KR100527623B1

KR100527623B1 - 세포외기질을 포함하는 인공장기 제조용 생분해성 고분자기질 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR100527623B1
Application number: KR10-2002-0030881A
Authority: KR
Inventors: 박정극; 서영권; 송계용; 김영진; 서성준
Original assignee: 라이프코드인터내셔날 주식회사; 박정극
Priority date: 2002-06-01
Filing date: 2002-06-01
Publication date: 2005-11-15
Also published as: KR20030093009A

Abstract

본 발명은 세포외기질 (extracellular matrix, ECM)을 포함하는 인공장기 제조용 생분해성 고분자 기질 (scaffold) 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 생분해성 고분자 기질에 세포를 배양한 후 세포로부터 분비된 세포외기질만을 남기고 세포를 제거하여 제조된 인공장기 제조용 생분해성 고분자 기질 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 생분해성 고분자 기질은 세포를 배양한 후 세포외기질만을 남기고 세포를 제거하였기 때문에 이식수술시 우려되는 면역반응 (immune response)을 줄일 수 있고 우수한 물성과 치료효과를 나타내어 인공장기의 제조를 위한 기질로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세포외기질을 포함하는 인공장기 제조용 생분해성 고분자 기질 및 그의 제조방법{BIODEGRADABLE POLYMER SCAFFOLD CONTAINING EXTRACELLULAR MATRIX USED FOR ARTIFICIAL ORGANS AND METHOD FOR PREPARING SAME}

본 발명은 생분해성 고분자 기질에 세포를 배양한 후 세포를 제거하여 세포외기질 (extracellular matrix, ECM)만을 포함하는 인공장기 제조용 생분해성 고분자 기질 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

조직공학 (tissue engineering)이란 세포를 생체 적합한 기질에 3차원적으로 배양하여 세포-기질 복합체를 제조하고 이를 이용하여 생체조직 및 장기를 재생하는 학문이다. 조직공학의 기본적인 원리는, 먼저 환자의 몸에서 필요한 조직을 약간 채취하고 그 조직편으로부터 세포를 분리한 다음 분리된 세포를 배양을 통하여 필요한 양만큼 증식기키고 다공성 생분해성 고분자 기질에 심어 일정기간 체외 배양한 후 상기 세포-기질 복합체를 다시 인체 내에 이식하는 것이다. 이식 후 세포들은 신생 혈관이 형성될 때까지는 체액의 확산에 의해 산소와 영양분을 공급받다가 인체 내에서 혈관이 자라 들어와 혈액의 공급이 이루어지면 세포들이 증식 분화하여 새로운 조직 및 장기를 형성하고 고분자 기질은 분해되어 없어지게 된다.

따라서, 조직공학의 연구는 세포 기질의 특성과 구조의 최적화에 많은 연구가 집중되고 있으며, 이러한 연구의 일환으로 생분해성 고분자 기질인 콜라겐 (collagen)-GAG를 이용한 인공피부의 개발 (S. T. Boyce, Medical & Biological Engineering & Computing, 36:791-800, 1998), 콜라겐 겔을 이용한 인공각막의 제조 (F. A. Auger, Pathobiology, 67:140-147, 1999), 뼈 재생을 위한 새로운 나노-HAp/콜라겐 세포 기질의 개발 (C. M. Serre, J. Biomed. Mater. Res. 44:626-633, 1999) 등이 보고된 바 있다.

조직공학은 인공피부, 인공뼈, 인공연골, 인공각막, 인공혈관, 인공근육, 인공건 등 인체의 모든 장기의 재생에 적용되고 있으며, 치료 효과를 높이기 위해서는 먼저 생체조직과 유사한 생분해성 고분자 기질을 제조하는 것이 매우 중요하다.

대한민국 특허공고번호 제 1994-1379 호에는 콜라겐 겔층에 섬유아세포를 배양하고 콜라겐 격자 형태로 구성된 진피층이 개시되어 있으며, 대한민국 특허공개번호 제 1993-700045 호에는 섬유아세포를 포함한 콜라겐 진피층과 각질세포를 포함한 표피층으로 구성된 스폰지 형태의 합성 생체피부 대체물이 개시되어 있다. 그리고 대한민국 특허공개번호 제 1992-336 호에는 천공되어 있는 막에 각질세포를 배양하는 방법이 개시되어 있다.

이 외에도 더글라스 등 (Douglas et al., In vitro 16:306-312, 1980)은 인공피부 제조를 위한 기질로 콜라겐 겔을 이용하였고, 레히토 등 (Leighto et al., J. Natl Cancer Inst. 12:545-561, 1951; Cancer Res. 28:286-296, 1968)은 인공피부 제조시 스폰지 형태의 셀롤로오즈 또는 젤라틴 기질을 이용하였다. 발렌타인 등 (Valentian Zacchi et al., J. Biomed Mater Res. 40:187-194, 1998; Giampaolo Galassi et al., Biomaterials 21:2183-2191, 2000)은 히아루론산 (hyaluronic acid) 유도물질로부터 막과 비-조립 메쉬 (non-woven mesh) 형태의 기질을 제조하여 각질세포와 섬유아세포를 배양한 바 있다.

조직공학 기술을 이용하여 상품화된 최초의 제품은 인공피부로서, 예를 들면 INTEGRA ^TM(Integra LifeScience사)는 콜라겐 스폰지에 실리콘 막이 붙어있는 형태로서 진피 재생용으로 개발되었고 Apligraf^TM(Organogenesis사)는 섬유아세포와 각질세포를 포함하는 제품으로 궤양치료용으로 미국식품의약안정청 (FDA)으로부터 허가를 받았다. Dermagraft^TM(Advanced Tissue Science사)는 비크릴 메쉬 (vicryl mesh)에 섬유아세포만을 배양하여 당뇨병성 궤양 (diabetic ulcers) 및 정맥성 궤양 (venous ulcer) 치료용으로 승인을 받았으며, TransCyte^TM(Advanced Tissue Science사)는 화상치료용으로 승인추천을 받았다. 미국의 LifeCell사의 AlloDerm^R은 사체로부터 피부를 채취하여 세포를 제거한 진피 기질만을 제품화하여 이식용 피부 및 삽입용 기질로 이용하고 있으며, Ortec사의 CCS^R는 섬유아세포와 각질세포가 배양되어 있는 스폰지형 콜라겐 기질을 이용한 인공피부로 사용되고 있다.

그러나, 이러한 종래의 겔 또는 스폰지 상태의 콜라겐, 젤라틴 또는 셀룰로오스 층을 포함하는 인공피부는 이식시술시 봉합에 필요한 인장 강도를 갖지 못할 뿐 아니라, 그 강도가 약하여 둥글게 말리거나 찢어지는 등 시술 조작에 불편함이 따르고 이식 후 체내에서의 콜라게나아제에 의한 분해 등으로 인해 그 강도가 유지되지 못하며 상처치유 기간에 비하여 너무 빨리 분해되는 단점이 있었다. 이에, 인공피부의 강도를 강화시키기 위하여 대표적으로 글루타르알데히드와 같은 화학물질이나 자외선 조사법과 같은 물리적 방법으로 콜라겐을 가교결합시키는 연구가 진행되어 왔다. 그러나, 이러한 화학적 또는 물리적 방법은 생체조직의 인장강도를 증가시키기는 하지만 생체조직을 경화시킬 가능성이 있고, 생체 내에서 세포 및 조직에 대하여 독성을 나타낼 수 있다는 우려가 지적되고 있다.

또한, 상기와 같이 생분해성 고분자 기질에 세포를 배양하고 이로부터 얻은 세포-기질 복합체를 그대로 이식하는 경우에는 면역반응이 일어날 수 있으며, 사체피부를 이용하는 경우에도 AIDS를 비롯한 각종 질병의 전염과 재료의 공급에 제한이 있다는 단점이 있다

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여, 생분해성 재료를 이용한 인공장기의 제조에 있어 세포외기질만을 남기고 배양된 세포를 제거하여 이식수술시 우려되는 면역반응을 줄이고 생체조직과 좀더 유사하면서 조직 친화성이 우수한 인공장기 제조용 생분해성 고분자 기질을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인공장기의 제조에 있어 생분해성 재료를 이용하여 생체조직과 유사하고 조직 친화성이 우수하며 운송 및 보관이 편리한 인공장기 제조용 생분해성 고분자 기질을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 생분해성 고분자 기질에 세포를 배양한 후 세포를 제거하여 세포외기질만을 포함하는 인공장기 제조용 생분해성 고분자 기질 및 그의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 기존에 인공기질로 사용되고 있는 세포-기질 복합체에서 세포외기질만을 남기고 배양된 세포를 제거함으로써 이식수술실 우려되는 면역반응을 줄이고 물성과 치료효과를 향상시킨 데에 그 특징이 있다.

본 발명의 인공진피용 생분해성 고분자 기질은 1) 생분해성 고분자를 이용하여 실, 메쉬 (mesh), 다공성 스폰지 또는 이들의 복합 구조물을 제조하는 단계; 2) 상기 구조물에 세포를 배양하는 단계; 및 3) 세포외기질만을 남기고 배양된 세포를 제거하는 단계에 의해 제조될 수 있다.

단계 1)에서 사용가능한 생분해성 고분자는 조직세포의 유착과 증식이 잘되어야 하며 분화된 세포의 기능이 보전되어야 하고, 또한 체내에 이식된 후에도 주위 조직과 융화가 잘되어야 하며 염증반응이 없고 일정 기간이 지난 후에는 스스로 분해되어 이물질로 남지 않아야 한다. 따라서, 본 발명에 따른 고분자 기질의 제조에 적용되는 생분해성 고분자 재료로는 생체 내에서 분해될 수 있는 고분자라면 모두 적용가능한 바, 예를 들면 콜라겐, 젤라틴, 키틴, 키토산, 알지네이트, 히아루론산 및 이들의 유도체와 같은 천연재료와 PLGA (Poly (L-lactic - co - glycolic acid)), PGA (poly glycolic acid), PLA (poly lactic acid) 등의 합성재료가 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 생분해성 고분자 재료로 생체 내 구조단백질인 콜라겐을 이용함으로써 생체 유해 위험성을 배제하고 생착 효과도 향상시켰다.

먼저, 생체적합성이 우수한 세포기질 성분인 콜라겐을 실로 제조한 후 이를 메쉬 또는 다공성 스폰지 형태로 제조하거나, 다공성 스폰지의 제조 도중에 메쉬 형태의 콜라겐 구조물을 삽입시켜 메쉬-스폰지 형태의 복합 구조를 취하는 콜라겐 층을 제조한다.

콜라겐 실은 존 등 (John F. et al., Collagen fabric as Biomaterials in Biotechnology and Bioengineering 43:781-791, 1994)에 기재된 방법에 따라 제조한다. 이때, 콜라겐 실은 60 내지 120 ㎛의 지름을 갖도록 제조되는 것이 바람직하며, 타입 Ⅰ 콜라겐, 타입 Ⅰ과 타입 Ⅲ의 혼합 콜라겐, 또는 타입 Ⅳ 콜라겐 등을 사용하는 것이 바람직하다.

메쉬 형태의 콜라겐 층은 상기에서 제조된 콜라겐 실을 가로×세로로 교차시켜 엮은 뒤 온풍건조기에 넣어 건조시켜 제조한다.

또한, 스폰지 형태의 콜라겐 층은 콜라겐을 산성용액에 용해시켜 크림형태의 용액으로 제조한 후 웰 플레이트에 도포하고 초저온 냉동고에서 완전히 냉동시킨다. 상기에서 사용될 수 있는 산성용액으로는 초산, 염산 의 수용액이 있으며, 산성용액의 농도는 0.05 내지 0.1 M이 바람직하다. 본 발명에서는 콜라겐과 함께 키토산을 혼합하여 사용할 수도 있으며, 이는 키토산이 강도를 향상시키는 작용을 하기 때문이며 이들의 혼합비는 95:5 내지 80:20이 바람직하다. 콜라겐 또는 콜라겐과 키토산의 혼합물을 산성용액에 0.5 내지 1%의 농도로 용해시킨다. 이를 동결 건조시킨 후 진공오븐에 넣어 3일간 처리하여 미량의 수분을 제거하고 다공성 형태의 콜라겐 스폰지를 제조한다. 이때, 콜라겐 스폰지의 기공 크기는 80 내지 200 ㎛가 바람직하다.

메쉬-스폰지 형태의 복합구조 콜라겐 층은 상기에서 다공성 콜라겐 스폰지를 제조하는 도중에 콜라겐 실로 엮은 메쉬 형태의 콜라겐 구조물을 삽입하여 저온에서 냉동시킨 후 동결건조하여 제조된다.

단계 2)에서는 상기와 같이 제조된 다양한 형태의 생분해성 고분자 기질 구조물을 페트리 디쉬에 깔고 세포를 그 위에 분주하여 배양한다. 이때, 세포는 생체 조직의 용도에 따라 임의대로 선택할 수 있는데, 섬유아세포, 각질세포, 케라토사이트, 연골세포, 골세포, 근육세포, 간세포 등이 바람직하게 사용된다. 콜라겐 층 내에 배양되는 세포가 섬유아세포일 경우에는 인공진피로 이용될 수 있으며 또한 전층인공피부의 지지층인 진피층으로 이용되어 인공피부 제조시에 사용될 수 있다. 전층인공피부는 콜라겐과 섬유아세포로 이루어진 진피층 위에 표피세포, 바람직하게는 각질세포를 배양함으로써 제조된다. 이때, 표피세포의 층은 증식, 분화된 표피세포들의 다중층으로 구성된다. 이렇게 제조된 전층인공피부는 실제 피부조직과 유사하며, 인장강도도 기존에 비하여 증가되었기 때문에 이식수술시 조작이 편리하여 봉합하기가 용이하다.

단계 3)은 단계 2)에서 제조된 생분해성 기질과 세포로 이루어진 복합체에서 세포로부터 분비된 세포외기질은 콜라겐 층에 잘 고정시키고 배양된 세포만을 제거하는 단계이다. 이를 위하여 감마 조사법, 글리세롤 처리법, 에틸옥사이드 멸균법 등이 사용될 수 있다. 감마 조사법은 동결건조를 통하여 표피와 진피를 분리시키고 5,000 rad의 감마 조사 (γ-irradiation)를 12분간 처리한 후 PBS에 3주간 보관하여 세포를 제거하는 방법 (N. C. Krejci et al., J. Invest Dermatol. 97:843-848, 1991)이고, 글리세롤 처리법은 다단계의 글리세롤을 처리하여 세포를 제거한 후 4일간 PBS (항생제 포함)로 세척하는 방법 (K. H. Chakrabarty, British Journal of Dermatology 141:811-823, 1999)이고, 에틸렌 옥사이드 멸균법은 에틸렌 옥사이드로 처리하고 1 M의 NaCl로 8시간 처리한 후 6주간 PBS (항생제 포함)로 세척하는 방법 (K. H. Chakrabarty, British Journal of Dermatology 141:811-823, 1999)이다. 상기 방법들은 모두 세포외기질의 손상을 막고 세포만을 제거하기 위한 것이다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 세포외기질만을 남기고 세포를 제거하기 위하여 단계적으로 글리세롤을 처리하고 희석한다. 구체적으로, 배양된 세포를 제거하는 단계는 ① 50% 글리세롤 처리 →② 80% 글리세롤 처리 →③ 98% 글리세롤 처리 →④ 인산염 완충용액으로 세척 →⑤ 70% 에탄올 처리 →⑥ 인산염 완충용액으로 세척하는 단계로 구성된다. 이때, 글리세롤은 세포로부터 분비된 세포외기질을 생분해성 고분자 기질에 잘 고정시키고 세포만을 제거하기 위한 것으로, 인산염 완충용액으로 희석하여 사용하다. 단계 ④ 및 ⑥의 인산염 완충용액은 세균의 증식을 억제하기 위하여 항생제를 포함하는 것이 바람직한데, 페니실린 (penicillin), 스트렙토마이신 (streptomycin), 암포테리신 B (amphotericin B) 또는 젠타마이신 (gentamincin) 등이 사용될 수 있다.

상기와 같이 제조된 본 발명의 인공장기 제조용 생분해성 고분자 기질은 실제의 사체에서 제조된 인공진피의 장점인 생체유사성과 적합성 및 생체 내 효소에 대한 분해 저항성을 모두 갖추고 있으며, 세포를 제거하고 세포외기질만을 이용하기 때문에 사체 피부를 이용하는 경우에 우려되는 AIDS와 각종 질병의 전염과 재료의 공급이 제한되는 문제점을 극복할 수 있다. 따라서, 본 발명의 인공장기 제조용 생분해성 기질은 인공피부, 인공각막, 인공연골, 인공뼈, 인공근육 등의 다양한 인공장기 제조를 위한 기질로 유용하게 사용될 수 있다.

이러한 적용범위의 일례로 본 발명의 제조방법에 따라 생분해성 고분자 기질에 섬유아세포를 배양한 후 세포를 제거한 인공진피용 기질에 환자의 자가세포를 배양하여 이식하거나, 생분해성 고분자 기질에 인체에서 분리된 줄기세포주 (stem cell) 또는 성체세포주 (adults cell)를 배양하거나 불멸화 세포주를 배양한 후 제거하여 이식용 기질로 이용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<참조예 1> 콜라겐 실 및 메쉬의 제조

타입 Ⅰ 콜라겐을 0.05 M 초산에 녹여 최종 농도 5~10 ㎎/㎖ 용액으로 제조한 후 콜라겐 용액을 18 G (3.17 ㎜) 굵기의 바늘 (blunt needle)이 부착된 연동펌프의 실리콘 튜브를 통해 완충용액 Ⅰ (20% polyethylene glycol [분자량 8,000], 94 mM sodium phosphate dibasic, 24 mM sodium phosphate monobasic, pH 7.55)에 바늘을 약 1 ㎝ 깊이로 담근 후 상기 바늘을 이동하면서 0.65 ㎖/분의 속도로 방출시켰다. 이를 약 5분 정도 방치한 후 겔화된 실 모양의 콜라겐 가닥을 완충용액 Ⅱ (5.5 mM sodium phosphate dibasic, 0.5 mM potassium phosphate monobasic, 75 mM NaCl, pH 7.10)에 옮겨 5~10분간 방치하였다. 이와 같이 제조된 콜라겐 실을 70% 이소프로판올 (isopropanol)에 옮겨 담아 18시간 동안 세척한 후 젖은 상태의 콜라겐 실 가닥들을 6웰 디쉬 (well dish)에 가로×세로 (9줄×9줄)로 교차시켜 엮은 뒤 38℃의 온풍건조기에 넣어 30분간 건조시켜 콜라겐 메쉬를 제조하였다.

<참조예 2> 콜라겐 스폰지의 제조

초산에 녹인 pH 3~4, 농도 0.5~1 % (W/V)의 콜라겐 용액 또는 콜라겐과 키토산의 혼합용액 (혼합비=95:5) 1,500 ㎕를 12웰 플레이트에 도포하고 -85℃의 초저온 냉동고에서 12시간 이상 냉동시킨 후 -80℃의 진공동결건조기 (SFDSM 06, 삼원)에서 36시간 동안 동결 건조시켰다. 동결 건조된 다공성 형태의 콜라겐 스폰지를 진공오븐에 넣고 먼저 실온에서 2시간 이상 진공을 걸어 스폰지 내 미량의 수분을 제거한 후 110℃까지 온도를 상승시켜 72시간 동안 진공을 유지시켰다. 72시간 경과 후 온도가 30℃까지 내려간 뒤 진공을 제거함으로써 스폰지의 변성을 막고 콜라겐 분자 내에 공유결합을 형성하여 구조를 안정화시켰다.

<참조예 3> 콜라겐 메쉬-스폰지 복합 구조물의 제조

참조예 2에 기재된 바와 같이, 콜라겐을 초산으로 녹여 pH 4, 농도 0.5~1% (W/V)인 용액을 제조한 후 콜라겐 용액 1,500㎕을 12웰 플레이트 페트리디쉬에 도포한 후 참조예 1에서 제조된 콜라겐 실로 엮은 콜라겐 망사를 삽입하여 -20 내지 -85℃의 초저온 냉동고에서 6시간 이상 냉동시켰다. 이를 24시간이상 진공 동결 건조시켜서 메쉬-스폰지 복합 구조의 콜라겐 층을 제조하였다.

<참조예 4> 섬유아세포의 일차배양

섬유아세포의 일차배양은 효소분해법 (enzymatic degradation)에 따라 수행하였다 (E. K. Yang, Artificial Organs, 24:7~17, 2000). 먼저 표피와 진피를 분리하기 위하여, 포피조직 (foreskin)을 각각 칼슘 아세테이트 완충용액 (130 mM NaCl, 10 mM Ca acetate, 20 mM HEPES, pH 7.2)에 용해시킨 3 ㎎/㎖ (1,000 U)의 콜라게나아제 (collagenase) 용액과 PBS에 용해시킨 1 ㎎/㎖ (1.5 U)의 디스파아제 (dispase) 용액, 및 0.05% 트립신 (trypsin) 효소 용액을 이용하여 표피와 진피를 분리하였다. 이로부터 분리된 섬유아세포를 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS)이 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, GIBCO 12100-038) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 7 내지 10일간 배양하였다.

<실시예 1> 세포외기질을 남기고 세포를 제거한 인공진피용 생분해성 고분자 기질의 제조

(1-1) 메쉬 및 스폰지형 인공진피의 제조

참조예 4에서 6번 계대배양된 섬유아세포를 5×10⁵ 세포/㎖의 농도로 10% (V/V) FBS가 함유된 DMEM 배지와 혼합하여 참조예 1 및 2에서 제조된 콜라겐 메쉬 또는 스폰지에 접종하였다. 이를 60~80 rpm으로 1시간 동안 교반하여 유동접종 (dynamic seeding)을 한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에 넣어 4주간 정치 배양하여 메쉬 또는 스폰지형 인공진피 모델을 제조하였다. 이때, 배지는 3일마다 교환하였다.

(1-2) 세포외기질을 제외한 세포의 제거

세포가 새로이 분비한 세포외기질 (ECM)을 콜라겐 메쉬 또는 스폰지에 잘 고정시키고 세포만을 제거하기 위해 하기와 같이 단계별로 처리하였다. 구체적으로, 배양된 세포는 실시예 1에서 제조된 인공진피를 50% 글리세롤로 4시간 동안 처리하고 80% 글리세롤로 다시 4시간 동안 처리하고 98% 글리세롤로 3일간 처리하였다. 이때, 글리세롤은 인산염 완충용액으로 희석하여 사용하였다. 이 후에 안티바이오틱-안티마이코틱 항생제 (Antibiotic-Antimycotic; 페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신 B를 포함하는 복합 항생제, GibCO, 15240-062)를 함유하는 인산염 완충용액으로 상기 인공진피를 1주일 동안 처리하고 70% 에탄올로 24시간 동안 처리하여 멸균하였다. 이를 다시 안티바이오틱-안티마이코틱 항생제를 함유하는 인산염 완충용액으로 3일간 세척하였다.

<실시예 2> 염색 및 전자현미경 관찰

상기와 같이 제조된 본 발명의 콜라겐 인공진피가 세포적합성을 가지고 글리세롤 처리에 의해 세포외기질은 남기고 배양된 세포만이 제거되었는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같이 H/E (hematoxylin eosin) 염색, M/T (masson trichome) 염색, A/B (alcian blue) 염색 및 전자현미경 관찰을 수행하였다. 조직학 검사는 조직검사학 (전국임상병리교수혐의회, 고려의학, 1992)과 병리조직특수염색도감 (김주호, 신광출판사, 1993)을 참고하여 실시하였다.

(1-1) H/E 염색

표본들을 4% 포름알데히드 (formaldehyde) 용액으로 고정한 후 파라핀 (paraffin)에 포매한 것을 절단하여 얻은 절편을 헤마톡실린/에오신 (hematoxlyn/eosin, H/E)으로 염색하였다.

(1-2) M/T 염색

표본들을 4% 포름알데히드 용액으로 고정한 후 파라핀에 포매한 것을 절단하여 얻은 절편을 메이슨 트리크롬 (Masson Trichrome, M/T)으로 염색하였다. 이 염색을 통하여 새로이 형성된 콜라겐을 관찰할 수 있다.

(1-3) A/B 염색

표본들을 4% 포름알데히드 용액으로 고정한 후 파라핀에 포매한 것을 절단하여 얻은 절편을 알시안 블루 (Alcian blue)로 염색하였다. 이 염색을 통하여 새로이 형성된 뮤신을 관찰할 수 있다.

(1-4) 전자현미경 관찰

2.5% 글루타르알데히드 (glutaraldehyde)로 세포를 배양하기 전의 콜라겐 스폰지, 배양 후의 콜라겐 스폰지 및 세포 배양 후 세포외기질만을 남기고 세포를 제거한 콜라겐 스폰지를 실온에서 2~4시간 정도 고정시킨 후 0.175 M의 인산염 완충용액 (phosphate buffer)으로 세척하고 1~2% 오스뮴 4산화물 완충용액 (osmium tetroxide buffer)에 2시간 동안 담가두었다. 이 후, 상기 시료들을 에탄올로 탈수시킨 후 HMDS (1,1,1,3,3,3-hexamethyl disilazane 98%)에 담그고 건조시킨 뒤 전자현미경 (JEOL, JSM-5600, 일본) (12~15 KV)으로 촬영하였다.

상기 결과를 도 1 내지 7에 나타내었다.

도 1은 본 발명의 콜라겐 스폰지가 세포적합성을 가지고 있는지 확인하기 위하여 H/E 염색을 수행한 결과로, a)는 세포를 배양하기 전의 콜라겐 스폰지를, b)는 섬유아세포를 접종하고 4주간 배양한 콜라겐 스폰지를, c)는 세포외기질만을 남기고 배양된 세포를 제거한 후의 콜라겐 스폰지를 나타낸 것이다. 도 1에 나타난 바와 같이, 콜라겐 스폰지에 접종된 세포가 잘 자라있어 본 발명의 생분해성 기질이 세포적합성을 가지고 있음을 확인하였다. 또한, 글리세롤 처리에 의해 대부분의 배양 세포가 효과적으로 제거되고 세포로부터 분비된 세포외기질만이 남아 있음을 확인하였다.

도 2는 불용성 (insoluble) 콜라겐으로 제조된 스폰지에 섬유아세포를 배양한 후 세포외기질만을 남기고 세포를 제거하여 제조한 인공진피의 H/E 염색사진으로, 실제 피부의 진피구조와 비슷하게 재구성이 된 것을 확인할 수 있다.

도 3은 M/T 염색을 한 결과로, a)는 세포를 배양하기 전의 콜라겐 스폰지를, b)는 섬유아세포를 접종하고 4주간 배양한 콜라겐 스폰지를, c)는 세포외기질만을 남기고 배양된 세포를 제거한 후의 콜라겐 스폰지를 나타낸 것이다. 도 3에 나타난 바와 같이, 세포가 접종되지 않은 대조군에 비하여 섬유아세포가 배양된 콜라겐 스폰지에서 새로이 생성된 콜라겐 (파란색)이 풍부하였고, 글리세롤 처리로 세포를 제거한 후에도 콜라겐이 상당량 잔존하는 것을 확인하였다.

도 4는 A/B 염색을 한 결과로, a)는 세포를 배양하기 전의 콜라겐 스폰지를, b)는 섬유아세포를 접종하고 4주간 배양한 콜라겐 스폰지를, c)는 세포외기질만을 남기고 배양된 세포를 제거한 후의 콜라겐 스폰지를 나타낸 것이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 대조군보다 섬유아세포가 배양된 콜라겐 스폰지에서 새로이 분비된 뮤신이 파란색으로 염색되어 실제 피부조직과 유사한 결합조직을 형성하였음을 확인하였다. 또한, 글리세롤 처리에 의해 세포가 제거된 후에도 뮤신이 잔존하였다.

상기 도 3 및 4의 결과로부터, 본 발명에 따라 제조된 콜라겐 인공진피에 세포로부터 분비된 콜라겐과 뮤신이 세포를 제거한 후에도 남아있어 인공장기의 생산을 위해 좋은 기질로 사용될 수 있음을 확인하였다.

도 5는 키토산이 함유된 콜라겐 스폰지를 M/T (a) 및 A/B (b) 염색한 결과로, 섬유아세포를 1주간 배양한 콜라겐 스폰지에서 콜라겐과 뮤신이 새롭게 분비되어 있음을 확인하였다.

도 6은 본 발명에 따라 제조된 콜라겐 메쉬에 섬유아세포를 배양한 후 전자현미경으로 관찰한 것으로, a)는 섬유아세포를 2주간 배양한 것으로 기공 (pore)과 메쉬 (mesh)가 관찰되고, b)는 섬유아세포를 4주간 배양한 것으로 세포가 치밀하게 잘 자라있으며 세포 표면과 주위에 세포외기질이 분비된 것을 알 수 있다.

도 7은 콜라겐 스폰지에 섬유아세포를 배양하기 전 (a)과 4주간 배양한 후 (b)의 전자현미경 사진을 나타낸 것으로, 세포를 배양한 후의 콜라겐 스폰지에 세포로부터 새로이 분비된 세포외기질 (화살표)을 관찰할 수 있다.

<실시예 3> 분해효소에 대한 분해도 측정 (Degradation test)

기질은 이식 후 새로운 육아조직의 형성시기까지 체내의 단백질 분해효소에 대해 저항성을 가져야 하는 동시에 치료가 진행되는 동안 천천히 분해되어야 한다. 이를 확인하기 위하여, in vitro 상에서 본 발명의 생분해성 기질의 콜라게나아제 (collagenase)에 대한 분해도를 하기와 같이 평가하였다.

(3-1) 콜라겐 (collagen) 분해도 측정

In vitro에서 콜라게나아제를 이용하여 기질을 분해시킴으로써 간접적으로 in vivo에서의 분해정도를 예측할 수 있다. 기질이 효소에 의해 분해되어 용출되는 콜라겐 (collagen) 양을 히드록시프롤린 분석방법 (Hydroxyproline Assay; S. N. Breit et al., Analytical biochemistry 203:187~190, 1992; L. B. Creemers et al., Biotechniques 22:656~658, 1997)을 이용하여 평가하였다.

구체적으로, 시료는 상기 실시예 1에 따라 제조된 인공진피용 콜라겐 스폰지를 콜라게나아제로 분해하여 준비하였다. 이때, 콜라게나아제의 농도는 실험조건과 목적에 따라 달라지지만, 본 실험에서는 인공진피 4 ㎎을 15 유니트의 콜라게나아제 1 ㎖에 넣은 후 37℃에서 각각 0.5 시간 및 5시간 동안 처리하였다 .

먼저, 상기와 같이 효소 처리된 시료 200 ㎕에 400 ㎕의 에탄올을 넣고 4℃에서 12시간 보관하여 혈청 등 분석에 영향을 주는 다른 성분들을 침전시켰다. 이를 15분 동안 1,719 ×g (≒ 5,500 rpm)로 원심분리한 후 상등액 500 ㎕를 조심스럽게 취하였고, 여기에 500 ㎕ 6 N 염산 (HCl)을 첨가한 후 105℃에서 24시간 동안 가수분해하였다.

가수분해 후 진공건조를 실시하여 용액을 모두 증발시킨 후 200 ㎕의 3차 증류수를 첨가하고, 볼텍스 (vortex)를 이용하여 용기의 바닥이나 벽에 묻어 있는 시료를 모두 용해시켰다. 이를 1.5 ㎖ 원심분리 튜브 (microcentrifuge test tube)로 옮긴 후 9,450 ×g (≒ 1,400 rpm)로 원심분리하여 상등액 180 ㎕을 취하였다. 여기에 분석 완충용액 (assay buffer) 60 ㎕와 클로라민-T (chloramine-T) 시약 120 ㎕를 첨가하였다. 이를 15분 동안 실온에서 방치한 후 80 ㎕ DMBA 시약을 첨가하고 60℃에서 20분간 중탕하고 차가운 물로 5분간 냉각시킨 뒤 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

이때, 분석 완충용액은 n-프로판올 (n-propanol) : 증류수 : 저장 완충용액 (stock buffer, pH 6.1, 0.24 M citric acid, 0.88 M sodium acetate trihydrate, 0.88 M anhydrous sodum acetate, 0.21 M acetic acid, 0.85 M sodium hydroxide)을 3 : 2 : 10의 비율로 혼합하여 제조하였다. 클로라민-T 시약은 0.282 g 클로라민-T, 1 ㎖ 증류수, 1 ㎖ n-프로판올, 및 8 ㎖ 저장 완충용액을 혼합하여 제조하였으며, DMBA 시약은 2 g 디메틸아미노 벤즈알데히드 (dimethylamino benzaldehyde), 1.25 ㎖ n-프로판올, 및 2.75 ㎖ 퍼클로르산 (perchloric acid)을 첨가하여 제조하였다. 클로라민-T 시약과 DMBA 시약은 사용 직전에 제조하여 사용하였다.

(2-2) 글리코스아미노글리칸 (glycosaminoglycan, GAG) 생성량 측정

GAG는 콜라겐과 함께 실제피부의 기질을 구성하는 주요 성분으로 세포가 분비하는 ECM 중의 하나로서 세포의 활성을 측정하는 지표가 될 수 있으며 콜라겐과 결합하여 강도 및 물성을 증가시킨다. 이에 세포가 분비한 세포외기질 중 GAG 함유량을 평가하기 위하여 파파인 분해 분석방법 (papain digestion; R. W. Farndale et al., Biochimica et Biophysica Acta, 883:173-177, 1986)을 수행하였다.

시료 200 ㎕에 파파인 분해 시약 1 ㎖을 첨가한 후 60℃에서 60분 동안 수조에 담가두었다. 여기에 이오도아세트산 (iodoacetic acid , I4386 Sigma)을 최종농도가 10 mM이 되게 첨가하고 발색시약 (color reagent) 1,000 ㎕를 첨가한 후 바로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

이오도아세트산은 매우 소량이 첨가되므로 증류수 100 ㎖에 1.859 g을 용해시켜 저장용액을 제조한 후 각 튜브에 100 ㎕씩 첨가하였다. 파파인 분해용액은 1 ㎖을 기준으로 20 mM 인산염 나트륨 완충용액 (sodium phosphate buffer, pH 6.8), 1 mM EDTA, 2 mM 디티오쓰레이톨 (dithiothreitol)과 파파인 300 ㎍을 첨가하여 제조하며, 이때 인산염 나트륨 완충용액은 0.2 M Na₂HPO₄ 46.3 ㎖과 NaH₂PO ₄ 0.2 M 53.7 ㎖을 혼합하여 제조하였다.

발색시약은 디메틸-메틸렌 블루 (dimethyl-methylene blue) 16 ㎎, 글리신 (glycine) 3.04 g, NaCl 2.37 g, 0.1 M HCl 95 ㎖을 3차 증류수 1 ℓ에 혼합하여 제조하였다. 이때, pH는 3.0이며 흡광도는 0.28 정도이다. 시약은 반드시 갈색병에 보관하였으며 실온에서 3개월까지 보관할 수 있다.

도 8a는 in vitro에서 세포가 배양된 후 세포외기질만을 남기고 세포를 제거한 본 발명의 인공진피용 콜라겐 스폰지에 새로이 분비된 GAG의 양을 측정한 결과이고, 도 8b는 상기 콜라겐 스폰지 인공진피의 콜라게나아제에 대한 분해 저항성을 측정한 결과이다. 이때, 시료 1은 돼지에서 추출한 콜라겐으로 스폰지를 제조한 후 본 발명에 따라 세포를 배양 및 제거한 것이고, 시료 2는 소에서 추출한 콜라겐으로 스폰지를 제조한 후 세포를 배양 및 제거한 것이다. 도 8a 및 8b에 나타난 바와 같이, in vitro에서 본 발명의 인공진피용 콜라겐 스폰지는 콜라게나아제 분해에 대해 저항성을 나타내었고 약 1.5 ㎍의 GAG를 분비하였다. 종래에 GAG나 콜라겐은 스폰지 및 기질의 주재료로 제조과정 초기에 혼합되지만 본 발명의 생분해성 기질은 세포가 분비한 천연상태의 세포외기질이 GAG나 콜라겐을 함유하기 때문에 좀더 인체와 유사하게 구조적 결합을 형성할 수 있다.

<실시예 4> 동물이식 검사

본 발명에 따라 제조된 생분해성 고분자 기질을 동물에 이식하기 위하여 근막과 피하지방 사이에 빈 공간을 만들어 이식하는 포켓 방법을 이용하였다 (K. Anselme et al, J. Biomedical Materials Research 24:689-703, 1990).

동물에 이식후 주위 조직으로부터 여러 종류의 세포의 이동에 따른 면역반응과 이에 따른 기질의 분해속도가 다르기 때문에 이식후 5일, 1주, 2주, 3주, 5주, 8주 후에 각각 생검하여 조직학적 염색을 실시하였다. 세포의 이동이 빠를 수록 치료효과가 높고 세포가 콜라겐을 분비하여 이식물과 콜라겐 섬유의 재구성이 일어나며 이는 H/E 염색과 M/T 염색, 그리고 TEM을 이용하여 확인하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 대조군 (a)에서는 이식 후 3주째 대부분의 콜라겐이 분해되었으나 본 발명의 인공진피용 콜라겐 스폰지가 이식된 부위의 절편 (b)에서는 5주째까지도 상당량의 콜라겐이 잔존하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 인공장기 제조용 생분해성 기질은 실제의 사체에서 제조된 인공진피의 장점인 생체유사성과 적합성 및 생체 내 효소에 대한 분해 저항성을 모두 갖추고 있으며, 세포를 제거하고 세포외기질만을 이용하기 때문에 사체 피부를 이용하는 경우에 우려되는 AIDS와 같은 각종 질병의 전염과 재료의 공급이 제한되는 문제점을 극복할 수 있다. 따라서, 본 발명의 인공장기제조용 생분해성 기질은 인공피부, 인공각막, 인공연골, 인공뼈, 인공근육 등의 다양한 인공장기 제조를 위한 기질로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따라 콜라겐 스폰지에 세포를 배양한 후 세포만을 제거하고 세포에서 분비된 세포외기질을 확인하기 위하여 H/E 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이고,

a: 세포를 배양하기 전의 콜라겐 스폰지,

b: 섬유아세포를 접종하고 4주간 배양한 콜라겐 스폰지,

c: 세포외기질만을 남기고 배양된 세포를 제거한 후의 콜라겐 스폰지

도 2는 본 발명에 따라 불용성 (insoluble) 콜라겐으로 제조된 스폰지에 섬유아세포를 배양한 후 세포외기질만을 남기고 세포를 제거하여 제조한 인공진피의 H/E 염색사진 (×200)을 나타낸 것이고,

도 3은 본 발명에 따라 콜라겐 스폰지에 세포를 배양한 후 세포만을 제거하고 세포에서 분비된 콜라겐을 확인하기 위하여 M/T 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이고,

a: 세포를 배양하기 전의 콜라겐 스폰지,

b: 섬유아세포를 접종하고 4주간 배양한 콜라겐 스폰지,

도 4는 본 발명에 따라 콜라겐 스폰지에 세포를 배양한 후 세포만을 제거하고 세포에서 분비된 콜라겐을 확인하기 위하여 A/B 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이고,

a: 세포를 배양하기 전의 콜라겐 스폰지,

b: 섬유아세포를 접종하고 4주간 배양한 콜라겐 스폰지,

도 5는 본 발명에 따라 제조된 키토산이 함유된 콜라겐 스폰지를 M/T (a) 및 A/B (b) 염색한 결과이고,

도 6은 본 발명에 따라 제조된 콜라겐 메쉬에 섬유아세포를 배양한 후 전자현미경으로 관찰한 것이고,

a: 섬유아세포를 2주간 배양한 콜라겐 메쉬,

b: 섬유아세포를 4주간 배양한 콜라겐 메쉬

도 7은 본 발명에 따라 제조된 콜라겐 스폰지에 섬유아세포를 배양하기 전 (a)과 4주간 배양한 후 (b)의 전자현미경 사진을 나타낸 것이고,

도 8a는 in vitro에서 세포를 배양한 후 세포외기질만을 남기고 세포를 제거한 본 발명의 인공장기 제조용 콜라겐 스폰지에 새로이 분비된 GAG의 양을 측정한 결과이고,

도 8b는 도 8a의 인공장기 제조용 콜라겐 스폰지의 콜라게나아제에 대한 분해저항성을 측정한 결과이고,

도 9는 본 발명의 인공장기 제조용 콜라겐 스폰지를 이식한 후 이로부터 얻은 파라핀 포매 절편을 이용하여 in vivo에서 분해정도를 측정한 결과이다.

a: 세포를 배양하기 전의 스폰지가 이식된 동물조직 (대조군)

b: 본 발명의 콜라겐 스폰지가 이식된 동물조직

Claims

콜라겐 기질에 세포를 배양한 후 세포로부터 분비된 세포외기질 (extracellular matrix, ECM)만을 남기고 세포를 제거하여 제조되는, 인공장기 제조용 콜라겐 기질.
삭제
제 1항에 있어서,

콜라겐 기질이 실, 메쉬, 다공성 스폰지 또는 이들의 복합 구조 형태를 갖는 것을 특징으로 하는, 인공장기 제조용 콜라겐 기질.
제 1항에 있어서,

세포가 섬유아세포, 각질형성세포, 케라토사이트, 연골세포, 골세포, 근육세포, 간세포, 줄기세포 (stem cell), 성체세포 (adults cell) 및 불멸화세포주로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 인공장기 제조용 콜라겐 기질.
제 1항에 있어서,

콜라겐 기질에 배양된 세포가 감마 조사법, 글리세롤 처리법 또는 에틸렌 옥사이드 멸균법에 의해 제거되는 것을 특징으로 하는, 인공장기 제조용 콜라겐 기질.
콜라겐 기질에 세포를 배양하는 단계; 및 세포로부터 분비된 세포외기질(extracellular matrix, ECM)만을 남기고 세포를 제거하는 단계를 포함하는, 제 1항의 인공장기 제조용 콜라겐 기질의 제조방법.