CN108251410A - 一种包埋气凝胶的固定化微生物制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种包埋气凝胶的固定化微生物制备方法，属于固定化微生物技术与环境功能复合材料制备领域，所述制备方法为：将单体甲基丙烯酸羟乙酯、N‑羟甲基丙烯酰胺、聚丙烯酰胺和已二酸二异癸酯按照比例混合，经过一系列处理制成气凝胶；将制成的气凝胶和菌液按比例混合培养，将负载细菌的气凝胶与混合液混合，混合混匀后将气凝胶转移到饱和的氯化钙溶液中交联，硬化后用无菌水清洗固定化小球表面，制成包埋的气凝胶固定化小球。本发明制成的包埋的气凝胶固定化微生物小球比表面积大、传质性能好，稳定性强，机械强度高和成本低等优点，在环境污染修复方面具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及固定化微生物技术与环境功能复合材料制备技术领域，具体是涉及一种包埋气凝胶的固定化微生物制备方法。
背景技术
固定化微生物技术是通过物理、化学手段等对某一种或者两种及以上游离微生物进行处理，使其固定在特定的空间范围内，并保持生物活性，可以反复利用。包埋法是目前制备固定化微生物最常见、研究最广泛的方法。是使微生物细胞扩散到多孔的载体内部，或者在水不溶性的高聚物形成凝胶时使微生物被包埋在其内的方法。包埋法操作简单，并能保持生物体内的多酶系统，常见的包埋固定材料有聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯醇(ACAM)、聚乙烯乙二醇(PEG)、琼脂、海藻酸钠等，其中海藻酸钠具有廉价易得，化学性质稳定、无生物毒性等优点，使用海藻酸钠制备固定化材料最经济的方法是海藻酸钠-氯化钙法，用此方法制作的固定化微生物化学性能稳定、机械强度高、与微生物细胞的结合力强等优点，但缺点是在微生物细胞与基质间扩散阻力大、细胞活性易丧失。
气凝胶作为一种具有多空结构的新型材料，引起了人们的关注。早起研究者对气凝胶的定义并不明确，一般根据干燥方式进行区分，主要分为：冻凝胶、干凝胶、气凝胶三类。随着对气凝胶的认识逐渐加深，研究发现，在常压干燥的条件下也可制备出性能优异、网络结构完整的材料。因此，目前对气凝胶的定义为能够保持湿凝胶的空间网络结构的同时，其孔隙中的液体能够被气体取代，以此获得的多孔材料都称为气凝胶。由于其具有超低密度(可降至3mg/cm3，仅为空气的2～3倍)、高比表面积(～1600m2/g)、高孔隙率(高达98％)、低介电常数(<1.01)、高光学透过性、较低折射系数和低热导率等特殊的性质，这些优异的性质使得气凝胶在吸附、分离、催化、光电传感器、生物医学、隔音隔热和环境治理等领域具有潜在的应用前景，处于科学研究的前沿和热点领域。但是，气凝胶也存在固有的致命缺点：韧性差、强度低、容易破碎等，这极大限制了气凝胶的实际应用。然而，若将气凝胶包埋在海藻酸钠-氯化钙混合溶液中，一方面可以很好地发挥气凝胶比表面积大，孔隙发达并能为微生物提供更大的生存空间的优点，另一方面充分发挥海藻酸钠-氯化钙化学性质稳定及机械强度高的优点，结合气凝胶和海藻酸钠-氯化钙制备的包埋气凝胶固定化材料可以为功能微生物修复环境污染提供广泛的应用前景。
发明内容
本发明解决的技术问题为:现有微生物固定化材料中，单一的固定化方法不能很好地满足固定功能微生物修复环境污染的使命，针对微生物在固定化材料中易流失、生物活性低、抗毒性能力弱、可生长空间小和可利用时间短等问题，提出一种包埋气凝胶的固定化微生物制备方法。
本发明的技术方案是:
一种包埋气凝胶的固定化微生物制备方法，步骤如下:
S1:将单体甲基丙烯酸羟乙酯、N-羟甲基丙烯酰胺、聚丙烯酰胺和已二酸二异癸酯按照比例混合，然后将水与单体混合液按照比例混合均匀；
S2:向上述混合液中加入一定量的四甲基乙二胺作为催化剂，冰水浴环境下磁力搅拌均匀后再加入一定量的过硫酸铵作为引发剂反应一定时间；
S3:将反应后的凝胶在冰箱中冷冻12～24h，温度从-40℃分四个阶段逐渐降低到-80℃，每个阶段降低温度为10℃，每个阶段之间改变温度的时间间隔为3～6h；最后将凝胶放入冻干仪中冻干制成甲基丙烯酸羟乙酯-丙烯酰胺共聚气凝胶；经过实验发现，将凝胶冷冻的时间进行阶段化控制，可以有效的提高凝胶的韧性和强度，且可以一定程度的使制成凝胶的表面积增大，进而增强气凝胶固定微生物的效果；
S4:将微生物在LB培养基中培养，8000rpm离心后制成OD600为1.0的菌悬液；
S5:将制成的气凝胶和菌悬液按一定比例混合培养一段时间；
S6:将负载细菌的气凝胶与混合液混合均匀，所述混合液为海藻酸钠溶液、海藻酸钾溶液和聚乙烯吡咯烷酮溶液的混合溶液，并经过超声波清洗器去除混合溶液中的气泡；防止混合液中夹杂气泡影响负载细菌的气凝胶与混合液的混合。
S7:混合液中物质均匀分布在气凝胶表面后，将混合后的气凝胶复合物滴加到4％～8％的饱和氯化钙溶液中进行交联，交联时间为12～24h；该质量浓度下的饱和氯化钙溶液可以促进本发明气凝胶交联的进行，提高交联的效果；
S8:硬化后用无菌水清洗固定化小球表面2～3次，制成包埋的气凝胶固定化小球。
进一步的，步骤S1中单体为甲基丙烯酸羟乙酯、N-羟甲基丙烯酰胺、聚丙烯酰胺和已二酸二异癸酯，按照甲基丙烯酸羟乙酯、N-羟甲基丙烯酰胺、聚丙烯酰胺和已二酸二异癸酯摩尔比为(1～8):(3～20):(2～5):(1～2)进行混合，制成单体混合物，水与单体混合液按照体积比为(1～3):(5～10)混合均匀，这几种单体的结合使固定化材料的比表面积更大，生物亲和力更好，化学性质更稳定及机械强度更好，很好地解决了传统固定化材料中存在的固定的微生物易流失、生物活性低、抗毒性能力弱、可生长空间小和可利用时间短。
进一步的，步骤S2中催化剂为四甲基乙二胺，在1L的混合液中的投加量为0.5～1.5mL；引发剂为过硫酸铵，在1L的混合液中的投加量为0.5～1g；过硫酸铵作为引发剂反应的时间为8～12h，能提高气凝胶的质量，使其化学性质更稳定及机械强度更好。
进一步的，步骤S3中在冻干仪中冻干时间为24～72h，在该范围区间可以有效避免气凝胶冻干时间不足无法制成气凝胶，或是冻干时间过长影响气凝胶的质量、化学性质等。
进一步的，步骤S4中微生物为保藏号为CGMCC No.12392的红球菌(Rhodococcussp.)HYW，培养12-24h后通过8000rpm离心后制成OD600为1.0的菌悬液。
更进一步的，包埋气凝胶固定的微生物并不局限于保藏号为CGMCC No.12392红球菌(Rhodococcus sp.)HYW，包埋的微生物可以是有环境修复功能的纯菌和复合菌剂。
进一步的，步骤S5中，菌液与气凝胶混合后在转速为140～160rpm的摇床中培养12～24h，其中，菌液与气凝胶混合的体积百分比为(2～7):(10～30)，经过实验我们发现在在该转速区间和时间下培育微生物与气凝胶混合的效果最优，使微生物可以更充分的与气凝胶混合，提高包埋气凝胶固定化微生物小球的效果作用。
进一步的，步骤S6中菌液与气凝胶混合培养后加入到混合液中进行混合，所述海藻酸钠溶液质量百分比为1％～6％，所述海藻酸钾溶液质量百分比为0.7％～1.5％，所述聚乙烯吡咯烷酮溶液质量百分比为1～2％，所述海藻酸钠溶液、海藻酸钾溶液和聚乙烯吡咯烷酮溶液的体积比为7:3:1，交联结束后用超纯水清洗固定化小球，我们实验发现在该浓度区间下发现的添加这三种物质，能有效的改进气凝胶的韧性和强度。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下:
(1)本发明充分利用新型材料气凝胶超大的比表面积和发达的孔隙结构为微生物生长提供广阔的空间，且气凝胶连续的孔洞网络结构有利于分子的流动，能使底物分子能够较易的进入负载微生物的内表面区，有利于微生物的生长和繁殖以及对污染物质的去除。对气凝胶进行包埋进一步克服限制气凝胶实际应用的韧性差、强度低、容易破碎等缺陷，大大增大了气凝胶在环境修复领域的应用前景。
(2)本发明所述的一种包埋气凝胶的固定化微生物制备方法操作简单，对设备要求低且价格低廉，制作过程相对安全。
(3)本发明所述的一种包埋气凝胶的固定化微生物制备方法充分结合了几种材料的优势，使固定化材料的比表面积更大，生物亲和力更好，化学性质更稳定及机械强度更好，很好地解决了传统固定化材料中存在的固定的微生物易流失、生物活性低、抗毒性能力弱、可生长空间小和可利用时间短等问题。
(4)本发明的制作原理简单，结构设计合理，制得的包埋气凝胶固定化微生物小球直径在0.8-1cm，开孔率高，传质性能好，生物亲和力强，能更好的应用环境的污染修复。运行成本低、操作方便，普遍适用于环境污染治理领域，有很高实际应用价值，易于推广使用。
附图说明
图1为红球菌(Rhodococcus sp.)HYW电镜图；
图2为包埋气凝胶负载红球菌(Rhodococcus sp.)HYW电镜图；
具体实施方式
下面结合具体实施方式来对本发明进行更进一步详细的说明，以更好地体现本发明的优势。
实施例1
一种包埋气凝胶的固定化微生物制备方法，它包括如下步骤：
S1:将单体甲基丙烯酸羟乙酯、N-羟甲基丙烯酰胺、聚丙烯酰胺和已二酸二异癸酯按照摩尔比为1:3:2:1混合，然后水与单体混合液按照体积比为1:7混合均匀；
S2:向上述混合均匀的混合液中加入0.5mL(1L的混合液)的四甲基乙二胺作为催化剂，冰水浴环境下磁力搅拌均匀后再加入0.5g(1L的混合液)的过硫酸铵作为引发剂反应8h；
S3:将反应后的凝胶在冰箱中冷冻12h，温度从-40℃分四阶段逐渐降低到-80℃，每个阶段降低温度为10℃，每个阶段之间改变温度的时间间隔为3h，最后在冻干仪中冻干24h制成甲基丙烯酸羟乙酯-羟甲基丙烯酰胺共聚气凝胶；
S4:将保藏号为CGMCC No.12392的红球菌(Rhodococcus sp.)HYW，在LB培养基中培养12h，8000rpm离心后制成OD600为1.0的菌悬液；
S5:将制成的气凝胶和红球菌(Rhodococcus sp.)HYW的菌悬液按体积百分比为2：25混合，在转速为140rpm的摇床中培养24h。
S6:将负载细菌的气凝胶与混合液混合均匀，混合液为质量百分比为2％的海藻酸钠溶液、质量百分比为0.7％的海藻酸钾溶液和质量百分比为1％的聚乙烯吡咯烷酮溶液按体积比为7:3:1形成混合溶液，并经过超声波清洗器去除混合溶液中的气泡；
S7:混合液中物质均匀分布在气凝胶表面后，将混合后的气凝胶复合物滴加到5％的饱和氯化钙溶液中进行交联，交联时间为12h；
S8:硬化后用无菌水清洗固定化小球表面2次，制成包埋的气凝胶固定化小球备用。
实施例2
一种包埋气凝胶的固定化微生物制备方法，它包括如下步骤：
S1:将单体甲基丙烯酸羟乙酯、N-羟甲基丙烯酰胺、聚丙烯酰胺和已二酸二异癸酯按照摩尔比为2:3:3:1混合，然后水与单体混合液按照体积比为2:5混合均匀；
S2:向上述混合均匀的混合液中加入0.6mL(1L的混合液)的四甲基乙二胺作为催化剂，冰水浴环境下磁力搅拌均匀后再加入0.6g(1L的混合液)的过硫酸铵作为引发剂反应8h；
S3:将反应后的凝胶在冰箱中冷冻24h，温度从-40℃分四阶段逐渐降低到-80℃，每个阶段降低温度为10℃，每个阶段之间改变温度的时间间隔为6h，最后在冻干仪中冻干72h制成甲基丙烯酸羟乙酯-羟甲基丙烯酰胺共聚气凝胶；
S4:将保藏号为CGMCC No.12392的红球菌(Rhodococcus sp.)HYW，在LB培养基中培养24h，8000rpm离心后制成OD600为1.0的菌悬液；
S5:将制成的气凝胶和红球菌(Rhodococcus sp.)HYW的菌悬液按体积百分比为7：20混合，在转速为150rpm的摇床中培养20h。
S6:将负载细菌的气凝胶与混合液混合均匀，混合液为质量百分比为3％的海藻酸钠溶液、质量百分比为0.9％的海藻酸钾溶液和质量百分比为1.4％的聚乙烯吡咯烷酮溶液按体积比为7:3:1形成混合溶液，并经过超声波清洗器去除混合溶液中的气泡；
S7:混合液中物质均匀分布在气凝胶表面后，将混合后的气凝胶复合物滴加到6％的饱和氯化钙溶液中进行交联，交联时间为14h；
S8:硬化后用无菌水清洗固定化小球表面2次，制成包埋的气凝胶固定化小球备用。
实施例3
一种包埋气凝胶的固定化微生物制备方法，它包括如下步骤：
S1:将单体甲基丙烯酸羟乙酯、N-羟甲基丙烯酰胺、聚丙烯酰胺和已二酸二异癸酯按照摩尔比为3:17:4:2混合，然后水与单体混合液按照体积比为2:9混合均匀；
S2:向上述混合均匀的混合液中加入0.8mL(1L的混合液)的四甲基乙二胺作为催化剂，冰水浴环境下磁力搅拌均匀后再加入1g(1L的混合液)的过硫酸铵作为引发剂反应9h；
S3:将反应后的凝胶在冰箱中冷冻24h，温度从-40℃分四阶段逐渐降低到-80℃，每个阶段降低温度为10℃，每个阶段之间改变温度的时间间隔为6h，最后在冻干仪中冻干36h制成甲基丙烯酸羟乙酯-羟甲基丙烯酰胺共聚气凝胶；
S4:将保藏号为CGMCC No.12392的红球菌(Rhodococcus sp.)HYW，在LB培养基中培养20h，8000rpm离心后制成OD600为1.0的菌悬液；
S5:将制成的气凝胶和红球菌(Rhodococcus sp.)HYW的菌悬液按体积百分比为5：12混合，在转速为160rpm的摇床中培养18h。
S6:将负载细菌的气凝胶与混合液混合均匀，混合液为质量百分比为3％的海藻酸钠溶液、质量百分比为1.2％的海藻酸钾溶液和质量百分比为1.6％的聚乙烯吡咯烷酮溶液按体积比为7:3:1形成混合溶液，并经过超声波清洗器去除混合溶液中的气泡；
S7:混合液中物质均匀分布在气凝胶表面后，将混合后的气凝胶复合物滴加到8％的饱和氯化钙溶液中进行交联，交联时间为12h；
S8:硬化后用无菌水清洗固定化小球表面3次，制成包埋的气凝胶固定化小球备用。
实施例4
一种包埋气凝胶的固定化微生物制备方法，它包括如下步骤：
S1:将单体甲基丙烯酸羟乙酯、N-羟甲基丙烯酰胺、聚丙烯酰胺和已二酸二异癸酯按照摩尔比为2:5:3:1混合，然后水与单体混合液按照体积比为1:6混合均匀；
S2:向上述混合均匀的混合液中加入0.7mL(1L的混合液)的四甲基乙二胺作为催化剂，冰水浴环境下磁力搅拌均匀后再加入0.7g(1L的混合液)的过硫酸铵作为引发剂反应10h；
S3:将反应后的凝胶在冰箱中冷冻24h，温度从-40℃分四阶段逐渐降低到-80℃，每个阶段降低温度为10℃，每个阶段之间改变温度的时间间隔为6h，最后在冻干仪中冻干24h制成甲基丙烯酸羟乙酯-羟甲基丙烯酰胺共聚气凝胶；
S4:将保藏号为CGMCC No.12392的红球菌(Rhodococcus sp.)HYW，在LB培养基中培养24h，8000rpm离心后制成OD600为1.0的菌悬液；
S5:将制成的气凝胶和红球菌(Rhodococcus sp.)HYW的菌悬液按体积百分比为3：10混合，在转速为140rpm的摇床中培养24h。
S6:将负载细菌的气凝胶与混合液混合均匀，混合液为质量百分比为1％的海藻酸钠溶液、质量百分比为1.5％的海藻酸钾溶液和质量百分比为2％的聚乙烯吡咯烷酮溶液按体积比为7:3:1形成混合溶液，并经过超声波清洗器去除混合溶液中的气泡；
S7:混合液中物质均匀分布在气凝胶表面后，将混合后的气凝胶复合物滴加到5％的饱和氯化钙溶液中进行交联，交联时间为24h；
S8:硬化后用无菌水清洗固定化小球表面2次，制成包埋的气凝胶固定化小球备用。
为了更好的验证本发明方法的效果，我们对实施例3制备包埋的气凝胶固定化微生物小球进行了电镜观察。图1为红球菌(Rhodococcus sp.)HYW电镜图，图2为经过实施例3处理的包埋气凝胶负载红球菌电镜图；可见本发明制成的包埋的气凝胶固定化微生物小球比表面积大，稳定性强。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种包埋气凝胶的固定化微生物制备方法，其特征在于，步骤如下:
S1:将单体甲基丙烯酸羟乙酯、N-羟甲基丙烯酰胺、聚丙烯酰胺和已二酸二异癸酯按照比例混合，然后将水与单体混合液按照比例混合均匀；
S2:向上述混合液中加入一定量的四甲基乙二胺作为催化剂，冰水浴环境下磁力搅拌均匀后再加入一定量的过硫酸铵作为引发剂反应一定时间；
S3:将反应后的凝胶在冰箱中冷冻12～24h，温度从-40℃分四阶段逐渐降低到-80℃，每个阶段降低温度为10℃，每个阶段之间改变温度的时间间隔为3～6h；最后将凝胶放入冻干仪中冻干制成甲基丙烯酸羟乙酯-羟甲基丙烯酰胺共聚气凝胶；
S4:将微生物在LB培养基中培养，8000rpm离心后制成OD600为1.0的菌悬液；
S5:将制成的气凝胶和菌悬液按一定比例混合培养一段时间；
S6:将负载细菌的气凝胶与混合液混合均匀，所述混合液为海藻酸钠溶液、海藻酸钾溶液和聚乙烯吡咯烷酮溶液的混合溶液，并经过超声波清洗器去除混合溶液中的气泡；
S7:混合液中物质均匀分布在气凝胶表面后，将混合后的气凝胶复合物滴加到4％～8％的饱和氯化钙溶液中进行交联，交联时间为12～24h；
S8:硬化后用无菌水清洗固定化小球表面2～3次，制成包埋的气凝胶固定化小球。
2.根据权利要求1所述的包埋气凝胶的固定化微生物制备方法，其特征在于：步骤S1中单体为甲基丙烯酸羟乙酯、N-羟甲基丙烯酰胺、聚丙烯酰胺和已二酸二异癸酯，按照甲基丙烯酸羟乙酯、N-羟甲基丙烯酰胺、聚丙烯酰胺和已二酸二异癸酯摩尔比为(1～8):(3～20):(2～5):(1～2)进行混合，制成单体混合物，水与单体混合液按照体积比为(1～3):(5～10)混合均匀。
3.根据权利要求1所述的一种包埋气凝胶的固定化微生物制备方法，其特征在于，步骤S2中催化剂为四甲基乙二胺，在1L的混合液中的投加量为0.5～1.5mL；引发剂为过硫酸铵，在1L的混合液中的投加量为0.5～1g；过硫酸铵作为引发剂反应的时间为8～12h。
4.根据权利要求1所述的一种包埋气凝胶的固定化微生物制备方法，其特征在于，步骤S3中在冻干仪中冻干时间为24～72h。
5.根据权利要求1所述的一种包埋气凝胶的固定化微生物制备方法，其特征在于，步骤S2中每1L的混合液加入0.5～1.5mL的四甲基乙二胺。
6.根据权利要求1所述的一种包埋气凝胶的固定化微生物制备方法，其特征在于，步骤S4中微生物为保藏号为CGMCC No.12392的红球菌(Rhodococcus sp.)HYW，培养时间为12-24h后通过8000rpm离心后制成OD600为1.0的菌悬液。
7.根据权利要求5所述的一种包埋气凝胶的固定化微生物制备方法，其特征在于，包埋气凝胶固定的微生物并不局限于保藏号为CGMCC No.12392红球菌(Rhodococcus sp.)HYW，包埋的微生物可以是有环境修复功能的纯菌和复合菌剂。
8.根据权利要求1所述的一种包埋气凝胶的固定化微生物制备方法，其特征在于，步骤S6中菌液与气凝胶混合培养后加入到混合液中进行混合，所述海藻酸钠溶液质量百分比为1％～6％，所述海藻酸钾溶液质量百分比为0.7％～1.5％，所述聚乙烯吡咯烷酮溶液质量百分比为1～2％，所述海藻酸钠溶液、海藻酸钾溶液和聚乙烯吡咯烷酮溶液的体积比为7:3:1，交联结束后用超纯水清洗固定化小球。
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