CN110272824A - 新的细胞培养方法、细胞培养系统及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供新的细胞培养方法、细胞培养系统及其用途，属于生物材料及生物技术领域，提供一种三维细胞培养系统，用于体外细胞培养，包括填充床细胞反应器，其含有一个复合多孔支架，复合多孔支架包括胶原蛋白、丝素蛋白、羟基磷灰石。利用其进行三维细胞的培养方法，包括以下步骤：设置三维细胞培养系统；向细胞反应器供给细胞和细胞培养液；循环灌注所述细胞培养液；细胞的接种方式为动态接种。该细胞培养系统的复合多孔支架的孔隙率和孔结构的均匀性以及贯通性佳，有利于水分、离子和其它营养物质的运输和传送，对温度的敏感性较高，能够对环境温度的变化产生响应，可以控制生长因子后续的释放。

Description

新的细胞培养方法、细胞培养系统及其用途
技术领域
本发明属于生物材料及生物技术领域，具体涉及新的细胞培养方法、细胞培养系统及其用途。
背景技术
目前，体外细胞水平的研究很大程度上是在二维培养条件下完成；在体内，主要在实验动物模型体内完成。二维细胞培养技术培养的细胞在体外环境下逐渐丧失了其体内原有的性状，在形态、结构和功能方面都与其在体内自然生长的状态相去甚远；而动物实验由于体内的多种不可控因素的制约以及体内和体外环境相互影响而变得复杂化，不利于探究具体机制。鉴于两者均存在一定的局，近年来发展了三维细胞培养技术，这种培养方法获得的细胞在形态结构、增殖分化、基因表达及细胞的功能活动等方面均与二维培养存在显著不同。三维细胞培养既能保留天然细胞微环境的物质结构基础，又能更好的模拟体内细胞生长的微环境，克服了之前两种方式的缺陷，为细胞水平的研究提供了一种更简单、更安全、更可靠的方法。
现有技术如授权公告号为CN 104830774 B的中国发明专利，公开了一种细胞三维培养支架、其制备方法及用途，其属于生物组织工程和生物医药领域，涉及一种细胞三维培养支架、其制备方法及用途。具体地，所述细胞三维培养支架分布有一个或多个孔隙，所述孔隙能够容纳至少一个细胞，并且所述孔隙有开口，所述开口能够容许至少一个细胞进入。该细胞三维培养支架孔径致密，生物相容性和细胞渗入的效果好，并且强度好，无塌陷分离等现象。
发明内容
本发明的目的在于提供新的细胞培养方法、细胞培养系统及其用途，该细胞培养系统用复合多孔支架的孔隙率和孔结构的均匀性以及贯通性佳，有利于水分、离子和其它营养物质的运输和传送，对温度的敏感性较高，能够对环境温度的变化产生响应，可以控制生长因子后续的释放。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
本发明提供一种三维细胞培养系统，用于体外细胞培养，包括填充床细胞反应器，其至少含有一个复合多孔支架，其特征在于：所述复合多孔支架的制备方法为：
1)将氯化钠与羟基磷灰石混合均匀；
2)将步骤1)制得的氯化钠与羟基磷灰石的混合物紧密地装入注射器中；
3)将活性因子、胶原蛋白溶液和丝素蛋白溶液混匀后，加入双活性酯聚乙二醇交联处理后，倒入步骤2)的注射器中，按下注射器活塞，室温放置；
4)从注射器中取出材料，用乙醇浸泡，然后用超纯水清洗。
除了利用生物材料本身的表面和结构性质来指导细胞行为之外，生物材料结合可溶性生长因子来控制细胞的分化和功能也是一个构建细胞外微环境的重要手段，生长因子在培养液中难以维持时间较长的活性，半衰期比较短，只有在早期才可以与细胞产生作用。为了解决上述问题，本发明在制备复合多孔支架过程中加入了双活性酯聚乙二醇，能够对与胶原蛋白、丝素蛋白进行交联改性，与蛋白上的自由氨基生成分子间共价交联键，从而降低胶原蛋白间的氢键作用，进而使得蛋白链间的聚集解离，而蛋白与水分子之间的氢键作用更强，从而使活性因子、胶原蛋白和丝素蛋白在水中的分布更加均匀，提高活性因子在后续得到的支架中的均匀性，且使获得的混合溶液的流动性更佳，能够更顺畅地、更均匀地通过制孔剂，提高制得的支架孔隙率和孔结构的均匀性以及贯通性，有利于水分、离子和其它营养物质的运输和传送，为后续培养细胞提供良好的生物环境；同时，还显著提高了SCH复合多孔支架对温度的敏感性，从而使SCH复合多孔支架能够对环境温度的变化产生响应，因而可以用来控制生长因子后续的释放过程，通过构建SCH复合多孔缓释支架载体，保护了生长因子的活性，促进了细胞的生长和分化；此外，也能够接枝到与丝素蛋白链上，提高制得的支架力学性能和亲水性，降低了生物材料的免疫原性。
纳米羟基磷灰石有着很好的致密性与烧结性，但很难形成理想的形状，胶原蛋白本就是人体细胞外基质的组成成分，但是机械强度较差，成本较高，丝素蛋白由蚕苗提取而来，机械强度高、韧性、弹性和环境稳定性均较处于较高水平。由胶原蛋白、丝素蛋白、羟基磷灰石组成的复合支架(SCH)可以综合优点，同时克服缺点。本发明将制孔剂先进行密堆积，再使溶液通过制孔剂，通过盐析和与钙的结合导致丝素蛋白和胶原蛋白变性形成支架，制得的支架孔隙率高、孔结构均匀且贯通性好、力学性能和亲水性佳，有利于水分，离子和其它营养物质的运输和传送，同时将活性因子均匀地包括在支架中，提高了SCH复合多孔支架对温度的敏感性，可以用来控制生长因子后续的释放过程，保护了生长因子的活性，促进了细胞的生长和分化。
在某些实施方案中，胶原蛋白溶液的浓度为5-7％，丝素蛋白溶液的浓度为5-7％。
在某些实施方案中，过筛后的氯化钠的粒径在125-300μm。支架的孔径的大小取决于氯化钠的粒径大小，通过调节氯化钠的粒径大小，可以制得不同孔径大小的复合多孔支架，氯化钠的粒径减小时，支架的孔隙率增大，而吸水率与膨胀率则随之减小，氯化钠的粒径在125-300μm时，制得的支架成型性比较好，孔之间的连通性也比较好。
在某些实施方案中，氯化钠与羟基磷灰石的质量比为1:0.01-0.03。为了能够提高复合多孔支架的机械强度，应当选择羟基磷灰石占比最高的配制方法，当羟基磷灰石的比例大于1:0.01-0.03时，随着羟基磷灰石的增加，复合多孔支架成型效果不断变差。
在某些实施方案中，胶原蛋白溶液与所述丝素蛋白溶液的体积比为1:3-5。为了能够提高复合多孔支架的生物相容性，应当选择胶原蛋白占比最高的配制方法，当胶原蛋白溶液与丝素蛋白溶液的比例大于1:3-5时，随着胶原蛋白占比的增加，复合多孔支架成型效果不断变差。
在某些实施方案中，细胞选自癌细胞、子宫内膜细胞、干细胞、成骨细胞、成纤维细胞之一。三维培养技术能够为体外培养细胞模拟体内微环境，从而促进细胞增殖和细胞定向分化、维持细胞的分化表型，能够更好的模拟体内细胞的基因表达、基质分泌及细胞功能，为组织工程学、肿瘤学、再生医学和干细胞生物学等研究领域提供新的手段。
在某些实施方案中，细胞是奶牛乳腺上皮细胞。利用本发明的三维培养系统对奶牛乳腺上皮细胞进行培养，提供了类细胞基质的成分，能够使细胞之间、细胞与类基质之间进行较多的物质交换，形成较多的信号传递通道，更好的模拟体内细胞的代谢方式和生长环境，有利于在微观领域揭示乳腺生理与泌乳机制。
本发明还提供一种利用本发明任一种三维培养系统进行三维细胞培养的方法，该三维细胞培养方法包括以下步骤：
设置三维细胞培养系统；
向细胞反应器供给细胞和细胞培养液；
循环灌注细胞培养液；
细胞在复合多孔支架上的接种方式为动态接种。动态接种可以增加接种率，接种的重现性和细胞分布的均匀性，能够使细胞悬液直接通过支架的孔，方便营养物质与气体通过。培养液以循环灌注的方式透过支架扩散到固定在支架上的细胞上，因此，细胞对剪切应力的敏感性较低，在填充床细胞反应器外能够利用循环灌注的营养液携带细胞生长所需要的氧气，不会产生气泡从而伤及细胞。
本发明还提供一种利用本发明任一种三维细胞培养系统在筛选新药物中的用途。通过建立与人类疾病相关的细胞模型进行药物筛选分析，具有特异性强、选择性髙和高通量的特点，此外，细胞培养材料基质易得，可操作性较强，具有广阔的应用前景。
本发明还提供一种利用本发明任一种三维细胞培养系统在研究奶牛泌乳调控中的用途。乳腺具有合成和分泌功能，通过摄取血液里的营养物质来合成乳汁，乳成分的含量与配比受营养物质摄入、环境因素、管理模式等的影响。奶牛乳腺上皮细胞的三维培养技术能够将机体的复杂的代谢模式分割开来进行研究，有助于奶牛泌乳调控机理的研究，具有很高的经济价值。
本发明的有益效果为：
1)本发明通过对三维培养支架的材料选择、配比等条件的优化，制得由胶原蛋白、丝素蛋白和羟基磷灰石组成的复合多孔支架(SCH)，该复合多孔支架的力学性能、生物相容性、对细胞粘附性均较好，有利于细胞的生长和分化；
2)本发明利用双活性酯聚乙二醇对胶原蛋白和丝素蛋白进行交联改性，制得的复合多孔支架的孔隙率和孔结构的均匀性以及贯通性较佳，有利于水分、离子和其它营养物质的运输和传送，为后续培养细胞提供良好的生物环境；同时，对温度的敏感性较高，能够对环境温度的变化产生响应，可以控制生长因子后续的释放；
3)本发明将该培养系统用于筛选新药，具有特异性强、选择性髙和高通量的特点，本发明将该培养系统用于研究奶牛泌乳调控，能够简化研究方式，提高研究效率，具有很高的经济价值。
附图说明
图1为试验例1中复合多孔支架的孔隙率、吸水率以及失重率的示意图；
图2为试验例1中复合多孔支架的SEM照片；
图3为试验例2中HGF在复合多孔支架中的释放曲线示意图；
图4为试验例3中细胞在复合多孔支架上的粘附情况示意图；
图5为试验例4中细胞的αs1-酪蛋白和β-酪蛋白基因的表达量示意图；
图6为试验例5细胞的κ-酪蛋白基因的表达量示意图。
具体实施方式
本文中在三维细胞培养系统的上下文中描述了许多实施方案。本领域普通技术人员将认识到，以下实施方式的详细描述仅是示例性的，而非旨在以任何方式进行限制。在本公开内容的教导下，对于本领域技术人员而言提出其他实施方式是容易的。在本文中提及“实施方案”、“方面”或“实施例/实例”表示这样描述的本发明之实施方案可包括特定特征、结构或特性，但并非每个实施方案都必然包括所述特定特征、结构或特性。此外，重复使用短语“在一个实施方案中”尽管可以指同一实施方案，但并非必然指同一实施方案。
为了清楚起见，本文中并未示出和描述本文所述实施或方法的全部常规特征。当然将理解，在研发任何这样的实际实施时，将作出许多实施特异性的决定以实现具体目标。此外，将理解，这样的开发工作可能是复杂且耗时的，但在本公开内容的教导下，这对于本领域普通技术人员而言不过是常规工作。
本申请提供了一种三维细胞培养系统，用于体外细胞培养，包括填充床细胞反应器，其至少含有一个复合多孔支架，该复合多孔支架的制备方法为：将氯化钠与羟基磷灰石混合均匀；将制得的氯化钠与羟基磷灰石的混合物紧密地装入注射器中；将活性因子、胶原蛋白溶液和丝素蛋白溶液混匀后，加入双活性酯聚乙二醇交联处理后，倒入上述的注射器中，按下注射器活塞，室温放置；从注射器中取出材料，用乙醇浸泡，然后用超纯水清洗。利用该三维培养系统进行三维细胞培养的方法包括设置三维细胞培养系统；向细胞反应器供给细胞和细胞培养液；循环灌注细胞培养液；细胞在复合多孔支架上的接种方式为动态接种。将该三维细胞培养系统用于筛选新药物。某些实施方式中，将该三维细胞培养系统用于研究奶牛泌乳的调控。
本文的三维细胞培养系统用于体外细胞培养，包括填充床细胞反应器，其至少含有一个复合多孔支架，其特征在于：所述复合多孔支架通过如下制备方法制得：
1)将氯化钠进行过筛，然后与羟基磷灰石混合均匀；
2)将制得的氯化钠与羟基磷灰石的混合物紧密地装入8-10mL(例如8mL、9mL、10mL等)塑料注射器中；
3)将活性因子、胶原蛋白溶液和丝素蛋白溶液混匀后，将双活性酯聚乙二醇交联剂溶于二甲基亚砜中，然后滴加到胶原蛋白和丝素蛋白的混合溶液中，使得双活性酯聚乙二醇在混合溶液中的浓度为0.02-0.03％(例如0.02％,0.03％等)，在pH值为7-8.5(例如7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5)，温度为8-10℃(例如8℃、9℃、10℃)的条件下，搅拌反应30-45min，优选地，例如30min、31min、32min、33min、35min、37min、38min、39min、40min、41min、42min、43min、44min、45min等，倒入注射器，立刻按下注射器活塞，室温条件下放置22-24h，例如22h、23h、24h等；
4)将材料从注射器中取出，先用体积比为70-72％(例如70％、71％、72％等)的乙醇浸泡30-35min(例如30min、31min、32min、33min、34min、35min等)，然后用超纯水清洗4-6次，例如4次、5次、6次。
除了利用生物材料本身的表面和结构性质来指导细胞行为之外，生物材料结合可溶性生长因子来控制细胞的分化和功能也是一个构建细胞外微环境的重要手段，生长因子在培养液中难以维持时间较长的活性，半衰期比较短，只有在早期才可以与细胞产生作用。为了解决上述问题，本发明在制备复合多孔支架过程中加入了双活性酯聚乙二醇，能够对与胶原蛋白、丝素蛋白进行交联改性，与蛋白上的自由氨基生成分子间共价交联键，从而降低胶原蛋白间的氢键作用，进而使得蛋白链间的聚集解离，而蛋白与水分子之间的氢键作用更强，从而使活性因子、胶原蛋白和丝素蛋白在水中的分布更加均匀，提高活性因子在后续得到的支架中的均匀性，且使获得的混合溶液的流动性更佳，能够更顺畅地、更均匀地通过制孔剂，提高制得的支架孔隙率和孔结构的均匀性以及贯通性，有利于水分、离子和其它营养物质的运输和传送，为后续培养细胞提供良好的生物环境；同时，还显著提高了SCH复合多孔支架对温度的敏感性，从而使SCH复合多孔支架能够对环境温度的变化产生响应，因而可以用来控制生长因子后续的释放过程，通过构建SCH复合多孔缓释支架载体，保护了生长因子的活性，促进了细胞的生长和分化；此外，也能够接枝到与丝素蛋白链上，提高制得的支架力学性能和亲水性，降低了生物材料的免疫原性。
纳米羟基磷灰石有着很好的致密性与烧结性，但很难形成理想的形状，胶原蛋白本就是人体细胞外基质的组成成分，但是机械强度较差，成本较高，丝素蛋白由蚕苗提取而来，机械强度高、韧性、弹性和环境稳定性均较处于较高水平。由胶原蛋白、丝素蛋白、羟基磷灰石组成的复合支架(SCH)可以综合优点，同时克服缺点。本发明将制孔剂先进行密堆积，再使溶液通过制孔剂，通过盐析和与钙的结合导致丝素蛋白和胶原蛋白变性形成支架，制得的支架孔隙率高、孔结构均匀且贯通性好、力学性能和亲水性佳，有利于水分，离子和其它营养物质的运输和传送，同时将活性因子均匀地包括在支架中，提高了SCH复合多孔支架对温度的敏感性，可以用来控制生长因子后续的释放过程，保护了生长因子的活性，促进了细胞的生长和分化。
在某些实施方案中，胶原蛋白溶液的浓度为5-7％，例如5％、6％、7％等，丝素蛋白溶液的浓度为5-7％，例如5％、6％、7％等。
双活性酯聚乙二醇的加入使制得的支架不利于细胞的粘附，为了提高复合多孔支架对细胞的粘附能力，更优选地，在某些实施方案中，用双活性酯聚乙二醇进行交联时，加入儿茶酚胺，使得儿茶酚胺在混合溶液中的浓度为0.04-0.06％，优选地，例如0.04％、0.05％、0.06％等。儿茶酚胺能够通过共价键连接被接枝到胶原蛋白和丝素蛋白上，从而对复合多孔支架表面进行修饰，进一步增加复合多孔支架表面上能与细胞的膜蛋白上存在的氨基或疏基发生反应的基团种类和数量，从而使复合多孔支架能粘附更多的细胞，并且随着培养时间的延长，细胞外基质不断被分泌并伴随着细胞的增殖和通信，细胞逐渐形成细胞片层。
在某些实施方案中，细胞活性因子选自表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、神经生长因子、干细胞生长因子、脑源性神经营养因子、血小板源性生长因子、血管内皮生长因子、转化生长因子的一种或几种。
在某些实施方案中，过筛后的氯化钠的粒径在125-300μm，优选地，例如125-137μm、140-158μm、160-188μm、190-240μm、246-280μm、283-300μm等。支架的孔径的大小取决于氯化钠的粒径大小，通过调节氯化钠的粒径大小，可以制得不同孔径大小的复合多孔支架，氯化钠的粒径减小时，支架的孔隙率增大，而吸水率与膨胀率则随之减小，氯化钠的粒径在125-300μm时，制得的支架成型性比较好，孔之间的连通性也比较好。
在某些实施方案中，氯化钠与羟基磷灰石的质量比为1:0.01-0.03，优选地，例如1:0.01、1:0.02、1:0.03等。为了能够提高复合多孔支架的机械强度，应当选择羟基磷灰石占比最高的配制方法，当羟基磷灰石的比例大于1:0.01-0.03时，随着羟基磷灰石的增加，复合多孔支架成型效果不断变差。
在某些实施方案中，胶原蛋白溶液与所述丝素蛋白溶液的体积比为1:3-5，优选地，例如1:3、1:4、1:5等。为了能够提高复合多孔支架的生物相容性，应当选择胶原蛋白占比最高的配制方法，当胶原蛋白溶液与丝素蛋白溶液的比例大于1:3-5时，随着胶原蛋白占比的增加，复合多孔支架成型效果不断变差。
在某些实施方案中，细胞选自癌细胞、干细胞、成骨细胞、肝细胞、成纤维细胞之一。三维培养技术能够为体外培养细胞模拟体内微环境，从而促进细胞增殖和细胞定向分化、维持细胞的分化表型，能够更好的模拟体内细胞的基因表达、基质分泌及细胞功能，为组织工程学、肿瘤学、再生医学和干细胞生物学等研究领域提供新的手段。
在某些实施方案中，细胞是奶牛乳腺上皮细胞。利用本发明的三维培养系统对奶牛乳腺上皮细胞进行培养，提供了类细胞基质的成分，能够使细胞之间、细胞与类基质之间进行较多的物质交换，形成较多的信号传递通道，更好的模拟体内细胞的代谢方式和生长环境，有利于在微观领域揭示乳腺生理与泌乳机制。
本发明提供一种利用本文描述的任一种三维培养系统进行三维细胞培养的方法，在实施方案中，该三维细胞培养方法包括以下步骤：
制备细胞悬液：将细胞放入面积为25-30cm2(例如25cm2、26cm2、27cm2、28cm2、29cm2、30cm2等)的细胞培养瓶里，加入含有10-12％(例如10％、11％、12％等)胎牛血清和1-1.2％(例如1％、1.1％、1.2％等)青链霉素混合液的RPMI-1640培养基，置于36-37℃(例如36℃,37℃等)、4.5-5％(例如4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.95％等)二氧化碳和93-95％(例如93％、94％、95％等)相对湿度条件下的二氧化碳培养箱中进行培养，每隔一天更换一次培养液，待细胞生长汇合度达到79-81％(例如79％、80％、81％等)时，抽去培养基，加入少量PBS冲洗瓶壁，后加入0.9-1.1mL(例如0.9mL、1mL、1.1mL等)胰蛋白酶，待通过显微镜观察到细胞连接松散时，加入1.8-2.2mL(例如1.8mL、1.9mL、2mL、2.1mL、2.2mL等)上述的RPMI-1640培养基终止消化，用吸管反复吹打瓶壁，使贴壁细胞完全被吹下后，1000-1200rpm(例如1000rpm、1100rpm、1200rpm等)，3-5min(例如3min、4min、5min)离心，去上清，加入适量上述的RPMI-1640培养基稀释细胞，得到2.5-4.5×105/mL(例如2.5×105/mL、2.6×105/mL、2.7×105/mL、3×105/mL、3.2×105/mL、3.3×105/mL、3.7×105/mL、3.9×105/mL、4×105/mL、4.1×105/mL、4.4×105/mL、4.5×105/mL等)的细胞悬液。
设置复合多孔支架填充床细胞反应器：将反应器清洗干净；用去离子水将复合多孔支架浸洗3-4次(例如3次，4次)后装入反应器内；然后在120-123℃(例如120℃、121℃、122℃、123℃等)的条件下高压灭菌75-80min(例如75min、76min、77min、78min、79min、80min等)；排空反应器中的水，再对pH电极和溶氧电极进行校正，调试好后加入上述的RPMI-1640培养基预运转。将制备好的细胞悬液接种于培养罐。在2-3天(例如2天，3天等)后开始灌流，每天灌流1.8-2L(例如1.8L、1.9L、2L等)。用CO2和7.4-7.5％(例如7.4％、7.5％等)的NaHCO3溶液调整pH，使pH＝7.2-7.4(例如pH＝7.2、pH＝7.3、pH＝7.4等)，在35.8-37.5℃(例如35.8℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃等)、溶氧为40-45％(例如40％、41％、42％、43％、44％、45％等)的条件下培养，初始搅拌转速为80-100r/min(例如80r/min、81r/min、82r/min、84r/min、87r/min、89r/min、90r/min、91r/min、93r/min、95r/min、98r/min、100r/min等)，2-4h(例如2h、3h、4h等)后升至150-200r/min(例如150r/min、156r/min、158r/min、167r/min、174r/min、176r/min、182r/min、183r/min、189r/min、190r/min、192r/min、193r/min、195r/min、200r/min等)。接种后每日采样，用血糖测定试剂盒检测培养上清中葡萄糖浓度，根据葡萄糖的消耗情况及时调整灌流速度。
细胞在复合多孔支架上的接种方式为动态接种。动态接种可以增加接种率，接种的重现性和细胞分布的均匀性，能够使细胞悬液直接通过支架的孔，方便营养物质与气体通过。培养液以循环灌注的方式透过支架扩散到固定在支架上的细胞上，因此，细胞对剪切应力的敏感性较低，在填充床细胞反应器外能够利用循环灌注的营养液携带细胞生长所需要的氧气，不会产生气泡从而伤及细胞。
本发明提供一种利用本文任一种三维细胞培养系统在筛选新药物中的用途。通过建立与人类疾病相关的细胞模型进行药物筛选分析，具有特异性强、选择性髙和高通量的特点，此外，细胞培养材料基质易得，可操作性较强，具有广阔的应用前景。
本发明还提供一种利用本文任一种三维细胞培养系统在研究奶牛泌乳调控中的用途。乳腺具有合成和分泌功能，通过摄取血液里的营养物质来合成乳汁，乳成分的含量与配比受营养物质摄入、环境因素、管理模式等的影响。奶牛乳腺上皮细胞的三维培养技术能够将机体的复杂的代谢模式分割开来进行研究，有助于奶牛泌乳调控机理的研究，具有很高的经济价值。
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
一种复合多孔支架的制备方法，包含：
将氯化钠进行过筛，过筛后的氯化钠的粒径在283-300μm，然后与羟基磷灰石按1:0.03的比例混合均匀；
将制得的氯化钠与羟基磷灰石的混合物紧密地装入塑料注射器中；
将肝细胞活性因子HGF、比例为1:4的胶原蛋白溶液和丝素蛋白溶液混匀后，将双活性酯聚乙二醇溶于二甲基亚砜中，然后滴加到胶原蛋白和丝素蛋白的混合溶液中，使得双活性酯聚乙二醇在混合溶液中的浓度为0.02％，在一定的pH值和温度条件下，搅拌反应；
倒入注射器，立刻按下注射器活塞，室温条件下放置；
将材料从注射器中取出，先用乙醇浸泡，然后用超纯水清洗。
实施例2：
一种复合多孔支架的制备方法，包含：
将氯化钠进行过筛，过筛后的氯化钠的粒径在283-300μm，然后与羟基磷灰石按1:0.03的比例混合均匀；
将制得的氯化钠与羟基磷灰石的混合物紧密地装入塑料注射器中；
将肝细胞活性因子HGF、比例为1:4的胶原蛋白溶液和丝素蛋白溶液混匀后，将双活性酯聚乙二醇溶于二甲基亚砜中，然后滴加到胶原蛋白和丝素蛋白的混合溶液中，使得双活性酯聚乙二醇在混合溶液中的浓度为0.02％，加入儿茶酚胺，使得儿茶酚胺在混合溶液中的浓度为0.04％，在一定的pH值和温度条件下，搅拌反应；
倒入注射器，立刻按下注射器活塞，室温条件下放置；
将材料从注射器中取出，先用乙醇浸泡，然后用超纯水清洗。
实施例3：
一种复合多孔支架的制备方法，包含：
将氯化钠进行过筛，过筛后的氯化钠的粒径在283-300μm，然后与羟基磷灰石按1:0.02的比例混合均匀；
将制得的氯化钠与羟基磷灰石的混合物紧密地装入塑料注射器中；
将肝细胞活性因子HGF、比例为1:4的胶原蛋白溶液和丝素蛋白溶液混匀后，将双活性酯聚乙二醇溶于二甲基亚砜中，然后滴加到胶原蛋白和丝素蛋白的混合溶液中，使得双活性酯聚乙二醇在混合溶液中的浓度为0.03％，加入儿茶酚胺，使得儿茶酚胺在混合溶液中的浓度为0.05％，在一定的pH值和温度条件下，搅拌反应；
倒入注射器，立刻按下注射器活塞，室温条件下放置；
将材料从注射器中取出，先用乙醇浸泡，然后用超纯水清洗。
实施例4：
一种复合多孔支架的制备方法，包含：
将氯化钠进行过筛，过筛后的氯化钠的粒径在190-240μm，然后与羟基磷灰石按1:0.02的比例混合均匀；
将制得的氯化钠与羟基磷灰石的混合物紧密地装入塑料注射器中；
将肝细胞活性因子HGF、比例为1:4的胶原蛋白溶液和丝素蛋白溶液混匀后，将双活性酯聚乙二醇溶于二甲基亚砜中，然后滴加到胶原蛋白和丝素蛋白的混合溶液中，使得双活性酯聚乙二醇在混合溶液中的浓度为0.03％，加入儿茶酚胺，使得儿茶酚胺在混合溶液中的浓度为0.05％，在一定的pH值和温度条件下，搅拌反应；
倒入注射器，立刻按下注射器活塞，室温条件下放置；
将材料从注射器中取出，先用乙醇浸泡，然后用超纯水清洗。
实施例5：
一种复合多孔支架的制备方法，包含：
将氯化钠进行过筛，过筛后的氯化钠的粒径在190-240μm，然后与羟基磷灰石按1:0.02的比例混合均匀；
将制得的氯化钠与羟基磷灰石的混合物紧密地装入塑料注射器中；
将肝细胞活性因子HGF、比例为1:5的胶原蛋白溶液和丝素蛋白溶液混匀后，将双活性酯聚乙二醇溶于二甲基亚砜中，然后滴加到胶原蛋白和丝素蛋白的混合溶液中，使得双活性酯聚乙二醇在混合溶液中的浓度为0.03％，加入儿茶酚胺，使得儿茶酚胺在混合溶液中的浓度为0.05％，在一定的pH值和温度条件下，搅拌反应；
倒入注射器，立刻按下注射器活塞，室温条件下放置；
将材料从注射器中取出，先用乙醇浸泡，然后用超纯水清洗。
实施例6：
制备复合多孔支架时添加的细胞活性因子为转化生长因子TGF-β1，其余部分和实施例3完全一致。
实施例7：
一种三维细胞培养方法，包括以下步骤：
制备细胞悬液：将肝细胞放细胞培养瓶里，加入含有胎牛血清和1％(例如青链霉素混合液的RPMI-1640培养基，置于一定温度、含有一定浓度二氧化碳和一定相对湿度条件下的二氧化碳培养箱中进行培养，每隔一天更换一次培养液，待细胞生长到适当汇合度时，抽去培养基，加入少量PBS冲洗瓶壁，后加入胰蛋白酶，待通过显微镜观察到细胞连接松散时，加入上述的RPMI-1640培养基终止消化，用吸管反复吹打瓶壁，使贴壁细胞完全被吹下后离心，去上清，加入适量上述的RPMI-1640培养基稀释细胞，得到3×105/mL的细胞悬液。
细胞罐培养：将反应器清洗干净；用去离子水将实施例1制得的复合多孔支架浸洗后装入反应器内；高压灭菌；排空反应器中的水，再对pH电极和溶氧电极进行校正，调试好后加入上述的RPMI-1640培养基预运转。将制备好的细胞悬液动态接种于培养罐，在2天后开始灌流，每天灌流2L。用CO2和NaHCO3溶液调整pH，在一定溶氧量下，搅拌培养。接种后每日采样，用血糖测定试剂盒检测培养上清中葡萄糖浓度，根据葡萄糖的消耗情况及时调整灌流速度。细胞接种后先在36.8-37.5℃条件下培养4d，然后在35.8-36.5℃条件下进行培养。
实施例8：
一种三维细胞培养方法，包括以下步骤：
制备细胞悬液：将肝细胞放细胞培养瓶里，加入含有胎牛血清和1％(例如青链霉素混合液的RPMI-1640培养基，置于一定温度、含有一定浓度二氧化碳和一定相对湿度条件下的二氧化碳培养箱中进行培养，每隔一天更换一次培养液，待细胞生长到适当汇合度时，抽去培养基，加入少量PBS冲洗瓶壁，后加入胰蛋白酶，待通过显微镜观察到细胞连接松散时，加入上述的RPMI-1640培养基终止消化，用吸管反复吹打瓶壁，使贴壁细胞完全被吹下后离心，去上清，加入适量上述的RPMI-1640培养基稀释细胞，得到3×105/mL的细胞悬液。
细胞罐培养：将反应器清洗干净；用去离子水将实施例3制得的复合多孔支架浸洗后装入反应器内；高压灭菌；排空反应器中的水，再对pH电极和溶氧电极进行校正，调试好后加入上述的RPMI-1640培养基预运转。将制备好的细胞悬液动态接种于培养罐，在2天后开始灌流，每天灌流2L。用CO2和NaHCO3溶液调整pH，在一定溶氧量下，搅拌培养。接种后每日采样，用血糖测定试剂盒检测培养上清中葡萄糖浓度，根据葡萄糖的消耗情况及时调整灌流速度。细胞接种后先在36.8-37.5℃条件下培养4d，然后在35.8-36.5℃条件下进行培养。
实施例9：
一种三维细胞培养方法，包括以下步骤：
制备细胞悬液：将奶牛乳腺上皮细胞放细胞培养瓶里，加入含有胎牛血清和1％(例如青链霉素混合液的RPMI-1640培养基，置于一定温度、含有一定浓度二氧化碳和一定相对湿度条件下的二氧化碳培养箱中进行培养，每隔一天更换一次培养液，待细胞生长到适当汇合度时，抽去培养基，加入少量PBS冲洗瓶壁，后加入胰蛋白酶，待通过显微镜观察到细胞连接松散时，加入上述的RPMI-1640培养基终止消化，用吸管反复吹打瓶壁，使贴壁细胞完全被吹下后离心，去上清，加入适量上述的RPMI-1640培养基稀释细胞，得到4.5×105/mL的细胞悬液。
细胞罐培养：将反应器清洗干净；用去离子水将实施例6制得的复合多孔支架浸洗后装入反应器内；高压灭菌；排空反应器中的水，再对pH电极和溶氧电极进行校正，调试好后加入上述的RPMI-1640培养基预运转。将制备好的细胞悬液动态接种于培养罐，在2天后开始灌流，每天灌流2L。用CO2和NaHCO3溶液调整pH，在一定溶氧量下，搅拌培养。接种后每日采样，用血糖测定试剂盒检测培养上清中葡萄糖浓度，根据葡萄糖的消耗情况及时调整灌流速度。细胞接种后先在36.8-37.5℃条件下培养4d，然后在35.8-36.5℃条件下进行培养。
对比例1：
制备复合多孔支架时未加入双活性酯聚乙二醇，其余部分和实施例3完全一致。
对比例2：
反应器中装入的支架为对比例1制得的复合多孔支架，其余部分和实施例8完全一致。
对比例3：
细胞接种后一直在37℃条件下培养，其余部分和实施例8完全一致。
对比例4：
细胞接种后一直在37℃条件下培养，其余部分和对比例3完全一致。
对比例5：
制备细胞悬液：将奶牛乳腺上皮细胞放细胞培养瓶里，加入含有胎牛血清和1％(例如青链霉素混合液的RPMI-1640培养基，置于一定温度、含有一定浓度二氧化碳和一定相对湿度条件下的二氧化碳培养箱中进行培养，每隔一天更换一次培养液，待细胞生长到适当汇合度时，抽去培养基，加入少量PBS冲洗瓶壁，后加入胰蛋白酶，待通过显微镜观察到细胞连接松散时，加入上述的RPMI-1640培养基终止消化，用吸管反复吹打瓶壁，使贴壁细胞完全被吹下后离心，去上清，加入适量上述的RPMI-1640培养基稀释细胞，得到4.5×105/mL的细胞悬液。
将制备的细胞悬液接种至80cm2的细胞培养瓶中，放入37℃,5％CO2浓度的培养箱中培养，激素处理48h。
试验例1：
复合多孔支架的表征：
1.孔隙率的测定：
将体积为V1的正己烷放入量筒，把质量为W复合多孔支架放入其中浸泡5分钟，测得正己烷饱和的支架的总体积为V2。取出正己烷饱和的支架，剩余的正己烷的体积为V3，复合多孔支架的总体积V的计算公式如下：
V＝V2-V3；
复合多孔支架的孔隙率ε(％)的计算公式如下：
ε(％)＝(V1-V2)/(V2-V3)×100％。
2.吸水率和失重率的测定：
对复合多孔支架进行称重，然后浸入PBS中，用滤纸吸去支架表面的多余水分，按照选定的时间间隔重复测定质量，待不再发生变化时，为复合多孔支架的湿重W1。
吸水率(％)＝(W1-W)/W×100％；
对复合多孔支架进行称重，然后浸入PBS中，在选定的时间点取出6个支架，用滤纸吸去支架表面的多余水分，冷冻干燥，称得质量为W2。
失重率(％)＝(W-W2)/W2×100％。
结果见图1。
由图1可以看出，实施例2和实施例3的氯化钠与羟基磷灰石按比例不同，制得的复合多孔支架的孔隙率变化较小、吸水率和失重率变化较大，在实施例3的条件下制得的复合多孔支架的吸水率较高且失重率较小，性能更佳；实施例3和实施例3中过筛后的氯化钠直径范围不同，在实施例3的条件下制得的复合多孔支架的孔隙率和吸水率较大，且失重率较小；实施例4和实施例5中胶原蛋白溶液和丝素蛋白溶液的比例不同，在实施例4的条件下制得的复合多孔支架的孔隙率和吸水率较大，但失重率也较大；总体看来，在实施例3的条件下制得的复合多孔支架达到最佳效果。
3.SEM扫描
干燥后的复合多孔支架的内部结构通过KYKY-2800B型数字化扫描电子显微镜观察。SEM照片见图2。
由图2可以看出，实施例2和实施例4的复合多孔支架的孔隙率和孔结构的均匀性以及贯通性均优于对比例1，这说明双活性酯聚乙二醇的加入能提高制得的支架孔隙率和孔结构的均匀性以及贯通性，有利于水分、离子和其它营养物质的运输和传送，为后续培养细胞提供良好的生物环境。
试验例2：
支架粘附性的测定：
在细胞接种7d后，取出细胞与复合多孔支架的复合物，用PBS清洗3次后，用2.5％的戊二醛在4℃下固定30min，接着用PBS进行清洗，切片，用体积分数体积50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％的乙醇行梯度脱水，每个梯度脱水30min，喷金，用环境扫描电镜E-SEM观察。结果见图3。
实验例6所用的复合多孔支架在制备时未加入儿茶酚胺，由图3可以看出，在实验例6中，细胞只在复合多孔支架的孔中有着少量分布；在实施例7中，细胞在支架上的孔的内外分布的较为均匀且密度较大。因此，实施例3中所用支架对细胞的粘附较好。这说明双活性酯聚乙二醇的加入使制得的支架不利于细胞的粘附，而儿茶酚胺能使复合多孔支架能粘附更多的细胞，并且随着培养时间的延长，细胞外基质不断被分泌并伴随着细胞的增殖和通信，细胞逐渐形成细胞片层。
试验例3：
采取双抗夹心ELISA法检测HGF，细胞先在37℃培养4d后，然后在36℃进行培养，检测细胞培养期间HGF体外的释放情况，在共培养后6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d后取100μL细胞培养液，按ELISA试剂盒说明书进行操作，用酶标仪测定提取液中HGF在450nm处的吸光度，绘制HGF的标准曲线，进一步绘制出HGF在复合多孔支架中的释放曲线，试验重复3次，取平均值。结果见图4。
由图4可以看出，实施例8、对比例2、对比例3、对比例4中，HGF在最开始的24h爆发性释放，在对比例3和对比例5中，所用的复合多孔支架在制备时未加入双活性酯聚乙二醇，共培养3d后，HGF释放量较少，累计的释放量没有明显变化，对比例4中，培养温度一直处于36.8-37.5℃，共培养3d后，HGF释放量较少，实施例6中，共培养3d后，培养温度降至35.8-36.5℃，由于复合多孔支架的温度敏感性，HGF释放速度加快，且培养10d仍呈稳定释放状态。
试验例4：
乳蛋白基因的表达量的测定：
总RNA的提取：
三维培养的细胞：在生长的第7d时，回收细胞，用PBS清洗2次；二维培养的细胞：待细胞的生长汇合度达到80-90％时，用0.25％的胰蛋白酶收集细胞，用PBS清洗细胞2次。
除去上清，加入1mL Trizol溶液，混合均匀，后将其转入新的无酶无菌的离心管中，低温静置5min，加入200μL氯仿，混合均匀。
低温静置5min，4℃，12000r/min离心15min。
取上清，加入等体积的异丙醇，混合均匀。
低温静置10min，4℃，12000r/min离心10min。
除去上清，加入75％的乙醇清洗沉淀，4℃，7500r/min离心5min。
除去乙醇，室温干燥沉淀，待沉淀透明时，加入10μL的无酶无菌水溶解，置于-80℃的冰箱中保存。
单链cDNA的合成：
PCR反应体系如表1，反应程序为：37℃，15min；85℃，5s。
表1反转录体系
反应体系成分 体积(μL)
5×Prime Script Buffer 5
Prime Script TMRT Enzyme Mix 1.25
随机引物 1.25
Oligo(dT)<sub>15</sub> 1.25
无菌无酶水 13.75
总RNA 2.5
总体系 25
RT-PCR反应：
反应体系见表2。检测基因的引物序列见表3。反应条件为：95℃，30s；95℃，5s；60℃，30s；60℃，30s；共40个循环。
表2 RT-PCR反应体系
表3 RT-PCR乳蛋白基因分析引物
引物名称 引物序列
β-酪蛋白基因正向引物 5-TCTGCGTCGCTTCCGATCTT-3
β-酪蛋白基因反向引物 5-AGCAGCCCCGATCTTATTT-3
αs1-酪蛋白基因正向引物 5-CCTCTGTTATGGCTATTCGTC-3
αs1-酪蛋白基因反向引物 5-CATGTCTCTTTTCAATGTGCTT-3
κ-酪蛋白基因正向引物 5-CACGGACACCCTCTATTATC-3
κ-酪蛋白基因反向引物 5-GACTTCCGTTCTCTTGCTTG-3
GAPDH正向引物 5-GTTCGTGCTGAGCCTGAACC-3
GAPDH反向引物 5-CACTCGTCTCGGTAGCCGTGAT-3
RT-PCR试验结果采用2-ΔΔCt法进行计算。结果见图5、图6。
对比例5采用二维模式培养奶牛乳腺上皮细胞，由图5和图6可以看出，实施例9采用三维模式培养的奶牛乳腺上皮细胞的αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白的基因表达量均明显高于对比例5，因此，实施例9更有助于奶牛泌乳调控机理的研究。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (10)

1.一种三维细胞培养系统，用于体外细胞培养，包括填充床细胞反应器，其至少含有一个复合多孔支架，其特征在于：所述复合多孔支架的制备方法为：
1)将氯化钠与羟基磷灰石混合均匀；
2)将步骤1)制得的氯化钠与羟基磷灰石的混合物紧密地装入注射器中；
3)将活性因子、胶原蛋白溶液和丝素蛋白溶液混匀后，加入双活性酯聚乙二醇交联处理后，倒入步骤2)的注射器中，按下注射器活塞，室温放置；
4)从注射器中取出材料，用乙醇浸泡，然后用超纯水清洗。
2.根据权利要求1所述的三维细胞培养系统，其特征在于：所述胶原蛋白溶液的浓度为5-7％，丝素蛋白溶液的浓度为5-7％。
3.根据权利要求1或2所述的三维细胞培养系统，其特征在于：所述过筛后的氯化钠的粒径在125-300μm。
4.根据权利要求1或2所述的三维细胞培养系统，其特征在于：所述氯化钠与羟基磷灰石的质量比为1:0.01-0.03。
5.根据权利要求1或2所述的三维细胞培养系统，其特征在于：所述胶原蛋白溶液与所述丝素蛋白溶液的体积比为1:3-5。
6.根据权利要求1或2所述的三维细胞培养系统，其特征在于：所述细胞选自癌细胞、子宫内膜细胞、干细胞、成骨细胞、成纤维细胞之一。
7.根据权利要求1或2所述的三维细胞培养系统，其特征在于：所述细胞是奶牛乳腺上皮细胞。
8.一种三维细胞培养方法，该三维细胞培养方法包括以下步骤：
1)设置权利要求1-7任一项中所述的三维细胞培养系统；
2)向所述细胞反应器供给细胞和细胞培养液；
3)循环灌注所述细胞培养液；
所述细胞在所述复合多孔支架上的接种方式为动态接种。
9.权利要求1-7任一项中所述的三维细胞培养系统在筛选新药物中的用途。
10.权利要求7所述的三维细胞培养系统在研究奶牛泌乳调控中的用途。
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