CN105754984A - 海藻酸钠复合固定化菌剂及其制备方法以及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了海藻酸钠复合固定化菌剂及其制备方法，解决了现有技术中并没有适用于二氯喹啉酸降解用假单胞菌的固定化方式的问题。本发明包括将具有假单胞菌的载体培养基和海藻酸钠混合后，滴入浓度为1～4%的氯化钙中静置2～4h制成的颗粒剂；所述海藻酸钠的质量浓度为2～6%；所述载体培养基包括吸附载体和无机盐液体培养基；该吸附载体与海藻酸钠的重量比为1～3∶1，该吸附载体由重量比为1∶1～2∶1的玉米芯、竹炭和油枯组成。本发明通过有效提高菌体的降解效率；且本发明固定化菌剂的降解率远远高于空白小球物理吸附效率和游离菌株的生物降解效率之和，能有效达到相互促进的效果。

Description

海藻酸钠复合固定化菌剂及其制备方法以及用途

技术领域

本发明涉及一种菌剂，具体涉及一种海藻酸钠复合固定化菌剂及其制备方法以及用途。

背景技术

我国是农药生产和使用的大国之一，每年施用的农药量高达50-60万吨，包括除草剂、杀虫剂和杀菌剂等农用化学品，由于农药在我国的利用效率低，导致大量农药流入环境中。农药在提高农作物产量的同时，也对食品安全造成了威胁，因此，近年来受到研究者的广泛关注。

二氯喹啉酸（quinclorac）为一种选择性苗后处理除草剂，属于激素型喹啉羧酸类药剂，主要用于防治稻田中稗草和其他禾本科杂草，在我国农业生产中广泛使用，该药剂性质稳定，易在土壤中残留。由于不合理的施用，使其残留于土壤与水体环境中，对人类的健康造成潜在的威胁。当前针对二氯喹啉酸土壤中残留污染问题主要治理方法有物理吸附、深耕覆土、增施有机肥和化学药剂缓解药害等措施，但不能从根本上解决二氯喹啉酸在土壤中的残留问题。而物修复是一种低成本的环境友好型面源污染修复技术，大量的研究结果显示农药降解菌在实验室纯培养条件下可以高效地降解化学农药，已分离出有机磷杀虫剂、菊酯类杀虫剂、磺酰脲类除草剂以及对硝基苯酚进行降解的菌种，农业部农业环境微生物重点开放实验室等机构也建立了较为全面的降解性微生物菌种资源库。

尽管已获得了一批具有高效降解能力的菌种资源，但降解菌在田间条件下对农药残留的降解仍然是目前土壤修复中面临的难题。通常将菌种资源投入田间进行原位修复时，存在污染成分复杂，筛选的功能菌株会因不适应环境而使活性受到抑制、与土著微生物竞争等缺点，从而导致在实际应用中受到限制。

固定化微生物技术可以通过物理或化学的方法将游离的微生物与特定的载体相结合，使其固定在某一空间区域内，以提高微生物细胞的浓度，缓冲外界物质对细胞的毒害，从而达到强化降解的目的。固定化所用的载体和方法很多，由于不同载体种类及联合方式的固定化对降解效果存在极大差异，因而探索针对特定污染物，即二氯喹啉酸降解用的假单胞菌载体种类及联合方式对污染修复具有现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种优化地菌剂固定化方式，即海藻酸钠复合固定化菌剂，并公开了该固定化菌剂的制备方法和用途，解决了现有固定化方式对二氯喹啉酸的降解效率不够高的问题。

本发明通过下述技术方案实现：

海藻酸钠复合固定化菌剂，包括将具有菌体的载体培养基和海藻酸钠混合后，将其滴入氯化钙溶液中静置制成的颗粒剂。

降解菌用于水体或土壤原位修复时往往面对复杂的环境条件，菌株降解能力下降甚至失去降解能力。本发明采用固物理载体吸附及海藻酸钠包埋的复合固定化技术，通过本发明的优选固化方式后，能为微生物提供了一个相对稳定的生存环境，对不良环境起缓冲作用，使菌株得到较宽的温度适应范围，同时也可增强菌株对酸碱变化的缓冲能力，与现有单独使用载体培养基进行降解的效果相比效果十分显著。

且通过实施例2中图1的数据可知，载体培养基与海藻酸钠结合后对二氯喹啉酸的降解效果优于分别使用两种固定化方式进行二氯喹啉酸降解的效果，且固定化菌剂的二氯喹啉酸的去除效果高于游离菌体和空白小球去除效果之和，效果非常显著。同时，通过实施例5的试验数据可知：通过本发明的固定化菌剂能有效提高重复使用次数，效果极佳。

同时，本发明采用上述固化方式制成的固定化菌剂，不仅仅对流体介质中污染物的降解具有促进作用，而且在非流体介质中，对污染物的降解也具有促进作用，适用的介质类型更加广泛。

进一步，所述菌体为假单胞菌、红球菌或短短芽孢杆菌。所述海藻酸钠的质量浓度为2～6%，氯化钙溶液浓度为1～4%；静置时间为2～4h。

在上述条件设置下，载体培养基在氯化钙中能达到较好的交联效果，有效提高降解效率。上述氯化钙浓度和静置时间对降解率产生较大的影响原因主要在于：过短的交联时间，会导致海藻酸钠的交联不完全，固定化菌剂机械强度和微生物活性较低；而交联时间过长则会导致固定化微生物在长时间低温条件下，生物活性降低以及会对载体传质性能的影响。

所述载体培养基包括吸附载体和液体培养基；该吸附载体与海藻酸钠的重量比为1～3∶1，该吸附载体由重量比为1∶1～2∶1的玉米芯、竹炭和油枯组成。所述液体培养基为无机盐液体培养基。

玉米芯和油枯均富含有机质，竹炭的高比表面积及空隙特性有助于形成稳定的网状结构，利于菌体的吸附；并且本发明通过上述组成成分和配比的设置，使本发明的固定化菌剂不产生二次污染、能降解且富含有机质。

本发明中的高效降解菌、固定化载体、固定化方式这三者相辅相成，通过本发明高效降解菌、载体种类和固化方式的优选设置，可有效提高菌体的降解效率。本发明中吸附载体比例对降解效果影响，主要表现在随着竹炭含量变化而发生改变。本发明中吸附载体各组分的比例优选为1∶1～2∶1，通过表1的试验数据可知，在上述比例下，降解效果最优，这可能与竹炭发达的孔隙特征及高碳含量有关，随着竹炭比例增大，吸附能力增强，但过高的竹炭比例可能会破坏吸附体系中最适的碳氮比，对菌体生长产生影响。

通过实施例1中数据可知：本发明的固定化菌剂的降解率远远高于空白小球物理吸附效率和游离菌株的生物降解效率之和，能有效达到相互促进的效果。

优选地，所述氯化钙浓度为2～3%，载体培养基在氯化钙中的静置时间为3～4h。所述海藻酸钠的质量浓度为3～5%。所述玉米芯、竹炭和油枯的重量比为1∶2∶1。

本发明提供了上述复合固定化菌剂的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）载体培养基制备：分别制备吸附载体和液体培养基，混合后灭菌；

（2）菌体母液的制备和添加：获得假单胞菌的母液，将母液混合到载体培养基中；

（3）固化：将海藻酸钠浸泡后灭菌，冷却后将其与混合有菌体母液的载体培养基混合均匀，然后将其滴加入氯化钙中，静置后固化制成颗粒剂；

本发明还提供了该复合固定化菌剂的用途，即一种利用上述海藻酸钠复合固定化菌剂降解二氯喹啉酸的用途。

进一步，本发明固定化菌剂适用于温度为25℃～35℃，pH值为6～8的条件下。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、采用本发明的载体种类的选择和固化方式相结合后，不仅仅对流体介质中污染物的降解具有促进作用，而且在非流体介质中，对污染物的降解也具有促进作用，适用的介质类型更加广泛；

2、通过本发明的优选设置方式结合后，能为微生物提供了一个相对稳定的生存环境，对不良环境起缓冲作用，使菌株得到较宽的温度适应范围。

3、本发明通过的载体种类和固化方式的优选设置，有效提高菌体的降解效率；且本发明的固定化菌剂的降解率远远高于空白小球物理吸附效率和游离菌株的生物降解效率之和，能有效达到相互促进的效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为实施例2中施氏假单胞菌的不同菌剂类型在土壤中的二氯喹啉酸降解率的示意图。

图2为本发明的固定化菌剂在不同温度条件下二氯喹啉酸降解率的示意图。

图3为本发明的固定化菌剂在不同初始pH值下二氯喹啉酸降解率的示意图。

图4为本发明中不同菌剂在不同类型污水中二氯喹啉酸降解率的示意图。

图5为实施例1中实例③所述固定化菌剂在污水和土壤中重复使用时二氯喹啉酸降解率的示意图。

图6为实施例6中菌株PFS-4的生长量与二氯喹啉酸降解率的示意图。

图7为实施例6中菌株PFS-4的不同菌剂类型的二氯喹啉酸降解率的示意图。

图8为实施例7中短短芽孢杆菌的不同菌剂类型的二氯喹啉酸降解率的示意图。

图9为实施例8中红球菌的不同菌剂类型的二氯喹啉酸降解率的示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

本发明海藻酸钠复合固定化菌剂，包括菌株、海藻酸钠，氯化钙，玉米芯、竹炭和油枯组成的吸附载体，以及无机盐液体培养基。

本实施例中该菌株为从广东省微生物菌种保藏中心购买的施氏假单胞菌，其编号为GIM1.446，由于采用上述施氏假单胞菌，因而，本发明优选采用利于该类菌株生长的无机盐液体培养基，该无机盐液体培养基简称为MSM，该MSM的组成成分包括：FeCl₃0.15g、MnCl₂0.15g、NaNO₃0.5g、K₂HPO₄1.70g、CaCl₂﹒2H₂O0.01g、KH₂PO₄1.50g、FeSO₄﹒7H₂O0.04g、MgSO₄﹒7H₂O0.2g、(NH4)₂SO₄1.0g，pH﹦7，H₂O1000ml。

本发明固定化菌剂的具体制备方法如下：

（1）吸附载体的制备：

将脱粒后的玉米芯烘干，打碎过80目的筛；将油枯碾碎过80目的筛；取粒径约0.16mm的竹炭用蒸馏水洗净后烘干；

将玉米芯、竹炭和油枯按照重量比为1∶1～2∶1的比例混合均匀制成吸附载体。

（2）载体培养基制备：

首先按照上述无机盐液体培养基的配比配置出无机盐液体培养基，将吸附载体加入到含有40ml无机盐培养基的锥形瓶中高温灭菌，冷却后制成载体培养基备用；

（3）菌体母液的制备和添加：

将LB固体培养基中培养的施氏假单胞菌PFS-4的单菌落转接至LB液体培养基中，在140r/min、25℃的摇床上培养5d，培养完成后离心收集菌体，再用无机盐液体培养基重悬后获得母液，将其中4ml母液混合到载体培养基中即可；

上述LB培养基的组成成分为：酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，pH7，H₂O1000ml。LB液体培养基和LB固体培养基的区别在于：LB固体培养基中增加有琼脂20g。

（4）固化：将海藻酸钠浸泡后高温灭菌，冷却后将其与混合有菌体母液的载体培养基混合均匀，然后滴加入质量浓度为1～4%的氯化钙中，静置2～4h后固化制成颗粒剂，颗粒剂经过无菌水冲洗三次后即制成成品颗粒。

本发明中所述海藻酸钠的质量浓度为2～6%，该海藻酸钠的质量浓度计算方式为：海藻酸钠重量除以具有菌体母液的载体培养基重量，再乘以百分之百；该吸附载体与海藻酸钠的重量比为1～3∶1。

本实施例中不同的组成成分的比例具体如表1所示。其中，因素A为海藻酸钠的质量浓度（%）；因素B为玉米芯、竹炭和油枯之间的重量比；因素C为氯化钙质量浓度（%）；因素D为静置时间（h）；因素E为吸附载体与海藻酸钠的重量比。

采用表1实例③中的固定化菌剂和游离菌进行预实验，探讨不同菌种添加量对降解量的影响，具体检测方法为：采用不同添加量的固定化菌剂和游离菌分别加入到初始pH=7的含800mg/L二氯喹啉酸的MSM中，在140r/min、30℃的摇床上培养6d后检测二氯喹啉酸的去除率（%）。检测结果为：在固定化菌剂添加量为10%、游离菌添加量为3%时，降解量达到峰值，继续增大浓度对降解率提高影响很小。

利用表1中不同配比制成的固定化菌剂进行二氯喹啉酸去除率的检测，本实施例中固定化菌剂的添加量均为10%，本发明采用高效液相色谱仪HPLC(Aglient1200series)测定二氯喹啉酸的含量。分析条件为：柱温40℃，流动相甲醇：水(90:10,v/v)，流速为0.5mL/min，进样量为20L。色谱柱InertsilODS-2151-K(6mm×150mm)。所有实验重复3次。检测结果如表1所示。

表1

通过上述结果可知：通过本发明的方法制备出的固定化菌剂均能有效提高菌体去除二氯喹啉酸的效果。当玉米芯、竹炭和油枯的重量比为1∶1～2∶1，氯化钙浓度为2～3%，载体培养基在氯化钙中的静置时间为3～4h，海藻酸钠与吸附载体的重量比为1∶2，海藻酸钠的质量浓度为3～5%时，该二氯喹啉酸的去除率可达到80%以上，二氯喹啉酸去除效果显著。

实施例2

本实施例采用实施例1中实例③组成比例制成的固定化菌剂，接种量为10%。再分别考察空白小球、分散载体、游离菌体、含菌载体、海藻酸钠固定菌剂对土壤样中二氯喹啉酸去除效果。上述剂型与固定化菌剂的区别仅仅在于：空白小球中不包含菌体母液；分散载体是指固定化菌剂中的吸附载体；含菌载体是指加入有菌体母液的吸附载体；海藻酸钠固定菌剂中不包含吸附载体。

具体检测方法为：将供试土壤去石砾后过3mm筛，测定二氯喹啉酸含量，过筛后添加二氯喹啉酸使其含量达到1000mg.kg^-1，稳定5d后再次测定土壤中二氯喹啉酸含量，不改变土壤其它性质，当二氯喹啉酸含量稳定后将其铺在长15×10×5cm的订制塑料槽，保持水土比为3:1，在温度为25℃、pH值为7的条件下静置培养，每48h取一次样，测定二氯喹啉酸剩余量，检测结果如图1所示。

通过图1可知：各处理对土壤中二氯喹啉酸的去除率都低于对水体中二氯喹啉酸的去除率，固定化菌剂去除率最高为76.3%。

空白小球和分散载体对二氯喹啉酸的去除率低，这主要是由于空白小球和分散载体只通过物理吸附的方式去除二氯喹啉酸，没有微生物参与降解作用。由于土壤中存在微生物竞争及对菌体的吞噬等原因导致游离菌体对二氯喹啉酸去除率低于其它几组处理，为47.3%。由于载体的存在，使得含菌载体、海藻酸钠固定菌剂、固定化菌剂这三组处理对二氯喹啉酸的去除率较前三组处理有所上升。在含菌载体处理中，菌体能吸附在载体上有利于生长，其降解率提高，但吸附能力有限、并不牢固。经海藻酸钠包埋的菌剂，由于联结方式比含菌载体的物理吸附能力强，为菌体的生长提供了有利条件，使降解率略高于含菌载体。菌剂对土壤中二氯喹啉酸的去除效果表现为：固定化菌剂>海藻酸钠固定菌剂>含菌载体>游离菌体>分散载体>空白小球。

同时，通过图1中的数据可知固定化菌剂对土壤中二氯喹啉酸的去除效果极大地优于海藻酸钠固定菌剂和含菌载体。且固定化菌剂的二氯喹啉酸的去除效果也高于游离菌体和空白小球去除效果之和，因而可以进一步证明本发明的方式具有显著的进步。

实施例3

本实施例采用实施例1中实例③组成比例制成的固定化菌剂，用其进行不同温度、不同初始pH浓度下二氯喹啉酸去除率的检测，检测方法为：将10%的固定化菌剂和3%的游离菌分别加入到含800mg/L二氯喹啉酸的MSM中，在140r/min的摇床上培养，间隔一定时间测定二氯喹啉酸含量。分别考察温度15℃、20℃、25℃、30℃、35℃，初始pH为4、5、6、7、8、9对降解效果的影响。考察温度的影响时，初始pH为7，考察初始pH时，温度为30℃，检测结果如图2和图3所示。

通过图2可知：

固定化菌剂在温度为30℃时降解率最大，达到88.3%。随着温度变化，降解率也呈现下降趋势，当温度为40℃时，降解率为71.2%；当温度为15℃时降解率为54.3%；在15-35℃时，降解率无显著差异(P＞0.05)；

游离菌体在温度低于或高于30℃时，降解率迅速下降，在温度15℃和40℃时降解率分别为27.5%和63.3%，温度对游离菌体的降解能力产生了极显著影响(P<0.05)；

总体而言，固定化菌剂在15-35℃范围时，具有较稳定的降解率，具有较宽的温度适应范围，但游离菌体对温度变化敏感，适应范围窄。

通过图3可知：

总体而言，在各初始pH条件下，固定化菌剂对二氯喹啉酸的降解率都高于游离菌体。固定化菌剂在初始pH=7时降解率最大，为91.3%，与固定菌剂相比较，游离菌体最适pH向碱性条件移动，最适pH为8，但降解率也仅仅只达到76.4%。产生上述效果的原因在于：由于固定后的菌体包埋在海藻酸钙中，缓解了酸性或碱性环境对菌体的毒害，从而提高酶活性。并且游离菌体在pH发生变化时，降解率受到显著影响，而固定化菌剂在初始pH为5-8时，降解率差异不显著(P>0.05)，因此通过本发明的固定方式，可增强菌株对酸碱变化的缓冲能力。

实施例4

本实施例采用实施例1中实例③组成比例制成的固定化菌剂，用其对不同状态下实际污水中的二氯喹啉酸进行检测。考察固定化菌剂对未经处理污水、灭菌污水、含二氯喹啉酸的MSM以及含二氯喹啉酸无菌水（蒸馏）四种类型的污水处理能力。

采集位于四川新津（30°25′17″N,103°55′8″E）污水收集池的废水作为未经处理污水进行实验，该污水中二氯喹啉酸的含量在127-134mgL^-1之间，COD含量为1600-1690mg/L之间，pH为6.3。MSM和无菌水中二氯喹啉酸的含量均设置为与污水相同。

本实施例同时考察游离菌体和空白小球的去除能力，该空白小球与固定化菌剂的区别仅仅在于：空白小球中不包含菌体母液。

本实施例中的固定化菌剂、游离菌体和空白小球均在温度为25℃，pH为7.0，140r/min的条件下培养6d后，计算对二氯喹啉酸的去除率。检测结果如图4所示。

通过图4可知：

在含二氯喹啉酸的MSM中，由于存在利于菌体生长的碳源及无机营养物质且无其它不利因素的存在，去除效率最高，固定菌剂和游离菌体对二氯喹啉酸的去除率分别为91.4%、75.8%。固定化菌剂和游离菌体对实际污水处理能力显著低于含二氯喹啉酸的MSM，对未经处理实际污水去除率分别为84.2%、64.4%。游离菌体对灭菌污水中二氯喹啉酸的去除效率高于未经处理实际污水，则可能是由于污水中存在一些与菌体存在竞争或毒害的微生物菌群。固定菌剂和游离菌体对含二氯喹啉酸无菌水去除能力最低，原因在于水体中缺少菌体生长的无机营养物质。空白小球对各类污水中二氯喹啉酸去除率都低于2%，这是由于载体中不含菌体，仅通过有限的吸附能力去除二氯喹啉酸。

在实际污水处理中，固定化菌剂对二氯喹啉酸的降解率下降了7.4%，游离菌体下降了15.7%，说明固定化菌剂抵抗实际污水中复杂化学成份的能力强于游离菌体，在水体原位修复中具有一定潜力。

固定化菌剂对各类污水中二氯喹啉酸的去除效果均优于游离菌体和空白小球。且固定化菌剂的二氯喹啉酸的去除效果也高于游离菌体和空白小球去除效果之和，因而可以证明本发明的固定方式具有显著的进步。

实施例5

本实施例是对实例③组成比例制成的固定化菌剂进行重复使用次数试验，具体试验方法为：为了考察固定化小球的重复使用能力，将其在未经处理的污水中使用6d，在含1000mg/L二氯喹啉酸的土壤中使用12d的固定化菌剂取出用灭菌生理盐水洗涤，再次加入到含相同浓度的污水和土壤中使用一个周期，重复利用5次，计算每1次的降解率，检测结果如图5所示。

通过图5可知：

随着固定化小球使用次数增加，处理水体的固定化小球与处理土壤的固定化小球降解率均呈下降趋势。处理水体的固定化小球，其降解能力下降速率较快，但在重复使用4次时仍保持在53.5%，当重复使用第5次时降解率下降到27.9%，且出现了大量漏菌现象，溶液混浊。处理土壤的固定化小球，由于其受到的溶液冲击力小于水体中的固定化小球，因此在重复使用第5次时降解率仍达到42.8%。

实施例6

本实施例中的菌株是从四川新津受二氯喹啉酸污染的农田土壤中分离到，通过个体及菌种形态、生理生化反应及做血清学反应鉴定，判定该菌株为施氏假单胞菌，因而命名为施氏假单胞菌PFS-4（PseudomonasstutzeriPFS-4）。

本实施例将菌株PFS-4以3%的量接种到浓度为800mg/L的二氯喹啉酸培养基中，在温度为25℃，pH为7，140r/min的条件下培养，测定其生长曲线以及对二氯喹啉酸的降解效果，测定结果如图6所示。

通过图6可知，经1d培养后，二氯喹啉酸降解率仅为3.7%，随着菌株进入对数生长期，生长量的增大、活性提高，降解率也随之增加，5d后菌株开始衰亡，降解速度下降，到6d时菌株对二氯喹啉酸降解率为74.3%，菌株生长量与菌株对二氯喹啉酸的降解率在1-5d呈显著正相关(r=0.97,p<0.05)。

采用本实施例的菌株PFS-4按照实施例1中实例③的组成比例制成固定化菌剂，接种量为10%。再分别考察空白小球、分散载体、游离菌体、含菌载体、海藻酸钠固定菌剂对土壤样中二氯喹啉酸去除效果，二氯喹啉酸去除效果的具体检测方法与实施例2相同，测定结果如图7所示，本发明固定化菌剂的最高降解率可达到74.3%。

实施例7

本实施例与实施例6的区别在于，菌种不同，本实施例中的菌株为从广东省微生物菌种保藏中心购买的短短芽孢杆菌，编号为GIM1.825。再分别考察空白小球、分散载体、游离菌体、含菌载体、海藻酸钠固定菌剂对土壤样中二氯喹啉酸去除效果，测定结果如图8所示，本发明固定化菌剂的最高降解率可达到80.2%。

实施例8

本实施例与实施例6的区别在于，菌种不同，本实施例中的菌株从四川新津受二氯喹啉酸污染的农田土壤中分离到，通过个体及菌种形态、生理生化反应及做血清学反应鉴定，判定该菌株为红球菌。再分别考察空白小球、分散载体、游离菌体、含菌载体、海藻酸钠固定菌剂对土壤样中二氯喹啉酸去除效果，测定结果如图9所示，本发明固定化菌剂的最高降解率可达到71.4%。

通过图7～图9可知：本发明的固定化方式不仅仅适用于施氏假单胞菌，还适用于红球菌和短短芽孢杆菌，本发明的固定方法应用在上述菌种上时，对促进二氯喹啉酸降解作用效果是十分明显的。本发明同时还购买了编号为GIM1.476的短短芽孢杆菌，采用该短短芽孢杆菌进行试验后得到的效果相同。本发明的固定化方法优选的适用于二氯喹啉酸降解菌株，但由于短短芽孢杆菌对多种污染物具有降解能力，因而可以推断本发明的固定化方法不仅仅只针对二氯喹啉酸降解菌株。

且通过图中数据进一步证明：载体培养基与海藻酸钠结合后对二氯喹啉酸的降解效果优于分别使用两种固定化方式进行二氯喹啉酸降解的效果，且固定化菌剂的二氯喹啉酸的去除效果高于游离菌体和空白小球去除效果之和，效果非常显著。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.海藻酸钠复合固定化菌剂，其特征在于，包括将具有菌体的载体培养基和海藻酸钠混合后，将其滴入氯化钙溶液中静置制成的颗粒剂。

2.根据权利要求1所述的海藻酸钠复合固定化菌剂，其特征在于，所述菌体为假单胞菌、红球菌或短短芽孢杆菌。

3.根据权利要求1所述的海藻酸钠复合固定化菌剂，其特征在于，所述海藻酸钠的质量浓度为2～6%，氯化钙溶液浓度为1～4%；静置时间为2～4h。

4.根据权利要求3所述的海藻酸钠复合固定化菌剂，其特征在于，所述氯化钙浓度为2～3%，载体培养基在氯化钙中的静置时间为3～4h。

5.根据权利要求3所述的海藻酸钠复合固定化菌剂，其特征在于，所述海藻酸钠的质量浓度为3～5%。

6.根据权利要求1～5任一项所述的海藻酸钠复合固定化菌剂，其特征在于，所述载体培养基包括吸附载体和液体培养基；该吸附载体与海藻酸钠的重量比为1～3∶1，该吸附载体由重量比为1∶1～2∶1的玉米芯、竹炭和油枯组成。

7.根据权利要求6所述的海藻酸钠复合固定化菌剂，其特征在于，所述玉米芯、竹炭和油枯的重量比为1∶2∶1；所述液体培养基为无机盐液体培养基。

8.采用权利要求1～7任一项所述的海藻酸钠复合固定化菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）载体培养基制备：分别制备吸附载体和液体培养基，混合后灭菌；

（2）菌体母液的制备和添加：获得具有菌体的母液，将母液混合到载体培养基中；

（3）固化：将海藻酸钠灭菌后与混合有菌体母液的载体培养基混合均匀，然后将其滴加入氯化钙中，静置后固化制成颗粒剂。

9.一种利用权利要求1～7任一项所述的海藻酸钠复合固定化菌剂降解二氯喹啉酸的用途。

10.根据权利要求9所述的海藻酸钠复合固定化菌剂降解二氯喹啉酸的用途，其特征在于：其适用温度为25℃～35℃，适用pH值为6～8。