DE60127983T2

DE60127983T2 - Nicht störendes, dreidimensionales system für die kultivierung und ernte verankerungsabhängiger zellen

Info

Publication number: DE60127983T2
Application number: DE60127983T
Authority: DE
Inventors: Harry Irvine YU; Kam W. Ellicott City LEONG; Ser-Mien Chia
Original assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore; National University of Singapore
Current assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore; National University of Singapore
Priority date: 2000-10-12
Filing date: 2001-10-12
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2021-10-13
Also published as: ATE360063T1; US20040023370A1; EP1326968A1; US20020094569A1; US20050220891A1; US20090286278A1; DE60127983D1; EP1326968B1; EP1326968A4; US6916640B2; WO2002031135A1; US7943353B2; US6905875B2; AU2002213143A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Zellkultur und insbesondere ein dreidimensionales System zur Kultur und Ernte von verankerungsabhängigen Zellen.
Beschreibung des Standes der Technik
Es hat neuerdings ein Wiederaufleben des Interesses an Stammzellforschung gegeben. Stammzellen sind multipotent und plastisch, was es ihnen ermöglicht, zur Differenzierung in verschiedene Zelltypen induziert zu werden. Almeida-Porada et al., "Adult Stem Cell Plasticity and Methods of Detection", Rev Clin Exp Hematol 5(1), 26–41 (2001). Adulte Stammzellen (AS-Zellen) sind bei den meisten Verwendungen zu bevorzugen, nicht nur weil die Herkunft der Zellen weniger kontrovers und leichter zugänglich ist als embryonale Stammzellen (ES Zellen), sondern adulte Stammzellen werden auch leichter in die finalen differenzierten Zelltypen induziert, die bei Anwendungen benötigt werden. Clarke, D. et al., "Differentiation Potential of Adult Stem Cells", Curr Opin Genet Dev 11(5), 575–580 (2001). Bis heute werden AS-Zellen auf Grund der Unterschiede in ihrer Proliferationskapazität in vitro nicht als geeigneter Ersatz für ES-Zellen angesehen. Gage, F. H., "Mammalian Neural Stem Cells," Science 287 (5457), 1433–1438 (2000). ES-Zellen haben (insbesondere in Mausmodellen) in vitro eine im Wesentlichen unbegrenzte Proliferationskapazität, was bedeutet, dass sie für Anwendungen in großem Maße expandiert werden können. Andererseits können die meisten AS-Zellen in vitro nur für etwa 5–12 Passagen proliferieren und hören dann auf zu profilieren und differenzieren stattdessen in zufälliger Weise in andere Zelltypen. Pittenger, M. F. et al., "Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells", Science 284 (5411), 143–147 (1999). Dieses Kennzeichnen hat daher vordem die Brauchbarkeit von AS-Zellen für therapeutische Anwendungen erheblich begrenzt.
Die meisten Säugetierzellen sind verankerungsabhängig (mit Ausnahme von Zellen in Flüssigkeit, wie lymphatischen und hämatopoetischen Zellen). Die in vitro Kultur der verankerungsabhängigen Zellen ist traditionell durch zwei Hauptfaktoren limitiert. Der eine ist der begrenzte Platz in den Kulturgefäßen. Zellen werden nur in Logphase exponentiell proliferieren, wenn ausreichend Platz im Kulturgefäß vorhanden ist. Sobald die Zellen einen Kontakt miteinander herstellen, verlangsamt sich ihre Proliferation und hört schließlich auf oder die Zellen signalisieren einander sogar, durch Apoptose zu sterben. Der andere begrenzende Faktor ist die Eignung des Substrates für die Zellanheftung. Eine ungeeignete Anheftung ändert oft die Zellfunktionen und im Folgenden alle beobachteten Strukturen und Funktionen. Beide Faktoren können potentiell Artefakte hervorrufen, die das Ergebnis von biologischen Zellstudien oder Zelltransplantations- oder Gewebetechnikanwendungen beeinflussen können.
Ein Ansatz zur Verbesserung des Ausmaßes, zu dem der Platz eines Zellkulturgefäßes genutzt wird, ist die Verwendung von Mikrokapseln. US-Patentanmeldung 5,620,883 offenbart biokompatible Mikrokapseln, die lebende Zellen enthalten, die in einer Membran eingekapselt sind. Gemäß diesem Dokument ist die Membran durchlässig für Material, das für die normale Zellfunktion nötig ist, und für Produkte, die von Zellen freigesetzt werden.
Chia et al. beschreiben in Tissue Engineering 6 (5), 481–495 (2000), ein Dokument, das nach dem Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht wurde, ein Verfahren zum Einkapseln von Rattenhepatozyten in Mikrokapseln. Die von Chia et al. verwendeten Mikrokapseln waren nur für kleine Moleküle durchlässig und hatten eine 2 bis 3 μm dicke äußere Schicht aus synthetischem Polymer und eine innere Schicht aus positiv geladenem modifiziertem Kollagen.
Verschiedene Ansätze wurden eingesetzt, um die Kontaktinhibition der Zellproliferation zu vermeiden, indem ausreichend Platz oder Oberfläche zur Verfügung gestellt wurde, auf dem/der Zellen wachsen können. Ein Ansatz bestand darin, bevor die Zelldichte konfluent wurde, Zellen durch Protease-Behandlung umzusetzen, um die Zellen von der Kulturoberfläche zu lösen. Im Allgemeinen wird Trypsin eingesetzt, aber andere, wie Kollagenase, werden in einigen Fällen auch verwendet. Die mit Protease behandelten Zellen werden typischerweise zusammengetragen, aufgenommen, durch Zentrifugation sedimentiert, in frischem Kulturmedium resuspendiert und auf mehrere Kulturgefäße verteilt. Jedes neue Gefäß enthält einen Bruchteil der ursprünglichen Zellzahl und hat daher ausreichend neue Oberfläche, um Zellproliferation zu ermöglichen, bis wieder Konfluenz auftritt. Solch ein Umsetzungsprozess kann mehrere Male wiederholt werden bis die Zellen auf Grund anderer Ursachen aufhören zu proliferieren.
Ein anderer Ansatz war es, die Zeit vor dem fortlaufenden Umsetzen der Zellen zu erhöhen, indem die Minimalzellzahl, die in Gefäße gesät wird, vermindert wird, oder indem die Höchstzahl an Zellen, die das Kulturgefäß vor der Konfluenz aufnehmen kann, erhöht wird. Da es Zellen von Natur aus bevorzugen, in der Nachbarschaft von anderen Zellen zu sein, um sich gegenseitig zu stützen, ist die Mindestzahl, die anfänglich in ein Kulturgefäß gesät werden kann, oft durch die Unterstützung begrenzt, die die Zell-Zell-Wechselwirkung, Kommunikation und das Freisetzen von Wachstumsfaktoren und ähnliches erbringen. Daher sind angereicherte Kulturmedien verwendet worden, um Zellwachstum und -proliferation zu unterstützen, was es erlaubt, eine niedrigere Minimalzellzahl in das Gefäß zu säen, und eine längere Zeitspanne ermöglicht, bis die Zellen wieder umgesetzt werden müssen.
Eine andere Möglichkeit, die Kulturzeit zwischen jedem Umsetzen zu verlängern, war es, Zellen in einer dreidimensionalen Matrix wachsen zu lassen. Eine dreidimensionale Matrix hat typischerweise eine dicke Schicht einer Matrix wie Kollagen auf der Oberfläche des Kulturgefäßes oder Mikrosphären einer konzentrierten Matrix. In einer solchen dreidimensionalen Matrix können Zellen in drei Dimensionen in mehrfache Schichten wachsen, was eine längere Kulturperiode bis zur Konfluenz ermöglicht. Um das Anheften von Zellen an ein Substrat zu modulieren, wurden verschiedene natürliche und synthetische Substrate entwickelt, wie solche die kurze Peptide und Zuckermotive und ähnliches einbeziehen.
Im Wesentlichen beinhalten all diese Ansätze das Umsetzen von Zellen mit die Intaktheit von Zellen angreifenden Techniken, wie Proteasen, Kältebehandlung oder EDTA-Behandlung, kombiniert mit Zell-Schaben, um die Zellen vom Substrat (entweder geladene Oberflächen oder dreidimensionale Matrix) zu lösen. Jede dieser Techniken des Umsetzens kann schädliche Wirkungen auf Zellstruktur und Funktion haben. Beispielsweise entfernen Proteasen per Verdau Zelloberflächenmoleküle, die nicht nur für die Anheftung von Zellen an Substrate essentiell sind, sondern auch für Signalmoleküle, die für die Funktion der Zelle wichtig sind. Es ist gezeigt worden, dass Kältebehandlung verschiedene zelluläre Vorgänge wie die Anordnung des Zytoskeletts, Wege des Membran-Trafficking und ähnliches ungünstig einflusst. Es wurde gezeigt, dass EDTA-Behandlung und mechanisches Schaben Zellfunktionen ungünstig beeinflussen, da sich die Zellen abrunden und für Beschädigung durch mechanisches Schaben anfällig sind. Im Falle der dreidimensionalen Kultur in einer Matrix ist die Proteasebehandlung der einzige derzeit bekannte Weg, um Zellen umzusetzen. Für die Zelltransplantation oder das Aussäen von Zellen auf Gewebetechnikgerüste werden derzeit Zellen mit vorübergehend beschädigten Funktionen (auf Grund der die Intaktheit von Zellen angreifenden Zellumsetztechniken) eingesetzt, da die derzeitigen Kulturmethoden keine bessere Alternative anbieten können.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein die Intaktheit von Zellen nicht angreifendes dreidimensionales System für die Kultivierung von einem oder mehreren verankerungsabhängigen Zelltypen. Das System weist eine Mehrzahl an hohlen Mikrokapseln auf, von denen jede eine innere Extrazellulärmatrix in Kontakt mit mindestens einer Zelle aufweist und eine äußere Schale aus synthetischem Polymer, die die Extrazellulärmatrix umgibt. Zellen in Kontakt mit der Extrazellulärmatrix werden in drei Dimensionen im Inneren der hohlen Mikrokapseln kultiviert. Die Mikrokapseln sind durchlässig für Nährstoffe, die notwendig sind, um normale metabolische Funktionen der Zelle zu gewährleisten, und für von den Zellen freigesetzte Toxine. Die äußere Schale hat eine Dicke von etwa 1 bis etwa 20 μm und kann durch mechanische Bewegung zerbrochen werden, um die kultivierten Zellen zu ernten.
Das dreidimensionale Kultursystem ermöglicht Zellwachstum und Proliferation in drei Dimensionen, was ein Umsetzen der Zellen ermöglicht, ohne die Zellen ihre Intaktheit angreifenden Bedingungen auszusetzen, die Zellstruktur und Funktionen beeinflussen können. Die im System verwendete Matrix stellt auch eine gute Umwelt für die Kultivierung oder Kokultivierung verankerungsabhängiger Zellen bereit. Die in dieser Weise kultivierten Zellen können sogleich für Zelltransplantation, das Aussäen von Zellen auf Gerüste in der Gewebetechnik und andere Anwendungen verwendet werden, die eine sofortige Verfügbarkeit funktionsfähiger Zellen erfordern. Das Kultursystem der vorliegenden Erfindung verwendet mechanisch bruchempfindliche Mikrokapseln, die leicht während des Zellumset zungsprozesses zerbrechen können. Das positiv geladene Kollagen wird bevorzugterweise darauf optimiert, dass es im Inneren der Mikrokapseln ausreichend verdünnt ist, damit das Kollagen während des Umsetzens der Zellen leicht von den Zellen gewaschen werden kann.
Das die Intaktheit von Zellen nicht angreifende dreidimensionale Zellkultursystem ermöglicht es, dass verankerungsabhängige Zellen in den Mikrokapseln kultiviert werden können, und ohne das Erfordernis geerntet werden können, die Zellen rauhen Bedingungen, wie Proteasen, Kälte oder Zell-Schaben aussetzen zu müssen. Die geernteten Zellen, die auf diese Weise kultiviert werden, werden sogleich für Zelltransplantation oder das Aussäen von Zellen auf Gerüste in Gewebetechnikanwendungen verwendet. Im Gegensatz dazu werden Zellen, die mit gegenwärtigen Systemen kultiviert werden, durch den Erntevorgang in gewissem Ausmaß beschädigt.
Die Dreidimensionalität des Systems ist dafür vorgesehen, große Zellzahlen mit einer verminderten Zellumsetzungsfrequenz zu vermehren. Das System ermöglicht es auch, Zellen für eine Wieder-Proliferation oder für einen unmittelbaren Einsatz in Anwendungen zu ernten, ohne die typischen Ablöseverfahren zu durchlaufen. Die Zellen, die in die Intaktheit von Zellen nicht angreifender Weise aus dem Zellkultursystem der Erfindung geerntet werden, zeigen typischerweise beim Binden an mit Liganden konjugierte Polymeroberflächen verbesserte Anheftungskinetiken, besser erhaltene Zellmorphologie und -funktionen als auf herkömmlicher Weise kultivierte Zellen.
Das Zellkultursystem der Erfindung ist bei zellbasierten Analysen oder Diagnosemethoden hilfreich, wie Durchflusszytometrieanalysen, die von Zelloberflächenmarkern abhängig sind. Solche Analysen sind derzeit nur für Suspensionszellen wie hämatopoetische Zellen anwendbar. Beispiele schließen das Verwenden von Annexin V als Marker für Apoptose ein, Ca⁺⁺-Kinetiken oder Zytoskelettmarker, die auf Zellerntebedingungen wie Proteasen, Kälte oder EDTA-Behandlungen empfindlich sind. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, dass diese Analysen mit allen anderen Zelltypen, die verankerungsabhängig sind, durchgeführt werden können.
Die dreidimensionale Kultur ähnelt stärker der natürlichen Umgebungssituation von Zellen, was sich in einem höheren Niveau an Zellfunktionen im Vergleich zu denen aus zweidimensionaler Kultur zeigt. Es ist auch mehr Platz für Zellen zum Proliferieren vorhanden, wodurch die Kulturzeit erhöht wird, bis ein neues Umsetzen der Zellen erforderlich ist. Dies hat auch eine kleinere Zahl ausgesäter Zellen zur Folge und einer größeren Zahl geernteter Zellen. Solche Merkmale sind ideal für eine großtechnische Zellproduktion. Frühere dreidimensionale Verfahren werden durch die schwierigen Arbeitsabläufe beim Umsetzen der Zellen und beim Ernten behindert. Die vorliegende Erfindung überwindet diese Nachteile früherer dreidimensionaler Verfahren.
Da der Einsatz von Enzym, Chemikalien oder Temperaturänderungen im dreidimensionalen Zellkultursystem während des Umsetzens der Zellen nicht notwendig ist, wird der Vorgang des Umsetzens der Zellen erheblich vereinfacht und Kosten und Lagerung von Enzymen, die beim Umsetzen der Zellen verwendet werden, minimiert. Dies ist besonders für eine großtechnische Produktion und Umsetzung von verankerungsabhängigen Zellen vorteilhaft.
Jede Mikrokapsel dient als eine unabhängige Mikrokammer für die Zellkultur, wodurch die Mikrokapseln in jedem Bioreaktoraufbau eingesetzt werden können. Die Stofftransporteigenschaften der Mikrokapseln sind ausreichend gut, um sogar Zellkultur in stationären Kulturgefäßen zu ermöglichen. Dies kann beispielsweise mittels einer niedrigen Konzentration der Extrazellularmatrix erreicht werden. Wenn beispielsweise Kollagen als eine Extrazellularmatrix verwendet wird, liegt die Konzentration typischerweise im Bereich von etwa 0,2 bis etwa 3,5 mg/ml. In früheren Systemen wurden unter Verwendung von Kollagen als Matrix höhere Kollagenkonzentrationen (4–5 mg/ml) verwendet, da es erforderlich war, das Kollegen-Gel zu haben und die Form eines sphärischen Tröpfchens zu bilden und dann mit Poly-L-Lysin zu beschichten. Höhere Konzentrationen der Extrazellularmatrix neigen dazu, einen Hauteffekt zu haben, der die Stofftransporteigenschaften behindert. Daher müssen die bisherigen Mikrokapseln in einem Fließbettbioreaktor eingesetzt werden, um einen verbesserten Stofftransport für eine ausreichende Versorgung der Zellkultur mit Nährstoffen und Gas zu erreichen. Die Mikrokapseln der vorliegenden Erfindung können mit jedem Bioreaktoraufbau verwendet werden. Besonders im Fall des Festbetts kann das Volumen des verwendeten Kulturmediums auf ein Minimum beschränkt werden.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden in größerem Detail unter Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beschrieben, die nur als Beispiele aufgeführt und in den nachfolgenden Abbildungen illustriert werden.
1 ist ein Diagramm, das illustriert, wie stark PC 12, HepG2 und mesenchymale Stammzellen (MSc) in den Mikrokapseln ohne Umsetzen stark vermehrt werden.
2A–2B veranschaulichen „Konformergerüste", die um individuelle Zellen gebildet werden und das Umsetzen oder Ernten von Zellen ohne Ablösen von den Substraten ermöglichen: 2A ist ein Diagramm, das die Kollegengelierung veranschaulicht, gemessen bei 37°C durch die Zunahme des Brechungsindex; 2B ist ein konfokales Bild, das Kollagen zeigt, das mit FITC markiert ist.
3 ist ein Abtastelektronenmikroskop(engl. Scanning Electron Microscope, SEM)-Bild einer Mikrokapsel, in der ein Teil einer Mikrokapsel abgelöst wurde, sodass die darin eingekapselten Zellen bloßgelegt wurden.
4 ist ein Diagramm, das die erneute Zellproliferation von PC 12-, HepG2- und MSc-Zellen in den Mikrokapseln veranschaulicht.
5A–5F veranschaulichen den Vergleich von ligandenspezifischer Anheftung, Zellmorphologie und Funktionen der auf die Intaktheit nicht angreifende und auf herkömmliche Weise kultivierte Zellen: 5A ist ein Diagramm, das die Anheftung von PC 12-Zellen an YIGSR, das an ein Polyesterdeckgläschen konjugiert ist; 5B ist ein Diagramm, das die Anheftung von Rattenhepatozyten an eine mit Laktose konjugierte Polyestermembran veranschaulicht; 5C veranschaulicht die Morphologie und Funktion der PC 12-Zellen; 5D ist ein Diagramm, das die Detoxifikationsfunktionen der Rattenhepatozyten veranschaulicht; 5E sind Bilder, die die Morphologie und Proliferationskapazitätsbeurteilung der MSc-Zellen nach einem Monat durchgehender Kultur zeigen und 5F veranschaulicht die Verdopplungszeit von in der Intaktheit nicht angegriffenen Zellen und von auf herkömmliche Weise kultivierten Zellen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Das dreidimensionale Zellkultursystem der vorliegenden Erfindung verwendet bruchempfindliche Mikrokapseln mit einer kontrollierten dreidimensionalen Mikroumgebung für optimales Zellwachstum, -proliferation und -funktion. Mikrokapseln in Form von Sphären haben das höchste Oberflächen/Volumen-Verhältnis und haben bevorzugterweise eine ultradünne Schale, die gute Stofftransporteigenschaften ermöglicht, wodurch eine Zentralnekrose vermieden wird, die aus einem Nährstoff/Sauerstoff-Mangel resultiert, wie er typischerweise bei gegenwärtigen dreidimensionalen Kulturanordnungen beobachtet wird. In einer bevorzugten Anordnung der vorliegenden Erfindung ist es im Wesentlichen die einzige Rolle der äußeren Schale, ein Behältnis zur Verfügung zu stellen, um die Extrazellularmatrix im Innern der sphärischen Form zu halten, um ein Substrat für die Zellen bereitzustellen. Zu diesem Zweck kann eine Minimalkonzentration der Matrix verwendet werden, die dazu ausreicht, Wachstum, Proliferation und Funktion der Zellen aufrecht zu erhalten. Wenn z.B. Kollagen als eine Extrazellularmatrix verwendet wird, liegt die Konzentration typischerweise im Bereich von etwa 0,2 bis 3,5 mg/ml und typischererweise von etwa 0,5 bis etwa 1,5 mg/ml, im Gegensatz zu den 4 bis 5 mg/ml, die typischerweise verwendet werden, um Zellen in derzeitigen dreidimensionalen Kulturanordnungen einzufangen.
Zu den prinzipiellen Vorteilen, die mit dem dreidimensionalen Zellkultursystem der vorliegenden Erfindung einhergehen, zählen die, die sich beim Umsetzen der Zellen und beim Ernten der Zellen zeigen. Vorteilhafterweise braucht die Matrix nicht zu gelieren, um die Zellen an ihrem Platz festzuhalten. Wenn daher die bruchempfindlichen Schalen zum Zeitpunkt des Umsetzens der Zellen zerbrochen werden, kann die verdünnte Matrix leicht von den Zellen entfernt werden, indem die Zellen sedimentiert und mit frischem Kulturmedium oder Puffern gewaschen werden. Die Zellen können in kleinere Fraktionen aufgeteilt werden, mit neuer Matrix verdünnt werden und wieder in Mikrokapseln eingeschlossen und kultiviert werden. Der Vorgang kann wiederholt werden, ohne die Zellen jedweden rauen Bedingungen auszusetzen, die die Intaktheit von Zellstrukturen und Funktionen von Zellen angreifen. Durch eine natürlichere und konstante Kulturumgebung ohne das Erfordernis, die Zellen regelmäßigen rauen Bedingungen auszusetzen, sind die Zellen gesünder als solche, die in herkömmlichen Systemen kultiviert sind. Der begrenzende Faktor in einer solchen dreidimensionalen Zellkultur ist oft die Sauerstoffkonzentration. Die Mikrokapsel sollte bevorzugterweise weniger als etwa 200 μm im Durchmesser sein.
Die Zerbrechlichkeit der Mikrokapseln ist ein bedeutender Aspekt des die Intaktheit von Zellen nicht angreifenden dreidimensionalen Kultursystems. Schwache mechanische Einwirkungen, wie z.B. ein paar Mal auf- und abpipettieren, ist üblicherweise ausreichend, um die Mikrokapseln aufzubrechen und den Inhalt der Mikrokapseln freizusetzen, z.B. die Matrix und die Zellen. Durch Spülen mit Puffern oder Kulturmedien können die Zellen dann von der verdünnten Matrix getrennt werden. Die Zerbrechlichkeit der Mikrokapseln kann durch Verwenden einer sehr dünnen Mikrokapselschale erreicht werden. Die Mikrokapselschale hat üblicherweise eine Dicke von bis zu etwa 40 μm, oft von etwa 1 bis etwa 20 μm, und noch öfter von etwa 2 bis etwa 5 μm.
Eine große Vielzahl verankerungsabhängiger Zellen kann mit dem dreidimensionalen Zellkultursystem der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. PC-12, eine Rattenphäochromozytomzelle, die normalerweise auf Kollagen kultiviert wird und die die Fähigkeit hat, zu neuronenähnlichen Zellen induziert zu werden, ist ein Beispiel für eine verankerungsabhängige proliferierende Zelle. Als ein weiteres Beispiel sind Hepatozyten für Umwelteinflüsse sehr empfindliche verankerungsabhängige Zellen. HepG2 ist ein Beispiel einer humanen hepatozellulären Karzinomzelle. Mesenchymale Stammzellen (MSc-Zellen) sind multipotente Zellen, die sich als undifferenzierte Zellen replizieren können und die das Vermögen haben, sich in Linien von mesenchymalem Gewebe zu differenzieren. Andere Zellen, die eine sehr starke Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkung haben, wie z.B. Keratinozyten, sind ebenfalls beim Kultursystem der vorliegenden Erfindung verwendbar. Das dreidimensionale System der vorliegenden Erfindung ist besonders für die Expansion von Cokulturen nützlich, z.B. durch das Aufnehmen von mehr als einem Zelltyp in die Mikrokapseln.
Das dreidimensionale Zellkultursystem der vorliegenden Erfindung ist in einer Vielzahl von Gewebetechnik- und Zell transplantationsanwendungen nützlich, wie bei der enzymfreien Kultur und Expansion von Keratinozyten für die Haut oder Chondrozyten oder mesenchymalen Stammzellen für Knorpel/Knochen. Zusätzlich ist das Zellkultursystem bei Anwendungen nützlich, die die dreidimensionale Kultur von verankerungsabhängigen Zellen für entweder Forschungszwecke oder für die Produktion von eukaryotischen Zellen oder von Zellen sezernierten Produkten erfordern oder bevorzugen. Das Kultursystem kann in der ex vivo Zellproduktion verwendet werden, sowie für genetische Veränderungen von Zellen für Transplantationstherapien, um Krebs, Infektionskrankheiten und Gewebewiederherstellung zu behandeln. Das Kultursystem ist auch in einer zellbasierten Diagnose oder Analyse dienlich, die davon abhängt, dass die Zellen in einem natürlichen Zustand (entweder von normalen oder pathologischen Proben) sind, ohne rauen Proteasebehandlungen ausgesetzt zu werden.
Zellen können in den Mikrokapseln mit der Matrix im Inneren kultiviert werden, während die Stofftransporteigenschaften optimiert werden, um zentrale Nekrose zu vermeiden. Typischerweise werden ins Innere der Mikrokapseln etwa 1 × 10⁵ Zellen ausgesät. Die Zellen werden typischerweise über eine Zeitspanne von Tagen, gewöhnlicherweise 7–9, poliferieren gelassen. Am Ende eines Kulturzyklus ist das Verhältnis der Zellzahl am Ende zur ursprünglich ausgewählten Zellzahl typischerweise mindestens 10 und noch typischererweise mindestens 20. Das Verhältnis kann so hoch wie 100, 200, 400, 600 oder höher sein. Dieses Verhältnis beweist eine viel längere Zellkulturzeit (8–9 Tage) zwischen jedem aufeinander folgenden Umsetzen der Zellen im Vergleich zur herkömmlichen zweidimensionalen Kultur (2 Tage unter der Annahme der gleichen Zellverdopplungszeit von 24 Stunden). Das Kulturmedium sollte alle 2–3 Tage gewechselt werden, um einen frischen Vorrat an Nährstoffen zur Verfügung zu stellen und um Stoffwechselabfallprodukte zu entfernen. Abhängig von der mechanischen Stärke der Mikrokapseln können die Zellen in ortsfesten Gefäßen oder im Festbett für einen geringeren Kulturmediumverbrauch in großtechnischen Zellkulturen kultiviert werden. Im letzteren Fall können ein einfacher Apparat und ein Minimal-Kulturmedium für die großtechnische Produktion von verankerungsabhängigen Zellen verwendet werden.
Sowohl natürliche vorkommende als auch modifizierte Biopolymere sind in der Anwendung der Erfindung für die Verwendung als Extrazellularmatrix geeignet, wie auch sowohl kationische als auch anionische Biopolymere. Im Allgemeinen können jedwede üblicherweise in Zellstudien verwendeten Substrate verwendet werden, von denen nicht einschränkende Beispiele Kollagen, kationisches Kollagen, anionisches Kollagen, anionische veresterte Hyaluronsäure, anionische aminmodifizierte Hyaluronsäure, Fibonektin und Laminin umfassen. Die Biopolymere sind bevorzugterweise wasserlöslich und haben in den meisten Fällen ein Molekulargewicht von wenigstens 20,000, bevorzugterweise wenigstens 75,000, bevorzugtererweise wenigstens 125,000, noch bevorzugtererweise wenigstens 200,000 und noch bevorzugtererweise wenigstens 250,000.
Während Kollagen verwendet wurde, um Arzneistoffe einzukapseln, fand es keine weite Verbreitung zur Einkapslung von Zellen, da bei neutralen pH eine unzureichende Ladungsdichte vorhanden ist, um eine einkapselnde Membran zu bilden. Kollagen, das verändert wurde, um seinen pK_i auf mindestens 9 anzuheben, ist bei physiologischem pH dagegen ausreichend positiv geladen, um mit synthetischen Polyelektrolyten entgegengesetzter Ladung komplexiert zu werden, um eine zusammenhängende Membran zu bilden. Kollagen kann auch verändert werden, um ein stärker basisches Polymer zu bilden, in dem die primären Aminogruppen in tertiäre Aminogruppen verwandelt werden oder durch Veresterung.
Anionische Biopolymermaterialien, wie z.B. Hyaluronsäure (engl. Hyaluronic Acid, HA) und modifizierte HA (veresterte HA oder aminmodifizierte HA) sind in der Erfindung verwendbar. Im Allgemeinen haben anionische Biopolymere, die für den Gebrauch in dieser Erfindung geeignet sind, eine Ladungsdichte von wenigstens etwa 20 %, bevorzugterweise wenigstens etwa 30 % und noch bevorzugtererweise wenigstens etwa 50 %. HA, das vollständig oder teilweise verestert oder mit einem primären Amin umgesetzt ist, um es weniger wasserlöslich zu machen, wird einen stärkeren Komplex mit der polykationischen äußeren Schicht bilden als HA selbst. Zu bevorzugten Biopolymeren zur Bildung der Extrazellularmatrix zählen modifiziertes HA und modifiziertes Kollagen. Besonders bevorzugt wird veresteres Kollagen. Im Allgemeinen wird die Extrazellularmatrix, obwohl wasserlöslich, leicht hydrophob sein.
Eine Veresterung oder eine Reaktion, um auf dem Biopolymer tertiäre Aminogruppen zu bilden, kann durch eine Reaktion des Biopolymers mit einer großen Auswahl an aliphatischen Ausgangsstoffen erreicht werden, welche in ihrer Kette wenigstens 18 Kohlenstoffatome enthalten können. Zu solchen Ausgangsstoffen zählen u.a. Alkohole, primäre Amine und Alkoholamine. Bevorzugte Ausgangsstoffe enthalten etwa 8 Kohlenstoffatome oder weniger. Für einige Zwecke kann die Verwendung von Ausgangsstoffen mit nur 2 oder 3 Kohlenstoffatomen bevorzugt sein. Zu typischen Alkoholen zählen Methanol, Ethanol, Butanol und höhere Alkohole, während zu typischen primären Aminen Methylamin, Ethylamin und höhere Amine zählen. Ausgangsstoffe mit sowohl Alkohol als auch Aminogruppen, wie z.B. Ethanolamin, können ebenfalls verwendet werden. Die Ausgangsstoffe sollten so ausgewählt werden, dass die Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinträchtigt wird.
Die äußere Schale weist einen biokompatiblen synthetischen Polyelektrolyten auf, der eine Ladung hat, die der des Biopolymers entgegengesetzt ist. Wenn das Biopolymer polykationisch ist (z.B. modifiziertes Kollagen) sollte daher der in der äußeren Schicht verwendete Polyelektrolyt polyanionisch sein. Wenn umgekehrt das Biopolymer polyanionisch ist (z.B. HA, modifiziertes HA, etc.), sollte der in der äußeren Schale verwendete synthetische Polyelektrolyt polykationisch sein. Geeignete synthetische Polyelektrolyte der äußeren Schicht bilden einen Komplex mit dem entgegengesetzt geladenen Biopolymer, um durch den Koazervierungsprozess eine Membran zu bilden und der Verkapselung Stabilität zu verleihen. Die Ladungsdichte des synthetischen Polymers wird typischerweise im Bereich von etwa 0,1 % bis etwa 20 % liegen, beträgt bevorzugterweise wenigstens etwa 1 % und beträgt noch bevorzugtererweise wenigstens etwa 3 %. Die synthetischen Polyelektrolyte haben wie die Biopolymere bevorzugterweise ein Molekulargewicht von wenigstens 20,000, bevorzugterweise wenigstens 75,000, noch bevorzugtererweise wenigstens 125,000, noch bevorzugtererweise wenigstens 200,000 und noch bevorzugtererweise wenigstens 250,000.
Die biokompatible synthetische Polyelektrolytschicht, die in der Lage ist, mit dem Biopolymer der Extrazellularmatrix eine Membran zu bilden, die es für Umwelteinflüsse empfindliche Zellen, wie z.B. Hepatozytenzellen, ermöglicht lebensfähig zu bleiben und gleichzeitig die Zellen gegen eine Immunreaktion durch den Wirt schützt. Eine bevorzugte Klasse an biokompatiblen synthetischen Polyelektrolyten sind Acrylatpolymere. Zu solchen Polymeren zählen Acrylatpolymere, Kopolymere und Terpolymere wie z.B. Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure, Polymethacrylat, Polymethylmethacrylat und Acrylatkopolymere und Terpolymere der Acrylsäure, Methacrylsäure, von Methacrylaten, Methylmethacrylaten, Hydroxyethylmethacrylsäure wie z.B. 2-Hydroxyethylmethacrylat, Hydroxypropylacrylat und ähnlichen und Mischungen daraus. Polydimethylaminoethylmethacrylat (DMAEMA) und Kopolymere und Terpolymere von Dimethylaminoethylmethacrylat mit 2-Hydroxyethylmethacrylat und/oder Hydroxypropylacrylat und Methacrylat und/oder Methylmethacrylat sind bevorzugte kationische synthetische Polymere. Kopolymere oder Terpolymere von Acrylsäure und/oder Methacrylsäure mit 2-Hydroxyethylmethacryl- und/oder Hydroxypropylacrylat und Methacrylat und/oder Methylmethacrylat sind bevorzugte anionische synthetische Polymere. Jedes hat bei Verwendung mit anderen Biomaterialien Biokompatibilität gezeigt.
Eine bevorzugte äußere Schale aus biokompatiblem synthetischem Polyelektrolyt ist ein Acrylat-Terpolymer der Methacrylsäure (MAA), Hydroxyethylmethacrylat (HEMA) und Methylmethacrylat (MMA). Das Terpolymer weist bevorzugterweise von etwa 10 mol% bis etwa 30 mol%, bevorzugtererweise von etwa 15 mol% bis etwa 25 mol% MAA, von etwa 10 mol% bis etwa 40 mol%, bevorzugtererweise von etwa 20 mol% bis etwa 30 mol% HEMA und von etwa 20 mol% bis etwa 60 mol%, bevorzugtererweise von etwa 45 mol% bis etwa 55 mol% MMA auf. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Terpolymer durch Polymersieren von MAA-, HEMA- und MMA-Monomeren in einem molaren Verhältnis von etwa 1:1:2 gebildet.
Die Membran der eingekapselten Zelle ist selektiv permeabel. Die Zellen, die gemäß der Erfindung verkapselt sind, bleiben lebensfähig, da die Membran für Nährstoffe und andere Materialien durchlässig ist, die notwendig sind, um normale metabolische Funktionen der Zellen zu gewährleisten. So passieren beispielsweise ionische Materialien und Sauerstoff die Membran. Die Membran ist auch für Zellprodukte durchlässig, wie z.B. Hormone und Stoffwechselabfallprodukte. Daher kann Material, das von den Zellen gebildet wird, aus dem Inneren der Mikrokapsel durch die Membran hindurch treten. Auf diese Weise kann Material, das von der eingekapselten Zelle gebildet wird, in das Blut eines Wirtes eingeführt werden oder in ein Kulturmedium, in dem verkapselte Zellen platziert sind, eingebracht werden.
Die Durchlässigkeit der Membran verhindert im Wesentlichen den Eintritt von Immunglobulinen, Makrophagen und anderen Stoffen des Immunsystems, die die Abstoßung von Zellen durch das Immunsystem des Wirts bewirken. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Membran für Moleküle undurchlässig, die größer als etwa 100 kDa sind und ist bevorzugterweise für Moleküle undurchlässig, die größer als etwa 71 kDa sind. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Membran für Moleküle durchlässig, die größer als etwa 60 kDa sind, und für Moleküle undurchlässig, die größer als etwa 150 kDa sind.
Die Zusammensetzung der äußeren Schale kann verändert werden, um die Durchlässigkeits- und Transporteigenschaften der Membran zu verändern. Als ein Beispiel kann die Durchlässigkeit der Membran für typische polare Bestandteile, die in biologischen System vorkommen, erhöht werden, in dem ein hydrophiles Copolymer, wie etwa Poly-(2-hydroxethylmethacrylat) (HEMA) oder andere Hydroxy-enthaltende Acrylate in den Polyelektrolyten einbezogen werden, der die äußere Schicht der Membran bildet. Eine Zunahme der Hydrophobizität von Polyelektrolyten neigt dazu, eine verminderte Durchlässigkeit zu bewirken.
Im bevorzugten MAA/HEMA/MMA-Terpolymer stellt HEMA Hydrophilie bereit, um das Terpolymer wasserlöslich zu machen, sodass die gesamte Einkapselung im physiologischen wässrigen Puffer ohne das Erfordernis eines organischen Lösungsmittels durchgeführt werden kann. MMA verleit den Mikrokapseln mechanische Stärke, Belastbarkeit und Elastizität. MAA sorgt für eine negative Ladung, um mit einer positiv geladenen inneren Schicht Wechselwirkungen einzugehen. Die innere Schicht ist bevorzugterweise ein verestertes Kollagen mit einer positiven Nettoladung. Das Gleichgewicht zwischen den beiden geladenen Polymeren bestimmt die physikalischen Eigenschaften der Mikrokapseln. Beispielsweise können beim Verwenden eines 10 %igen Terpolymers und 1,5 mg/ml modifizieren Kollagens Mikrokapseln gebildet werden, die eine dünne Schicht einer äußeren Schale (~ 2 μm) und eine halb gelartige innere Schicht haben, die den Scheinwiderstand gegen einen Stofftransport durch die Membran minimieren, aber als Mikrokapseln über Tage stabil bleiben. Die halb gelartige innere Kollagenschicht ist in der Lage, eine „lockere" Extrazellularmatrixanordnung bereitzustellen, die die in vivo Situation nachahmt, sodass die Mikrokapseln höhere Grade an Zellfunktion aufrechterhalten können. Diese Merkmale der Mikrokapseln, die die meisten Erfordernisse eines leberunterstützenden bioartifiziellen Systems (engl. Bioartificial liver-assisted device, BLAD) erfüllen, wurden durch eine Optimierung verschiedener Parameter erreicht.
Die Durchlässigkeit der Membran kann also durch die Auswahl des Molekulargewichts oder der Struktur der äußeren Schale eingestellt werden, um auszuschließen, dass Moleküle die Membran passieren, die von zuvor ausgewähltem Molekulargewicht oder zuvor ausgewählter Struktur sind. Wenn das Molekulargewicht des Polyelektrolyten erhöht wird, neigt die Membran dazu, durchlässiger zu werden. Auch große Unterschiede in den Ladungsdichten zwischen dem inneren Biopolymer und dem äußeren Polyelektrolyten neigen dazu, die Membran durchlässiger zu machen. Die mechanische Stabilität der Membran kann verbessert werden, indem das Molekulargewicht des Polyelektrolyten in der äußeren Schale erhöht wird, oder indem Monomere im Polyelektrolyten verwendet werden, die für mechanische Stärke sorgen, wie z.B. MMA.
Die Membran kann durch Komplexkoazervierung gebildet werden, indem Tropfen der Lösung eines Biopolymers, das eine Zellsuspension enthält, mit der Lösung eines synthetischen Polymers bei physiologischen oder neutralen pH-Werten von etwa 6 bis etwa 8 vereinigt werden, um zu verhindern, dass die Lebensfähigkeit der Zellen nachteilig beeinflusst wird. In einem solchen Verfahren wird das Biopolymer in einem geeigneten wässrigen Lösungsmittel gelöst, das die Überlebensfähigkeit der Zellen nicht nachteilig beeinflussen wird. Solche Lösungsmittel sind gut bekannt und zu ihnen zählen gepufferte Saline, Kulturmedium und Ähnliches. Gleichermaßen ist der synthetische Polyelektrolyt in einem geeigneten Lösungsmittel löslich, das die Lebensfähigkeit der Zellen nicht bedrohen wird, und wird darin gelöst. Zu solchen Lösungsmitteln zählen wässrige Lösungsmittel wie gepufferte Saline, Kulturmedium und Ähnliches. Das für das Biopolymer verwendete Lösungsmittel braucht nicht das gleiche Lösungsmittel zu sein, das für das synthetische Polymer verwendet wird. Falls gewünscht kann leichtes Bewegen der Polyelektrolytlösung durchgeführt werden.
Bei einer geeigneten Technik wird die Lösung eines Substratpolymers, die in einem geeigneten Lösungsmittel wie etwa Phosphat gepufferter Saline (PBS) eine Zellsuspension enthält, tropfenweise zu einer Aufnahmelösung zugegeben, die bei Umgebungstemperatur in PBS einen synthetischen Polyelektrolyten entgegengesetzter Ladung enthält. An der Grenzfläche der beiden Lösungen bildet sich eine zusammenhängende Membran, um eingekapselte Zellen bereitzustellen. Vorteilhafterweise ist kein organisches Lösungsmittel notwendig und keine Quervernetzungsreaktion erforderlich. Die Bedingungen der Verkapselung sind daher besonders mild, was eine geringe Zellsterberate ergibt.
Das richtige Zusammenpassen von Biopolymer und synthetischem Polyelektrolyten kann zugleich bestätigt werden. Ein Tropfen einer Lösung des Biopolymers kann zu einer Lösung des Elektrolyten zugegeben werden. Ein richtiges Zusammenpassen führt durch Komplexkoazervierung zur schnellen Bildung einer Mikrokapsel oder einer Membran, was optisch beobachtet werden kann. Die Eignung einer gegebenen Verkapselung hinsichtlich ihrer Durchlässigkeit kann leicht durch in vitro-Tests mit Hilfe von Standardzellkulturmedien festgestellt werden, zur Bestimmung, ob die gewünschten Produkte sezerniert werden, ob unerwünschte Immunbestandteile ausgeschlossen werden, und ob die Überlebensfähigkeit der eingekapselten Zellen in geeigneter Weise erhalten bleibt.
Die Konzentrationen der Polymerlösungen, die Größe der Tröpfchen, die zur Lösung des synthetischen Polyelektrolyten zugegeben werden, und die Geschwindigkeit, mit der die Substratpolymerlösung, die die Zellsuspension enthält, zur Lösung des synthetischen Polyelektrolyten zugegeben wird, kann eingestellt werden, um eine Verkapselungsmembran mit der gewünschten Dicke an Schichten und der gewünschten Größe zu erzielen. Geeignete Konzentrationen der Biopolymerlösung und der Lösung des synthetischen Polyelektrolyten werden je nach den verwendeten spezifischen Polymeren und Lösungsmitteln variieren, die Bestimmung solcher Konzentrationen liegt jedoch mühelos in den Fertigkeiten des Fachmanns. Es ist zwar nicht möglich, Konzentrationen für alle Möglichkeiten zu umreißen, jedoch wird die Konzentration des Biopolymers oft im Bereich von etwa 0,1 bis 2 % liegen, während die Konzentration des synthetischen Polyelektrolyten oft im Bereich von etwa 2 bis 6 % liegen wird.
Die Dicke der inneren Substratpolymerschicht wird u.a. von der Viskosität der Biopolymerlösung und dem Eindringungsgrad in die Lösung des synthetischen Polyelektrolyten abhängen, den die Tröpfchen der Lösung des Substratpolymers erreichen. Der Eindringungsgrad steht im Zusammenhang mit dem Molekulargewicht der Polyionen und der Viskosität der Lösungen.
Die Zellzahl im Innern jeder Mikrokapsel kann leicht gesteuert werden und ist eine Funktion der Dichte der Zellsuspension im Biopolymer. Beispielsweise können Zellen in PBS (die bei Dichten von 10³ bis 10⁶ Zellen pro ml vorliegen können) mit dem Biopolymer vermischt werden, um eine Vielzahl von Zellkonzentrationen zur Verfügung zu stellen. Einzelne Mikrokapseln können jede gewünschte Zellzahl enthalten, die typischerweise im Bereich von 1 bis 200 Zellen oder mehr liegt. Es wurde beobachtet, dass Kollagen eine „Hautwirkung" zeigt, die dem Stofftransport abträglich ist, da eine hohe Konzentration von Kollagen zur Gelierung führt. Eine solche „Hautwirkung" ist konzentrations- und temperaturabhängig. Extrazelluläre Matrizen wie Kollagen oder Matrigel haben Gelierungstemperaturen von 22–35°C, je nach der Konzentration dieser Proteine. Bei 37°C, wo Hepatozyten normalerweise in einem Bioreaktor kultiviert werden oder eine Transplantation in vivo durchgeführt wird, kann die „Hautwirkung" am stärksten ausgeprägt sein. Da der Stofftransport eine der wichtigsten Erwägungen bei der Ausgestaltung von Bioreaktoren für ein bioartifizielles leberstützendes System (BLAD) ist, ist es wünschenswert, die optimale Kollagenkonzentration einzusetzen, so dass die „Hautwirkung" minimiert wird, während noch genug Kollagen zur Komplexierung mit dem synthetischen Polyanion vorhanden ist und stabile Mikrokapseln bildet.
Albumin wurde als Modellmolekül für die Optimierung der Durchlässigkeit von Mikrokapseln verwendet. Albumin (MW 67,000 Da) ist eins der von Hepatozyten sezernierten Proteine. Es fungiert als Überträger, der die meisten Stoffwechselabfallprodukte in der Leber bindet, um sie aus dem Blut zu entfernen. Ein anderes wichtiges Fängerprotein ist Bilirubin (10,000 Da), welches kleiner als Albumin ist. Es wurde beobachtet, dass Albumin ungehindert in die Mikrokapseln dringen kann. Eine bekannte Albuminkonzentration (1 % w/v) wurde zu Kollagen gegeben und Mikrokapseln wurden gebildet. Die Mikrokapseln wurden in einem Kulturmedium mit der gleichen Albuminkonzentration (1 % w/v) bei 37°C für 2 Stunden äquilibriert, um das Auftreten einer möglichen „Hautwirkung" zu ermöglichen. Eine solche Äquilibrierung vor den Permeabilitätsmessungen ist für die Beobachtung jedweder „Hautwirkung" durch das gelierende Kollagen unerlässlich. Eine Voräquilibrierung von bis zu 5 Tagen zeigte, dass die „Hautwirkung" geringfügig stärker ausgeprägt war als mit einer Voräquilibrierung von 2 Stunden. Anschließend wurde das aus den Mikrokapseln in frisches Kulturmedium freigesetzte Albumin überwacht, dem kein Albumin zugesetzt war. Bei 1,5 mg/ml des modifizierten Kollagens wurde das meiste des eingekapselten Albumins aus den Mikrokapseln innerhalb von 15 Minuten freigesetzt. Bei einer Erhöhung der Kollagenkonzentration in den Mikrokapseln auf 4 mg/ml (~ 0,4 % w/v) wurde die Freisetzung von Albumin stark gehemmt. Bei Kollagenkonzentrationen unter 1,5 mg/ml konnten Hepatozyten nicht eingekapselt werden, möglicherweise durch eine ungenügende positive Ladung des verdünnten Kollagens.
Eine bevorzugte Terpolymerzusammensetzung besteht aus 25 mol% HEMA, 25 mol% MAA und 50 mol% MMA bei einer Konzentration von 10 % in PBS. Wurde die Terpolymerzusammensetzung für eine höhere negative Ladung auf Kosten der mechanischen Stabilität verändert (z.B. 50 mol% MAA, 25 mol% HEMA, 25 mol% MMA), so nahm die Harnstoffsynthese der eingekapselten Hepatozyten auf Niveaus ab, die unter der der Monoschichtkontrolle lagen. Die Zusammensetzung und Konzentrationen an Polymeren können variiert werden, um eine erhöhte mechanische Stabilität und andere physikalische Merkmale zu erreichen.
Da die Membran der eingekapselten Zellen der Erfindung den Kontakt zwischen den Zellen und Bestandteilen des Immunsystems des Wirts ausschließt, können alle Typen lebender Zellen, inklusive sowohl natürlich vorkommender als auch durch Gentechnik veränderter Zellen, eingekapselt werden. Das Einkapselungssystem ist für verankerungsabhängige Zellen geeignet und insbesondere für die Verkapselung von für Umwelteinflüsse empfindliche, verankerungsabhängige lebende Zellen wie Hepatozyten geeignet.
Eingekapselte Zellen der Erfindung sind z.B. auch als hormonproduzierendes System dienlich. Die Verwendung von Zellen, die in einer selektiv durchlässigen Biopolymermembran mikroverkapselt sind, bietet die Gelegenheit, künstliche Organe und andere Verfahren zur Verbesserung und Wiederherstellung von Funktionen in Personen mit physischen Behinderungen bereitzustellen.
Ein Beispiel eines Typs einer hormonproduzierenden Zelle ist eine Zelle des Hypophysen-Vorderlappens. Eine solche Zelle scheidet Wachstumshormone aus, die u.a. das Skelettwachstum stimulieren. Gemäß der Erfindung eingekapselte natürliche vorkommende Hyphophysen-Vorderlappenzellen sind für die Stimulation des Skelettwachstums in einem Wirt dienlich. Die eingekapselten Zellen stellen Wachstumshormone zur Verfügung, die von den Zellen produziert und in das Blut des Wirtes über die Verkapselungsmembran eingeführt werden. Auch durch Gentechnik veränderte Mikroorganismen können Wachstumshormone produzieren. Wenn verkapselt, können solche Mikroorganismen verwendet werden, um einem Wirt Wachstumshormone zur Verfügung zu stellen.
Eingekapselte Zellen, die Hormone sezernieren, können auch in einem Kulturmedium suspendiert werden und werden über einen längeren Zeitraum Hormone ausscheiden. Eingekapselte Insulin produzierende Zellen, z.B. Säugetier-Alphazellen des Pankreas, Betazellen oder intakte Langerhanssche Inseln können auch als eine künstliche Bauspeicheldrüse verwendet werden. Solche verkapselten Zellen können in ein Säugetier mit Diabetes implantiert werden und werden in vivo dadurch wirken, dass sie als Antwort auf eine Blutzuckerkonzentration des Wirtes Insulin und andere Hormone ausschütten.
Andere Zelltypen können ebenfalls in nutzbringender Weise verkapselt werden. Eingekapselte Neurotransmitter sezernierende Zellen können beispielsweise verwendet werden, um neurologische Störungen wie die Parkinsonsche und Alzheimersche Krankheit zu behandeln. Ebenso können Transplantate chromaffiner Zellen verwendet werden, um Schmerz, insbesondere chronischen Schmerz, zu lindern und eingekapselte Knorpelzellen können zur Reparatur von Skelettmuskeldefekten verwendet werden. Praktische Ärzte vom Fach werden die Nützlichkeit, lebende Zellen einzukapseln, erkennen, und werden in der Lage sein, noch weitere Zellen zu identifizieren, die für eine Einkapselung gemäß der Erfindung geeignet sind.
Obwohl die Membran für Proteasen durchlässig sein kann, die Kollagen und andere Biopolymere verdauen können, die für die Bildung der inneren Membranschicht verwendet wurden, wurde beobachtet, dass die innere Schicht intakt bleibt. Ohne sich an eine Theorie zu binden, wird angenommen, dass die Proteasen das modifizierte Kollagen, HA, modifizierte HA, oder andere Biopolymere nicht verdauen können, wenn das Biopolymer mit der äußeren Schicht komplexiert ist. Dieser Widerstand kann mit dem Widerstand gegen in Lösung bringen von Typ 1 Kollagen und von quervernetztem Kollagen analogisiert werden, wie er beim Herzklappengewebe gefunden wird. Wiederum ohne dem Wunsch sich an eine Theorie zu binden, wird postuliert, dass die Komplexierung die Konformation der Spaltstelle (zwischen Glycin und Leucin) abschirmt oder verändert, sodass das entstehende komplexierte Biopolymer gegen einen Abbau resistent wird.
Die Länge der Zeitspanne, während der eingekapselte Zellen intakt bleiben, wird von den Eigenschaften des Mediums abhängen, in dem die eingekapselten Zellen verwendet werden, sowie von der Zusammensetzung des Biopolymers und des synthetischen Polyelektrolyten. Beispielsweise könnte erwartet werden, dass eingekapselte Zellen, die in einem Kulturmedium verwendet werden, für einen längeren Zeitraum intakt bleiben als eingekapselte Zellen, die in einen menschlichen oder tierischen Körper eingeführt werden. Auch kann die mechanische Stabilität der Membran verbessert werden, indem das Molekulargewicht des synthetischen Polyelektrolyten erhöht wird. Praktische Ärzte des Fachgebietes werden in der Lage sein, die Länge der Zeitspanne zu bestimmen, während der eingekapselte Zellen in verschiedenen Medien intakt bleiben.
Das dreidimensionale Kultursystem der vorliegenden Erfindung unterstützt die Proliferation von verankerungsabhängigen Säugerzellen. Drei beispielhafte verankerungsabhängige Säuger zelltypen von Interesse sind 1) PC 12, eine Rattenphäochromozytomzelle, die normalerweise auf Kollagen kultiviert wird, 2) HepG2, eine humane hepatozelluläre Karzinomzelle, und 3) mesenchymale Stammzellen (MSc-Zellen), welche multipotente Zellen sind, die sich als undifferenzierte Zellen replizieren können und die die Leistungsfähigkeit haben, sich in Linien von Mesenchymgewebe zu differenzieren. Wie in 1 gezeigt, können all diese Zelltypen in den Mikrokapseln proliferieren. Die Zellen können z.B. proliferieren, wenn sie bei einem Dichtebereich von etwa 5 × 10⁴ bis 2 × 10⁶ Zellen/ml mit der optimalen Dichte bei etwa 1 × 10⁶ Zellen/ml ausgesät werden, was in 7 Tagen eine mehr als 100-fache Zellvermehrung ergab (als die entgültigen/anfänglichen Zelldichten in Mikrokapseln definiert).
Im Vergleich konnten Zellen auf herkömmlichen zweidimensionalen Oberflächen, die mit Kollagen beschichtet waren (der Einfachheit halber als „2D-Kultur" bezeichnet), nur proliferieren, wenn die Zellen im engeren Dichtebereich von 1 × 10⁵ bis 7 × 10⁵ Zellen pro 35 mm-Schale ausgesät wurden. Unter einer Zellaussädichte von etwa 1 × 10⁵ Zellen pro Schale prolifierten die Zellen nicht und lösten sich oft innerhalb von zwei Tagen von Kollagenoberflächen ab. Oberhalb von etwa 7 × 10⁵ Zellen/Schale waren die Zellen in der 2D-Kultur im Wesentlichen konfluent und proliferierten auf Grund der Kontaktinhibition nicht. Die dreidimensionale Mikroumgebung der Mikrokapseln erlaubt es verankerungsabhängigen Zellen mehr zu proliferieren, bevor sie auf die Kontaktinhibition stoßen.
Mit einer Zellaussädichte von etwa 1 × 10⁶ Zellen/ml wurden die Wirkungen verschiedener Kollagenkonzentrationen auf die Proliferation von PC 12- und HepG2-Zellen in den Mikrokapseln beurteilt. Es wurde gefunden, dass Zellen im Kollagenkonzentrationsbereich von 0,5–5,0 mg/ml proliferieren konnten, mit der optimalen Konzentration bei etwa 1,5 mg/ml. In den unten beschriebenen Experimenten wurden 1 × 10⁶ Zellen/ml der PC 12-, HepG2- und MSc-Zellen in 1,5 mg/ml Kollagen kultiviert.
Es wurde gefunden, dass das dreidimensionale Kultursystem mit positiv geladenem Kollagen das Umsetzen der Zellen minimiert. Eine der Möglichkeiten, ein zu häufiges Angreifen der Intaktheit von Zellen in Kultur zu vermeiden, ist es, die Zellen bis zum Umsetzen solange wie möglich proliferieren zu lassen. Da die Mikrokapseln im gleichen Kulturvolumen mehr verankerungsabhängige Zellen aufnehmen können als die 2D-Kultur, können die Mikrokapseln potentiell eine längere Zellkulturperiode ermöglichen, um eine stärke Zellvermehrung zu erreichen, bevor ein Umsetzen der Zellen erforderlich ist. In der Tat können PC 12-, HepG2- und MSc-Zellen für 7 Tage in den Mikrokapseln der vorliegenden Erfindung kultiviert werden, bevor die Zellen die Mikrokapseln ausfüllten und ein Umsetzen der Zellen notwendig wurde. Die längste zulässige Kulturperiode bis zum Umsetzen der Zellen und das Niveau der Zellamplifikation zwischen jedem aufeinander folgenden Umsetzen der Zellen hängen von der Proliferationsrate der Zellen unter den verwendeten Kulturbedingungen ab. In 7 Tagen wurden PC 12-, HepG2- und MSc-Zellen jeweils 130 ± 7-, 50 ± 3- und 100 ± 8-fach in den Mikrokapseln amplifiziert, im Vergleich zur typischen 2–10-fachen Zellamplifikation und wöchentlich 2–3-fachen Umsetzen in 2D-Kultur, wie in 1 gezeigt. Die Vielfachen der Amplifikation (als das Verhältnis der abschließenden Zelldichte zur anfänglichen Zelldichte definiert) sind in 1 gezeigt (F/I). Das Symbol
repräsentiert den F/I-Wert für Zellen, die in 2D kultiviert wurden; das Symbol
repräsentiert die F/I-Werte für Zellen, die in Mikrokapseln mit dem leicht modifizierten Kollagen kultiviert wurden; und das Symbol
repräsentiert den F/I-Wert für Zellen, die in Mikrokapseln mit hoch modifiziertem Kollagen kultiviert wurden. Alle drei Zellen wurden stark in den Mikrokapseln amplifiziert, jedoch nicht in der 2D-Kultur. Die zusätzlichen positiven Nettoladungen auf dem hoch modifizierten Kollagen konnten allein die Amplifikation von Zellen, die in Mikrokapseln kultiviert wurden, verdoppeln.
Da von vielen Zellen bekannt ist, dass sie in Mikroumgebungen auf elektrische Signale reagieren, wird angenommen, dass die positiven Nettoladungen auf dem modifizierten Kollagen zum beobachteten höheren Zellamplifikationsniveau in den Mikrokapseln im Vergleich zur 2D-Kultur beitragen. Um dies zu zeigen, wurden unterschiedliche Mengen positiver Nettoladungen auf dem Kollagen durch eine Veränderung der Temperatur und der Zeit der Kollagenmodifikation gesteuert. Bei Verwendung eines hoch modifizierten Kollagens (die Zubereitung, die unten beschrieben ist) wurde eine starke Stimulation der Zellamplifikation beobachtet. In den Mikrokapseln mit dem hoch modifizierten Kollagen wurden die PC 12-, HepG2- und MSc-Zellen jeweils 295 ± 19, 170 ± 9 und 163 ± 12-fach amplifiziert (1) Es wird angenommen, dass die zusätzlichen positiven Nettoladungen allein auf der Kollagenmatrix die Amplifikation von Zellen, die in den Mikrokapseln kultiviert werden, verdoppeln kann.
Die kultivierten Zellen müssen schließlich für eine erneute Proliferation umgesetzt werden oder für sofortige Verwendungen geerntet werden. Um die Zellschädigungen, die durch die Ablöseverfahren, die beim Umsetzen oder Ernten von Zellen überlicherweise eingesetzt werden, zu minimieren oder zu vermeiden, erlaubt das Kultursystem der vorliegenden Erfindung bevorzugterweise, Zellen voneinander, aber nicht von den tragenden Substraten zu trennen. Dies ist auf Grund von zwei einzigartigen Eigenschaften des Kultursystems möglich, nämlich dem positiv geladenen modifizierten Kollagen mit einer verminderten Gelbildung (2) und der bruchempfindlichen Mikrokapselschale (3). Der obere Teil des Bildes in 3 zeigt den intakten Teilbereich der Mikrokapsel und zeigt, dass eine sehr dünne und bruchempfindliche Schicht der Schale sich um die eingekapselten Zellen hüllt. Der untere Teil des Bildes in 3 zeigt den zerbrochenen Teilbereich der Mikrokapsel und zeigt, dass die eingekapselten Zellen durch freibewegliche Kollagenfasern gestützt werden.
Wie in 2A gezeigt, hat das modifizierte Kollagen mit positiven Nettoladungen einen geringeren Gelbildungsgrad als das natürliche Kollagen, wie in einer Brechungsindexuntersuchung gemessen wurde. Das Symbol (O) repräsentiert das natürliche Kollagen (1,5 mg/ml), das Symbol (☐) repräsentiert leicht modifiziertes Kollagen (1,5 mg/ml), das Symbol (x) repräsentiert hoch modifiziertes Kollagen (1,5 mg/ml), das Symbol (♢) repräsentiert leicht modifiziertes Kollagen (5 mg/ml) und das Symbol (+) repräsentiert hoch modifiziertes Kollagen (5 mg/ml). Die positiven Ladungen auf dem modifizierten Kollagen hemmen die Kollagengelbildung. In einer solchen Untersuchung begannen 1,5 mg/ml des nativen Kollagens bei einer Inkubation für 1 Stunde bei 37°C erhöhte Brechungsindizes zu zeigen. Daher deckten sich die Kinetiken der Zunahme des Brechungsindex mit den Kinetiken der Gelbildung natürlichen Kollagens. Je stärker positiv geladen das Kollagen war, desto weniger Gelbildung wurde beobachtet. Da Zelloberflächen durch vor allem die negativen Ladungen auf den Glykoproteinen und der N-Acetylneuraminsäure auf Glykolipiden negativ geladen sind, wird angenommen, dass die negativ geladenen Zelloberflächen das positiv geladene modifizierte Kollagen, das unmittelbar die Zellen umgibt, neutralisieren und die Neutralisierung einer dünnen Schicht von Kollagen das Gelieren induzieren kann. Mit anderen Worten wird angenommen, dass bald nachdem die Zellen mit dem positiven geladenen Kollagen vermischt wurden sich um die Zellen eine Schicht von Kollagenfasern bildet.
Wenn das modifizierte Kollagen mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Fluorescein-Isothiocyanat, FITC) markiert wurde und mit dem markierten modifiziertem Kollagen Mikrokapseln gebil det wurden, wurde innerhalb von 5 min eine Schicht von Kollagenfasern um die Zellen beobachtet (2B). Solche Kollagenfasern, die sich an die Form der Zellen anpassen, könnten die Proliferation und Funktionen der verankerungsabhängigen Säugerzellen unterstützen (solche Kollagenfasern werden im Folgenden als „Konformergerüste" bezeichnet).
In größerer Entfernung von den Zellen verblieb das positiv geladene modifizierte Kollagen im flüssigen Zustand oder hatte freibewegliche Kollagenfasern (3), die nicht wie in einem dichten Gel verkettet waren. Daher konnte das flüssige Kollagen von den Zellen durch Spülen mit einem Puffer entfernt werden, nachdem sie bei einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min durch eine Düse mit einem inneren Durchmesser von etwa 1 mm gegeben wurden, um die bruchempfindliche Mikrokapselschale zu zerbrechen. Die Konformergerüste konnten, während die Zellen voneinander getrennt wurden, an die individuellen Zellen angeheftet bleiben. Daher wurden verankerungsabhängige Säugerzellen unter Bedingungen geerntet, die die Intaktheit von Zellen nicht angreifen (in der Intaktheit nicht angegriffene Zellen), ohne sie den typischen die Intaktheit von Zellen angreifenden Ablöseverfahren auszusetzen, die in herkömmlichen 2D-Kulturen verwendet werden.
Die geernteten Zellen wurden in den Mikrokapseln bei 1 × 10⁶ Zellen/ml in 1,5 mg/ml des modifizierten Kollagens wieder eingekapselt und für 7 Tagen proliferieren gelassen. Die PC 12-, HepG2- und MSc-Zellen wurden jeweils 150 ± 12, 100 ± 8 und 89 ± 6-mal in den Mikrokapseln mit leicht modifiziertem Kollagen amplifiziert und jeweils 295 ± 24, 220 ± 19 und 150 ± 12-mal mit hoch modifiziertem Kollagen (4). Die Zellamplifikation wurde quantifiziert, indem das Verhältnis der schließlichen Zelldichte zur anfänglichen Zelldichte (F/I) berechnet wurde. In 4 repräsentieren
und
die großen F/I-Werte für Zellen, die in Mikrokapseln mit dem leicht modifizierten Kollagen im jeweils vollständig dissoziierten und unvollstän dig dissoziierten Zustand kultiviert wurden;
und
repräsentieren die F/I-Werte von Zellen, die in Mikrokapseln mit hoch modifiziertem Kollagen im jeweils vollständig dissoziierten und unvollständig dissoziierten Zustand kultiviert wurden. Geerntete Zellen, die sich im Zustand der Einzelzelle befanden, proliferierten wieder bis zur vollen Leistungsfähigkeit, während die Zellaggregate ein vermindertes Niveau an erneuter Proliferation zeigten.
Es war vorstellbar, dass die Aggregation, die bei den unvollständig dissoziierten Zellen beobachtet wurde, die Zellproliferation hemmen könnte. Es wurde beobachtet, dass die vollständig dissoziierten Zellen wieder zum vollen Potential proliferieren konnten (wie in 1), während die unvollständig dissoziierten Zellen ein vermindertes Niveau an erneuter Proliferation zeigten (4). Das hoch modifizierte Kollagen konnte die Zellamplifikation erhöhen, ohne signifikante Unterschiede in der Zellamplifikation zwischen vollständig oder unvollständig dissoziierten Zuständen (4).
In der Intaktheit nicht angegriffene Zellen zeigten auch bessere Anheftungskinetiken, Zellmorphologie und Funktionen als die auf die herkömmliche Weise kultivierten Zellen, die mit Ablöseverfahren, die die Intaktheit von Zellen angreifen, geerntet wurden. Für Gewebetechnikanwendungen ist es sehr wünschenswert, geerntete Zellen zu transplantieren, die die Merkmale in vivo nachahmen.
Die Merkmale von PC 12-Zellen und Rattenhepatozyten, die auf mit spezifischen Liganden konjugierten Polymeroberflächen kultiviert worden waren, wurden untersucht. Rattenhepatozyten wurden anstelle von HepG2 verwendet, da Rattenhepatozyten gut charakterisierte Anheftungsmerkmale an spezifische Liganden haben. Für Rattenhepatozyten gibt es auch ein gut etabliertes funktionelles Untersuchungsverfahren für die Aktivität der Cytochrom P450 abhängigen Monooxygenase-Aktivität, die ein guter Indikator für die Entgiftungsfähigkeit der Zellen ist.
PC 12 Zellen gehen Wechselwirkungen mit der das YIGSR-Peptid bindenden Domäne des Laminin ein. Rattenhepatozyten binden spezifisch an Motive auf bestimmten Zuckern, wie Laktose und Galaktose. Die Laktose und das YIGSR-Fragment des Laminin wurden chemisch an Polyester-(PET)Membranen konjugiert und die Kinetiken der Zellanheftung an diese Membranen untersucht. Es wurde beobachtet, dass die in der Intaktheit nicht angegriffenen Zellen bessere Anheftungskinetiken beim Binden an diese Liganden modifizierten Polymeroberflächen zeigten als die auf herkömmliche Weise kultivierten Zellen (5A–B).
In 5A repräsentieren (☐) und (
) die Anheftung von in der Intaktheit nicht angegriffenen PC 12-Zellen an YIGSR-konjugierte bzw. an einfache Polyestermembranen, (Δ) und (
) repräsentieren die Anheftung von auf herkömmliche Weise kultivierten PC 12-Zellen an jeweils YIGSR-konjugierte und einfache Polyestermembranen. In 5B repräsentieren (O) und (☐) die Anheftung von in der Intaktheit nicht angegriffenen Rattenhepatozyten an ein jeweils Laktose konjugiertes PET-Deckgläschen, (♢) und (x) repräsentieren die Anheftung von auf herkömmliche Weise kultivierten Rattenhepatozyten an ein Laktose konjugiertes bzw. einfaches PET-Deckgläschen. Es wurde beobachtet, dass die in der Intaktheit nicht angegriffenen PC 12-Zellen und Rattenhepatozyten eine bessere Anheftung an ein Liganden konjugiertes PET-Deckgläschen zeigten als die auf herkömmliche Weise kultivierten Zellen.
Die Morphologie von PC 12-Zellen ändert sich als Antwort auf die extrazelluläre Mikroumgebung. Es wurde die Zellmorphologie von PC 12-Zellen untersucht, während sie sich an mit Liganden konjugierte PET-Membranen anhefteten. Drei Stunden nachdem die Zellen mit den Membranen inkubiert worden waren, begannen die Zellen, die aus herkömmlicher Kultur geerntet worden waren, sich mit ausgestreckter Morphologie anzuheften (5C). Im Gegensatz dazu zeigten die in der Intaktheit nicht angegriffenen PC 12-Zellen beim Binden an eine signifikante Menge von Extrazellularmatrix, die von den Zellen sezerniert wurden zu sein schien, die gesunde runde Morphologie (5C). Undifferenzierte PC 12-Zellen zeigen normalerweise bis nach vielen Passagen eine runde Morphologie. Daher scheinen die in der Intaktheit nicht angegriffenen Zellen die Zellmorphologie und Matrixausscheidung besser zu bewahren als die auf herkömmliche Weise kultivierten Zellen.
In 5C repräsentiert das Bild oben links die in der Intaktheit nicht angegriffenen PC 12-Zellen 3 Stunden nach dem Anheften an ein YIGSR-konjugiertes PET-Deckgläschen, das Bild oben rechts repräsentiert die auf herkömmliche Weise kultivierten PC 12-Zellen. Die in der Intaktheit nicht angegriffenen PC 12-Zellen haben im Vergleich zu den auf herkömmliche Weise kultivierten Zellen eine signifikante Menge der Extrazellularmatrix gebildet. Das Bild unten links repräsentiert die in der Intaktheit nicht angegriffenen PC 12-Zellen 48 Stunden nach Induktion durch Nervenwachstumsfaktor, das Bild unten rechts repräsentiert auf herkömmliche Weise kultivierte PC 12-Zellen. Die Maximallänge = Σ (Länge des längsten Neuriten auf jeder Zelle)/n. Die Durchschnittslänge = Σ(Durchschnittslänge aller Neuriten auf jeder Zelle)/n (n = 50 Zellen). Die in der Intaktheit nicht angegriffenen PC 12-Zellen zeigen eine längere Neuritenausstreckung als die auf herkömmliche Weise kultivierten Zellen.
Die PC 12-Zellen können durch den Nervenwachstumsfaktor dazu induziert werden, Neuriten zu bilden. Die Maximal- und Durchschnittslängen der Neuritenausweitung sind ein gutes Maß für die Funktionen der PC 12-Zellen. Die Längen der Neuriten, die sich aus PC 12-Zellen erstrecken, wurden 48 Stunden nach Induktion durch Nervenwachstumsfaktor gemessen. Es wurde beobachtet, dass die Neuritenausdehnung aus den ungestörten PC 12-Zellen 2-fach länger war, hinsichtlich sowohl Maximal- als auch Durchschnittslänge, als die Neuriten, die sich aus den auf herkömmliche Weise kultivierten PC 12-Zellen erstreckten (5C).
Auch die Aktivität der Cytochrom P450 abhängigen Monooxygenase der Rattenhepatozyten wurde gemessen. 7-Ethoxyresorufin kann durch die Cytochrom P450 abhängige Monooxygenase in ein fluoreszierendes Produkt, Resorufin, umgewandelt werden.
Die Fluoreszenzmenge wurde mittels eines konfokalen Mikroskops abgebildet und quantifiziert. Die in der Intaktheit nicht angegriffenen Rattenhepatozyten zeigten 3 Stunden nach dem Anheften an Laktose konjugierte PET-Membranen eine 2-fach höhere Entgiftungsfunktion als die auf herkömmliche Weise kultivierten Zellen (5D). Daher zeigten die in der Intaktheit nicht angegriffenen Zellen bessere Anheftung, Morphologie und Funktionen als die auf herkömmliche Weise kultivierten Zellen. 5D veranschaulicht die Entgiftungsfunktion von Rattenhepatozyten (bestimmt mittels der Aktivitätsuntersuchung der Cytochrom P450 abhängigen Monooxygenase, angeheftet an das Laktose konjugierte PET-Blättchen). Das Symbol
repräsentiert die Entgiftungsfunktion der nicht gestörten Zellen, das Symbol
repräsentiert auf herkömmliche Weise kultivierte Zellen. Die in der Intaktheit nicht angegriffenen Rattenhepatozyten zeigen eine 2-fach höhere Entgiftungsfunktion als die auf herkömmliche Weise kultivierten Zellen, drei Stunden nach Anheften an das Laktose konjugierte PET-Blättchen (n = 150).
Die Morphologie von MSc-Zellen ändert sich in der 2D-Kultur in Reaktion auf die Zahl von Passagen und sie neigen dazu, eine spontane Differenzierung einzugehen. Die Morphologie der in der Intaktheit nicht angegriffenen Zellen und der auf herkömmliche Weise in 2D-Kultur kultivierten Zellen wurde beobachtet, während sie sich nach einem Monat durchgehender Kultur an die Gewebekultur-Polystyrolschale anhefteten. In einer geeigneten Umgebung können die heterogenen Zellpopulationen sich je nach Induktionsfaktoren und Umgebung in verschiedene Zelllinien differenzieren. Ein typisches Merkmal dieser in 2D-Kultur kultivierten Zellen ist es, dass sie eine begrenzte Proliferationskapazität haben (von etwa 7–13 Passagen). Die meisten Zellen zeigen nach etwa 10 Passagen eine verlangsamte Proliferation (verlängerte Verdopplungszeit) und hören nach etwa 12–13 Passagen nahezu völlig auf, zu proliferieren. Nach diesem Zeitpunkt differenzieren die Zellen in zufälliger Weise und lösen sich von der Kulturschale ab und schweben aufwärts in das Kulturmedium hinein (5E). Die Zellen haben typischerweise eine Verdopplungszeit von etwa 48 Stunden, d.h. die Zellen können sich, wenn in 2D-Kultur kultiviert, pro Isolation aus Knochenmark für etwa 2¹² (= 4096)-fach proliferieren.
In 5E repräsentiert das linke Bild die in 2D-Kultur kultivierten Zellen bei Passage 5, 48 Stunden nach Anheftung an eine Polystyrol-Zellkulturschale. Das Bild in der Mitte repräsentiert die in der Intaktheit nicht angegriffenen Zellen bei Passage 11, 48 Stunden nach Anheftung an eine Polystyrol-Zellkulturschale. Das rechte Bild repräsentiert die Zellen aus 2D-Kultur bei Passage 14, die eine verminderte Proliferationsrate zeigten. Die in der Intaktheit nicht angegriffenen Zellen und die Zellen aus 2D-Kultur nehmen bei Konfluenz eine weit ausgebreitete Morphologie an. 5F veranschaulicht die Verdopplungszeit der Zellen. Das Symbol
repräsentiert die Verdopplungszeit der unestörten Zellen; das Symbol
repräsentiert die Verdopplungszeit der auf herkömmliche Weise kultivierten Zellen.
Wenn die Zellen im 3D-System der vorliegenden Erfindung kultiviert wurden, wurde eine 100- bis 160-fache Amplifikation in 5–7 Tagen beobachtet. Somit war in den Mikrokapseln die Verdopplungszeit auf etwa 24 Stunden verkürzt. Diese Zellen wurden für 35 Tage in Mikrokapseln kultiviert, was einer 2³⁵ (~ 3,4 × 10¹⁰)-fachen Amplifikation entspricht. Hinsichtlich des Alters der Zellen entspricht eine solche Amplifikation etwa 35 Passagen in 2D-Kultur. Zur Zeit des Einreichens dieser Anmeldung proliferierten die Zellen nach wie vor bereitwillig in Mikrokapseln (z.B. mit der gleichen beständigen Geschwindigkeit), so wie zu dem Zeitpunkt als sie zuerst aus dem Knochenmark isoliert worden waren. Wenn diese Zellen auf eine 2D-Kulturschale plattiert wurden, zeigten sie die gleiche Morphologie und die gleiche Verdopplungszeit (48 Stunden) in 2D-Kultur wie die Zellen, die frisch isoliert waren (im Gegensatz zu den Zellen, die für 12 Passagen in 2D-Kultur kultiviert wurden, die dann aufhörten, zu proliferieren).
Das dreidimensionale Zellkultursystem der vorliegenden Erfindung kann die Proliferationsfähigkeit vieler Primärzellen stark ausweiten, die aus Geweben isoliert werden, insbesondere jene Vorläufer- und verschiedene Stammzellen aus Knochenmark und anderen möglichen Quellen, wie Nabelschnurblut, adultes Blut, Fett etc., für eine Produktion solcher Zellen im wirklich großtechnischen Maßstab. Dies wird wiederum die verschiedenen Anwendungen (z.B. Transplantation, Gewebetechnik, etc.) mittels autogenetischer oder allogener Zellquellen erheblich vereinfachen oder ermöglichen. Wenn für verschiedene Anwendungen ausreichend adulte Stammzellen amplifiziert werden können, so kann dies möglicherweise eine der Haupteinschränkungen für adulte Stammzellen (AS-Zellen) überwinden, was seinerseits gänzlich die ethisch schwierige Verwendung embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) vermeiden könnte.
Gewebetechnikanwendungen können von den in der Intaktheit nicht angegriffenen Zellen, die durch die 3D-Kultur der vorliegenden Erfindung erhalten werden, erheblich profitieren. Es wurden zahlreiche Anstrengungen unternommen, um die Anheftung von Zellen zu entwickeln und verbessern. Es wird angenommen, dass die in der Intaktheit nicht angegriffenen Zellen, die die verbesserten Anheftungskinetiken aufweisen, diese Anstrengungen ergänzen können. Das Erfordernis, dass Zellen sich von den typischen Ablöseschäden erholen müssen, wie es bei auf herkömmliche Weise kultivierten Zellen durchgemacht wird, wird vermieden, sodass die ungestörten Zellen sofort nach dem Ernten mit den manipulierten Biomaterialoberflächen Wechselwirkungen eingehen können. Eine Vielzahl von Zelltypen kann innerhalb eines kurzen Zeitraumes aufeinander folgend ausgesät werden, um besser die Bildung komplexer Gewebekonstruktionen steuern zu können. Die in der Intaktheit nicht angriffenen Zellen haben also intakte Zelloberflächenrezeptoren und andere Membranbestandteile, die die Wechselwirkung zwischen diesen in der Intaktheit nicht angriffenen Zellen Zellen und anderen Zellen oder Extrazellularmatrixes erhöhen können, um bei einer in vivo-Transplantation zur Reparatur oder Regeneration von Gewebe funktionsfähige Gewebe zu erzeugen.
Die mikroverkapselten Zellen können des Weiteren in gut etablierten Makroumgebungen wie den Festbett- und Fließbettbioreaktoren für die Produktion von hochfunktionellen verankerungsabhängigen Zellen im großen Maßstab für verschiedene Anwendungen kultiviert werden.
Beispiel
Das folgenden Beispiel veranschaulicht bevorzugte Aspekte der Erfindung und sollte nicht dahingehend ausgelegt werden, dass es die Ansprüche in irgendeiner Form begrenzt. Das Beispiel veranschaulicht das Erstellen einer dreidimensionalen Zellkultur mit Hepatozyten, PC 12- und MSc-Zellen. Alle Reagenzien wurden, falls nicht anders angegeben, von Sigma-Aldrich erworben.
Terpolymerherstellung
Terpolymere von Methacrylsäure (MAA), 2-Hydroxyethylmethacrylat (HEMA) und Methylmethacrylat (MMA) wurden durch Polymerisation in Lösung in 2-Propanol mit Hilfe von 2,2'-Azobisisobutyronitril (AIBN) als Initiator synthetisiert. Die Monomere wurden unter Stickstoff bei vermindertem Druck destilliert. Die Polymerisation wurde mit einer Anfangskonzentration von 0,1 mol% der Monomere unter Stickstoff mit einem Magnetrührer bei 78°C in einem Ölbad durchgeführt. Das molare Verhältnis der Beschickung mit MAA, HEMA und MMA wurde bei 25:25:50 oder wie gewünscht bei anderen Verhältnissen angesetzt und das Verhältnis von Gesamtmonomer zu Lösungsmittel bei 1:6 (W/V). Der Reaktion wurde gestattet, über Nacht von statten zu gehen, und sie wurde durch Abkühlen auf Raumtemperatur beendet. Das Polymer wurde durch Zugabe eines großen Überschusses von Petrolether gefällt. Das Präzipitat wurde in einem Minimalvolumen von Ethanol wieder aufgelöst und in destilliertem Wasser wieder gefällt. Das wiedergewonnene Polymer wurde dann in einer 1 M Natriumhydroxidlösung gelöst und durch wiederholte Dialyse gegen destilliertes Wasser mit einem MWCO von 3500 dialysiert und lyophilisiert. Es wurde festgestellt, dass die Ausbeute an dem Polymer ca. 63 % betrug. Die Polymerzusammensetzung wurde durch einem Proton-NMR bestimmt und das molare Verhältnis von MAA, HEMA und MMA wurde für das molare Bestückungsverhältnis von 25:25:50 als 20,4:27,4:52,2 festgestellt. Das Molekulargewicht des Terpolymers vor der Dialyse wurde durch GPC (mit THF als Elutionsmittel) zu 30,000 bestimmt.
Modifizierung des Kollagens bei 4°C
Um kationisch und anionisch zu sein, kann Kollagen durch das Entfernen von entweder den negativen oder den positiven Ladungen aus den Kollagenketten modifiziert werden. In diesem Fall wurde kationisches Kollagen durch Modifizieren der Carboxylgruppe durch Veresterung mit einem Alkohol von niedrigem Molekulargewicht erhalten. 20 ml Stammlösung (3 mg/ml) von Kollagen (Vitrogen 100, Collagen Corp., Palo Alto, CA) wurde zuerst mit 400 ml Aceton gefällt. Das gefällte Kollagen wurde in 200 ml einer 0,1 M HCl, die Methanol (Merck) enthielt, gelöst, für 6 Tage bei 4°C unter sterilen Bedingungen gerührt. Das lyphilisierte modifizierte Kollagen kann dann bei –20°C in Gegenwart von Trockenmittel bis zu 6 Monate gelagert werden. Die Modifizierung wurde mittels Titration überwacht. Die Titration des natürlichen Kollagens ergab eine typische Titrationskurve einer gemischten Säure oder einer dibasischen Säure, während die des modifizierten Kollagens eine typische Titrationskurve einer schwachen monobasischen Säure ergab, was darauf hindeutete, dass die meisten Carboxylgruppen im modifizierten Kollagen verestert wurden sind. Zusätzlich benötigt die Neutralisierung des modifizierten Kollagens weniger Natriumhydroxid als die des natürlichen Kollagens, was daraufhin weist, dass die Polymerkette des modifizierten Kollagens auf Grund der Veresterung der Carboxylgruppen weniger ionische Gruppen hat.
Modifizierung von Kollagen bei Raumtemperatur
Kollagen kann modifiziert werden, um kationisch oder anionisch zu werden, indem entweder negative oder positive Ladungen aus den Kollagenketten entfernt werden. In diesem Fall wurde kationisches Kollagen durch die Modifizierung der Carboxylgruppen durch Veresterung mit einem Alkohol niedrigem Molekulargewichts (z.B. Methanol) erhalten. 20 ml der Stammlösung (3 mg/ml) Kollagen (Vitrogen 100, Collagen Corp., Palo Alto, CA) wurde zuerst mit 400 ml Aceton gefällt. Das präzipitierte Kollagen wurde in 200 ml 0,1 M HCl die Methanol (Merck) enthielt, gelöst, bei Raumtemperatur unter sterilen Bedingungen für verschiedene Zeitintervalle gerührt (3, 6, 24 & 48 Stunden). Die Lösung des modifizierten Kollagens wurde für 2 Tage dialisiert, bis der pH 5 erreichte und lyophilisiert. Das lyophilisierte modifizierte Kollagen kann dann in Gegenwart von Trockenmittel bei –20°C bis zu 6 Monate gelagert werden. Das Ausmaß der Modifizierung wurde durch Titration überwacht. Titrieren des natürlichen Kollagens ergab eine typische Kurve einer gemischten Säure oder einer dibasischen Säure, während die des modifizierten Kollagens eine typische Titrationskurve einer schwachen monobasischen Säure ergab, was darauf hinwies, dass die meisten Carboxylgruppen im modifizierten Kollagen verestert worden sind. Zusätzlich benötigt das Neutralisieren des modifizierten Kollagens weniger Natriumhydroxyd als das des natürlichen Kollagens, was darauf hinweist, dass die Polymerkette des modifizierten Kollagen auf Grund der Veresterung der Carboxylgruppen weniger carboxylische Protonen enthält. Das Kollagen, das bei Raumtemperatur modifiziert wurde, hat einen höheren Freiheitsgrad in Hinblick auf die Menge an positiven Ladungen als jenes, das wie zuvor beschrieben bei 4°C modifiziert wurde. Dadurch kann ein größerer Bereich an Kollagenkonzentrationen verwendet werden, um Mikrokapseln zu bilden, da die vorherigen Mikrokapseln durch die Ladungen auf dem modifizierten Kollagen begrenzt sind.
Isolieren von Hepatozyten
Hepatozyten wurden aus männlichen Wistarratten, die zwischen 250 und 300 g wogen, durch eine aus 2 Schritten bestehende in situ-Kollagenaseperfusion so gewonnen, wie zuvor beschrieben, mit einigen Veränderungen. 30 min vor der Anästhesie wurde den Ratten 100 U/kg Heparin gegeben. Zu Beginn der Operation wurde intraperitoneal Pentobarbital bei einer Dosis von 30 mg/kg verabreicht. Nach dem Brauchschnitt wurde ein Portalkanüle platziert und in einer Position entlang der Pfortader fixiert. Es wurde schnell ein Schnitt in die untere Hohlvene (Vena cava) vorgenommen. In den ersten 2–3 Minuten erfolgte eine Vorperfusion (mit Ca²⁺-freiem Perfusionspuffer), während die Leber in situ verblieb. Der Fluss des Perfusats wurde mit einer Menge von 50 ml/min begonnen. Während die Vorperfusion durchgeführt wurde, wurde die Leber in eine Petrischale überführt und in einer Position platziert, die ihrer in situ-Lage ähnelte. Nach einer Vorperfusion von 10 Minuten mit Ca²⁺-freiem Medium wurde die Leber dann mit ständig umlaufenden 0,05 %igen Kollagenasepuffer für weitere 10 Minuten perfundiert. Als die Hohlvene brach wurde dies beendet. Der gesamte Perfusionsvorgang wurde unter Oxygenierung durchgeführt, was die Überlebensfähigkeit der Zellen stark verbesserte. Die Zellen wurden vom vaskulären Bindegewebe befreit und in frischem Wachstumsmedium resuspendiert. Anschließend wurde die Zellesuspension für 30 min in einen 37°C-CO₂ Brutschrank inkubiert. Die Zellsuspension wurde dann durch Nylongase mit einer Porengröße von 60 μm filtriert, um weiter Bruchstücke des Bindegewebes zu entfernen. Das Filtrat wurde dann für 1 Minute bei 50 g zentrifugiert, um das Zellpellet zu erhalten. Die Zellen wurden mit Wachstumsmedium aufgenommen und zweimal gewaschen. Mit Hilfe des herkömmlichen Trypan Blau-Ausschlusstests wurde in allen Fällen festgestellt, dass die Lebensfähigkeit der Hepatozyten 90–95 % betrug.
Präparation von mikroverkapselten PC 12-Zellen
Die Mikroverkapselung wurde bei Raumtemperatur mit Hilfe einer Injektionsspritzenpumpe (IVAC P6000, Alaris Meidical Systems, San Diego, CA) durchgeführt. Die PC 12 Zellen wurden in einer modifizierten Kollagenlösung suspendiert, die hergestellt wurde, indem zuerst das lyphilisierte modifizierte Kollagen in Phosphat gepufferte Saline (PBS) gelöst wurde, um Kollagenkonzentrationen von 0,5, 1,0 und 1,5 mg/ml zu erhalten. Die Zellsuspension wurde vor dem Experiment bei 4°C gehalten, um das Gelieren der Kollagenlösung zu verhindern. Die PC 12-Zellsuspension wurde aus einer 30,5 Gauge-Nadel, die an die Injektionsspritzenpumpe angeschlossen war, bei verschiedenen geeigneten Flussraten in eine 10 % bis 17 % Terpolymerlösung ausgestoßen, falls nicht anders angegeben. Die positiv geladenen Kollagenmoleküle banden somit an die negativ geladenen Terpolymermoleküle auf der Außenoberfläche der Mikrokapseln, um einen Polyelektrolytkomplex zu bilden. Die Mikrokapseln wurden für eine Stunde bei 37°C inkubiert, um eine Gelieren des Kollagens zu ermöglichen, bevor die Mikrokapseln mittels des Sedimentationsverfahrens geerntet und zweimal mit 1 × PBS für ein weiteres Kultivieren gewaschen wurden.
Eine Änderung der Ladungen des positiv geladenen Kollagens und der Konzentration des negativ geladenen Terpolymers steuert die Dicke der Terpolymerschale. Kollagen von 0,5 mg/ml hat weniger positive Ladungen als Kollagen von 1,5 mg/ml. Es wurde gefunden, dass die Dicke der Terpolymerschale im Bereich von 2–5 μm optimale Massentransporteigenschaften bereitstellt. Daher werden 10 % des Terpolymers benötigt, um 0,5 mg/ml Koazervat-Kollagen zu komplexieren, aber 17 % des Terpolymers werden benötigt, um 1,5 mg/ml Koazervat-Kollagen zu komplexieren, um eine Schale von 2–5 μm zu bilden. Wenn ein 10 %iges Terpolymer für Kollagen von 1,5 mg/ml mit hoher Ladungsdichte (für einen Tag bei Raumtemperatur modifiziert) verwendet wird, dann wird eine viel dickere Schale gebildet, die die Massentransporteigenschaften behindert und zu einer zentralen Nekrose in der Mitte der Mikrokapseln führt.
Zubereitung von mikroverkapselten Hepatozyten
Die Mikroverkapselung wurde bei Raumtemperatur mit Hilfe einer Injektionsspritzenpumpe durchgeführt. In Kürze wurden die Hepatozyten in einer Lösung modifizierten Kollagens suspendiert, die hergestellt worden war, indem das lyophilisierte modifizierte Kollagen zuerst in Phosphat gepufferter Saline (PBS) gelöst wurde, um eine Kollagenkonzentration von 1,5 mg/ml zu erreichen. Die Hepatozytensuspension wurde vor dem Experiment bei 4°C gehalten, um das Gelieren der Kollagenlösung zu verhindern. Die Hepatozytensuspension wurde aus einer 18 % Gauge-Nadel, die an der Injektionsspritzenpumpe befestigt war, bei verschiedenen Flussraten in eine 10 % Terpolymerlösung ausgestoßen. Die positiv geladenen Kollagenmoleküle banden somit an die negativ geladenen Terpolymermoleküle auf der äußeren Oberfläche der Mikrokapseln, um einen Polyelektrolytkomplex zu bilden. Die Mikrokapseln wurden für eine Stunde bei 37°C inkubiert, um ein Gelieren des Kollagens zu ermöglichen, bevor die Mikrokapseln mit Hilfe des Sedimentationsverfahrens geerntet und für weiteres kultivieren zweimal mit 1 × PBS gewaschen wurden.
Zellkultur
Die mikroverkapselten Zellen wurden für die erforderliche Zeitspanne in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37°C mit 5 % CO₂ in 35 mm-Polystyrolschalen kultiviert. Kulturmedium (PC 12: DMEM mit Zusatz von 5 % Pferdeserum (GIBCO Laboratories, Chagrin Falls, OH) und 10 % fötalem Rinderserum (GIBCO Laboratories, Chagrin Falls, OH), HepG2: DMEM mit Zusatz von 10 % fötalem Rinderserum, mesenchymale Kaninchenstammzellen: DMEM mit Zusatz von 15 % fötalem Rinderserum und 1500 mg/ml Glukose und Rattenhepatozyten: Hepatozym-SFM (GIBCO Laboratories, Chagrin Falls, OH) wurde aller 2 Tage ersetzt. Eine herkömmliche Kultur der Zellen in 2D wurde durchgeführt wie beschrieben in (1) Jauregui, „Cell Adhesion to Biomaterials: The Role of Several Extracelluar Matrix Components in the Attachment of Non-transformed Fibroblasts and Parenchymal Cells", ASAIO Trans 33, 66–74 (1987); (2) Gutsche, A.T. et al., „Rat Hepatocyte Morphology and Function an Lactose-Derivatized Polystyrene Surfaces", Biotechnology and Bioengineering 49, 259–265 (1996); and (3) Hu, M.Y. et al., „Effects of Hepatocytes Growth Factor an Viability and Biotransformation Functions of Hepatocytes in Gel Entrapped and Monolager Culture", Crit Care Med 23, 1237–1242 (1995).
PC 12- und HepG2-Zellen wurden von ATCC erworben. Rattenhepatozyten wurden wie in Chia, S.M. et al., „Hepatocyte Encapsulation for Enhanced Cellular Functions", Tissue Eng 5, 481–496 (2000) beschrieben isoliert. An mesenchymalen Stammzellen (MSC) angereicherte mononukleare Knochenmarkszellen niedriger Dichte (engl.: Bone Marrow Mononuclear Cells, BMMNC) wurden wie folgt isoliert: Knochenmark wurde aus der Crista ilica von NZW-Kaninchen angesaugt und mit 1000 Einheiten/ml Konservierungsstoff-freien Heparin in 50 ml Polypropylenröhrchen aufgenommen und gründlich gemischt. BMMNC niedriger Dichte wurden durch Dichtegradientenzentrifugation über Ficoll (1,077 g/ml) bei 400 × g für 30 Minuten. Die BMMNC-Schichten wurden mit einer Pipette entfernt und in PBS gespült und in einem, wie oben beschriebenen, geeigneten Medium kultiviert.
Umsetzen und Ernten der Zellen
Die in der Intaktheit nicht angriffenen Zellen wurden aus den Mikrokapseln geerntet, indem die Mikrokapseln bei einer Flussgeschwindigkeit von 8 ml/min durch eine Plastikdüse mit einem Durchmesser von einem Millimeter gegeben wurden. Die Zellen, die aus den Mikrokapseln freigesetzt waren, wurden bei 80 × g für 1 Minute zentrifugiert, um die großen Stücke der gebrochenen Mikrokapselschale zu entfernen. Der Überstand, der die Zellen enthielt und aus den gebrochenen Mikrokapseln freigesetzt worden war, wurde aufgenommen und für zusätzliche 3 Minuten bei 800 × g zentrifugiert, um das flüssige Kollagen zu entfernen. Die Zellniederschläge wurden mit Puffer gewaschen, also in Phosphat gepufferter Saline (PBS) resuspendiert und noch einmal zentrifugiert. Dann wurden die Zellniederschläge zur weiteren Proliferation in frischem Kulturmedium resuspendiert oder unmittelbar für Anwendungen eingesetzt. Die Zahl der amplifizierten Zellen wurde bestimmt, indem mit Hilfe eines Hämocytometers die Zellen gezählt wurden, die aus den Mikrokapseln freigesetzt worden waren.
Aufnahme der Mikrokapseln unter dem Lichtmikroskop
Lebende Zellen wurden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen (Olympus FLUOVIEW 300, Tokio). Um die Bildung der „Konformergerüste" sichtbar zu machen, wurde das modifizierte Kollagen mit FITC markiert, indem 1 mg FITC in 10 ml einer Lösung von 1,5 mg/ml modifizierten Kollagens über Nacht gelöst wurden, worauf eine ausgedehnte Dialyse von 24 Stunden folgte, um die unmarkierten FITC Moleküle zu entfernen. Das lyophilisierte markierte Kollagen kann bis zu 6 Monate in der Dunkelheit bei –20°C gelagert werden. Die Mikrokapseln wurden für Rasterelektronenmikroskopie bearbeitet und mit einem JOEL 5600 LV SEM abgebildet.
Peptidkonjugation an PET Membranen
Thermanox-Deckgläschen (PET-Deckgläschen, NUNC, Naperville, IL, USA) wurden durch Spülen mit Lösungsmitteln gereinigt (in einer Reihenfolge Wasser-Methanol-Hexan-Methanol-Wasser). Saubere Deckgläschen wurden in Kulturplatten mit 24 Vertiefungen platziert, die in jeder Vertiefung 1 M NaOH (1 ml) enthielten) und unter Schütteln für 4 Stunden bei Raumtemperatur hydrolysiert. Die Deckgläschen wurden dann mehrere Male mit 1 M HCl und destilliertem Wasser gespült. Die erhaltenen Deckgläschen wurden in einer gemischten Lösung, die 0,1 M MES, 1 mg/ml NHS, 10 mg/ml EDC und 0,5 mg/ml YIGSR-Peptid enthielt, für mehr als 4 Stunden auf einem Standflächenschüttler behandelt. Schließlich wurden die Deckgläschen einmal mit PBS gespült und dreimal mit 4 N NaCl, dann vor Verwendung mehrmals mit PBS.
Laktose Konjugation an PET Membranen
Thermanox-Deckgläschen wurden zunächst aminiert, indem sie für 8 Stunden bei 40°C mit einer 50 %igen wässrigen Ethylendiamin-Lösung inkubiert und mit einer Überschussmenge an Tetrahydrofuran und deionisiertem Wasser gespült wurden. Die aminierten PET-Deckgläschen wurden dann für 48 Stunden bei 40°C in einen 0,1 M Natriumboratpuffer (pH 9,3) inkubiert, der 10 mg/ml Laktose und 10 mg/ml Natriumcyanoborhydrid enthielt, worauf ein ausgiebiges Spülen mit 4 N NaCl und deionisiertem Wasser folgte. Die Menge an Laktose/Galaktose, die an die PET Membranen konjugiert war, wurde durch Zählen der ¹⁴C-markierten Laktose (ICN Biomedicals, Inc., Aurora, Ohio) in der Reaktion bestimmt. Zellen, die an die Membranen angeheftet waren, wurden durch Zählen des Prozentsatzes an nicht angehefteten Zellen aus der Gesamtzahl an Zellen, die mit den Membranen inkubiert wurden, quantifiziert.
Morphologische Untersuchung
Mesenchymale Stammzellen, die aus den Mikrokapseln oder der 2D Kultur geerntet wurden waren, wurden in 35 mm Zellkulturschalen ausgesät und für 48 Stunden mit 5 % CO₂ bei 37°C inkubiert. Die Morphologie der Zellen wurde mit einem Invert-Auflicht-Mikroskop mit Hoffmanoptik abgebildet.
Funktionelle Untersuchungen
PC 12-Zellen, die aus den Mikrokapseln oder 2D-Kultur geerntet worden waren, wurden auf mit Kollagen beschichteten Membranen ausgesät und für 48 Stunden mit 20 ng/ml Nervenwachstumsfaktor induziert (Baldwin, S.P. et al., „PC12 Cell Aggregation and Neurite Growth in Gels of Collagen, Laminin and Fibronectin", Int J Dev Neurosci 14, 351–364 (1996)). Die Zellen wurden für 10 Minuten mit 3,7 % Formalin fixiert, abgebildet und mit einem konfokalen Mikroskop die maximale und die mittlere Neuritenlänge quantifiziert. Die Aktivität der Cytochrom 450-abhängigen Monooxygenase-Aktivität von Rattenhepatozyten wurde bestimmt. Es wurden die Daten aus drei unabhängigen Versuchen analysiert und die Werte sind als arithmetischer Mittelwert ± Standardfehler dargestellt.

Claims

Die Intaktheit von Zellen nicht angreifendes, dreidimensionales System für die Kultivierung einer oder mehrerer verankerungsabhängiger Zelltypen, wobei das System eine Mehrzahl an hohlen Mikrokapseln aufweist, von denen jede eine innere Extrazellularmatrix in Kontakt mit mindestens einer Zelle und eine äußere Schale aus synthetischem Polymer aufweist, die die Extrazellularmatrix umgibt, wobei Zellen im Kontakt mit der Extrazellularmatrix in drei Dimensionen im Inneren der hohlen Mikrokapseln kultiviert werden, wobei die Mikrokapseln durchlässig sind für Nährstoffe, die notwendig sind, um normale metabolische Funktionen der Zellen zu gewährleisten und für von den Zellen freigesetzte Toxine und wobei die äußere Schale eine Dicke von etwa 1 bis etwa 20 μm hat und durch mechanische Bewegung zerbrochen werden kann, um die kultivierten Zellen zu ernten.
Zellkultursystem nach Anspruch 1, wobei das Verhältnis der Zellzahl am Ende des Kulturzeitraums zur Zahl der anfänglich ausgesäten Zellen mindestens 10:1 beträgt.
Zellkultursystem nach Anspruch 1, wobei die Extrazellularmatrix aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus kationischem Kollagen, anionischem Kollagen, anionischer veresterter Hyaluronsäure, anionischer amin-modifizierter Hyaluronsäure, Fibronectin und Laminin besteht.
Zellkultursystem nach Anspruch 3, wobei die Extrazellularmatrix ein kationisches Kollagen in einer Konzentration von etwa 0,2 bis etwa 3,5 mg/ml aufweist.
Zellkultursystem nach Anspruch 1, wobei das synthetische Polymer ein Acrylat-Terpolymer aus Methacrylsäure, Hydroxyethylmethacrylat und Methylmethacrylat aufweist.
Zellkultursystem nach Anspruch 1, wobei die verankerungsabhängigen Zellen einen oder mehr Zelltypen aufweisen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Pheochromocytomzellen, Hepatocytenzellen und mesenchymalen Stammzellen besteht.
Zellkultursystem nach Anspruch 1, wobei die verankerungsabhängigen Zellen mindestens zwei Zelltypen oder mindestens drei Zelltypen aufweisen.
Verfahren zur Kultivierung verankerungsabhängiger Zellen in einem dreidimensionalen Zellkultursystem, das umfasst: einkapseln verankerungsabhängiger Zellen in einer hohlen Mikrokapsel, die eine innere Extrazellularmatrix, welche mindestens eine Zelle umgibt, und eine äußere Schale aus synthetischem Polymer aufweist, welche die Matrix umgibt und stützt, wobei Zellen im Kontakt mit der Extrazellularmatrix in drei Dimensionen im Inneren der hohlen Mikrokapsel kultiviert werden, wobei die Mikrokapsel durchlässig ist für Nährstoffe, die notwendig sind, um normale metabolische Funktionen der Zellen zu gewährleisten und für von den Zellen freigesetzten Toxinen und wobei die äußere Schale eine Dicke von etwa 1 bis etwa 20 μm hat, nach einer zuvor festgelegten Zeit Bewegung auf die Mikrokapsel ausüben, um die äußere Schale zu zerbrechen, und die Extrazellularmatrix entfernen, um die Zellen zu gewinnen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Verhältnis der Zellzahl am Ende des Kulturzeitraums zur Zahl der anfänglich ausgesäten Zellen mindestens 10:1 beträgt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Extrazellularmatrix aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus kationischem Kollagen, anionischem Kollagen, anionischer veresterter Hyaluronsäure, anionischer amin-modifizierter Hyaluronsäure, Fibronectin und Laminin besteht.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Extrazellularmatrix ein kationisches Kollagen in einer Konzentration von etwa 0,2 bis etwa 3,5 mg/ml aufweist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das synthetische Polymer ein Acrylat-Terpolymer aus Methacrylsäure, Hydroxyethylmethacrylat und Methylmethacrylat aufweist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die verankerungsabhängigen Zellen einen oder mehr Zelltypen aufweisen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Pheochromocytomzellen, Hepatocytenzellen und mesenchymalen Stammzellen besteht.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die verankerungsabhängigen Zellen mindestens zwei Zelltypen oder mindestens drei Zelltypen aufweisen.