CN105126171A - 一种具有形状记忆功能的凝胶生物材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种凝胶生物材料,由小肠黏膜下层细胞外基质制成,其特征在于:所述凝胶生物材料为多孔结构,孔隙相互贯通,体积压缩85%以上可恢复原有形态。本发明其主要成分结构与天然细胞外基质成分接近,具有弹性形变能力及形态记忆功能,良好的机械性能,同时具有较好生物相容性,适合作为临床用组织再生修复材料。
Description
技术领域
本发明属于生物材料领域,具体涉及一种具有形状记忆功能的凝胶生物材料,尤其适合用于皮肤创面修复。
背景技术
烧伤、创伤、糖尿病、慢性溃疡等原因常造成皮肤的缺损。细胞治疗作为皮肤缺损/缺失及皮肤色素性疾病最有效的治疗手段,在规模化培养制备得到临床级细胞数量之后,如何将其有效应用于机体进行治疗,保持其活力与活性是细胞治疗成败的关键1。
人体组织的基本结构由细胞和细胞外基质所构成,细胞和细胞外基质的相互作用是创伤组织再生修复的关键。人体的细胞外基质受来源、伦理等的限制,使用受限,而与人体亲缘关系较近的动物性细胞外基质在组织再生修复中具有重要的作用。动物源性的细胞外基质的成分组成和结构与人类似,且来源充分,安全可靠,是一种良好的再生组织材料支架,同时不存在伦理学问题,便于进行规模化、产业化制备2。
小肠黏膜下层细胞外基质(smallintestinalsubmucosa,SIS)作为一种天然细胞外基质材料,具备良好的机械特性、组织相容性和较低的免疫原性。但PSIS仍存在以下不足,天然的PSIS为薄膜状材料,用于皮肤等组织的修复缺乏足够的厚度,其次,需要在其表面接种细胞时,过程较为繁琐,使用不便。
利用SIS的主要成分胶原蛋白制备水凝胶或胶原海绵,用作细胞及药物的缓释载体及3D培养细胞支架已有报道,以改进天然生物材料在使用上的便利性。但上述水凝胶仍存在不足:一是其成分仅有胶原蛋白组成,结构成分与天然细胞外基质组成存在差异,其次水凝胶物理质脆易碎,操作不便,限制了它在体表创面修复上的临床应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种凝胶生物材料,其主要成分结构与天然细胞外基质成分接近,具有弹性形变能力及形态记忆功能,良好的机械性能,通过注射器进行注射后能恢复注射前的物理状态,同时具有较好生物相容性,适合作为临床用组织再生修复材料。
本发明的目的是通过以下措施实现的:
一种凝胶生物材料,由小肠黏膜下层细胞外基质(smallintestinalsubmucosa,SIS)制成,其特征在于:所述凝胶生物材料为多孔结构,孔隙相互贯通,体积压缩85%以上可恢复原有形态。优选为90%以上。
优选地,上述体积压缩和恢复原有形态可以在液体中进行。其具有良好的形态记忆功能,可利用其有水的环境里受压后可立即恢复原有形态,可以通过挤压排水后快速吸附细胞悬液恢复形态,将细胞转移至材料内部,通过体外孵育4h左右即可使细胞充分粘附在支架上,构建细胞缓释载体。不需要体外培养数天,让细胞迁移爬行至材料内部。大大减少了移植准备时间。且其相互连通的多孔结构还为营养物质的交换及血管内皮细胞的迁移提供良好的条件。
优选地,上述凝胶生物材料平均孔径为70-150μm。
上述凝胶生物材料,原料包括猪小肠黏膜下层细胞外基质(Pigsmallintestinalsubmucosa,PSIS),以1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)为交联剂制备而成。优选的还包括NHS。本发明在交联完成后并不会接枝到材料上,通过漂洗即可同MES、NHS一起从材料内部清除,而现有冷凝胶均需通过添加额外有毒化学基团(甲基丙烯酰胺、己二酸二酰肼等)达到交联效果,且操作步骤繁琐。优选地,猪小肠黏膜下层粉末溶液:EDC溶液的体积比为5-10∶1-3。优选为8∶1。EDC浓度为5-30mM,SIS粉末溶液浓度8-10mg/ml。
上述凝胶生物材料,其制备方法包括:将SIS粉末按终浓度为10mg/ml溶于MES缓冲液中,4℃搅拌至完全溶解;将SIS溶液与EDC/NHS交联液混合;将混匀液体-80℃交联24h;清洗,制得。
上述凝胶生物材料,其制备方法包括包括以下步骤:
(1)PSIS粉末的制备
获取新鲜猪小肠,首先通过机械方法将小肠的浆膜层和肌层去除,生理盐水反复冲洗干净;用甲醇和氯仿(1∶1,V/V)脱脂溶液浸泡12小时,并用去离子水以除去有机溶剂;随后,将SIS浸泡在0.05%胰蛋白酶/0.05%乙二胺四乙酸溶液中,室温下消化12小时,生理盐水溶液反复洗涤去除胰蛋白酶;将SIS置于0.5%十二烷基硫酸钠(SDS)生理盐水中摇晃振荡4小时,并用生理盐水溶液彻底冲洗以除去洗涤剂;将处理后的SIS浸于0.5%醋酸溶液中过夜,粉碎,加胃蛋白酶4℃酶解2天后过滤;滤液经两次盐析离心后取沉淀;将沉淀溶于0.1%醋酸中,透析去除NaCl,并用冷冻干燥机在-40℃条件下冷冻干燥48小时,将冻干的SIS海绵进一步粉碎后得到SIS粉末;
(2)冷凝胶的制备
将SIS粉末按终浓度为10mg/ml溶于MES缓冲液中,4℃搅拌至完全溶解;将SIS溶液与EDC/NHS交联液混合;将混匀液体-80℃交联24h;室温下用0.1M磷酸氢二钠溶液漂洗2h,每30分钟换液一次;蒸馏水清洗2h,每30分钟换液一次;浸于PBS中4℃保存待用。
上述生物凝胶材料在皮肤创面修复中的应用。
有益效果
1.本发明采用脱细胞PSIS粉末,利用水溶性碳化二亚胺零长交联,在不添加任何化学基团的条件下实现了PSIS冷凝胶的制备;并赋予其多孔并且相互贯通的特性,具有弹性形变能力及形态记忆功能,改善其机械性能,减缓降解率,使其能更好的促进细胞的粘附与生长。
2.本发明经实验验证支架材料的孔隙大小、体内外降解率、生物相容性及细胞毒性、体外细胞培养及动物移植,证明本发明制得的SIS海绵支架具有良好生物性能。
3.本发明的猪小肠粘膜下层冷凝胶具有弹性形变能力,可随意钳夹、挤压而不破碎。较水凝胶具有明显的优势。且因为其具有形态记忆功能,在有水的环境里受压后可立即恢复原有形态,可利用其特性通过挤压排水后快速吸附细胞悬液恢复形态,将细胞转移至材料内部,通过体外孵育4h使细胞充分粘附在支架上,构建细胞缓释载体。不需要体外培养数天,让细胞迁移爬行至材料内部。大大减少了移植准备时间。其相互连通的多孔结构还为营养物质的交换及血管内皮细胞的迁移提供良好的条件。
4.本发明冷凝胶的降解速率及机械性能均得到明显改善。
5.本发明中,小肠粘膜下层主要成分为I型和III型胶原,含有丰富的羧基和氨基,通过EDC将氨基和羧基链接。室温溶解后形成大小不一的孔径,已完成交联的小肠粘膜下层具有一定的机械强度,可维持水凝胶的形态。当遇到外力时通过改变孔径大小实现弹性形变,去除外力后吸水恢复。
附图说明
图1本发明的凝胶生物材料A-表面电镜扫描图,B-断面电镜扫描结果图,C-内部孔隙相连通SEM图。
图2本发明的凝胶生物材料吸水率。
图3本发明的凝胶生物材料,可随意钳夹不破碎,手术刀片切割呈圆盘状,直径3.5cm,厚0.2cm圆盘状冷凝胶(3mlSIS溶液/中皿)水合状态(左图)及PSIS冻干凝胶复水后又可复原成左图所示的状态(右图)。
图4本发明的凝胶生物材料具有的形状记忆功能;直径6mm,高1cm的冷凝胶A-压缩前,B-加压中,C-压缩后即刻恢复原状的效果图。
图5本发明的凝胶生物材料具有的形状记忆功能;长4mm厚2mm正方形冷凝胶左-注射前,右-采用12号针头注射后去除外力恢复原始大小的效果图。
图6本发明的凝胶材料体外降解实验。
图7本发明的凝胶材料细胞相容性实验;含绿色荧光蛋白的小鼠成纤维细胞在本发明的凝胶表面(A)和内部(B)的生长情况,绿色小点为细胞。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述,但本发明并不仅限于此。
实施例1
一种凝胶生物材料,按以下方法制备:
1、猪小肠黏膜下层细胞外基质(PSIS)的制备
从养猪场获取新鲜猪小肠,首先通过机械方法将小肠的浆膜层和肌层去除,生理盐水反复冲洗干净。用甲醇和氯仿(1∶1,V/V)脱脂溶液浸泡12小时,并用去离子水以除去有机溶剂。随后,将SIS浸泡在0.05%胰蛋白酶/0.05%乙二胺四乙酸溶液中,室温下消化12小时,生理盐水溶液反复洗涤去除胰蛋白酶。将SIS置于0.5%十二烷基硫酸钠(SDS)生理盐水中摇晃振荡4小时,并用生理盐水溶液彻底冲洗以除去洗涤剂。将处理后的SIS浸于0.5%醋酸溶液中过夜,用打浆机粉碎,加胃蛋白酶室温下酶解2天后过滤。滤液经两次盐析离心后取沉淀。将沉淀溶于0.1%醋酸中,透析去除NaCl,并用冷冻干燥机在-40℃条件下冷冻干燥48小时,将冻干的SIS海绵进一步粉碎后得到SIS粉末备用。
2、具有形状记忆功能的PSIS凝胶的制备
1)配制50mMMES缓冲液,用氢氧化钠调ph至5.5。
A:0.05MMES:MES9.761g溶于100ml水中
B:0.05MNaOH:NaOH0.2g溶于100ml水中
100mlA+19mlB测PH值为5.5
2)配制500mMEDC溶液及250mMNHS溶液,并按体积比例稀释成EDC/NHS浓度分别为:300mM/150mM交联液。EDC∶NHS=2∶1(摩尔比)。
3)将SIS粉末按终浓度为10mg/ml的量溶于MES缓冲液中,4℃下磁力搅拌器搅拌过夜至完全溶解。1000转/分,2分钟脱气泡。
4)将SIS溶液转移至20ml注射器中,取适量不同浓度EDC/NHS交联液至另一注射器中,通过三通管相连。注意排空气避免气泡产生。往复推注使交联剂混匀至SIS溶液中。溶液体积比为:SIS∶EDC∶NHS=8∶1∶1。
5)将混匀液体转入至模具中,-80℃交联24h。
6)室温下溶解后0.1M磷酸氢二钠以100转/分漂洗2h,每30分钟换液一次。蒸馏水清洗2h,每30分钟换液一次。
实施例2实施例1所制得的凝胶生物材料(PSIS冷凝胶)性能效果
1.形态学观察及吸水率测定。
(1)将冷凝胶-80℃冷冻12h后置于低温冷冻干燥机冻干24h。剪切成1cm*1cm大小。
(2)将30mMEDC交联样品喷金处理后,扫描电镜观察支架材料表面形态和截面形貌(图1),运用ImageJ软件分析图片,并计算支架的平均孔径(孔径大小为106.63±28.9um)。
结果表明PSIS凝胶具有良好的空隙结构,有利于组织修复过程中细胞的前移和营养物质的交换。
(3)将冻干冷凝胶称重(n=6)记M1,置于12孔板中,浸没于PBS溶液过夜。用镊子小心夹起冷凝胶的一角,滤纸吸除表面多余水分,再次称重,记M2。按以下公式计算冷凝胶吸水率:冷凝胶吸水率=(M2-M1)/M1。吸水率=61.5042±5.73703(图2)。
2.PSIS凝胶具有良好的机械性能和复水特性(图3)
图片显示形状记忆功能的PSIS凝胶具有良好的机械性能,能耐受镊子等手术器械的夹取。
3、形状记忆功能的PSIS凝胶具有优良的形状记忆功能(图4、图5)
图4显示形状记忆功能的PSIS凝胶再受到外界作用力的情况下,可压缩90%以上,而除去外界作用力之后,即刻恢复原来的形态,显示出良好的形状记忆能力。
图5显示直径0.4mm的形状记忆功能的PSIS凝胶能通过注射器针头,且通过注射器针头后能恢复之前的形态,显示该材料作为细胞治疗载体能够利用注射器方便的注射到修复组织部位。
4、形状记忆功能的PSIS凝胶具有良好的抗降解性(图6)
随着EDC浓度升高,降解速率逐渐减缓,第7天5、10、20、30、50mMEDC各组材料剩余率分别为16.6%、33.29%、56.57%、71.66%、74.71%。差异显著(P<0.0001)。本发明在5-30mM浓度范围,冷凝胶具有良好的降解速率及机械性能。通过调节不同的交联剂浓度,可实现形状记忆功能的PSIS凝胶的降解速率控制。
5、形状记忆功能的PSIS凝胶具有良好的细胞相容性(图7)
材料与含绿色荧光蛋白的小鼠成纤维细胞复合培养3天后,用荧光显微镜观察。可见细胞均匀分散在材料表面和内部,说明形状记忆功能的PSIS凝胶具有良好的细胞相容性,可作为细胞治疗的载体使用。
Claims (9)
1.一种凝胶生物材料,由小肠黏膜下层细胞外基质制成,其特征在于:所述凝胶生物材料为多孔结构,孔隙相互贯通,体积压缩85%以上可恢复原有形态。
2.如权利要求1所述的凝胶生物材料,体积压缩并恢复原有形态的性能可以在液体中实现。
3.如权利要求1或2所述的凝胶生物材料,所上述凝胶生物材料平均孔径为70-150μm。
4.如权利要求1-3任一所述的凝胶生物材料,原料包括PSIS,采用1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)为交联剂。
5.如权利要求4所述的凝胶生物材料,EDC浓度为5-30mM。
6.如权利要求4或5所述的凝胶生物材料,SIS粉末溶液浓度8-10mg/ml。
7.如权利要求5所述的凝胶生物材料,SIS粉末溶液:EDC溶液的体积比为5-10:1-3;优选的,SIS粉末溶液:EDC的体积比为8:1。
8.如权利要求1所述的凝胶生物材料,其制备方法包括将SIS粉末按终浓度为10mg/ml溶于MES缓冲液中,4℃搅拌至完全溶解;将SIS溶液与EDC/NHS交联液混合;将混匀液体-80℃交联24h;清洗,制得。
9.如权利要求1-8任一所述生物凝胶材料在皮肤创面修复中的应用。
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