur Zeit der Behandlung zwei Jahre alt und gegenüber vier APLIGRAF-Applikationen, REGRANEX und 30 Tage in einer Überdrucksauerstoffkammer refraktär. Die Patientenläsion zeigte wieder den „weißen Halo" nach einer oberflächlichen Injektion des Geschwürumkreises. Nach der ersten Woche fühlte sich der Patient ermutigt und legte eine beachtliche Gehstrecke ohne orthopädisches Schuhwerk zurück, was zu dem beobachteten ersichtlichen Öffnen und Schließen geführt haben kann. Am Tag 56 war es ungewiß, ob das Geschwür vollständig geschlossen war, jedoch hatte es sich mindestens dramatisch verkleinert. Da dieses Geschwür wieder kleiner als einige der anderen Geschwüre war, wird angenommen, daß es sich aufgrund der normalen Wundheilungsmechanismen geschlossen hat, die die Ränder zusätzlich zur durch die Grundsubstanz bewirkten Geweberegeneration zusammenziehen.
Viele Modifikationen und andere Ausführungsformen der Erfindung werden einem Fachmann einfallen, den diese Erfindung betrifft, der Nutzen aus den Lehren zieht, die in den vorhergehenden Beschreibungen und zugehörigen Zeichnungen präsentiert werden. Daher ist zu verstehen, daß die Erfindung nicht auf die spezifischen Ausführungsformen zu beschränken ist, und daß beabsichtigt wird, daß Modifikationen und andere Ausführungsformen im Rahmen der beigefügten Ansprüche eingeschlossen sind. Obwohl spezifische Ausdrücke hierin eingesetzt werden, werden sie nur in einem allgemeinen und beschreibenden Sinn und nicht zum Zweck der Beschränkung verwendet.

Claims

Verwendung einer Hydrogelgrundsubstanz, wobei die Grundsubstanzzusammensetzung Gelatine und ein langkettiges Kohlenhydrat mit einem Molekulargewicht von 20.000 bis 1.000.000 Da enthält, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Geschwürs, wobei die Hydrogelgrundsubstanz dazu bestimmt ist, in mehreren oberflächlichen Injektionen an beabstandeten Stellen um den Rand eines Geschwürs, in ein Geschwür oder beides injiziert zu werden, und wobei die oberflächlichen Injektionen dazu bestimmt sind, in einem Bereich der dermalen/subdermalen Gewebeverbindung vorgenommen zu werden.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Grundsubstanz 0,01 bis 40 mM Gelatine enthält.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Gelatine denaturiertes Kollagen enthält.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das langkettige Kohlenhydrat Dextran enthält.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Grundsubstanz 0,01 bis 10 mM Dextran enthält.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Grundsubstanz ferner eine effektive Menge polarer Aminosäuren enthält, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Arginin, Lysin, Histidin, Glutaminsäure und Asparaginsäure besteht.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die effektive Menge der polaren Aminosäuren 3 bis 150 mM polare Aminosäuren enthält.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die effektive Menge der polaren Aminosäuren 10 bis 65 mM polare Aminosäuren enthält.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die polaren Aminosäuren aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Arginin, Glutaminsäure, Lysin und Mischungen davon besteht.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Grundsubstanz enthält: 2 bis 60 mM L-Glutaminsäure; 0,5 bis 30 mM L-Lysin; und 1 bis 40 mM Arginin.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Grundsubstanz enthält: 5 bis 40 mM L-Glutaminsäure; 1 bis 15 mM L-Lysin; und 1 bis 30 mM Arginin.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die effektive Menge der polaren Aminosäuren 2 bis 60 mM L-Glutaminsäure enthält.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die effektive Menge der polaren Aminosäuren 1 bis 40 mM Arginin enthält.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die effektive Menge der polaren Aminosäuren 0,5 bis 30 mM L-Lysin enthält.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Grundsubstanz ferner mindestens einen Stickstoffmonoxidhemmstoff enthält, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus L-Cystein, L-Arginin-Analogen, Cystein, Heparin und Mischungen davon besteht.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei der Stickstoffmonoxidhemmstoff in einer Menge von 5 bis 1000 μM vorhanden ist.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei der Stickstoffmonoxidhemmstoff in einer Menge von 20 bis 200 μM vorhanden ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Grundsubstanz ferner 5 bis 500 μM L-Cystein enthält.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Grundsubstanz 15 bis 25 μM L-Cystein enthält.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Grundsubstanz ferner EDTA oder ein Salz davon enthält.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Gelatine denaturiertes Kollagen enthält und das langkettige Kohlenhydrat Dextran enthält.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die therapeutische Menge 1,0 bis 60 ml aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Geschwür ein diabetisches Fußgeschwür ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei an der Stelle des Geschwürs vor der Injektion der Hydrogelgrundsubstanz eine Gewebereinigung durchzuführen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Hydrogel dazu bestimmt ist, in einer Tiefe von 0,5 bis 2,0 mm unter der Oberfläche des Geschwürs verwendet zu werden.