CN106963986A - 脂肪干细胞‑ecm修饰sis复合工程骨及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脂肪干细胞‑ECM修饰SIS复合工程骨及其制备方法，该复合工程骨的微观结构包括SIS胶原纤维骨架、人脂肪干细胞和细胞外基质层，细胞外基质层由MC3T3‑E1细胞指导和分泌的基质蛋白和多糖构成，细胞外基质层覆盖在SIS胶原纤维骨架的表面，人脂肪干细胞黏附在细胞外基质层上；该复合工程骨具有较高的机械强度和高度类似于天然骨的微观结构，在植入体内初期能够提供较好的组织支撑，能够为干细胞植入提供优异的成骨微环境，植入后人脂肪干细胞能够迅速增殖和成骨分化，促进大骨骼损伤的快速修复；此外，该复合工程骨具有纯天然内源性特点，可避免引入外源物质/基因等带来的不可控因素，具有很好的安全性，在骨再生领域具有广泛的临床应用前景。

Description

脂肪干细胞-ECM修饰SIS复合工程骨及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学中组织工程及干细胞治疗技术领域，具体是一种可应用于骨再生的脂肪干细胞-ECM修饰SIS复合工程骨及其制备方法。
背景技术
我国每年约有350万人因不同原因出现骨缺损，骨手术移植约为150万例，对替代骨的需求量非常大，尤其是大骨骼损伤的替代骨。体内骨修复是细胞与支架材料的协同作用过程，支架材料的三维微观结构能为宿主细胞提供良好黏附、增殖和迁移的微环境。随着组织工程技术的快速发展，利用组织工程原理将细胞与支架材料在体外复合后植入体内进行治疗，往往能有效减少炎症反应和瘢痕生成，促进血管新生和骨骼的再生等。
支架材料作为组织工程的核心要素，其表面性状、结构，机械性能和生物学性能均能调控细胞的各种生命活动和体内组织的修复再生。猪小肠黏膜下层(SIS)，由于其优异的生物相容性、独特的生物力学特性和生物学活性，已被广泛用作再生医学的骨架材料。去细胞化的SIS外观呈淡白色，含碱性成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2,FGF-2)、转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factors-1,IGF-1)、肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)和血小板衍生生长因子-BB(Platelet derived growth factor BB,PDGF-BB)等多种生物活性因子，可用于促进细胞增殖分化与组织再生。功能细胞作为组织工程中的另一基本要素，对骨缺损处组织的重建起着非常重要的作用。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stemcell，BMSC)和脂肪干细胞(adipose-derived stem cell,ADSC)由于具有很强的增殖能力及多向分化的潜能，是目前用于支架材料复合治疗的主要种子细胞。但相比于BMSC而言，ADSC具有来源广泛、取材容易以及在人和动物体内含量丰富等优点，使其在再生医学领域获得了更广泛的关注，并逐渐成为了干细胞研究的热点。目前，干细胞治疗已经显示了良好的组织再生能力，但在提高细胞治疗效率方面仍存在很大困难，主要有以下两个问题：①引入外源性物质或采用基因工程技术定向诱导干细胞的分化，存在诸多不可控因素；②干细胞注入到体内，怎样快速地黏附、融合进入受体组织，从而发挥功能，至今尚在争论中，因此，提高细胞治疗的效率是尚待研究的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种脂肪干细胞-ECM修饰SIS复合工程骨及其制备方法，该复合工程骨具有较高的机械强度和高度类似于天然骨的微观结构，在植入体内初期能够提供较好的组织支撑，能够为干细胞植入提供优异的成骨微环境，植入后脂肪干细胞能够迅速增殖和成骨分化，促进大骨骼损伤的快速修复；此外，该复合工程骨具有纯天然内源性特点，可避免引入外源物质/基因等带来的不可控因素，具有很好的安全性，在骨再生领域具有广泛的临床应用前景。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：脂肪干细胞-ECM修饰SIS复合工程骨，该复合工程骨的微观结构包括SIS胶原纤维骨架、人脂肪干细胞和细胞外基质层，所述的细胞外基质层由MC3T3-E1细胞指导和分泌的基质蛋白和多糖构成，所述的细胞外基质层覆盖在所述的SIS胶原纤维骨架的表面，所述的人脂肪干细胞黏附在所述的细胞外基质层上，在所述的SIS胶原纤维骨架的表面覆盖的细胞外基质层的覆盖量为0.14±0.02mg/cm2，在所述的细胞外基质层上黏附的人脂肪干细胞的黏附量为5～10×105细胞/cm2。
该复合工程骨在干状态下的弹性模量为120±17MPa，在湿状态下的弹性模量为27±4MPa。
上述脂肪干细胞-ECM修饰SIS复合工程骨的制备方法，包括以下无菌操作步骤：
1)成骨细胞培养及传代：准备含有10％胎牛血清的α-MEM培养基作为成骨细胞培养液；将从小鼠颅顶前骨MC3T3-E1细胞系中分离的MC3T3-E1Subclone 14细胞置于5％二氧化碳浓度、37℃的细胞培养箱中培养，每隔48h弃去旧的培养液并加入等量新的培养液，当培养至MC3T3-E1Subclone 14细胞汇合度大于90％时进行细胞传代，该细胞传代的过程为：弃去旧的培养液，加入不含钙镁离子的PBS缓冲液，清洗2-3次；然后加入1-2mL的含EDTA的0.25wt％胰酶，在37℃下孵育1min；收集细胞并加入至离心管，在1000rpm转速下离心2min；弃去上清，然后加入1mL培养液重悬细胞，得到细胞悬液，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度；根据计算得到的细胞密度，将细胞悬液以(1-2)×104细胞/cm2的用量加入至新的细胞培养瓶，然后在该细胞培养瓶中加入5mL的培养液混匀，置于细胞培养箱中培养；重复上述细胞传代过程直至获得足够量的MC3T3-E1Subclone 14细胞；
2)ECM-SIS支架材料的制备：取出干燥无菌的SIS材料，裁剪成所需尺寸，将裁剪好的SIS材料浸泡于含有10％胎牛血清的α-MEM培养基，置于37℃的细胞培养箱中预处理24h；取汇合度为70-80％的MC3T3-E1细胞，消化离心，制备得到细胞悬液并均匀滴加于浸泡过的SIS材料上，种植细胞密度为5×105细胞/cm2，将种植有细胞的SIS材料置于37℃的细胞培养箱孵育，此后每隔48h更换一次含10％胎牛血清的α-MEM培养基，处理4周后用PBS缓冲液清洗3次，然后置于-80℃/37℃反复冻融4次，每次1h；之后再次用PBS缓冲液清洗3次，最终获得的ECM-SIS支架材料，置于-80℃保存备用；该ECM-SIS支架材料包括所述的SIS胶原纤维骨架和所述的细胞外基质层；
3)人脂肪干细胞培养及传代：自中科院干细胞库购入第5代人脂肪干细胞ADSC及配套培养液PCS-500-030TM，并在该培养液中加入干细胞培养用细胞因子试剂盒PCS-500-040TM，将得到的培养液作为干细胞完全培养液；然后将第5代人脂肪干细胞ADSC置于5％二氧化碳浓度、37℃的细胞培养箱中培养，待细胞长到70-80％满时进行传代，该细胞传代的过程为：弃去旧的干细胞完全培养液，加入不含钙镁离子的PBS缓冲液，清洗2-3次；然后加入1-2mL的含EDTA的0.05wt％胰酶至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖培养瓶的底面，置于37℃的细胞培养箱内消化细胞，在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落，收集细胞并加入至离心管，在1000rpm转速下离心5min；去上清，加入2mL干细胞完全培养液，多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液，按照1:2-1:3的比例进行传代，放入37℃的细胞培养箱内培养；重复上述步骤培养至第7代，得到第7代ADSC；
4)复合工程骨的制备：取出步骤2)制备的置于-80℃保存的ECM-SIS支架材料，浸泡于含有10％胎牛血清的α-MEM培养基，置于37℃的细胞培养箱中预处理24h，待用；取汇合度为70-80％的第7代ADSC，消化离心，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度，并将细胞密度为5～10×105细胞/cm2的细胞悬液种植到经预处理的ECM-SIS支架材料上，再置入37℃的细胞培养箱培养得到脂肪干细胞-ECM修饰SIS复合工程骨。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)、本发明公开的脂肪干细胞-ECM修饰SIS复合工程骨，具有较高的机械强度，在干、湿状态下的弹性模量分别可达120±17MPa、27±4MPa，在植入体内初期能够提供较好的组织支撑，该复合工程骨与天然骨内部的矿物化结构和分布极为接近，具有高度类似于天然骨的微观结构，能够为干细胞植入提供优异的成骨微环境，植入后脂肪干细胞能够迅速增殖和成骨分化，促进大骨骼损伤的快速修复；此外，该复合工程骨具有纯天然内源性特点，可避免引入外源物质/基因等带来的不可控因素，具有很好的安全性，在骨再生领域具有广泛的临床应用前景；
(2)、本发明公开的脂肪干细胞-ECM修饰SIS复合工程骨的制备方法，通过人脂肪干细胞ADSC与细胞外基质修饰小肠黏膜下层ECM-SIS支架材料复合得到复合工程骨，具有优异的生物相容性；ECM-SIS支架材料还能提供良好的成骨微环境，调控ADSC的黏附、迁移、增殖和分化等生命活动，利于ADSC进入体内后发挥功能加速修复。
附图说明
图1为本发明培养得到的第7代ADSC的光学显微镜明场照片；
图2为原始的干燥无菌的SIS材料的扫描电镜照片；
图3为制备得到的复合工程骨的微观结构示意图一；
图4为制备得到的复合工程骨的微观结构示意图二；
图5为细胞外基质层的微观结构示意图；
图6为制备得到的复合工程骨的扫描电镜照片；
图7为黏附有ADSC细胞的SIS材料的扫描电镜照片；
图8为黏附有ADSC细胞的ECM-SIS材料的扫描电镜照片；
图9为ECM-SIS与SIS促进ADSC的增殖效果对比；
图10为BMP/Smad通路配体Bmp-4，关键转录因子Runx2和Osterix，下游成骨标志物Alp、Col-I、Bsp、Ocn的mRNA相对表达量；
图11为空白对照组、SIS组、ADSC/SIS组、ECM-SIS组、ADSC/ECM-SIS组的HE染色结果对比图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1的脂肪干细胞-ECM修饰SIS复合工程骨的制备方法，包括以下无菌操作步骤：
1)成骨细胞培养及传代：准备含有10％胎牛血清的α-MEM培养基作为成骨细胞培养液；将从小鼠颅顶前骨MC3T3-E1细胞系中分离的MC3T3-E1Subclone 14细胞置于5％二氧化碳浓度、37℃的细胞培养箱中培养，每隔48h弃去旧的培养液并加入等量新的培养液，当培养至MC3T3-E1Subclone 14细胞汇合度大于90％时进行细胞传代，该细胞传代的过程为：弃去旧的培养液，加入不含钙镁离子的PBS缓冲液，清洗2次；然后加入1mL的含EDTA的0.25wt％胰酶，在37℃下孵育1min；收集细胞并加入至离心管，在1000rpm转速下离心2min；弃去上清，然后加入1mL培养液重悬细胞，得到细胞悬液，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度；根据计算得到的细胞密度，将细胞悬液以(1-2)×104细胞/cm2的用量加入至新的细胞培养瓶，然后在该细胞培养瓶中加入5mL的培养液混匀，置于细胞培养箱中培养；重复上述细胞传代过程直至获得足够量的MC3T3-E1Subclone 14细胞；
2)ECM-SIS支架材料的制备：取出干燥无菌的SIS材料(其扫描电镜照片见图2)，裁剪成所需尺寸，将裁剪好的SIS材料浸泡于含有10％胎牛血清的α-MEM培养基，置于37℃的细胞培养箱中预处理24h；取汇合度为70-75％的MC3T3-E1细胞，消化离心，制备得到细胞悬液并均匀滴加于浸泡过的SIS材料上，种植细胞密度为5×105细胞/cm2，将种植有细胞的SIS材料置于37℃的细胞培养箱孵育，此后每隔48h更换一次含10％胎牛血清的α-MEM培养基，处理4周后用PBS缓冲液清洗3次，然后置于-80℃/37℃反复冻融4次，每次1h；之后再次用PBS缓冲液清洗3次，最终获得的ECM-SIS支架材料，置于-80℃保存备用；参见图3和图4，该ECM-SIS支架材料包括SIS胶原纤维骨架1和细胞外基质层3；
3)人脂肪干细胞培养及传代：自中科院干细胞库购入第5代人脂肪干细胞ADSC及配套培养液PCS-500-030TM，并在该培养液中加入干细胞培养用细胞因子试剂盒PCS-500-040TM，将得到的培养液作为干细胞完全培养液；然后将第5代人脂肪干细胞ADSC置于5％二氧化碳浓度、37℃的细胞培养箱中培养，待细胞长到70-75％满时进行传代，该细胞传代的过程为：弃去旧的干细胞完全培养液，加入不含钙镁离子的PBS缓冲液，清洗3次；然后加入1mL的含EDTA的0.05wt％胰酶至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖培养瓶的底面，置于37℃的细胞培养箱内消化细胞，在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落，收集细胞并加入至离心管，在1000rpm转速下离心5min；去上清，加入2mL干细胞完全培养液，多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液，按照1:2的比例进行传代，放入37℃的细胞培养箱内培养；重复上述步骤培养至第7代，得到第7代ADSC，其光学显微镜明场照片如图1所示；
4)复合工程骨的制备：取出步骤2)制备的置于-80℃保存的ECM-SIS支架材料，浸泡于含有10％胎牛血清的α-MEM培养基，置于37℃的细胞培养箱中预处理24h，待用；取汇合度为70-75％的第7代ADSC，消化离心，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度，并将细胞密度为5～10×105细胞/cm2的细胞悬液种植到经预处理的ECM-SIS支架材料上，再置入37℃的细胞培养箱培养得到脂肪干细胞-ECM修饰SIS复合工程骨，简写为ADSC/ECM-SIS复合工程骨，其复合工程骨的扫描电镜照片见图6。
实施例2的脂肪干细胞-ECM修饰SIS复合工程骨的制备方法，包括以下无菌操作步骤：
1)成骨细胞培养及传代：准备含有10％胎牛血清的α-MEM培养基作为成骨细胞培养液；将从小鼠颅顶前骨MC3T3-E1细胞系中分离的MC3T3-E1Subclone 14细胞置于5％二氧化碳浓度、37℃的细胞培养箱中培养，每隔48h弃去旧的培养液并加入等量新的培养液，当培养至MC3T3-E1Subclone 14细胞汇合度大于90％时进行细胞传代，该细胞传代的过程为：弃去旧的培养液，加入不含钙镁离子的PBS缓冲液，清洗3次；然后加入1.5mL的含EDTA的0.25wt％胰酶，在37℃下孵育1min；收集细胞并加入至离心管，在1000rpm转速下离心2min；弃去上清，然后加入1mL培养液重悬细胞，得到细胞悬液，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度；根据计算得到的细胞密度，将细胞悬液以(1-2)×104细胞/cm2的用量加入至新的细胞培养瓶，然后在该细胞培养瓶中加入5mL的培养液混匀，置于细胞培养箱中培养；重复上述细胞传代过程直至获得足够量的MC3T3-E1Subclone 14细胞；
2)ECM-SIS支架材料的制备：取出干燥无菌的SIS材料，裁剪成所需尺寸，将裁剪好的SIS材料浸泡于含有10％胎牛血清的α-MEM培养基，置于37℃的细胞培养箱中预处理24h；取汇合度为75-80％的MC3T3-E1细胞，消化离心，制备得到细胞悬液并均匀滴加于浸泡过的SIS材料上，种植细胞密度为5×105细胞/cm2，将种植有细胞的SIS材料置于37℃的细胞培养箱孵育，此后每隔48h更换一次含10％胎牛血清的α-MEM培养基，处理4周后用PBS缓冲液清洗3次，然后置于-80℃/37℃反复冻融4次，每次1h；之后再次用PBS缓冲液清洗3次，最终获得的ECM-SIS支架材料，置于-80℃保存备用；参见图3和图4，该ECM-SIS支架材料包括SIS胶原纤维骨架1和细胞外基质层3；
3)人脂肪干细胞培养及传代：自中科院干细胞库购入第5代人脂肪干细胞ADSC及配套培养液PCS-500-030TM，并在该培养液中加入干细胞培养用细胞因子试剂盒PCS-500-040TM，将得到的培养液作为干细胞完全培养液；然后将第5代人脂肪干细胞ADSC置于5％二氧化碳浓度、37℃的细胞培养箱中培养，待细胞长到75-80％满时进行传代，该细胞传代的过程为：弃去旧的干细胞完全培养液，加入不含钙镁离子的PBS缓冲液，清洗2次；然后加入1.5mL的含EDTA的0.05wt％胰酶至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖培养瓶的底面，置于37℃的细胞培养箱内消化细胞，在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落，收集细胞并加入至离心管，在1000rpm转速下离心5min；去上清，加入2mL干细胞完全培养液，多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液，按照1:3的比例进行传代，放入37℃的细胞培养箱内培养；重复上述步骤培养至第7代，得到第7代ADSC，，其光学显微镜明场照片参见图1；
4)复合工程骨的制备：取出步骤2)制备的置于-80℃保存的ECM-SIS支架材料，浸泡于含有10％胎牛血清的α-MEM培养基，置于37℃的细胞培养箱中预处理24h，待用；取汇合度为75-80％的第7代ADSC，消化离心，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度，并将细胞密度为5～10×105细胞/cm2的细胞悬液种植到经预处理的ECM-SIS支架材料上，再置入37℃的细胞培养箱培养得到脂肪干细胞-ECM修饰SIS复合工程骨，简写为ADSC/ECM-SIS复合工程骨，其复合工程骨的扫描电镜照片参见图6。
以上实施例中制备得到的复合工程骨的微观结构示意图见图3和图4，其微观结构包括SIS胶原纤维骨架1、人脂肪干细胞2和细胞外基质层3，细胞外基质层3的微观结构示意图见图5，细胞外基质层3由MC3T3-E1细胞指导和分泌的基质蛋白和多糖构成，细胞外基质层3覆盖在SIS胶原纤维骨架1的表面，人脂肪干细胞2黏附在细胞外基质层上，在SIS胶原纤维骨架1的表面覆盖的细胞外基质层3的覆盖量为0.14±0.02mg/cm2，在细胞外基质层3上黏附的人脂肪干细胞2的黏附量为5～10×105细胞/cm2。
以下评估本发明脂肪干细胞-ECM修饰SIS复合工程骨在促进ADSC细胞的黏附、增殖、成骨分化和加速体内临界骨缺损的修复方面的效果。具体过程如下：
1、促进ADSC细胞的黏附
将-80℃保存的ECM-SIS支架材料取出并与作为对照的SIS空白材料一并放入96孔板，收集汇合度为70-80％的第7代ADSC，调整细胞悬液浓度，取等量细胞悬液分别加入至SIS、ECM-SIS两组材料上，每孔加入100μL细胞悬液，细胞密度为2500个细胞/孔，置入37℃的细胞培养箱培养；24h后用PBS缓冲液清洗3次，充分洗去材料表面残余培养基，10％福尔马林固定，4℃冰箱过夜；次日弃去10％福尔马林后分别用50％、70％、90％、95％和100％的梯度酒精脱水处理后，真空干燥处理；材料完全干燥后，制片，镀金属膜，分别通过扫描电镜观察两组材料表面ADSC细胞的黏附情况。黏附有ADSC细胞的SIS材料的扫描电镜照片见图7，黏附有ADSC细胞的ECM-SIS材料的扫描电镜照片见图8，对比发现，ADSC细胞在ECM-SIS材料上铺展的更为充分。
2、促进ADSC的增殖
a.将-80℃保存的ECM-SIS支架材料取出并与作为对照的SIS空白材料一并放入96孔板，收集汇合度为70-80％的第7代ADSC，调整细胞悬液浓度，取等量细胞悬液分别加入至SIS、ECM-SIS两组材料上，每孔加入100μL细胞悬液，细胞密度为2000个细胞/孔；
b.37℃细胞培养箱中培养，分别于day1，day2，day3，day5，day7测定细胞数量；
c.每孔加入10μL CCK-8溶液，在37℃培养箱中反应2h，酶联免疫检测仪OD450nm测量各孔的吸光值。
图9为ECM-SIS与SIS促进ADSC的增殖效果对比结果，结果显示，自第3天起，两组材料上的细胞数目出现显著差异，可见ECM-SIS具有促进ADSC增殖的作用。
3、促进ADSC的成骨分化
将-80℃保存的ECM-SIS支架材料取出并与作为对照的SIS空白材料一并放入96孔板，收集汇合度为70-80％的第7代ADSC，收集汇合度为70-80％的第7代ADSC，调整细胞悬液浓度，取等量细胞悬液分别加入至SIS、ECM-SIS两组材料上，每孔加入100μL细胞悬液，细胞密度为1×105个细胞/孔；置入37℃的细胞培养箱培养；分别培养3天、7天后，提取两组材料上细胞的RNA，利用real-time RT-PCR定量分析BMP/Smad通路配体Bmp-4，关键转录因子Runx2和Osterix，下游成骨标志物Alp、Col-I、Bsp、Ocn等的mRNA相对表达量(见图10)，培养在ECM-SIS上的ADSC，其细胞内成骨分化相关基因较原SIS明显上调，说明ECM-SIS可以加速ADSC向成骨方向分化，其是通过激活BMP/Smad通路来实现的。
4、加速体内临界骨缺损的修复
将制备得到的ADSC/ECM-SIS复合工程骨应用于小鼠头盖骨临界缺失模型，观察骨愈合修复过程，具体实验过程为：
1、选择实验对象：选取8周龄雄性C57BL/6小鼠作为实验对象。
2、建立头盖骨临界缺失模型：在小鼠头盖骨两侧部位用Miltex公司生产的BiopsyPunch设备移去直径为4mm的骨组织，然后分别随机植入SIS、ADSC/SIS、ECM-SIS、ADSC/ECM-SIS或无植入物作为对照；手术缝合后小鼠正常饲养4周后处死，取得头盖骨组织进行体内成骨状况分析。
3、组织学分析：结果如图11所示，五组分别为无植入物的空白对照组、SIS组、ADSC/SIS组、ECM-SIS组、ADSC/ECM-SIS组的HE染色。在空白对照骨缺失处，4周后几乎没有新生骨；ADSC/SIS组，靠近原始骨附近出现有限的新生骨；而在植入本发明ADSC/ECM-SIS复合工程骨的位置，出现了较多的新生骨组织，且骨桥几乎覆盖了整个缺失区域。
4、统计学分析：采用软件Imagej对小鼠骨缺失处的新生骨面积比例进行计算，每个样品随机取5张不同截面的切片，通过统计学分析发现空白组中新生骨面积比例为0.53％±0.12％(Mean±S.D.)，SIS组中新生骨面积比例为2.33％±2％(Mean±S.D.)，ADSC/SIS组中新生骨面积比例为8.02％±4.42％(Mean±S.D.)，ECM-SIS组中新生骨面积比例为6.77％±4.33％(Mean±S.D.)，而植入本发明ADSC/ECM-SIS复合工程骨组新生骨面积比例达到21.77％±6.99％(Mean±S.D.)，较空白组具有显著差异(p<0.001)，证明本发明ADSC/ECM-SIS复合工程骨在体内骨修复过程中效果显著。

Claims (3)

1.脂肪干细胞-ECM修饰SIS复合工程骨，其特征在于该复合工程骨的微观结构包括SIS胶原纤维骨架、人脂肪干细胞和细胞外基质层，所述的细胞外基质层由MC3T3-E1细胞指导和分泌的基质蛋白和多糖构成，所述的细胞外基质层覆盖在所述的SIS胶原纤维骨架的表面，所述的人脂肪干细胞黏附在所述的细胞外基质层上，在所述的SIS胶原纤维骨架的表面覆盖的细胞外基质层的覆盖量为0.14±0.02mg/cm2，在所述的细胞外基质层上黏附的人脂肪干细胞的黏附量为5～10×105细胞/cm2。
2.根据权利要求1所述的脂肪干细胞-ECM修饰SIS复合工程骨，其特征在于该复合工程骨在干状态下的弹性模量为120±17MPa，在湿状态下的弹性模量为27±4MPa。
3.权利要求1或2所述的脂肪干细胞-ECM修饰SIS复合工程骨的制备方法，其特征在于包括以下无菌操作步骤：
1)成骨细胞培养及传代：准备含有10％胎牛血清的α-MEM培养基作为成骨细胞培养液；将从小鼠颅顶前骨MC3T3-E1细胞系中分离的MC3T3-E1 Subclone 14细胞置于5％二氧化碳浓度、37℃的细胞培养箱中培养，每隔48h弃去旧的培养液并加入等量新的培养液，当培养至MC3T3-E1 Subclone 14细胞汇合度大于90％时进行细胞传代，该细胞传代的过程为：弃去旧的培养液，加入不含钙镁离子的PBS缓冲液，清洗2-3次；然后加入1-2mL的含EDTA的0.25wt％胰酶，在37℃下孵育1min；收集细胞并加入至离心管，在1000rpm转速下离心2min；弃去上清，然后加入1mL培养液重悬细胞，得到细胞悬液，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度；根据计算得到的细胞密度，将细胞悬液以(1-2)×104细胞/cm2的用量加入至新的细胞培养瓶，然后在该细胞培养瓶中加入5mL的培养液混匀，置于细胞培养箱中培养；重复上述细胞传代过程直至获得足够量的MC3T3-E1 Subclone 14细胞；
2)ECM-SIS支架材料的制备：取出干燥无菌的SIS材料，裁剪成所需尺寸，将裁剪好的SIS材料浸泡于含有10％胎牛血清的α-MEM培养基，置于37℃的细胞培养箱中预处理24h；取汇合度为70-80％的MC3T3-E1细胞，消化离心，制备得到细胞悬液并均匀滴加于浸泡过的SIS材料上，种植细胞密度为5×105细胞/cm2，将种植有细胞的SIS材料置于37℃的细胞培养箱孵育，此后每隔48h更换一次含10％胎牛血清的α-MEM培养基，处理4周后用PBS缓冲液清洗3次，然后置于-80℃/37℃反复冻融4次，每次1h；之后再次用PBS缓冲液清洗3次，最终获得的ECM-SIS支架材料，置于-80℃保存备用；该ECM-SIS支架材料包括所述的SIS胶原纤维骨架和所述的细胞外基质层；
3)人脂肪干细胞培养及传代：自中科院干细胞库购入第5代人脂肪干细胞ADSC及配套培养液并在该培养液中加入干细胞培养用细胞因子试剂盒将得到的培养液作为干细胞完全培养液；然后将第5代人脂肪干细胞ADSC置于5％二氧化碳浓度、37℃的细胞培养箱中培养，待细胞长到70-80％满时进行传代，该细胞传代的过程为：弃去旧的干细胞完全培养液，加入不含钙镁离子的PBS缓冲液，清洗2-3次；然后加入1-2mL的含EDTA的0.05wt％胰酶至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖培养瓶的底面，置于37℃的细胞培养箱内消化细胞，在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落，收集细胞并加入至离心管，在1000rpm转速下离心5min；去上清，加入2mL干细胞完全培养液，多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液，按照1:2-1:3的比例进行传代，放入37℃的细胞培养箱内培养；重复上述步骤培养至第7代，得到第7代ADSC；
4)复合工程骨的制备：取出步骤2)制备的置于-80℃保存的ECM-SIS支架材料，浸泡于含有10％胎牛血清的α-MEM培养基，置于37℃的细胞培养箱中预处理24h，待用；取汇合度为70-80％的第7代ADSC，消化离心，对此细胞悬液进行细胞计数并计算该细胞悬液的细胞密度，并将细胞密度为5～10×105细胞/cm2的细胞悬液种植到经预处理的ECM-SIS支架材料上，再置入37℃的细胞培养箱培养得到脂肪干细胞-ECM修饰SIS复合工程骨。
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