CN103013974A - 一种水华鱼腥藻的包埋固定化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水华鱼腥藻的包埋固定化方法，包括以下步骤：（1）水华鱼腥藻的预处理；（2）吸附固定；（3）包埋固定；（4）稳定处理。本发明专利的包埋方法适应了水华鱼腥藻的生理特性，能使其维持良好的生理活性；本发明提供的最佳的包埋比例使颗粒的大小、膨胀性、亲水性、传质效率和除氮磷的效率都能维持在良好的水平；该包埋颗粒有良好的脱氮除磷效果。

Description

一种水华鱼腥藻的包埋固定化方法

技术领域

本发明属于藻类固定化技术领域，涉及一种水华鱼腥藻的包埋固定化方法，且本包埋颗粒有良好的脱氮除磷效果。

背景技术

藻类固定化技术是由固定化细胞技术发展而来的，是利用物理或化学手段将游离的藻类细胞定位于限定的空间区域，使其成为一种既保持本身代谢活性，又可在连续反应后回收和反复利用的生物体系。藻类的一系列生物特性决定其在污水净化和资源化中的重要地位，而固定化藻类技术是实现藻类发展和应用到各个领域的重要手段。在污水处理方面，固定化藻类将广泛的应用在污水的脱氮除磷、重金属富集以及有机物的去除，并实现资源化；在生物方面，固定化藻类进行生物监测、产油、产氢以及微藻固定化保种等方面将是研究的热点。

传统的细胞固定化技术按细胞与载体的相互作用关系分为四种固定化：絮凝、共价耦合、包埋和吸附。随着研究的深入，后来又陆续出现了一些新的固定化技术如溶胶-凝胶固定化、无载体固定化、组合固定化技术、超微载体固定化、亲和配基固定化和絮凝吸附固定化等。藻类固定化技术发展于固定化细胞技术，在固定化细胞的基础上，藻类固定化要求固定化系统能保持良好生存力、光合作用能力、高密度、连续生产力、藻细胞从介质中泄漏少。目前藻类的固定化主要采用的方法有包埋法和吸附法两类。

固定化也会对藻产生一定的影响，固定化藻类细胞的生长通常慢于自由细胞，但其生长周期更长并且最终产量高于自由细胞；固定化后可能引起传质限制，导致生长速率下降；固定化提高了藻类的合成代谢，能较长时间保持藻细胞活性；降低了藻类的分解代谢，因为固定化后细胞活动受到约束，活动减弱，能量消耗减少，分解代谢作用随之降低；影响藻类形态与分布，固定化载体对不同藻种在形态上影响不同，但这种影响几乎很小，同时藻在载体中的分布是不均匀的。

藻类固定化后应用于污水处理过程中，其净化效果受许多因素的影响。这些影响因素主要有：藻的种类、固定化载体、固定化藻量、处理运行时间、污水的pH、营养盐因子、固定化比例以及反应器类型等。根据影响因素的作用条件可分为内部因素和外部因素。内因主要有藻种株系、种群结构、藻细细生理期以及通过饥饿改变藻类生理状态等。外部因素主要是影响藻类生长的环境因素包括温度、pH、光照、营养条件等。

水华鱼腥藻的光饱和点为96.29 umol/m²s，光补偿点3.01 umol/m²s，高光强时会出现明显的光抑制，但可在强光下生长。它的光合作用温度在10-35℃范围中都能生长,其最适温度在25℃左右。它在pH=6-9范围内可正常生长,最适pH=8。水华鱼腥藻具有固氮能力，其异形胞有较强的固氮能力，其营养细胞也有固氮能力但较异形胞弱。有研究表明，结合态氮会抑制异形胞的形成，而有机态氮会增加异形胞的形成，硝酸盐的抑制作用是短暂的，而在培养液中能够保持一定浓度的铵态氮的抑制作用是持久的，这一特点决定鱼腥藻在营养缺乏的条件下较其它藻类有较强的存活优势。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种水华鱼腥藻的包埋固定化方法。

本发明的技术方案如下：

一种水华鱼腥藻的包埋固定化方法，包括以下步骤：

（1）水华鱼腥藻的预处理：

两周前将藻种在无菌条件下转接到含缺氮BG11培养基的锥形瓶中，置于光照培养室进行扩大培养，反复接种，使之处于对数增长期。培养条件：温度为25±1℃，光照强度为2000～2500lux，光暗比12h：12h，每天定时摇瓶三次，并在饥饿处理2-3天后进行包埋处理；

(2) 吸附固定：

将处理培养后的水华鱼腥藻从锥形瓶中提取装入离心管在9000 r/min下，离心10 min，去掉上清液，用0.7%生理水洗涤，然后在相同条件下离心并去除上清液，重复上述洗涤操作2次；将水华鱼腥藻和粉末活性炭以质量比2:5均匀混合，并吸附5分钟备用，此即为混合碳藻，称溶液1；

（3）包埋固定：

加入少量无菌蒸馏水将在100℃恒温水浴中溶解所得聚乙烯醇和海藻酸钠以质量比40:3均匀混合，其中海藻酸钠的质量以与粉末活性炭和水华鱼腥藻的质量比为6:5:2为准，称溶液2；将溶液2与溶液1混合搅拌，并用无菌蒸馏水定容使溶液质量为藻的500倍；搅拌均匀后将其用孔径为2~3mm注射器滴入调节pH=7~8的3% CaCl₂与饱和硼酸的混合溶液，滴完后在4℃±3℃下凝胶8h；

（4）稳定处理：取出颗粒用蒸馏水冲洗2次，再用0.7%生理盐水在4℃下浸泡24h，用蒸馏水冲洗备用，最后放入第一步的缺氮培养基中培养以备使用。

本发明专利的包埋方法适应了水华鱼腥藻的生理特性，能使其维持良好的生理活性；本发明提供的最佳的包埋比例使颗粒的大小、膨胀性、亲水性、传质效率和除氮磷的效率都能维持在良好的水平；该包埋颗粒有良好的脱氮除磷效果。

附图说明

图1为富氮与缺氮下水华鱼腥藻形态观察（a富氮，b缺氮）；

图2为颗粒对碘的吸附；

图3为颗粒对亚甲基蓝的吸附；

图4为第3天和第9天MC毒素均值对比；

图5为水华鱼腥藻对包埋颗粒颜色影响；

图6为水华鱼腥藻在凝胶膜内形态；

图7为显微镜下颗粒孔径观察。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

2.1水华鱼腥藻的培养

采用BG11培养基培养水华鱼腥藻，其配方如下表：

表1 BG11培养基配方

表2 A5+Co溶液配方

根据水华鱼腥藻具有异形胞且受生长环境中氮的影响的特点，分别将水华鱼腥藻接入富氮培养基和缺氮培养集中，观察水华鱼腥藻在缺氮环境下生长情况和异形胞变化情况。

图1为富氮与缺氮下水华鱼腥藻形态在油镜下观察结果。可以明显的观察到在富氮培养基中水华鱼腥藻基本上未出现异形胞，而在缺氮培养基中观察到大量的异形胞，表明水华鱼腥藻在培养环境缺氮营养盐时会产生异形胞。异形胞出现的位置分布在藻的两端和中间部分，根据异形胞出现在中间位置可以推测，其是由营养细胞转化而来的。异形胞具有较强的固氮能力，能满足水华鱼腥藻在缺氮时对氮的补充。同时可以观察到，水华鱼腥藻在缺氮第二天开始出现异形胞，到第三天时开始大量出现，表明水华鱼腥藻在缺氮第三天时，开始表现对氮营养盐需求量大。因此可以大致确定水华鱼腥藻的饥饿时间为2-3天左右。

故使用缺氮BG11培养基对水华鱼腥藻进行培养。两周前将藻种在无菌条件下转接到含培养基的锥形瓶中，置于光照培养室进行扩大培养，反复接种，使之处于对数增长期。培养条件：温度为25±1℃，光照强度为2000～2500lux，光暗比12h：12h，每天定时摇瓶三次。并在饥饿处理2-3天后进行包埋处理。

2.2 设计正交实验确定最佳包埋比

选择聚乙烯醇（PVA）含量为8%，以海藻酸钠（SA）、粉末活性炭（PAC）和包埋藻量（Z）为正交实验因素，选用L₉(3⁴)正交表进行正交实验。（藻计量方法在9000rpm，离心15min称湿藻重）。通过将扩大培养后的水华鱼腥藻在9000 r/min下离心10 min，去掉上清液，用生理水洗涤，然后在相同条件下离心并去除上清液,重复上述洗涤操作2次。最后加入少量无菌水将藻和PAC均匀混合。然后将在100℃恒温水浴中溶解所得PVA（AR,聚合度1750±50）和SA混合，混合液冷却至室温（25℃±3℃）；然后将其与混合碳藻混合搅拌；搅拌均匀后将其用注射器滴入调至中性的混合溶液（3% CaCl₂与饱和硼酸）。滴完后在4℃下凝胶8h。取出颗粒用蒸馏水冲洗2次，再用0.7%生理盐水在4℃下浸泡24h，最后蒸馏水冲洗。

以包埋颗粒膨胀性、亲水性、直径以及传质效率等指标考察小球的物理性能，以氨氮、总磷以及处理后废水中MC残留量为筛选指标考察颗粒的脱氮除磷性能以及生物性能，根据实验观察到水华鱼腥藻在缺氮培养第2或3天开始出现异形胞的特性，颗粒于凝胶后第3天按质量比1:20接入200ml模拟废水进行静态模拟降解实验。实验分9个区组，每个实验组做两次重复。运行条件：温度25℃、光照2,500lux、光暗比12:12，低转速震荡8h/D。分别在第1、2、3、5、7、9、11天对污水进行NH₄ ⁺-N、TP。第3、9天测定MC含量。MC毒素的检测采用ELISA方法，试剂盒购于中国科学院水生生物研究所。实验各因素和水平设计见表3。

表3 各因素和水平设计

2.2.1包埋颗粒大小

实验通过游标卡尺测定各凝胶组小球直径，分析各正交因素对小球直径的贡献影响。

表4包埋颗粒直径测定结果

表5 颗粒直径—主体间效应检验

a. R 方 = .998 (调整 R 方 = .992)

表4是各试验组凝胶颗粒直径测定结果，用SPSS进行主体间效应检验结果如表5。检验结果发现，试验因素SA和PAC的sig值分别为0.002、0.23，小于0.05，表明在凝胶过程中因素SA和PAC的添加量对颗粒的直径有显著性影响， Z的包埋量对凝胶后成型颗粒的直径大小基本没影响。通过功效检验结果确定了各因素主次为SA>PAC>Z，对各因素水平采用SNK法进行多重比较，见表6。

表6 各水平间多重比较

通过水平间比较发现，当SA添加量在0.5、1和2之间都有显著性差别，并且在这之间颗粒直径大小和SA量成正相关，SA添加量越多成型后颗粒直径越大；对PAC各水平比较发现当包埋PAC量在0.1和0.5g之间对颗粒直径大小影响不大，包埋量在1g同0.1和0.5之间都显著区别，同样颗粒直径大小与PAC量成正相关；而Z包埋量个水平间无区别。因此通过比较可以筛选出最大直径组合为SA(2)PAC(1)Z(0.2)，最小直径组合为SA(0.5)PAC(0.2)Z(0.2)。

2.2.2包埋颗粒膨胀性

各试验小组分别选取5颗直径相同的凝胶颗粒，然后浸泡在验污水中。根据前期预备试验发现凝胶颗粒在浸泡1天后基本能够达到膨胀极限，因此实验在颗粒浸泡2天后测定其直径。表7是凝胶颗粒浸泡前后直径大小差的绝对值。

表7颗粒膨胀性测定结果

表8 颗粒膨胀性主体间效应检验

a. R 方 = .967 (调整 R 方 = .962)

显著性检验结果发现，SA和PAC的sig值小于0.05，表明在定量PVA条件下，包埋中添加的海藻酸钠和粉末活性炭对颗粒的膨胀性有显著影响。通过功效检验确定因素主次为SA>PAC>Z。

对各因素水平进行SNK多重比较结果发现，因素SA添加量在0.5、1和2之间都有显著性区别，颗粒膨胀性与SA量的多少成负相关；因素PAC添加量在0.1、0.5和1之间有显著区别，膨胀性与PAC量的多少成负相关；因素Z各水平间无显著性区别。通过比较可以确定最小膨胀组合为SA(2)PAC(1)Z(0.2)，最大膨胀组合为SA(0.5)PAC(0.1)Z(0.2)。

2.2.3亲水性测试

亲水性的测定方法，采用差重法。取5颗用滤纸吸干后质量相同的小球，放在烘箱内恒温108℃烘干2小时，然后取出称量并观察其变形情况；烘干后其变形情况采用目测法，其百分数越大表示变形越厉害，测量结果见表9。

表9亲水性和变形性测定结果

表10检验结果表明，在颗粒亲水性检验中，只有SA因素sig小于0.05，表明在一定的PVA含量下，只有海藻酸钠的添加量颗粒亲水性有显著性影响，因素影响主次为SA>PAC>Z。对变形情况检验发现，所有因素都未表现显著性。通过功效检验可以确定因素对颗粒变形影响主次为PAC>SA>Z。

表10 亲水性和变形情况主体间效应检验

通过水平间多重比较比较发现，颗粒的亲水性能力与SA的量成正相关，且当添加量为0.5g时，同添加量为1g和2g有显著区别，而添加量1g和2g之间差别不明显。通过比较结果得到颗粒最大亲水性组合为SA(2)PAC(0.1)Z(1.2)，最小为SA(0.5)PAC(0.1)Z(0.2)。颗粒抗变形能力最好组合为PAC(1)SA(1)Z(0.2)。

2.2.4包埋颗粒传质效率

传质效率的测定方法借鉴国标木质活性炭检验方法，测定颗粒分别对亚甲基蓝和碘吸附能力大小来反应颗粒的传质能力；其中颗粒对亚甲基蓝和碘吸附能力的值分别代表胶颗粒对较大分子和小分子碘的传质能力，测定时间分别为颗粒浸泡前第1天、浸泡后第3天以及第6天。

图2是颗粒在浸泡前后对碘分子的吸附对比，可以看出颗粒在浸泡后，碘的吸附值从1.69mg/g增加6mg/g左右，对碘的吸附能力增强；而浸泡时间在3天和6天之间对碘的吸附大小差异不大。图3是颗粒浸泡前后对亚甲基蓝的吸附情况，结果表明颗粒对亚甲基蓝的吸附能力在浸泡后有所减弱，浸泡时间在3天和6天之间对亚甲基蓝的吸附无明显差异。得出颗粒对碘和亚甲基蓝的吸附较好。

表11 碘吸附值主体间效应检验

表11检验结果表明，浸泡前显著因素为SA和PAC，因素主次为SA>PAC>Z；浸泡后显著因素为SA和PAC，因素主次为PAC>SA>Z。因素的显著性表明，颗粒吸附性能主要受海藻酸钠和粉末活性碳的影响。亚甲基蓝因素显著性检验和碘值显著性相同，浸泡前因素主次为SA>PAC>Z，浸泡后因素主次为PAC>SA>Z。通过水平多重比较表明，浸泡前最佳吸附效率组合为SA(0.5)PAC(0.5或1)Z(0.2)，浸泡后最佳组合为PAC(1)SA(0.5)Z(0.2)。亚甲基蓝吸附最佳组合与此相同。

2.2.5包埋颗粒脱氮除磷性能

表12氨氮、总磷、MC测定结果

表12是第3天和9天正交试验结果，颗粒对氮磷的去除率分别在处理第三天和第9天出现相对稳定点，因此选取第3天和9天正交试验结果做方差分析，对其进行显著性检验结果如表13和表14。

表13 氨氮去除率第3天和第9天主体间效应检验

a. R方= .912 (调整 R 方 = .863)a. R 方 = .692 (调整R 方 = .524)

表 14 TP去除率第3天和第9天主体间效应检验

a. R 方 = .668 (调整R 方 = .486)a. R 方 = .747 (调整 R 方 = .608)

表17、18分别为氨氮和总磷去除率第3天和第9天主体间效应检验结果。在氨氮第3天结果检验中，正交实验因素SA、PAC和Z的sig值都小于0.05达到显著水平，并通过功效检验（偏 Eta 方）可知SA和PAC功效分别为0.810和0.825，都明显大于Z的0.569，因素主次为PAC>SA>Z。对TP的检验结果显示，在第3天只有SA的sig值小于0.05达到显著，因素主次为SA>PAC>Z。在对第9天氮和磷去除率显著性检验结果中，都只有Z的sig值小于0.05达到显著，因素主次分别为Z>SA>PAC和Z>PAC>SA。采用SNK法对NH₄ ⁺-N和TP去除率影响因素进行水平比较，通过对比确定了NH₄ ⁺-N第3天的显著因素SA、PAC、Z最佳水平为0.5、0.5、0.2，第9天Z的最佳水平为0.2。TP第3天显著因素SA的最佳去除率水平为1，第9天显著因素Z为0.2。所以综合比较后，颗粒降解氨氮和总磷的最佳因素及水平组合确定为SA(0.5)PAC(0.5)Z(0.2)。

2.2.6最少MC残留量

图4为处理前期第3天和处理后第9天MC毒素对比结果。包埋水华鱼腥藻处理废水3天后，废水中MC毒素含量分仅为0.01275ug/L，表明包埋颗粒能够很好的截留MC毒素，截留率达到95.52%。包埋藻第3天与第9天的MC毒素含量对比发现，虽然在处理第9天时MC毒素明显增加，其含量仍然低于标准。根据表12藻毒素测定结果，进行显著进检验，结果见表15。

表15 MC显著性检验

检验结果表明，在第3天中因素未表现出显著性。在第9天结果检验中，PAC和Z的sig值都小于0.05，因此处理后废水中MC毒素的含量主要受包埋PAC量和藻量的影响。对第9天显著因素PAC和Z进行的多重比较分析，检验结果表明第9天显著因素Z的最佳水平分别为0.2，PAC的最佳水平为0.5或1。所以综合比较后，颗粒对MC毒素的最佳去除率组合确定为SA(0.5%)PAC(0.5%)Z(0.2%)。

将包埋颗粒的各种特性组合列表进行综合对比分析，对比情况如表16。

表16 包埋颗粒各种特性的最优组合

从中选取最小颗粒直径组合、最大膨胀组合、最小亲水性组合、抗变形能力最佳组合、传质效率最佳组合、脱氮除磷性能最佳组合、最少MC残留量最佳组合，将这些组合的固定化比率进行折中，最终得到最佳的固定化比率为SA(0.6) PAC(0.5) Z(0.2)。

2.3 具体步骤

（1）水华鱼腥藻的预处理

两周前将藻种在无菌条件下转接到含缺氮BG11培养基的锥形瓶中，置于光照培养室进行扩大培养，反复接种，使之处于对数增长期。培养条件：温度为25±1℃，光照强度为2000～2500lux，光暗比12h：12h，每天定时摇瓶三次。并在饥饿处理2-3天后进行包埋处理。

(2) 吸附固定

将处理培养后的水华鱼腥藻从锥形瓶中提取2ml装入离心管在9000 r/min下，离心10 min，去掉上清液，用0.7%生理水洗涤，然后在相同条件下离心并去除上清液，重复上述洗涤操作2次。加入少量无菌蒸馏水将藻和粉末活性炭（PAC）以质量比2:5均匀混合，并吸附5分钟备用。此即为混合碳藻，称溶液1。

（3）包埋固定

加入少量无菌蒸馏水将在100℃恒温水浴中溶解所得聚乙烯醇（PVA）（AR,聚合度1750±50）和海藻酸钠（SA）以质量比40:3（其中SA的质量以与PAC和Z的质量比为6:5:2为准）均匀混合，称溶液2。混合液冷却至室温（25℃±3℃）；然后将溶液2与上步骤中的溶液1混合搅拌，并用无菌蒸馏水定容使溶液质量为Z的500倍；搅拌均匀后将其用孔径为2~3mm注射器滴入调节pH=7~8的3% CaCl₂与饱和硼酸的混合溶液。滴完后在4℃±3℃下凝胶8h。

（4） 稳定处理

由于在包埋过程中含有大量的硼酸，会抑制水华鱼腥藻的生长，同时观察到饱和硼酸会使水华鱼腥藻死亡，其溶液均为兰色，大量死亡的藻沉降在底部。图5中a是空白颗粒（不含藻）在溶液中的状态，观察到溶液颜色较透明。b是包埋颗粒用蒸馏水浸泡24h后，在培养基中生长2天后的状态，可以观察到溶液为淡兰（固定藻颗粒初始颜色为淡绿色），表明颗粒内部的藻大量死亡，这可能是颗粒在凝胶后其内含有大量的硼酸引起的。c是包埋藻颗粒用0.7%生理盐水浸泡24h后在培养基中生长2天后的状态，可以观察到溶液为淡绿色，表明藻未死亡或死亡较少。d是包埋藻颗粒用0.7%生理盐水浸泡24h后在培养基生长一周后的状态，表明藻在颗粒内部能够保持良好的生长趋势。在凝胶过程中，偏碱性环境更利于水华鱼腥藻保持活性、降低颗粒之间粘连性和提高颗粒强度。过多的硼酸会明显抑制水华鱼腥藻的生长，而0.7%的生理盐水浸泡有助于减少高浓度硼酸对水华鱼腥藻的伤害，恢复其活性。

故取出颗粒用蒸馏水冲洗2次，再用0.7%生理盐水在4℃下浸泡24h，用蒸馏水冲洗备用。最后放入第一步的缺氮培养基中培养以备使用。

2.4 包埋颗粒性质

2.4.1包埋后藻形态观察

图6是颗粒制成膜后在显微镜下观察结果。由图6中1可以看出，混合凝胶后水华鱼腥藻基本均匀分布在凝胶体内；图6中2可以发现凝胶后水华鱼腥藻仍然保持正常形态，凝胶未对水华未对水华鱼腥藻造成生理上的形态变化。

2.4.2包埋颗粒孔径

图7是颗粒切片后将颗粒中间部分(a1)、表层部分(a2)以及表面部分(a3)在显微镜下观察结果。从图中可以发现颗粒内部具有发达的孔结构，其孔径大小由中间部分向表层部分逐渐减小。在图中a1中，中间部分较亮，是由于其被切开增加透光造成的。

2.4.3 对实际畜禽废水的降解

该包埋颗粒在温度为25℃、光照为5000lux、处理污水量与接入颗粒质量比为15:1的条件下，在饥饿处理3天后，对取至某畜禽废水污水处理厂，经CASS曝气池处理后的出水进行处理。每天进行人工摇瓶3次，五天后测定经处理后畜禽废水的TN、TP、TOC等指标。可以看出其对畜禽废水有很强的脱氮除磷能力。测定结果如表17。

表17 包埋颗粒对实际畜禽废水的降解

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种水华鱼腥藻的包埋固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）水华鱼腥藻的预处理：

两周前将藻种在无菌条件下转接到含缺氮BG11培养基的锥形瓶中，置于光照培养室进行扩大培养，反复接种，使之处于对数增长期。培养条件：温度为25±1℃，光照强度为2000～2500lux，光暗比12h：12h，每天定时摇瓶三次，并在饥饿处理2-3天后进行包埋处理；

(2) 吸附固定：

将处理培养后的水华鱼腥藻从锥形瓶中提取装入离心管在9000 r/min下，离心10 min，去掉上清液，用0.7%生理水洗涤，然后在相同条件下离心并去除上清液，重复上述洗涤操作2次；将水华鱼腥藻和粉末活性炭以质量比2:5均匀混合，并吸附5分钟备用，此即为混合碳藻，称溶液1；

（3）包埋固定：

加入少量无菌蒸馏水将在100℃恒温水浴中溶解所得聚乙烯醇和海藻酸钠以质量比40:3均匀混合，其中海藻酸钠的质量以与粉末活性炭和水华鱼腥藻的质量比为6:5:2为准，称溶液2；将溶液2与溶液1混合搅拌，并用无菌蒸馏水定容使溶液质量为藻的500倍；搅拌均匀后将其用孔径为2~3mm注射器滴入调节pH=7~8的3% CaCl₂与饱和硼酸的混合溶液，滴完后在4℃±3℃下凝胶8h；

（4）稳定处理：取出颗粒用蒸馏水冲洗2次，再用0.7%生理盐水在4℃下浸泡24h，用蒸馏水冲洗备用，最后放入第一步的缺氮培养基中培养以备使用。

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