CN114561348A

CN114561348A - 一种用于干细胞大规模培养的可溶性微载体

Info

Publication number: CN114561348A
Application number: CN202210199031.9A
Authority: CN
Inventors: 杨晓晨
Original assignee: Beijing Shengmei Cell Life Science Engineering Research Institute Co ltd
Current assignee: Beijing Shengmei Cell Life Science Engineering Research Institute Co ltd
Priority date: 2022-03-02
Filing date: 2022-03-02
Publication date: 2022-05-31

Abstract

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种用于干细胞大规模培养的可溶性微载体，包含以下原料：胶原蛋白、L‑谷氨酰胺、硫酸镁，氯化钙、氯化钾、丙酮酸钠、D‑葡萄糖、碳酸氢钠、氯化钙、L‑甲硫氨酸、羟乙基哌嗪乙磺酸和水；制备方法：将各组分按配比加入水中，加热溶解，充分搅拌，直至所有成分完全溶解，形成半凝胶；通过微流道向半凝胶中通入等量空气，形成均一气泡，至气泡充满材料；半凝胶完全凝固，穿透贯通半凝胶内气泡，形成规格排列的微米多孔结构。本发明可溶性微载体能够很好的支持干细胞贴附生长，为干细胞提供足够大的生长表面积，减少培养过程中细胞受到的剪切力，简化最终的细胞回收过程，保证最终回收得到高质量的干细胞。

Description

一种用于干细胞大规模培养的可溶性微载体

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种用于干细胞大规模培养的可溶性微载体。

背景技术

干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始细胞，可以分化形成各种功能细胞及组织器官。干细胞在医疗领域具有广泛的作用，可通过高活性干细胞的回输来激活人体自身的“自愈功能”，对病变的细胞进行补充与调控，激活细胞功能，增加正常细胞的数量，提高细胞的活性，改善细胞的质量，防止和延缓细胞的病变，恢复细胞的正常生理功能，从而达到疾病康复、对抗衰老的目的。

临床上干细胞使用量较大，传统培养方式难以在短时间内获得大批量高活性的干细胞。目前多采用生物反应器进行干细胞的大规模扩增，但目前常用微载体在干细胞培养过程中常常面临一些问题：

1)细胞培养过程中所受剪切力较大；

2)干细胞回收困难；

3)微载体提供的生长表面积有限。

有鉴于此，有必要提供一种新的用于干细胞大规模培养的可溶性微载体。

发明内容

本发明的目的在于克服传统技术中存在的至少一个上述问题，提供一种用于干细胞大规模培养的可溶性微载体。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现：

一种用于干细胞大规模培养的可溶性微载体，该可溶性微载体包含以下原料：胶原蛋白、L-谷氨酰胺、硫酸镁，氯化钙、氯化钾、丙酮酸钠、D-葡萄糖、碳酸氢钠、氯化钙、L-甲硫氨酸、羟乙基哌嗪乙磺酸和水。

进一步地，所述可溶性微载体包含以下百分比的原料：10％～30％的胶原蛋白、0.001％～0.1％的L-谷氨酰胺、0.001％～0.1％的硫酸镁，0.005％～0.2％的氯化钙、0.01％～0.5％的氯化钾、0.01％～0.5％的丙酮酸钠、0.1％～1％的D-葡萄糖、0.1％～5％的碳酸氢钠、0.1％～5％氯化钙、0.01％～0.5％的L-甲硫氨酸和0.1％～5％的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，余量为水。

进一步地，所述可溶性微载体的粒径为500～800μm。

进一步地，所述可溶性微载体的内部呈有规格排列的微米多孔结构。

进一步地，所述可溶性微载体能够被胰蛋白酶消化溶解。

进一步地，所述胶原蛋白是通过微生物发酵法制备获得。

进一步地，所述可溶性微载体的制备方法包括如下步骤：

1)将胶原蛋白、L-谷氨酰胺、硫酸镁，氯化钙、氯化钾、丙酮酸钠、D-葡萄糖、碳酸氢钠、氯化钙、L-甲硫氨酸、羟乙基哌嗪乙磺酸按配比加入水中，加热溶解，充分搅拌，直至所有成分完全溶解，形成半凝胶；

2)通过微流道间歇式向步骤1)得到的半凝胶中通入等量空气，形成均一气泡，气泡充满材料后停止通气；

3)等待半凝胶完全凝固，穿透贯通半凝胶内气泡，形成规格排列的微米多孔结构。

进一步地，步骤1)中，所述加热溶解的温度为130℃。

进一步地，步骤2)中，所述微流道为直径3～5μm的管道。

进一步地，步骤3)中，所述穿透贯通半凝胶内气泡的具体操作为：使用直径50～150μm的穿刺针进行交叉穿刺，贯通半凝胶内气泡。

本发明的有益效果是：

本发明提供一种用于干细胞大规模培养的可溶性微载体，可溶性微载体中胶原蛋白能够促进哺乳类动物细胞的贴附及生长；可溶性微载体中微米多孔结构为细胞生长提供了大量的生长表面积，达到4500cm²～6000cm²/g；细胞在微载体内部进行生长，大大减小了生物反应器培养过程中搅拌引起的剪切力对细胞的影响，简化最终的细胞回收过程，保证最终回收得到高质量的干细胞。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上的所有优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是实施例1中可溶性微载体的电子显微镜示意图；

图2是实施例1中干细胞在可溶性微载体的40倍显微镜生长图；

图3是实施例1中可溶性微载体和细胞的40倍显微镜消化图；

图4是实施例1中Cytodex-1和细胞的40倍显微镜消化图；

图5是实施例1中干细胞在不同微载体上的增值曲线图；

图6是实施例1中干细胞的流式细胞仪检测结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

一种用于干细胞大规模培养的可溶性微载体，所述可溶性微载体包含以下百分比的原料：10％～30％的胶原蛋白、0.001％～0.1％的L-谷氨酰胺、0.001％～0.1％的硫酸镁，0.005％～0.2％的氯化钙、0.01％～0.5％的氯化钾、0.01％～0.5％的丙酮酸钠、0.1％～1％的D-葡萄糖、0.1％～5％的碳酸氢钠、0.1％～5％氯化钙、0.01％～0.5％的L-甲硫氨酸和0.1％～5％的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，余量为水。

可溶性微载体的粒径为500～800μm。可溶性微载体的内部呈有规格排列的微米多孔结构。

其中，胶原蛋白是通过微生物发酵法制备获得，胶原蛋白能够促进哺乳类动物细胞的贴附及生长。可溶性微载体能够被胰蛋白酶消化溶解。4-羟乙基哌嗪乙磺酸具有缓冲作用，在细胞由微载体上消化下来后，保护细胞，避免细胞被过度消化。

上述可溶性微载体的制备方法包括如下步骤：

1)将胶原蛋白、L-谷氨酰胺、硫酸镁，氯化钙、氯化钾、丙酮酸钠、D-葡萄糖、碳酸氢钠、氯化钙、L-甲硫氨酸、羟乙基哌嗪乙磺酸按配比加入水中，在130℃调节下加热溶解，充分搅拌，直至所有成分完全溶解，形成半凝胶；

2)通过微流道间歇式向步骤1)得到的半凝胶中通入等量空气，形成均一气泡，气泡充满材料后停止通气；微流道为直径3～5μm的管道；

3)等待半凝胶完全凝固，穿透贯通半凝胶内气泡，形成规格排列的微米多孔结构。穿透贯通半凝胶内气泡的具体操作为：使用直径50～150μm的穿刺针进行交叉穿刺，贯通半凝胶内气泡。

本发明的具体实施例如下：

实施例1

间充质干细胞的获得

S1.准备好细胞培养相关材料及可溶性微载体，可溶性微载体尺寸为600μm，主要成分为：胶原蛋白20％，L-谷氨酰胺0.05％，硫酸镁0.05％，氯化钙0.1％，氯化钾0.25％，丙酮酸钠0.25％，D-葡萄糖0.5％，碳酸氢钠2.5％，氯化钙2.5％，L-甲硫氨酸0.25％，4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.5％；余量为水。制成的可溶性微载体结构如图1所示。

S2.将可溶性微载体用PBS浸润4小时，备用。

S3.使用细胞培养基MSCSFM(Gibco)对可溶性微载体进行预孵处理，过夜。

S4.将复苏的间充质干细胞接种于合适规格的T-flask中，待细胞生长至80％-90％时(如图2所示)，PBS清洗2遍，使用重组胰酶将细胞消化为单细胞悬液，使用胰酶抑制剂终止消化，1000rpm离心5分钟，使用培养基MSCSFM(Gibco)重悬，然后按照1×10⁵/ml的接种量接种于载有预处理微载体的Eppendorf-320生物反应器罐体中。

S5.间充质干细胞接种之后，通过生物反应器控制搅拌，搅拌10分钟，停止40分钟为一个循环，循环5次，然后正常搅拌，转速控制为50rpm；

S6.定时取样，通过葡萄糖试剂盒检测糖浓度，根据葡萄糖消耗速度，控制培养基灌流速度，保证反应器内糖浓度在1.3g/L以上；

S7.于6天后，回收所有微载体，用胰蛋白酶进行消化，收获间充质干细胞。

对照例：

以上实验条件均相同的情况下，将一种用于干细胞大规模培养的可溶性微载体替换为Cytodex-1，进行对照实验。

实验结果：细胞/微载体消化溶解见图3、图4，生长曲线见图5，本次实验细胞生长曲线呈类“S”形曲线，符合细胞生长规律，最终扩增10倍，扩增效率相较于Cytodex-1有较大优势，且最终回收过程中可溶性微载体全部溶解，方便细胞回收。

实验例2

免疫表型检测

收集使用实施例一中可溶性微载体培养收获的干细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml，加入抗体，室温避光孵育30mins。孵育完成后，以1000rpm/min离心5mins，弃去上清。每管加入2ml含1％胎牛血清的PBS，涡旋混匀，以1000rpm/min离心5mins，弃去上清，每管加入0.5mlPBS涡旋混匀，1h内上机检测。

如图6所示，流式细胞仪检测结果表示，使用可溶性微载体扩增培养出的干细胞表达CD90(99.2％)、CD105(99.4％)，不表达CD45、CD34、符合干细胞的表型特征，表面抗原表达无统计学差异(P>0.05)。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims

1.一种用于干细胞大规模培养的可溶性微载体，其特征在于，该可溶性微载体包含以下原料：胶原蛋白、L-谷氨酰胺、硫酸镁，氯化钙、氯化钾、丙酮酸钠、D-葡萄糖、碳酸氢钠、氯化钙、L-甲硫氨酸、羟乙基哌嗪乙磺酸和水。

2.根据权利要求1所述的可溶性微载体，其特征在于，所述可溶性微载体包含以下百分比的原料：10％～30％的胶原蛋白、0.001％～0.1％的L-谷氨酰胺、0.001％～0.1％的硫酸镁，0.005％～0.2％的氯化钙、0.01％～0.5％的氯化钾、0.01％～0.5％的丙酮酸钠、0.1％～1％的D-葡萄糖、0.1％～5％的碳酸氢钠、0.1％～5％氯化钙、0.01％～0.5％的L-甲硫氨酸和0.1％～5％的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，余量为水。

3.根据权利要求1所述的可溶性微载体，其特征在于：所述可溶性微载体的粒径为500～800μm。

4.根据权利要求1所述的可溶性微载体，其特征在于：所述可溶性微载体的内部呈有规格排列的微米多孔结构。

5.根据权利要求1所述的可溶性微载体，其特征在于：所述可溶性微载体能够被胰蛋白酶消化溶解。

6.根据权利要求1所述的可溶性微载体，其特征在于：所述胶原蛋白是通过微生物发酵法制备获得。

7.根据权利要求1-6任一项所述的可溶性微载体，其特征在于：所述可溶性微载体的制备方法包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的可溶性微载体，其特征在于：步骤1)中，所述加热溶解的温度为130℃。

9.根据权利要求7所述的可溶性微载体，其特征在于：步骤2)中，所述微流道为直径3～5μm的管道。

10.根据权利要求7所述的可溶性微载体，其特征在于：步骤3)中，所述穿透贯通半凝胶内气泡的具体操作为：使用直径50～150μm的穿刺针进行交叉穿刺，贯通半凝胶内气泡。