CN102973984B - 一种复合材料多孔支架的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合材料多孔支架的制备方法。该方法将丝素蛋白、胶原蛋白和壳聚糖复合在一起,得到白色海绵状的复合多孔支架。该方法制备的多孔支架可应用于组织和创面的填充和修复,以及组织工程,药物释放等技术领域。本发明所制备的复合多孔支架的孔隙率达到98%以上,且尺寸分布于50~400μm,微孔之间互通。本发明所得的复合多孔支架再浸水后能保持原有的形态,有海绵的功能,挤压后能恢复原有形态。
Description
技术领域
本发明涉及一种复合材料多孔支架的制备方法,涉及一种以丝素蛋白、胶原蛋白以及壳聚糖为原料,制备具有同细胞外基质结构相类似的多孔支架技术,所制备的多孔支架孔径直径在50μm~400μm之间,可应用于组织和创面的填充和修复,以及组织工程,药物释放等技术领域。
背景技术
生物医学工程中一个重要方面在于支架材料的研究。引入合适支架材料是促进细胞沿着需要的方向分化并形成组织的一个重要因素,这样利于组织的修复。三维多孔的细胞支架不但可以容纳细胞、细胞产物和细胞外基质,更是细胞附着的基本框架和代谢场所,它的形态和功能直接影响其所构成的组织形态和功能。
丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白,丝素蛋白作为组织工程支架材料具有强度高、多孔、易加工处理、生物相容性多,以及促进细胞粘附、增值和分化的优点。通常制备成各种形状、如膜、海绵、无纺网而广泛应用到人工皮肤、骨等领域。通过调整丝素蛋白的晶体结构种类和含量来调整支架生物降解性。
胶原用于组织修复已有20多年的历史,胶原是用于组织修复中研究得最广泛的天然材料。胶原作为支架材料的优势在于可以被细胞相关酶类识别,通过重建和降解为新生组织提供场所和空间。胶原作为天然细胞外基质的成分,含有利于细胞粘附的基团,为细胞提供了较为接近自然状态的表面。相比于其他支架,胶原还具有适合的分子信号刺激种子细胞合成新的胶原。
壳聚糖是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用得到的,化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖,由于其生物相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性,这种天然高分子在生物医药行业得到了广泛的应用。
单一材料构建的组织工程支架往往无法同时满足生物相容生物活性及一定的力学性能等特性,比如丝素蛋白虽有上述优点,但是由于其亲水性较差,降解缓慢而使其应用受到了限制。再比如,胶原蛋白也有机械性能差,强度不够,降解过快的缺点使其应用受到限制。壳聚糖具有很好的止血和吸水的能力,但是同样有强度不高,降解快的缺点。
有文献表明,有人曾用胶原蛋白和丝素蛋白制备复合支架。虽然该复合支架有着优异的生物相容性和力学强度高等特点,但是在亲水性和吸水能力方面却不尽人意,并且在组织和创面修复的过程中,止血效果也不是很好。
发明内容
鉴于上述不足之处,本发明目的是提供一种复合材料多孔支架制备的方法,可以制备出一种强度高,组织相容性好,吸水性好的多孔支架。
为达到上述目的,本发明通过将不同优异性能的材料复合,形成优势互补的新型复合支架材料。基于这个原理,我们以丝素蛋白为“骨架”,再以I型胶原蛋白和壳聚糖包裹和填充丝素蛋白的复合方式的一种新型材料。既包含胶原蛋白良好的生物相容性,又有丝素蛋白优异的机械性能,并且还具有壳聚糖的止血和吸水能力,同时我们可以通过调整丝素蛋白,胶原蛋白和壳聚糖在复合材料里的比例来控制其生物学功能和降解时间。
本发明的具体技术方案为:一种复合材料多孔支架的制备方法,其特征在于,包括下述步骤:
(1)取胶原蛋白溶液、丝素蛋白溶液、壳聚糖溶液混合:
将一混合容器置于0~10℃冷水浴和超声振荡环境中,然后再向混合容器中加入壳聚糖溶液,用搅拌器一边匀速搅拌一边加入胶原蛋白溶液,加入完毕后继续搅拌10~120分钟得复合溶液;最后将丝素蛋白溶液用均匀滴入复合溶液中,匀速搅拌,此滴入过程同样处于0~10℃冷水浴和超声振荡环境中,滴入完毕后继续搅拌10~120分钟得粘稠物,然后将粘稠物分装注入冻干模具后在0~10℃下保存1~6小时得初冻物备用;加入丝素蛋白溶液、胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液的质量比为1:1:1~7:7:1;
(2)冷冻干燥
将步骤(1)所得的初冻物放入-10℃~-80℃冷冻6h,然后再放到真空冷冻干燥器中冻干48h,得海绵状支架;
(3)乙醇水溶液蒸汽熏蒸
将浓度为95%乙醇水溶液放入蒸汽发生器,将发生的乙醇水溶液蒸汽注入一个密闭容器内,再将步骤(2)得到的海绵状支架放入密闭容器里,蒸汽熏蒸1~10小时;
(4)真空干燥
将步骤(3)熏蒸后的海绵状支架放入真空干燥器中干燥24h,得到复合材料多孔支架。
所述胶原蛋白溶液由以下方法制备:
选取天然无污染的新鲜牛跟腱,将其捣碎,再按质量比1:30~60比例加入浓度为3%的醋酸和按牛跟腱质量计为1%~20%的胃蛋白酶,在0℃~10℃的温度下进行酶解,然后离心取上清液,调pH值到6~8,再向上清液中加入固体的氯化钠,使氯化钠的终浓度为1.0mol/L~2.5mol/L,静置2~12小时后离心取沉淀,再用蒸馏水洗涤三次后用浓度为1%的醋酸溶解,最后用蒸馏水透析得到胶原蛋白溶液,加蒸馏水将其调整浓度为1%~5%。
所述丝素蛋白溶液由以下方法制备:
将蚕茧置于浓度为1%的碳酸钠沸水中煮30分钟脱去丝胶,然后过滤,再用蒸馏水洗涤三次,烘干得丝素纤维,将丝素纤维加入到质量比为1~9:1的Ca(NO3)2·4H2O:CH3CH2OH的溶液中,40~100℃,溶解0.5~5个小时,待冷却至室温后过滤,最后用蒸馏水透析得到胶原蛋白溶液,加蒸馏水将其调整浓度为1%~5%。
所述壳聚糖溶液由以下方法制备:
将壳聚糖溶解在浓度为0.5%~3%的醋酸中,得到浓度为1%~5%壳聚糖溶液。
构成本发明多孔支架的材料为丝素蛋白,胶原蛋白,壳聚糖。
采用本发明制备方法制得的多孔支架的孔隙率达到98%以上,孔径尺寸为50~400μm,微孔之间互通。
本发明的复合材料多孔支架既包含胶原蛋白良好的生物相容性,又有丝素蛋白优异的机械性能,并且还具有壳聚糖的止血和吸水能力,其强度高,组织相容性好,吸水性好,可以用来制备组织和创面的填充和修复器械、组织工程器械、药物释放器械。
本发明主要用于需要较好机械强度和较长降解时候的填充类生物支架。其复合材料本身还可以作为人工血管组织支架的原材料来应用。
本发明的有益效果是:
1、本发明所制备的复合多孔支架的孔隙率达到98%以上,且尺寸分布于50~400μm,微孔之间互通。
2、本发明得到的复合多孔支架强度高,易吸水,组织相容性好,未引入交联剂等细胞毒性物质。
3、本发明所得的复合多孔支架再浸水后能保持原有的形态,有海绵的功能,挤压后能恢复原有形态。
附图说明
图1是复合材料多孔支架的外观照片。
图2是复合材料多孔支架的内部结构扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合实施例子及附图,对本发明做进一步详细说明,但本发明的实施方式不限于此。
本施例所提供的复合材料多孔支架制备步骤如下:
(1)胶原蛋白溶液制备:选取20g天然无污染的新鲜牛跟腱,将其捣碎,再加入浓度为3%的醋酸和跟腱质量5%(1g)的胃蛋白酶,4℃下进行酶解。然后8000转离心30分钟,取上清液,用NaOH调pH值到7.0,再加入固体的氯化钠,使氯化钠的终浓度为2.0mol/L,静置12小时后9500转离心30分钟,取沉淀,再用蒸馏水洗涤三次后用浓度为1%的醋酸溶解,最后用蒸馏水透析得到纯度较高的胶原蛋白溶液,然后用蒸馏水将胶原蛋白溶液调整到浓度为3%。
(2)丝素蛋白溶液制备:将5g蚕茧置于浓度为1%的碳酸钠沸水中煮30分钟脱去丝胶,然后过滤,再用蒸馏水洗涤三次,烘干得3.5g丝素纤维。将丝素纤维加入到质量比为3:1的Ca(NO3)2·4H2O: CH3CH2OH的溶液中,60℃,溶解1.5个小时。待冷却至室温后用过滤,用蒸馏水透析得到丝素蛋白溶液,然后用蒸馏水将丝素蛋白溶液调整到浓度为3%。
(3)壳聚糖溶液制备:将5g壳聚糖溶解在浓度为3%的醋酸中,得到浓度为3%壳聚糖溶液。
(4)将混合容器置于4℃冷水浴和超声振荡环境中,然后再向混合容器中加入步骤(3)制得的浓度为3%的壳聚糖溶液,然后用搅拌器一边匀速搅拌一边加入步骤(1)制得的浓度为3%的胶原蛋白溶液,加入完毕后继续搅拌30分钟得复合溶液;最后将步骤(2)制得的浓度为3%的丝素蛋白溶液用均匀滴入复合溶液中,匀速搅拌,此滴入过程同样处于4℃冷水浴和超声振荡环境中,滴入完毕后继续搅拌30分钟得粘稠物,然后将粘稠物分装注入冻干模具后在4℃下保存3小时得初冻物备用;在本步骤中,丝素蛋白溶液、胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液的加入量的质量比为5:5:1。
(5)将初冻物放入-20℃~-40℃冷冻6小时;然后放到真空冷冻干燥器中冻干48小时,真空度小于10Pa,得海绵状支架。
(6)将浓度为95%乙醇水溶液放入蒸汽发生器,将发生的乙醇水溶液蒸汽注入一个密闭容器内,再将步骤(5)得到的海绵状支架放入密闭容器里,蒸汽熏蒸6小时;
(7)将步骤(6)熏蒸后的海绵状支架放入真空干燥器中干燥24h,真空度小于10Pa,得到多孔复合支架。
得到样品的外观如图1所示,其内部结构通过扫描电镜观察,如图2所示。可以看到其孔隙率很高,孔径大部分在50~400μm。
吸水测定:
参照《中华人民共和国药典》(2010年版)二部的吸收性明胶海绵吸水力检查测定,以被水完全侵润的时间记为吸水时间,以吸水后的重量与自身重量的倍数比为吸水量,测得实施例制备的复合材料多孔支架吸水时间和吸水量数据如表1:
。
孔隙率测定:
将实施例制备的复合材料多孔支架,以甲苯浸润法测得的孔隙率数据如表2:
。
Claims (4)
1.一种复合材料多孔支架的制备方法,其特征在于,包括下述步骤:
(1)胶原蛋白溶液制备:选取20g天然无污染的新鲜牛跟腱,将其捣碎,再加入浓度为3%的醋酸和1g的胃蛋白酶,4℃下进行酶解;
然后8000转离心30分钟,取上清液,用NaOH调pH值到7.0,再加入固体的氯化钠,使氯化钠的终浓度为2.0mol/L,静置12小时后9500转离心30分钟,取沉淀,再用蒸馏水洗涤三次后用浓度为1%的醋酸溶解,最后用蒸馏水透析得到纯度较高的胶原蛋白溶液,然后用蒸馏水将胶原蛋白溶液调整到浓度为3%;
(2)丝素蛋白溶液制备:将5g蚕茧置于浓度为1%的碳酸钠沸水中煮30分钟脱去丝胶,然后过滤,再用蒸馏水洗涤三次,烘干得3.5g丝素纤维;
将丝素纤维加入到质量比为3:1的Ca(NO3)2·4H2O: CH3CH2OH的溶液中,60℃,溶解1.5个小时;
待冷却至室温后用过滤,用蒸馏水透析得到丝素蛋白溶液,然后用蒸馏水将丝素蛋白溶液调整到浓度为3%;
(3)壳聚糖溶液制备:将5g壳聚糖溶解在浓度为3%的醋酸中,得到浓度为3%壳聚糖溶液;
(4)将混合容器置于4℃冷水浴和超声振荡环境中,然后再向混合容器中加入步骤(3)制得的浓度为3%的壳聚糖溶液,然后用搅拌器一边匀速搅拌一边加入步骤(1)制得的浓度为3%的胶原蛋白溶液,加入完毕后继续搅拌30分钟得复合溶液;最后将步骤(2)制得的浓度为3%的丝素蛋白溶液用均匀滴入复合溶液中,匀速搅拌,此滴入过程同样处于4℃冷水浴和超声振荡环境中,滴入完毕后继续搅拌30分钟得粘稠物,然后将粘稠物分装注入冻干模具后在4℃下保存3小时得初冻物备用;在本步骤中,丝素蛋白溶液、胶原蛋白溶液和壳聚糖溶液的加入量的质量比为5:5:1;
(5)将初冻物放入-20℃~-40℃冷冻6小时;然后放到真空冷冻干燥器中冻干48小时,真空度小于10Pa,得海绵状支架;
(6)将浓度为95%乙醇水溶液放入蒸汽发生器,将发生的乙醇水溶液蒸汽注入一个密闭容器内,再将步骤(5)得到的海绵状支架放入密闭容器里,蒸汽熏蒸6小时;
(7)将步骤(6)熏蒸后的海绵状支架放入真空干燥器中干燥24h,真空度小于10Pa,得到多孔复合支架。
2.一种如权利要求1所述的复合材料多孔支架的制备方法所制得的复合材料多孔支架。
3.根据权利要求2所述的复合材料多孔支架,其特征在于,该多孔支架的孔隙率达到98%以上,孔径尺寸为50-400μm,微孔之间互通。
4.权利要求2或3所述的复合材料多孔支架在作为制备组织和创面的填充和修复器械、组织工程器械、药物释放器械的应用。
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