CN115161279B - 用于培养胸腺类器官的培养基制备方法及胸腺类器官的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法及胸腺类器官的培养方法，旨在解决采用现有的培养基培养的人工胸腺类器官主要停留在T细胞发育早期阶段的问题。培养基制备方法，包括：将Pluronic F127、透明质酸和聚乙二醇采用超纯水共溶，搅拌形成微球形的凝胶；向凝胶内加入空气，使凝胶内均匀布满微米级气泡；静置使微米级气泡逐渐过度为纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，得到微气泡凝胶；将滋养细胞与微气泡凝胶按照体积比为1∶1‑1∶10的比例混合；所述滋养细胞包括两株体积比为1∶1‑1∶4的OP9‑DLL1细胞和MS5‑DLL1细胞；滋养细胞OP9‑DLL1、滋养细胞MS5‑DLL1与微气泡凝胶的结合，可以使T细胞的发育到达成熟的阶段。
Description
技术领域
本发明属于胸腺类器官培养技术领域，具体涉及一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法及胸腺类器官的培养方法。
背景技术
胸腺T细胞发育的场所。来源于骨髓(Bone marrow，BM)的共同淋巴祖细胞(Commonlymphoid progenitors，CLPs)随血液循环进入胸腺，在皮质胸腺上皮细胞(Corticalthymic epithelial cells，cTECs)和髓质胸腺上皮细胞(Medullary thymic epithelialcells，mTECs)指导下，经历T细胞受体-β(T cell receptor，TCR-β)选择、阳性选择(Positive selection)和阴性选择(Negative selection)等过程后分化为初始T细胞(Naive T cell)。
经典的T细胞二维培养方法既不能模拟cTECs和mTECs形成的三维(Three-dimensional，3D)结构，也不能完全满足正常T细胞发育对趋化因子和细胞因子的需求，因此无法培养出具有自身耐受性(Self-tolerant)和自身限制性(Self-restricted)的T细胞。
体外研究需要采用立体结构模拟胸腺基质的微结构。胸腺类器官在一定程度上重现了机体cTECs和mTECs的微环境，使T细胞的体外分化更贴近体内分化过程。胸腺类器官不仅能够长期传代培养，而且其表型和遗传学特性比二维培养产物更加稳定，在模拟器官组织的发生过程及生理病理状态方面优势突出。
现有的胸腺类器官培养方法是基于细胞系的细胞来构建，或者是利用来自动物模型的胸腺组织进行体外培养，整个过程较为复杂，所用的培养基中需要添加十几种的细胞因子、调控因子，均需要在使用时进行溶解配制，一方面容易产生污染和配制误差，另一方面，随着细胞生物学技术的发展以及新的细胞生长调控信号通路的发现，需要对原有的培养基配方进行持续改进，并且一般的培养基培养成功率较低(低于70％)、培养时间长(6～8周时间)，操作步骤繁琐。
发明内容
本发明提供了一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法及胸腺类器官的培养方法，旨在解决采用现有的培养基培养的人工胸腺类器官主要停留在T细胞发育早期阶段的问题。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法，包括：
S100、将Pluronic F127、透明质酸和聚乙二醇采用超纯水共溶，搅拌形成微球形的凝胶；
S200、向凝胶内加入空气，使凝胶内均匀布满微米级气泡；静置使微米级气泡逐渐过度为纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，得到微气泡凝胶；
S300、将滋养细胞与微气泡凝胶按照体积比为1:1-1:10的比例混合；
所述滋养细胞包括两株体积比为1:1-1:4的OP9-DLL1细胞和MS5-DLL1细胞。
进一步改进的方案：在步骤S100中，所述将Pluronic F127、透明质酸和聚乙二醇采用超纯水共溶的步骤具体包括：
将Pluronic F127用超纯水溶解得到Pluronic F127溶液；透明质酸用超纯水溶解得到透明质酸溶液；
将Pluronic F127溶液加入到透明质酸溶液中，然后用聚乙二醇400将PluronicF127、透明质酸和聚乙二醇400的总质量分数补足至100％；
其中，所述Pluronic F127的质量分数为5％-45％，所述透明质酸的质量分数为30％-60％；
所述质量分数为每100ml中所包含的克数。
进一步改进的方案：在步骤S100中，所述搅拌形成微球形的凝胶的步骤具体包括：300-1500g/min的搅拌速度磁力搅拌2小时，形成粒径大于100um的球形的凝胶。
进一步改进的方案：在步骤S200中，所述向凝胶内加入空气，使凝胶内均匀布满微米级气泡；静置使微米级气泡逐渐过度为纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，得到微气泡凝胶的步骤具体包括：
通过鼓泡法向凝胶内以100-250mL/min的气流速度加入空气2-8小时，使凝胶内均匀布满微米级气泡，静置10h-24h使微米级气泡逐渐过度为10-100nm的纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，形成空气饱和的微气泡凝胶。
进一步改进的方案：在步骤S200和步骤S300之间，还包括将微气泡凝胶导入搅拌池中以5000-10000g/min进行搅拌，使微气泡凝胶中气泡稳定的步骤。
进一步改进的方案：所述滋养细胞包括滋养细胞本体和用于培养滋养细胞的滋养细胞培养基。
进一步改进的方案：所述滋养细胞培养基为DMEM-F12培养基。
进一步改进的方案：所述OP9-DLL1细胞和MS5-DLL1细胞体积比为1:1、1:2、1:3或1:4。
第二方面，本发明提供了一种胸腺类器官的培养方法，包括以下步骤：
从人骨髓、小鼠骨髓或人脐带血中提取并依次经过磁珠细胞分选和流式细胞分选获取造血干细胞；
在transwell小室的上室放置第一方面任一方案所述的一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法制备的培养基，在transwell小室的下室放置滋养细胞培养基；
将造血干细胞在上室中的培养基上培养。
本发明的有益效果为：
本发明中将滋养细胞OP9-DLL1、滋养细胞MS5-DLL1与微气泡凝胶按一定比例混合，通过中微气泡凝胶纳米级气泡的缓释作用，产生模拟毛细血管网络的氧气弥散和营养物质补充，从而在体外模拟细胞在体内的增长环境，可以实现胸腺类器官的快速生长；滋养细胞OP9-DLL1、滋养细胞MS5-DLL1与微气泡凝胶的结合，可以使T细胞的发育到达成熟的阶段，具体表现为成熟的单阳T细胞(如CD4和CD8)增多，DN细胞即幼稚状态的T细胞(包括DN1-4阶段)较少。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简要介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关附图。
图1是滋养细胞分别为单独的MS5-DLL1和MS5-DLL1时，在滋养细胞与微气泡凝胶的混合培养基中，T细胞发育阶段的图。
图2是滋养细胞为体积比例分别为1:1、1:2和1:3的OP9-DLL1和MS5-DLL1细胞组合，并混入普通基质胶中得到的培养基，培养后的T细胞发育阶段的图。
图3是滋养细胞为体积比例分别为1:1、1:2和1:3的OP9-DLL1和MS5-DLL1细胞组合，并混入本发明制备的微气泡凝胶中得到的培养基，培养后的T细胞发育阶段的图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚完整的描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
骨髓(BM)中的细胞成分极为丰富，除了最原始的HSCs(造血祖细胞)，还有其分化的MPPs(多能祖细胞)、早期淋巴祖细胞(Earlylymphoidprogenitors，ELPs)、多能淋巴祖细胞(Lymphoid-primedmultipotentialprogenitors，LMPPs)、CLPs及CLP-2细胞等。以上祖细胞统称为循环T细胞祖细胞(CirculatingTcellprogenitors，CTPs)，它们不仅存在于BM，也会随血液循环进入胸腺定居。CTPs不仅有逐步发育为早期胸腺祖细胞(Earlythymicprogenitors，ETPs)、DN2细胞、DN3细胞、DP细胞和SPT细胞的潜力，甚至可以越过ETPs或DN2，进入胸腺细胞发育的下游阶段。为了使得T细胞进入胸腺细胞发育的下游阶段，本发明的培养基采用以下实施例制备而成。
实施例一：
本实施例提供了一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法，包括：
S100、将Pluronic F127、透明质酸和聚乙二醇采用超纯水共溶，搅拌形成微球形的凝胶；具体包括：
将Pluronic F127用超纯水溶解得到Pluronic F127溶液；透明质酸用超纯水溶解得到透明质酸溶液；
将Pluronic F127溶液加入到透明质酸溶液中，然后用聚乙二醇400将PluronicF127、透明质酸和聚乙二醇400的总质量分数补足至100％；
以300-1500g/min的搅拌速度磁力搅拌2小时，形成粒径大于100um的球形的凝胶。
其中，所述Pluronic F127的质量分数为5％-45％，所述透明质酸的质量分数为30％-60％；所述质量分数为每100ml中所包含的克数。
S200、向凝胶内加入空气，使凝胶内均匀布满微米级气泡；静置使微米级气泡逐渐过度为纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，得到微气泡凝胶；具体包括：
通过鼓泡法向凝胶内以100-250mL/min的气流速度加入空气2-8小时，使凝胶内均匀布满微米级气泡，静置10h-24h使微米级气泡逐渐过度为10-100nm的纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，形成空气饱和的微气泡凝胶。
S300、将滋养细胞与微气泡凝胶按照体积比为1:1-1:10的比例混合；具体体积比为可以为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。
所述滋养细胞包括两株体积比为1:1-1:4的OP9-DLL1细胞和MS5-DLL1细胞；具体的，所述OP9-DLL1细胞和MS5-DLL1细胞体积比可以为1:1、1:2、1:3或1:4。其中，OP9-DLL1细胞和MS5-DLL1细胞为转入了dll基因的小鼠骨髓基质细胞，使细胞能表达DLL蛋白，提供notch信号。
上述在计算体积比例时，所述滋养细胞的体积包括滋养细胞本体和用于培养滋养细胞的滋养细胞培养基一起的体积；所述滋养细胞培养基为DMEM-F12培养基；DMEM-F12培养基为现有培养基，其中一种具体的构成包括2％B27、30mML-抗坏血酸、1％青链霉素、1％谷氨酰胺、5ng/mlrmFLT3L、5ng/mlrmIL-7、10ng/mlrmSCF和0.05mMβ-巯基乙醇。
在上述方案的基础上，在步骤S200和步骤S300之间，还包括将微气泡凝胶导入搅拌池中以5000-10000g/min进行搅拌，使微气泡凝胶中气泡稳定的步骤。
实施例二：
本实施例提供了一种胸腺类器官的培养方法，包括以下步骤：
S1、从人骨髓、小鼠骨髓或人脐带血中提取并依次经过磁珠细胞分选和流式细胞分选获取造血干细胞；
其中，磁珠细胞分选和流式细胞分选均采用现有的细胞分选方法。
S2、在transwell小室的上室放置实施例一任一方案所述的一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法制备的培养基，在transwell小室的下室放置滋养细胞培养基；
S3、将造血干细胞在上室中的培养基上培养。
在培养过程中，每2天更换新鲜滋养细胞培养基。
下面结合试验数据对本发明做进一步说明：
本试验共建立六组，按照滋养细胞将培养基分组，分别为：
试验组1：滋养细胞OP9-DLL1与微气泡凝胶的混合培养基
试验组2：滋养细胞MS5-DLL1与微气泡凝胶的混合培养基
试验组3：体积比为1:1的MS5-DLL1和OP9-DLL1细胞组合，与普通基质胶(Matrigel基质胶)的混合培养基
试验组4：体积比为1:2的MS5-DLL1和OP9-DLL1细胞组合，与普通基质胶(Matrigel基质胶)的混合培养基
试验组5：体积比为1:3的MS5-DLL1和OP9-DLL1细胞组合，与普通基质胶(Matrigel基质胶)的混合培养基
试验组6：体积比为1:1的MS5-DLL1和OP9-DLL1细胞组合，与微气泡凝胶的混合培养基
试验组7：体积比为1:2的MS5-DLL1和OP9-DLL1细胞组合，与微气泡凝胶的混合培养基
试验组8：体积比为1:3的MS5-DLL1和OP9-DLL1细胞组合，与微气泡凝胶的混合培养基
试验步骤：
S1、从4-8周的健康C57BL/6小鼠骨髓中提取并依次经过磁珠细胞分选和流式细胞分选获取造血干细胞；
S2、在transwell小室的上室放置各实验组的混合培养基，在transwell小室的下室放置滋养细胞培养基；
S3、将造血干细胞加入不同试验组的混合培养基中培养，并采用气液法培养胸腺类器官，培养周期为6周，每周对数据进行监测。
监测数据如图1至图3：
图1中的A为将造血干细胞在滋养细胞OP9-DLL1与微气泡凝胶的混合培养基中培养后的T细胞发育阶段的图；可以看出T细胞更多地停滞在T细胞发育的DN2阶段(双阴T细胞)。
图1中的B为将造血干细胞在滋养细胞MS5-DLL1与微气泡凝胶的混合培养基中培养后的T细胞发育阶段的图；可以看出T细胞更多地停滞在T细胞发育的DN4阶段。
图2中体积比例分别为1:1、1:2和1:3的MS5-DLL1和OP9-DLL1细胞组合，并混入普通基质胶中得到的培养基，将造血干细胞混入该培养基中，培养后的T细胞发育阶段的图；可以看出T细胞的发育更倾向于幼稚状态(DN2更多)，不利于后期成熟T细胞的运用。
图3体积比例分别为1:1、1:2和1:3的MS5-DLL1和OP9-DLL1细胞组合，并混入本发明制备的微气泡凝胶中得到的培养基，将造血干细胞混入该培养基中，培养后的T细胞发育阶段的图；可以看出T细胞的发育呈现了更多的成熟趋势，表现为成熟的单阳T细胞如CD4和CD8增多，DN细胞即幼稚状态的T细胞(包括DN1-4阶段)较少。
上述试验中，培养周期为6周，每周对数据进行监测；纵坐标为得到的胸腺类器官中不成熟T细胞(DNT：MDLL1-CD45+TCR+βCD3+细胞)在整个胸腺类器官细胞群中的比例，体现了不同组别获得产物(DNT)的差异。
综上可以看出，采用滋养细胞OP9-DLL1、滋养细胞MS5-DLL1与微气泡凝胶按照本发明设定比例的结合，T细胞的发育呈现了更多的成熟趋势，有利于后期成熟T细胞的运用。
本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法，其特征在于，包括：
S100、将Pluronic F127、透明质酸和聚乙二醇采用超纯水共溶，搅拌形成微球形的凝胶；
S200、向凝胶内加入空气，使凝胶内均匀布满微米级气泡；静置使微米级气泡逐渐过度为纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，得到微气泡凝胶；
S300、将滋养细胞与微气泡凝胶按照体积比为1:1-1:10的比例混合；
所述滋养细胞包括两株体积比为1:1-1:4的OP9-DLL1细胞和MS5-DLL1细胞；
在步骤S100中，所述将Pluronic F127、透明质酸和聚乙二醇采用超纯水共溶的步骤具体包括：
将Pluronic F127用超纯水溶解得到Pluronic F127溶液；透明质酸用超纯水溶解得到透明质酸溶液；
将Pluronic F127溶液加入到透明质酸溶液中，然后用聚乙二醇400将Pluronic F127、透明质酸和聚乙二醇400的总质量分数补足至100%；
其中，所述Pluronic F127的质量分数为5%-45%，所述透明质酸的质量分数为30%-60%；
所述质量分数为每100ml中所包含的克数；
在步骤S100中，所述搅拌形成微球形的凝胶的步骤具体包括：300-1500g/min的搅拌速度磁力搅拌2小时，形成粒径大于100um的球形的凝胶；
在步骤S200中，所述向凝胶内加入空气，使凝胶内均匀布满微米级气泡；静置使微米级气泡逐渐过度为纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，得到微气泡凝胶的步骤具体包括：
通过鼓泡法向凝胶内以100-250mL/min的气流速度加入空气2-8小时，使凝胶内均匀布满微米级气泡，静置10h-24h使微米级气泡逐渐过度为10-100nm的纳米级气泡，并使得纳米级气泡稳定储存于凝胶中，形成空气饱和的微气泡凝胶；
在步骤S200和步骤S300之间，还包括将微气泡凝胶导入搅拌池中以5000-10000g/min进行搅拌，使微气泡凝胶中气泡稳定的步骤。
2.根据权利要求1所述的一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法，其特征在于，所述滋养细胞包括滋养细胞本体和用于培养滋养细胞的滋养细胞培养基。
3.根据权利要求2所述的一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法，其特征在于，所述滋养细胞培养基为DMEM-F12培养基。
4.根据权利要求1所述的一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法，其特征在于，所述OP9-DLL1细胞和MS5-DLL1细胞体积比为1:1、1:2、1:3或1:4。
5.一种胸腺类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
从人骨髓、小鼠骨髓或人脐带血中提取并依次经过磁珠细胞分选和流式细胞分选获取造血干细胞；
在transwell小室的上室放置权利要求1-4任一所述的一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法制备的培养基，在transwell小室的下室放置滋养细胞培养基；
将造血干细胞在上室中权利要求1-4任一所述的一种用于培养胸腺类器官的培养基制备方法制备的培养基上培养。
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