CN108641997A - 一种多孔plga微载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多孔PLGA微载体及其制备方法和应用，属于生物制药领域。该多孔PLGA微载体的分子量为10000～100000，粒径为50～300μm，表面和内部具有相互连通的孔洞，所述孔洞的孔径为5～40μm，孔洞率为35～82％。本发明的制备方法为气体发泡和乳化溶剂蒸发法，其步骤为：气体发泡剂水溶液与生物可降解高分子PLGA有机溶剂经机械搅拌和高速均质后，形成稳定的油包水乳液，将其滴加入含有表面活性剂的外水相中，然后以一定速率机械搅拌，收集微载体，离心清洗数次，最后冷冻干燥即得多孔PLGA微载体。本发明的制备方法具有简单高效、制备条件温和、成本低廉、微载体结构可控、适合工业化生产等诸多优点。本发明的多孔PLGA微载体适合于多种贴壁细胞的悬浮培养，具有广阔的市场前景。

Description

一种多孔PLGA微载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，特别涉及一种基于多孔PLGA微载体及其制备方法和应用。
背景技术
微载体是一种能在立体空间支持贴壁型细胞在其表面黏附、生长及代谢的球形颗粒，基于这种载体可以用于研究贴壁型细胞的结构、功能及分化，还可以用于大规模生产一些生物医药，如疫苗、抗体、白细胞介素、重组蛋白、激素及酶类等多种生物制品。动物细胞生物反应器微载体培养技术是当前生物制药领域的领先技术。微载体具有较大的表面积/体积比率，增加了细胞黏附生长的面积，减少了细胞培养所占的空间，有利于细胞的大规模培养，且细胞传代时避免了胰酶对细胞带来的损伤，只需要添加新的微载体即可。此外，利用动物细胞生产的疫苗、干扰素、蛋白、激素等初产物经过了翻译后蛋白的折叠、糖基化修饰、大分子的组装等生物功能化过程，相对于利用传统的酵母等真菌悬浮培养体系生产的产物具有更低的免疫原性。
DEAE-Sephadex A50是1967年首次用于贴壁细胞培养的微载体，此后细胞培养用微载体发展越来越快，至今已有十几种微载体用于动物细胞悬浮培养。如常用的葡聚糖微载体、壳聚糖微载体、纤维素微载体、明胶微载体、聚苯乙烯微载体等。国外已有部分微载体实现产业化生产，如GE公司的Cytodex系列产品、Cytopore、Cytoline等，这些产品在应用过程中也取得了比较好的效果。Goh等人将人间充质干细胞培养于悬浮微载体(Cytodex 3)和传统的单层平面培养体系，结果表明Cytodex 3体系中人间充质干细胞能获得更多的细胞数目且表现出更好的成骨潜能(Goh TKP,Zhang ZY,Chen AK L,et al.BioResearch openaccess,2013,2(2)：84-97.)。Tharmalingam等将Cytopore用于中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的悬浮培养生产β-IFN和t-PA，这种微载体为细胞提供了更多的生存空间并影响了细胞生长的状态，从而有利于产物的合成和分泌(Tharmalingam T,Sunley K,Spearman M,etal.Mol biotechnol,2011,49(3)：263-276.)。目前，利用微载体进行动物细胞大规模培养是发展的趋势，国外已经普遍使用微载体生物反应器生产医用生物制品，我国大部分医用生物制品依赖于国外进口，而且价格昂贵，有时出现供不应求状态。虽然国内已经使用传统的转瓶培养体系生产疫苗等生物制品，但因生产成本高、产值低、产品不稳定等多种问题，因此无法提高产品竞争力，只有大力发展动物细胞生物反应器微载体培养技术才能解决眼前的难题，而微载体的设计和制备是其成功的关键因素。
聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)为制备细胞微载体提供了一个非常好的选择。它具有优良的生物相容性、良好的机械性能、生物可降解性和可吸收性，在组织工程领域、药物缓释载体等领域具有广泛的应用(Pan Z,Ding J,Interface focus,2012,2(3)：366-377；Danhier F,Ansorena E,Silva J M,et al.J control release,2012,161(2)：505-522.)，已被美国食品药品监督管理局(FDA)认证通过。将其制备成多孔PLGA微载体应用于细胞微载体将具有非常广阔的前景，其多孔性为细胞的生长提供高比表面积、气体和营养液的传质以及细胞代谢废物的排出，并且通过控制工艺过程可以调节微载体尺寸、孔径大小和孔洞率，满足不同细胞、不同应用的需要。此外，多孔PLGA微载体还可对其表面进行特异性修饰提高其生物亲和性。目前，制备多孔微载体的方法主要有相分离法、致孔剂法、喷雾干燥法、双嵌段共聚法等，但这些方法制备多孔微载体的过程过于复杂，工艺条件很难掌握，而且对设备要求较高。专利CN 102728287A通过乳化溶剂蒸发法制备了一种表面多孔的PLGA微载体，微载体表面形成的孔孔径太小，不适合用作细胞微载体，且制备过程中使用的油相和水相表面活性剂较难去除。因此，采取一种新型方法制备多孔PLGA微载体用作细胞微载体非常必要。
发明内容
本发明针对现有技术中的PLGA微载体无孔洞或孔洞的孔径过小、制备过程复杂、杂质难以去除等问题，提供一种多孔PLGA微载体及其制备方法和应用。本发明的多孔PLGA微载体外观形貌规整、分散均匀，孔径大小适合贴壁性细胞进行三维培养，且制备方法简单高效，制备条件温和，对设备没有过高的要求，能够通过改变工艺条件有效控制多孔PLGA微载体的结构，适合于大规模工业化生产。
本发明提供一种多孔PLGA微载体，分子量为10000～100000，其形状为球形，粒径为50～300μm，其表面和内部具有相互联通的孔洞，所述孔洞的孔径为5～40μm，孔洞率为35～82％。
所述多孔PLGA微载体的粒径优选184.5～235μm，更优选为212.8～220μm。
所述孔洞的孔径优选为8～34μm，更优选为18～34μm，当所述孔洞为不规则形状时，其孔径指的是平均直径。
所述孔洞率优选为44～72％，更优选为48～65％。
其中，所述多孔PLGA微载体的粒径、孔径以及孔洞率的数值为均值，如本领域技术人员公知，其均有一定的标准差，例如所述微载体粒径的标准偏差可为15～25.2μm，所述孔径的标准偏差为4～6μm，所述孔洞率的标准偏差为4～8％。
上述任一种多孔PLGA微载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)将内水相与油相混合，进行机械搅拌后采用均质机高速均质，得到油包水(W1/O)初乳液；所述内水相为含有发泡剂的水溶液，所述油相为含有PLGA和有机溶剂的混合溶液；
(2)将所述油包水(W1/O)初乳液缓慢滴加至外水相中，机械搅拌乳化得到水包油包水(W1/O/W2)复乳液，所述外水相为聚乙烯醇水溶液；
(3)将所述水包油包水(W1/O/W2)复乳液在10～35℃温度下搅拌2～24h，离心收集，用去离子水清洗数次，冷冻干燥，即得多孔PLGA微载体。
步骤(1)的操作可为本领域常规。优选地，所述内水相与油相的体积比为1：3～1：6；优选地，所述发泡剂为碳酸钠、碳酸氢钠和碳酸氢铵中的一种或多种；优选地，所述有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷和丙酮中的一种或多种；优选地，所述机械搅拌转速为200～1000rpm，搅拌时间为3～15min；优选地，所述高速均质机转速为5000～20000rpm，均质时间为1～10min；优选地，所述发泡剂的浓度为2～10％(W/V)，所述PLGA的浓度为20～80mg/mL，PLGA中LA与GA的摩尔比为50：50～85：15。
步骤(2)中，任选地，所述油包水(W1/O)初乳液与外水相体积比为1：50～1：80；任选地，所述聚乙烯醇的浓度为0.5％～3％(W/V)；任选地，所述机械搅拌的转速为300～1000rpm。
上述孔洞形成原理：水包油包水(W1/O/W2)复乳液在一定温度下搅拌2～24h，有机溶剂挥发，乳滴固化成球，其中发泡剂分解，产生的气体在球形PLGA微载体中形成表面和内部相互连通的微孔结构。
本发明还提供一种上述多孔PLGA微载体在细胞三维培养中的应用，所述细胞优选贴壁性细胞，更优选L-02肝细胞、人胚胎干细胞、中国仓鼠卵巢细胞、乳仓鼠肾细胞、非洲绿猴肾细胞。
所述细胞三维培养包括如下步骤：
(1)使用6～9kGy辐照强度的60Coγ射线照射多孔PLGA微载体24小时；
(2)将灭菌后的多孔PLGA微载体用磷酸盐缓冲液清洗，置于4℃的胎牛血清中；
(3)进一步用磷酸盐缓冲液清洗，将细胞接种于多孔PLGA微载体上进行细胞三维培养。
优选地，所述多孔PLGA微载体的浓度为5～20mg/mL；
优选地，所述细胞接种密度为2～6×105cell/mL。
本发明的多孔PLGA微载体为球形，形貌规整、分散均匀，其表面和内部具有相互连通的孔洞，孔洞的尺寸、孔洞率、多孔PLGA微载体的粒径可根据工艺条件的改变而调整。本发明的制备方法条件温和、工艺简单高效，可实现大批量工业化生产。利用本发明的微载体培养细胞，生物相容性良好，可以有效促进细胞在微载体上黏附生长和保持细胞形态，满足细胞高活性、高密度的生长，并在三维空间形成有效的细胞-细胞连接，实现真正的三维培养，有效地模拟体内环境，更好地保持细胞的活力与功能，同时充分利用多孔微载体内部空间还有望提高细胞产量。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
附图说明：
图1为本发明的多孔PLGA微载体制备方法流程示意图；
图2为本发明实施例1所制备的多孔PLGA微载体的扫描电子显微镜图片；
图3为本发明实施例2所制备的多孔PLGA微载体的扫描电子显微镜图片；
图4为本发明实施例3所制备的多孔PLGA微载体的扫描电子显微镜图片；
图5为本发明实施例4所制备的多孔PLGA微载体的扫描电子显微镜图片；
图6为本发明实施例5所制备的多孔PLGA微载体的扫描电子显微镜图片；
图7为本发明实施例6所制备的多孔PLGA微载体的扫描电子显微镜图片；
图8为应用实施例1(a)中细胞在多孔PLGA微载体黏附生长24h的光学显微镜图片。
图9为应用实施例1(b)中细胞毒性测试结果；
图10为应用实施例1(c)中溶血率测试结果。
具体实施方式
下面通过附图以及具体实施例对本申请技术方案做详细的说明，应当理解本申请实施例以及实施例中的具体特征是对本申请技术方案的详细的说明，而不是对本申请技术方案的限定，在不冲突的情况下，本申请实施例以及实施例中的技术特征可以相互结合。
实施例1多孔PLGA微载体的制备
1、称取0.0775g碳酸氢铵溶于1.55mL去离子水中，配制成5％(W/V)的气体发泡剂作为内水相；
2、称取0.25gPLGA(分子量为40000，LA：GA＝50：50)溶于5mL二氯甲烷中，配制成50mg/mL的PLGA溶液作为油相；
3、将步骤1制备的碳酸氢铵水溶液加入至步骤2的PLGA油相溶液中，先500rpm机械搅拌10min，然后使用高速均质机10000rpm均质3min，得到油包水(W1/O)初乳液，其中内水相与油相的体积比为1：3.2；
4、称取4.5gPVA1788加入到300mL去离子水中，加热溶解得到1.5％(W/V)的PVA水溶液作为外水相；
5、将步骤3中的初乳液缓慢滴加到步骤4的外水相溶液中，20℃，600rpm机械搅拌进行乳化，得到水包油包水(W1/O/W2)复乳液，继续搅拌5h，乳液固化形成白色微载体，其中初乳液与外水相的体积比为1：60；
6、离心清洗收集微载体后，用去离子水离心清洗3次，冷冻干燥保存备用。
根据图2的扫描电子显微镜(SEM)结果所示，本实施例制备的多孔PLGA微载体为多孔微载体形态，微载体的平均粒径为220.0±22.5μm；平均孔径为8±4μm，孔洞率为44±5％。
实施例2多孔PLGA微载体的制备
1、称取0.11g碳酸氢钠溶于2.0mL去离子水中，配制成5.5％(W/V)的气体发泡剂作为内水相；
2、称取0.3gPLGA(分子量为40000，LA：GA＝50：50)溶于6mL二氯甲烷中，配制成50mg/mL的PLGA溶液作为油相；
3、将步骤1制备的碳酸氢钠水溶液加入至步骤2的PLGA油相溶液中，先600rpm机械搅拌5min，然后使用高速均质机12000rpm均质3min，得到油包水(W1/O)初乳液，其中内水相与油相的体积比为1：3；
4、称取5.4gPVA1788加入到360mL去离子水中，加热溶解得到1.5％(W/V)的PVA水溶液作为外水相；
5、将步骤3中的初乳液缓慢滴加到步骤4的外水相溶液中，25℃，560rpm机械搅拌进行乳化，得到水包油包水(W1/O/W2)复乳液，继续搅拌6h，乳液固化形成白色微载体，其中初乳液与外水相的体积比为1：60；
6、离心清洗收集微载体后，用去离子水离心清洗3次，冷冻干燥保存备用。
根据图3的扫描电子显微镜(SEM)结果所示，本实施例制备的多孔PLGA微载体为多孔微载体形态，微载体的平均粒径为235.5±20.0μm；平均孔径为10±4μm，孔洞率为48±6％。
实施例3多孔PLGA微载体的制备
1、称取0.072g碳酸钠溶于1.8mL去离子水中，配制成4％(W/V)的气体发泡剂作为内水相；
2、称取0.252gPLGA(分子量为40000，LA：GA＝75：25)溶于6.3mL二氯甲烷中，配制成40mg/mL的PLGA溶液作为油相；
3、将步骤1制备的碳酸氢钠水溶液加入至步骤2的PLGA油相溶液中，先400rpm机械搅拌8min，然后使用高速均质机10000rpm均质1min，得到油包水(W1/O)初乳液，其中内水相与油相的体积比为1：3.5；
4、称取3.6gPVA1788加入到360mL去离子水中，加热溶解得到1％(W/V)的PVA水溶液作为外水相；
5、将步骤3中的初乳液缓慢滴加到步骤4的外水相溶液中，22℃，600rpm机械搅拌进行乳化，得到水包油包水(W1/O/W2)复乳液，继续搅拌6h，乳液固化形成白色微载体，其中初乳液与外水相的体积比为1：57。
6、离心清洗收集微载体后，用去离子水离心清洗3次，冷冻干燥保存备用；
根据图4的扫描电子显微镜(SEM)结果所示，本实施例制备的多孔PLGA微载体为多孔微载体形态，微载体的平均粒径为195.8±18.5μm；平均孔径为18±5μm，孔洞率为48±4％。
实施例4多孔PLGA微载体的制备
1、称取0.13g碳酸钠溶于2.0mL去离子水中，配制成6.5％(W/V)的气体发泡剂作为内水相；
2、称取0.24gPLGA(分子量为40000，LA：GA＝75：25)溶于6mL二氯甲烷中，配制成40mg/mL的PLGA溶液作为油相；
3、将步骤1制备的碳酸钠水溶液加入至步骤2的PLGA油相溶液中，先550rpm机械搅拌5min，然后使用高速均质机10000rpm均质2min，得到油包水(W1/O)初乳液，其中内水相与油相的体积比为1：3；
4、称取4.5gPVA1799加入到300mL去离子水中，加热溶解得到1.5％(W/V)的PVA水溶液作为外水相；
5、将步骤3中的初乳液缓慢滴加到步骤4的外水相溶液中，25℃，650rpm机械搅拌进行乳化，得到水包油包水(W1/O/W2)复乳液，继续搅拌6h，乳液固化成白色微载体，其中初乳液与外水相的体积比为1：50；
6、离心清洗收集微载体后，用去离子水离心清洗3次，冷冻干燥保存备用。
根据图5的扫描电子显微镜(SEM)结果所示，本实施例制备的多孔PLGA微载体为多孔微载体形态，微载体的平均粒径为215.6±22.4μm；平均孔径为20±6μm，孔洞率为55±5％。
实施例5多孔PLGA微载体的制备
1、称取0.12g碳酸氢铵溶于1.5mL去离子水中，配制成8％(W/V)的气体发泡剂作为内水相；
2、称取0.257gPLGA(分子量为20000，LA：GA＝50：50)溶于5.7mL二氯甲烷中，配制成45mg/mL的PLGA溶液作为油相；
3、将步骤1制备的碳酸氢钠水溶液加入至步骤2的PLGA油相溶液中，先350rpm机械搅拌6min，然后使用高速均质机10000rpm均质3min，得到油包水(W1/O)初乳液，其中内水相与油相的体积比为1：3.8；
4、称取5.4gPVA205S加入到360mL去离子水中，加热溶解得到1.5％(W/V)的PVA水溶液作为外水相；
5、将步骤3中的初乳液缓慢滴加到步骤4的外水相溶液中，25℃，600rpm机械搅拌进行乳化，得到水包油包水(W1/O/W2)复乳液，继续搅拌4h，乳液固化成白色微载体，其中初乳液与外水相的体积比为1：63；
6、离心清洗收集微载体后，用去离子水离心清洗3次，冷冻干燥保存备用。
根据图6的扫描电子显微镜(SEM)结果所示，本实施例制备的多孔PLGA微载体为多孔微载体形态，微载体的平均粒径为184.5±15.0μm；平均孔径为12±4μm，孔洞率为65±7％。
实施例6多孔PLGA微载体的制备
1、称取0.15g碳酸氢铵溶于1.5mL去离子水中，配制成10％(W/V)的气体发泡剂作为内水相；
2、称取0.24gPLGA(分子量为20000，LA：GA＝50：50)溶于6mL二氯甲烷中，配制成40mg/mL的PLGA溶液作为油相；
3、将步骤1制备的碳酸氢钠水溶液加入至步骤2的PLGA油相溶液中，先450rpm机械搅拌5min，然后使用高速均质机10000rpm均质2min，得到油包水(W1/O)初乳液，其中内水相与油相的体积比为1：4；
4、称取3.75gPVA205S加入到250mL去离子水中，加热溶解得到1.5％(W/V)的PVA水溶液作为外水相；
5、将步骤3中的初乳液缓慢滴加到步骤4的外水相溶液中，28℃，500rpm机械搅拌进行乳化，得到水包油包水(W1/O/W2)复乳液，继续搅拌5h，乳液固化成白色微载体，其中初乳液与外水相的体积比为1：42。
6、离心清洗收集微载体后，用去离子水离心清洗3次，冷冻干燥保存备用。
根据图7的扫描电子显微镜(SEM)结果所示，本实施例制备的多孔PLGA微载体为多孔微载体形态，微载体的平均粒径为212.8±25.2μm；平均孔径为34±6μm，孔洞率为72±8％。
应用实施例1多孔PLGA微载体用于L-02肝细胞的三维培养
(a)L-02肝细胞在多孔PLGA微载体上生长的形态学观察
以L-02肝细胞为模型细胞来检验实施例1制备的多孔PLGA微载体对细胞黏附的效果。细胞实验前，使用剂量为9kGy的60Coγ射线对多孔PLGA微载体灭菌24h，用磷酸盐缓冲液清洗后浸泡于4℃的胎牛血清12h，然后用磷酸盐缓冲液离心清洗3次后备用。获取处于对数生长期的L-02细胞，调整细胞的密度为5×105cell/mL，取100μl细胞悬液与微载体混合吹打后转移至96孔细胞培养板，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h，然后使用光学显微镜观察L-02细胞在多孔PLGA微载体上的黏附生长情况。
由图8可见，大量L-02细胞黏附于多孔PLGA微载体上，细胞形态均一，大小一致，在微载体上沿着各个方向密集生长，细胞相互联系呈一个整体，证实多孔PLGA微载体对L-02细胞增殖无不良影响，较适合用于细胞的三维培养。
(b)多孔PLGA微载体的细胞毒性实验
将60Coγ射线灭菌处理的多孔PLGA微载体配制成0.5mg/mL、1mg/mL和2mg/mL的浸提液，空白对照只加培养液，阴性对照为加有细胞的培养液，阳性对照为0.64wt％的苯酚溶液。将处于对数生长期的L-02细胞按5×105cell/mL的细胞密度接种于96孔板中，培养24h后置换为微载体浸提液，上述实验平行重复三次，分别培养1、2、3天后通过CCK-8法测定OD值，按照下式计算细胞的相对增殖率，评价微载体的细胞毒性。
RGR(％)＝(实验组平均OD值-空白组平均OD值)/(阴性对照组平均OD值-空白组平均OD值)
多孔PLGA微载体的细胞毒性实验结果如图9所示，从L-02细胞的RGR值可以看出，0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL 3种不同浓度的微载体浸提液中细胞生存状态良好，表明无明显的细胞毒性，而阳性对照组出现明显的细胞死亡情况。
(c)多孔PLGA微载体的溶血实验
取4mL新鲜抗凝兔血与5mL生理盐水混合配制成稀释的兔血备用。将适量多孔PLGA微载体与生理盐水混合配制成5mL 0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL的微载体混悬液，阴性对照为生理盐水，阳性对照为去离子水，每组设置5个平行样品，37℃恒温培养箱中孵育30min，每只离心管中加入0.1mL稀释的兔血，37℃恒温培养箱中继续孵育1h，离心后取上清液在545nm波长处测定其OD值，按照下列公式计算其溶血率。
溶血率(％)＝(实验样品OD值-阴性对照OD值)/(阳性对照OD值-阴性对照OD值)
若溶血率＜5％，则认为符合生物材料的溶血实验要求；若溶血率＞5％，则认为实验材料有溶血作用。样品溶血率测试结果如图10所示，0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL三种不同浓度的多孔PLGA微载体的溶血率分别为0.72％、1.36％、1.9％，均小于5％，表明其无溶血作用，符合生物医学材料的血液相容性标准。
应用实施例2多孔PLGA微载体用于其它细胞的三维培养
以应用实施例1为基础，不同点为：将L-02细胞分别换成人胚胎干细胞、中国仓鼠卵巢细胞、乳仓鼠肾细胞、非洲绿猴肾细胞。细胞培养液、接种密度也做相应的调整，其它与应用实施例1相同。本实施例获得的人胚胎干细胞、中国仓鼠卵巢细胞、乳仓鼠肾细胞、非洲绿猴肾细胞均具有良好的形态，细胞在微载体表面和内部孔洞均有分布，且能观察到大量细胞外基质以及细胞-细胞连接，细胞数量随着培养时间增加而逐渐增加，通过相关蛋白和基因表达分析表明细胞均具有正常的功能。

Claims (9)

1.一种多孔PLGA微载体，其特征在于，所述多孔PLGA微载体分子量为10000～100000，其形状为球形，粒径为50～300μm，其表面和内部具有相互连通的孔洞，所述孔洞的孔径为5～40μm，孔洞率为35～82％。
2.如权利要求1所述的多孔PLGA微载体，其特征在于，所述多孔PLGA微载体的粒径优选为184.5～235μm；
所述孔洞的孔径优选为8～34μm；
和/或，所述多孔PLGA微载体的孔洞率优选为44～72％。
3.如权利要求1所述的多孔PLGA微载体，其特征在于，所述多孔PLGA微载体的粒径优选为212.8～220μm；
所述孔洞的孔径优选为18～34μm；
和/或，所述多孔PLGA微载体的孔洞率优选为48～65％。
4.如权利要求1至3所述多孔PLGA微载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将内水相与油相混合，机械搅拌，均质机均质，得到油包水(W1/O)初乳液；所述内水相为含有发泡剂的水溶液，所述油相为溶解PLGA的有机溶剂；
(2)将所述油包水(W1/O)初乳液滴加至外水相中，机械搅拌乳化得到水包油包水(W1/O/W2)复乳液，所述外水相为聚乙烯醇水溶液；
(3)将所述水包油包水(W1/O/W2)复乳液在10～35℃温度下搅拌2～24小时，离心收集，用去离子水清洗，冷冻干燥，即得多孔PLGA微载体。
任选地，所述内水相与油相的体积比为1：3～1：6；
任选地，所述发泡剂为碳酸钠、碳酸氢钠和碳酸氢铵中的一种或多种；
任选地，所述有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷和丙酮中的一种或多种；
任选地，所述机械搅拌转速为200～1000rpm，搅拌时间为3～15min；
任选地，所述均质机转速为5000～20000rpm，均质时间为1～10min；
任选地，所述发泡剂的浓度为2～10％(W/V)，所述PLGA的浓度为20～80mg/mL，PLGA中LA与GA的摩尔比为50：50～85：15。
任选地，所述油包水(W1/O)初乳液与外水相体积比为1：50～1：80；
任选地，所述聚乙烯醇的浓度为0.5％～3％；
任选地，所述机械搅拌的转速为300～1000rpm。
5.一种权利要求1至3所述的多孔PLGA微载体在细胞三维培养中的应用，其特征在于，所述细胞为贴壁性细胞，优选为L-02肝细胞、人胚胎干细胞、中国仓鼠卵巢细胞、乳仓鼠肾细胞、非洲绿猴肾细胞。
6.一种携载细胞的多孔PLGA微载体系统，其特征在于，包括权利要求1～3任一项中所定义的多孔PLGA微载体。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述细胞三维培养包括如下步骤：
(1)使用6～9kGy辐照强度的60Coγ射线照射多孔PLGA微载体24小时；
(2)将灭菌后的多孔PLGA微载体用磷酸盐缓冲液清洗，置于4℃的胎牛血清中；
(3)进一步用磷酸盐缓冲液清洗，将细胞接种于多孔PLGA微载体上进行细胞三维培养。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(1)中所述多孔PLGA微载体的浓度为5～20mg/mL。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(3)中所述细胞接种密度为2～6×105cell/mL。
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