KR100782892B1

KR100782892B1 - 표면 개질된 생분해성 폴리에스테르 피엘지에이 스캐폴드및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR100782892B1
Application number: KR1020060082208A
Authority: KR
Inventors: 전흥재
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2006-08-29
Filing date: 2006-08-29
Publication date: 2007-12-06

Abstract

본 발명은 간세포(hepatocyte) 증착을 위해 생분해성 폴리에스테르 PLGA를 표면 개질하였으며, 특히 갈락토오즈를 그라프트한 생분해성 폴리에스테르 PLGA 스캐폴드 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 표면 개질된 생분해성 폴리에스테르 PLGA 스캐폴드는, 세포증식용 스캐폴드에 있어서, 상기 스캐폴드는 생분해성 고분자인 PLGA(poly(D,L-lactic-co-glycolic acid))에 관능기, 커플링제 또는 생물학적 인자를 하나 이상 또는 전부를 그라프트하여 얻어진 세포 증착 및 배양용 스캐폴드로 구성됨을 특징으로 한다.

상기와 같이 구성되는 본 발명의 표면 개질된 생분해성 폴리에스테르 PLGA 스캐폴드는 PLGA의 표면에 리간드-수용체 상호작용에 의하여 간세포의 점착과 기능을 증대시키는 갈락토오스를 그라프트시킴으로 세포의 점착이 증대되며, 특히 상기 갈락토오즈는 간세포의 표면에 존재하는 아시아로그리코프로테인 수용체와의 상호작용을 하여 간세포의 점착을 조정하고 간세포의 기능을 상실을 야기하는 인테그린에 의한 시그널링 경로를 최소화시키는 역할을 하여 그 기능을 증대한다.

스캐폴드, 세포배양, 간세포, PLGA, 갈락토오스.

Description

표면 개질된 생분해성 폴리에스테르 피엘지에이 스캐폴드 및 그의 제조방법{Scaffold using a surface modified PLGA and a preparing emthod thereof}

도 1은 본 발명에 따라 제조된 각 스캐폴드의 FTIR 스펙트럼들로, (A)는 PLGA, (B)는 PLGA-g-AAc, (C)는 PLGA-g-AAc-HD, (D)는 PLGA-g-Galactose에 대한 스펙트럼이고,

도 2는 본 발명에 따라 제조된 각 스캐폴드의 ESCA에 의한 광범위 스캔 스펙트럼들로, (A)는 PLGA, (B)는 PLGA-g-AAc, (C)는 PLGA-g-AAc-HD, (D)는 PLGA-g-Galactose에 대한 스펙트럼이고,

도 3은 PLGA와 PLGA-g-AAc의 C1s 코어 스펙트라(core spectra)이고,

도 4는 PLGA 및 PLGA-g-AAc-HD의 C1s 코어 스펙트라이고,

도 5는 PLGA와 PLGA-g-AAc-HD의 O1s 코어 스펙트라이고,

도 6은 PLGA와 PLGA-g-Galactose의 C1s 코어 스펙트라이고,

도 7은 PLGA와 PLGA-g-Galactose의 O1s 코어 스펙트라이고,

도 8은 간세포 점착 시험의 결과를 나타내는 그래프이고,

도 9 및 10은 스캐폴드 표면에 점착된 간세포의 배양에 대해 각각 1일과 4일에 결과를 나타내는 사진이다.

본 발명은 표면 개질된 생분해성 폴리에스테르 PLGA 스캐폴드 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 자세하게는 간세포(hepatocyte) 증착을 위해 생분해성 폴리에스테르 PLGA를 표면 개질하였으며, 특히 갈락토오즈를 그라프트한 생분해성 폴리에스테르 PLGA 스캐폴드 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

스캐폴드(Scaffold)는 조직 세포의 체외 배양과 체내 이식이 가능하도록 만들어진 물리적 지지체 및 점착 기질을 칭하는 것으로, 이러한 스캐폴드는 인체조직 재생을 위한 세포 이식에 사용되고 있으며, 또한 세포의 대량배양 및 증식에 있어서 그 중요성은 매우 높다. 특히, 최근 조직공학기법을 이용한 스캐폴드에 대한 관심이 높아지고 있는데, 그 이유는 줄기세포 또는 생검으로부터 얻은 세포들이 환자들에게 보다 효과적으로 사용되기 위해서는 체외에서 가능한 많은 수의 세포가 얻어져야 함은 물론 새로운 자기유래의 조직으로 분화가 이루어져야 하는데, 스캐폴드의 사용은 이들을 가능하게 할 수 있는 유일한 방법이기 때문이다. 일반적으로, 대부분의 조직들은 계층적인 여러 가지 세포로 구성되어있으며, 분리시켰을 때 많은 세포들이 작은 규모에서 본래의 형태를 다시 형성할 수 있지만 그 세포들은 큰 형태를 이루기 위해 보조 지지체를 필요로 한다. 이러한 보조 지지체는 합성된 세포외 기질은 생체 내에서나 외에서나 세포를 모아 점착시킬 수 있어야하고 조직으 로 발전시키기 위한 잠재적 장소가 되어야하며 점착된 세포들과 주변의 숙주 세포들이 새로운 조직을 형성할 수 있도록 해주어야 하는 특성을 충분히 발휘할 수 있어야 하는데, 이러한 요구를 가장 잘 충족하는 것으로 생분해성 고분자를 들 수 있다. 이와 같이, 일반적으로 생분해성 고분자는 생체 내에서나 생체 외에서 세포의 점착과 확장을 위한 임시적인 장소를 제공해주기에 세포증식 및 세포분화를 위한 합성 세포외 기질로 사용하기에 좋은 물질이다. 또한, 생분해성 고분자는 정해진 크기나 모양으로 조직을 재생할 수 있는 능력이 있어 스캐폴드로서 더욱 바람직한 물질이다.

이러한 특성을 갖는 생분해성 고분자를 이용한 종래의 관련 특허로는 예를 들어, 대한민국 특허 제2003-0064761호를 들 수 있다. 상기 발명에서는 이식용 진피대체물을 제공하기 위해 세포가 잘 부착하는 생분해성 고분자물질을 사용한다는 것과 사용될 수 있는 이들 생분해성 고분자 물질로는 콜라겐, 젤라틴, 히아루론산(hyaluronic acid) 및 그의 유도체, 키틴, 키토산, 알지네이트(alginate), 피브로넥틴 (fibronetin), 덱스트란의 천연재료와 PLGA(poly(D,L-lactic-co-glycolic acid)), PGA(polyglycolic acid), PLA(poly(lactic acid)) 및 유사 공중합체들, 폴리 ε-카프로락톤(poly ε-caprolactone), 폴리안히드라이드 (polyanhydride), 폴리오르쏘에스터(polyorthoesters), 폴리우레탄(polyurethane)의 합성재료 등을 개시하고 있을 뿐이다.

이와 같이, 종래의 기술에서는 세포증식 등에 생분해성 고분자 물질이 우수하게 사용될 수 있다는 것과 특히 바람직하게 사용될 수 있는 생분해성 고분자 물 질이 개시되어 있을 뿐이며, 세포, 특히 특정세포의 점착과 대량배양 및 기능 증대에 가장 적합할 수 있도록 생분해성 고분자 물질을 조작한 발명에 대해서는 특별히 제안된 바 없다. 한편, 상기 종래 발명에서 예시된 생분해성 고분자 중에서도 PLGA가 생체적합성이 특히 우수하며, 락티드(lactide)와 글리코리드(glycolide)의 비율을 조정하여 기계적물성과 분해속도를 쉽게 조절할 수 있다는 장점을 가지고 있다.

따라서, 본 발명자 등은 상기한 종래기술을 기초로 하여 특히 특정세포의 점착과 대량배양 및 기능 증대에 가장 적합할 수 있도록 생분해성 고분자인 PLGA를 개질하고 이를 이용한 스캐폴드 및 그 제조방법에 대해 예의 연구하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 특히 특정세포의 점착과 대량배양 및 기능 증대에 가장 적합할 수 있도록 생분해성 고분자인 PLGA를 개질한 것을 이용한 스캐폴드를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 특성을 갖는 스캐폴드를 보다 용이하게 제조할 수 있는 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기한 본 발명의 목적은 생분해성 고분자 중에서도 PLGA가 생체적합성이 특히 우수하며, 기계적 물성과 분해속도를 쉽게 조절할 수 있다는 점과 이러한 장점이 있는 PLGA에 세포와의 상호작용을 증대시킬 수 있는 생물학적 인자를 도입한다 면 세포-기질간의 상호작용의 극대화에 의한 세포점착의 기능을 더한층 증대시킬 수 있다는 사실을 이용함으로 달성되었다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 표면 개질된 생분해성 폴리에스테르 PLGA 스캐폴드는;

세포증식용 스캐폴드에 있어서, 상기 스캐폴드는 생분해성 고분자인 PLGA(poly(D,L-lactic-co-glycolic acid))에 관능기, 커플링제 또는 생물학적 인자를 하나 이상 또는 전부를 그라프트하여 얻어진 세포 증착 및 배양용 스캐폴드로 구성됨을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구성에 따르면, 상기 관능기는 아크릴산(AAc)이고, 상기 커플링제는 핵산디아민(Hexanediamine; HD)이고, 생물학적 인자는 갈락토오스(Galactose)임을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구성에 따르면, 상기 세포는 간세포(hepatocyte)임을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위한 스캐폴드의 제조방법은;

PLGA(poly(D,L-lactic-co-glycolic acid))를 폴리에틸렌 글리콜과 혼합하여 삼차원의 PLGA 스캐폴드를 제조하는 단계,

상기 PLGA 스캐폴드에 플라즈마화된 아크릴산을 증착하는 단계,

상기 아크릴산이 증착된 PLGA 스캐폴드를 핵산디아민을 포함하는 완충액에 침지하는 단계, 및

상기 침지단계에 의해 아민화된 스캐폴드에 락토바이오닉산(lactobionic acid)을 첨가하여 반응을 종료한 후 세척 및 건조하는 단계로 구성됨을 특징으로 한다.

상기와 같이 구성되는 본 발명의 표면 개질된 생분해성 폴리에스테르 PLGA 스캐폴드는 세포 혹은 조직이식용 스캐폴드로서 널리 사용되고 있는 PLGA의 표면에 리간드-수용체(ligand-receptor) 상호작용에 의하여 세포, 특히 간세포의 점착과 기능을 증대시키는 아크릴산, 핵산디아민 또는 갈락토오즈를 그라프트 시킴으로 세포의 점착이 증대되며, 특히 상기 갈락토오즈는 간세포의 표면에 존재하는 아시아로그리코프로테인 수용체(asialoglycoprotein receptor)와의 상호작용을 하여 간세포의 점착을 조정하고 간세포의 기능을 상실을 야기하는 인테그린(integrin)에 의한 시그널링 경로(signaling pathway)를 최소화시키는 역할을 하여 그 기능을 증대한다. 또한, 본 발명의 제조 방법에 따르면, PLGA의 표면에 갈락토오즈를 그라프트시키기 위하여, 관능기가 없는 PLGA의 표면에 수용성단량체인 아크릴산(AAc)을 그라프트시켜 관능기를 도입하였으며, 갈락토오즈의 하이드록시기가 카르복실그룹으로 치환된 락토바이오닉산(lactobionic acid)을 핵산디아민을 커플링제(coupling agent)로 사용하여 그라프트시켰으며, 그 결과 종래 PLGA 스캐폴드의 단점인 소수성이 한층 완화되었으며, 간세포의 점착능이 대폭 향상되었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 자세히 설명하지만 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

삼차원 PLGA 스캐폴드의 제조

PLGA(75:25. MW 90000~126000 ; Sigma)를 폴리에틸렌글리콜(PEG; MW 2,000; Sigma)와 4:6의 비율로 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)에 녹인 다음, 호모믹서(rpm; 10,000)를 사용하여 혼합한다. 혼합물은 PTFE(poly(tetrafluoroethylen)) 틀에 부어 주조된 후, 진공건조시킨다. 건조된 스캐폴드는 혼합된 PEG를 용해시킬 수 있는 에탄올 용액에 72시간 동안 침지 및 교반시킨다. PEG가 에탄올에 의하여 용출된 스캐폴드는 다시 진공 건조하여 흡수된 에탄올을 제거시켜, PLGA 스캐폴드를 완성한다.

실시예 2

PLGA-g-AAc 스캐폴드의 제조

생분해성 폴리에스테르 계열의 고분자는 PLA, PGA 그리고 이들의 공중합체인 PLGA로 구분된다. PLA 및 PGA의 경우, 이들 고분자의 표면에 아크릴산 및 다른 비닐계모노머를 그라프트시키기 위하여, 표면에 플라즈마 혹은 자외선을 사용하여 퍼록시드(peroxide) 그룹을 도입하고 그 후, 60℃이상으로 가열된 모노머용액에 폴리 머를 침지시키는 방법을 사용하였다. 즉, 비닐계모노머의 그라프트중합을 위하여, 퍼록시드를 도입 후, 열에 의한 퍼록시드의 분해에 의한 모노머의 중합을 사용하였다. 그러나 공중합체인 PLGA의 경우 열에 약한 관계로 상기의 방법을 도입시키기는 어려운 실정이다. 따라서, 본 실시예에서는 아크릴산을 도입하기 위하여 ICP-CVD를 사용하였다. 즉, 반응기 내의 온도는 상온으로 유지하는 반면, 모노머콘테이너의 온도를 상승시켜 기화 및 플라즈마화된 AAc를 상기 실시예 1에서 제조된 PLGA 스캐폴드 표면에 직접 그라프트시켰다. 증착에 앞서 반응기는 1.33×10^-5 Pa의 진공상태로 유지하였으며, AAc 단량체가 들어있는 용기는 증발이 잘 일어날 수 있도록 외벽을 예열시키기 위하여 80±2℃로 가열한다. 매스 플로우 컨트롤러(Mass flow controller)에 의해 고정된 공급율(feeding rate)로 증발된 단량체 기체들은 아르곤 가스와 함께 플라즈마화되어 주입되었다. 아르곤 가스는 전리기체를 연소시킴과 동시에 단량체를 플라즈마화하여 PLGA 스캐폴드 표면에 단량체를 증착시키는 결과를 가져온다. 다른 과정들의 변수들은 고정되었다. 증착압력은 1.2×10^-2Pa, r.f.power는 30W, 아르곤, AAc 개스 유동비(flow rate)는 5cm³min^-1(sccm), 증착시간은 2분 이였다.

실시예 3

PLGA-g-AAc-HD 스캐폴드의 제조

갈락토오즈의 커플링반응에 의한 갈락토오즈를 상기 실시예 2에서 제조된 스 캐폴드 표면에 도입시키기 위해 먼저 갈락토오즈와 글루코노락톤(gluconolactone)이 결합된 형태인 락토바이오닉산(lactobionicacid)을 사용하였으며 두 물질의 결합을 위해 커플링제로서 핵산 디아민(hexane diamine)을 사용하였다.

우선 상기 실시예 2에서 제조된 PLGA-g-AAc 스캐폴드를 지름 15mm정도의 원형으로 잘라 1mg 핵산 디아민이 포함된 인산 나트륨 완충액(0.1M, pH8.0, 1.0mL)에 침지시킨 후 건조하여 PLGA-g-AAc-HD 스캐폴드를 얻었다.

실시예 4

PLGA-g-Galactose 스캐폴드의 제조

상기 실시예 3에 의해 핵산디아민에 의하여 아민화가 확인된 스캐폴드에 1mg 락토바이오닉산을 첨가하여 36시간 후에 반응을 종료시켰다. 반응종료 후 미반응 물질을 제거하기 위하여 증류수로 여러 차례 세척하고 건조하여 PLGA-g-Galactose 스캐폴드를 얻었다.

실험예 1

제조된 스캐폴드의 확인

가) FTIR에 의한 스캐폴드의 분석

상기 각 실시예에서 얻어진 스캐폴드의 표면 처리된 시료들을 multi-reflection ATR이 장치된 Nicolet Avatar 360 FTIR을 사용하여 그라프트된 아크릴산, 핵산디아민 그리고 갈락토오스의 주요 관능기의 피크를 확인함으로서 스캐폴드 표면에서 그라프트 반응이 일어났음을 확인하였으며. 결과는 도 1에 나타냈다.

도 1은 실시예 1 내지 4에서 얻어진 스캐폴드의 FTIR 스펙트럼이다. 도 1에나타난 바와 같이, 실시예 1에 따라 얻어진 PLGA 스캐폴드의 IR 스펙트럼(도 1의(A))을 살펴보면 1750 cm^-1부근에의 C=O stretching band, 1397 cm^-1에서 C-H bending vibration 및 1456 cm^-1에서 메틸 기에 의한 특성 밴드를 살펴볼 수 있다. 도 1의 (B)는 실시예 2에 따라 제조된 PLGA-g-AAc 스캐폴드의 IR 스펙트럼이다. AAc 역시 PLGA와 마찬가지로 C=O stretching band를 1710 cm^-1주변에 지니고 있었다. 따라서 PLGA-g-AAc 스캐폴드의 경우 부가처리과정을 거치지 않으면 IR상으로 AAc가 PLGA에 그라프트되었다는 것을 확인할 수가 없다. 따라서 본 실험에서는 AAc의 COOH기를 NaOH를 사용하여 염화 하였다. 즉, AAc의 COOH기를 NaOH에 의하여 COO^-Na⁺의 형태로 치환시킨 다음 IR에 의한 정성분석을 수행하였다. 그 결과, PLGA-g-AAc의 경우 C=O stretching band를 1640 cm^- ¹주변에 지니고 있다. 따라서 AAc가 PLGA에 성공적으로 그라프트됨을 확인하였다. 실시예 3에 따라 얻어진 PLGA-g-AAc-HD 스캐폴드의 경우(도 1의 (C)참고), 헥사디아민이 AAc의 카르복실기와 축합됨을 확인하는 아미드 기(amide group)의 특성 밴드인 1610과 1670 cm^-1에서의 스펙트라를 확인하였다.

상기 실시예 4에 따라 얻어진 스캐폴드 표면에 갈락토오스가 그라프트된 FTIR 스펙트럼은 도 1의 (D)에 도시되어 있다. 3400 cm^-1 주변에서의 수산기의 흡수 밴드(adsorption band)가 두드러지며, 1550과 1645 cm^-1에서의 아미드 밴드에 기인하는 특성 피크들이 보인다.

이상의 결과에 의하여, PLGA에 AAc, 핵산디아민 그리고 갈락토오스가 상기 각 실시예에 따라 성공적으로 그라프트되었음을 확인할 수 있다.

나) ESCA에 의한 스캐폴드의 분석

상기 가)에서 설명된 FTIR-ATR은 고분자 표면의 화학반응에 따른 조성변화에 매우 민감하지만, PLGA의 카르복실 에스테르 밴드(Carboxyl ester band)와 물리화학적 인자 및 생물학적인자의 C=O 밴드와 서로 중첩이 되는 이유로, 보다 정확한 표면분석법을 필요하게 된다. 또한 AAc, 핵산디아민 그리고 갈락토오스등이 스캐폴드 표면에 공중합된 경우, 정량 및 정성분석은 FTIR에만 의존할 수는 없다. 따라서 본 실험에서는 ESCA(Physical Electronic PHI 558)를 사용하여 PLGA, PLGA-g-AAc, PLGA-g-AAc-HD 그리고 PLGA-g-Galactose의 조성변화에 대한 정밀 분석을 실시하였다. X-ray 빔의 소스는 10 ㎸-30 ㎃의 모노크로메이트화된 빔(monochromatized beam)이 마그네슘 아노드(magnesium anode)에 의하여 조사되었으며, 0-1000 eV 까지 광범위 스캔(scan) 된 다음, 20 eV 영역으로 다시 고해상(high-resolution) 스캔이 되어, C1s, O1s 및 N1s를 취하고, 각 피크의 면적을 계산하여, 표면의 조성변화를 확인하였다.

도 2에는 각 실시예에 의해 제조된 PLGA, PLGA-g-AAc, PLGA-g-AAc-HD 그리고 PLGA-g-Galactose 스캐폴드의 ESCA에 의한 광범위 스캔 스펙트라가 도시되어 있다. 고 2의 (A)와 (B)에서 각각 286과 532 eV에서 C1s와 O1s 스펙트라를 보여주고 있다. 왜냐하면 PLGA와 PLGA-g-AAc 모두 카르보닐 기를 지니고 있기 때문에 비슷한 ESCA의 와이드 스펙트라를 보이고 있다. 도 2의(C)와 (D)에서는 PLGA-g-AAc-HD와 PLGA-g-Galactose의 ESCA 서베이 스캔(survey scan)을 나타내는 것으로 PLGA의 표면에 아미드 기의 존재를 확인시켜주는 400과 399.6 eV에서 여분의 피크가 나타났다. 도 3에는 PLGA와 PLGA-g-AAc의 C1s 코어 스펙트라(core spectra)가 도시되어 있다. 도 3의 (A)에서는 PLGA의 특성 피크로 285 eV에서의 C-C, 286.8 부근에서의 C-O, 그리고, 289.4부근에서의 O-C=O가 그 주류를 이루고 있다. PLGA-g-AAc (도 3의 (B))의 경우 PLGA (도 3의 (A))와 비교해 보면, O-C=O에 해당하는 286.8 eV에서의 피크가 증가했고, PAAc의 카르복실 기의 중첩에 의하여 289.9eV로 피크가 이동하였다.

도 4에는 PLGA 및 PLGA-g-AAc-HD의 C1s 코어 스펙트라가 도시되어 있다. PLGA의 특성 피크로서 285eV에서의 C-C, 286.8 부근에서의 C-O, 그리고, 289.4 부근에서의 O-C=O가 도시되어 있다. 하지만 PLGA-g-AAc-HD (도 4의 (B))의 경우, N-C=O에 해당하는 288.5 eV에서 하나 더 많은 C1s 피크를 보이고 있다.

도 5에서도 역시 PLGA의 O1s 코어 스펙트라에서는 나타나지 않은 N-C=O에 해당하는 531.24 eV에서 여분의 O1s 피크를 확인할 수 있었다.

PLGA-g-Galactose의 C1s 코어 스펙트라인 도 6의 (B)에서는 287.5 와 288.5 eV에서 여분의 피크가 나타났다. 이것은 각각 N-C-O와 N-C=O 기에 해당하는 것이 다. O1s 코어 스펙트라인 도 7에서도 마찬가지로 PLGA에서는 나타나지 않은 2 개의 피크로 N-C=O에 해당하는 531.15 eV와 -OH에 해당하는 533.06 eV에서 나타났다.

다) 표면처리에 의한 세포-구조체의 표면 물성변화

각 실시예에 따라 표면 처리된 시료들의 친수성도는 접촉각과 임계표면장력의 측정에 의하여 이루어졌다. Erma의 접촉각 측정미터(contact angle meter) G-1을 사용하여 시료표면의 증류수 및 요오드화 메틸렌(methylene iodide) 대한 접촉각을 측정하였고, 오웬스(Owens) 식에 의하여 각 시료의 임계표면장력을 계산하여 다음 표 1에 나타냈다.

표면 처리된 스캐폴드의 임계 표면 장력

시료	접촉각	임계표면장력 (dyn/cm)
실시예 1(PLGA)	65	45
실시예 2(PLGA-g-AAc)	39	60.5
실시예 4(PLGA-g-Galactose)	31	67

상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1의 PLGA 스캐폴드에 대한 접촉각(water contact angle)은 약 65도로서 비교적 소수성의 표면을 보여주며, 그 임계표면장력은 45dyn/cm이다. AAc 그룹이 도입된 시료인 실시예 2의 PLGA-g-AAc의 경우 접촉각이 39도로서, PLGA 보다, 현저히 감소하였음을 보여주며, 갈락토오즈가 처리된 실시예 4의 시료는 접촉각이 31도로서 최고치의 임계표면장력의 값을 보이고 있다. 상기의 결과들을 바탕으로 PLGA 스캐폴드 표면을 AAc 그리고 갈락토오스로 표면개질을 함으로써 친수성이 현저히 증가함을 확인할 수 있다.

실험예 2

세포 점착도 시험

세포 점착도의 실험 방법은 각 실시예에 따라 얻어진 스캐폴드가 넣어져 있는 24 웰 플레이트(well plate)에 1×10⁵ cell/㎖의 프라이머리 랫트(primary rat) 간세포를 시딩(seeding) 하였고 이것을 4, 8, 12, 24시간 동안 CO₂ 인큐베이터에서 배양한 후 배지를 모두 제거하였다. 그리고 0.9% 생리식염수로 10분씩 3번 세척한 후, 0.05% 트립신 처리하여 T75 플라스크에서 세포를 떼어냈다. 새 배지를 첨가하여 잘 재현탁 시킨 후 1.5㎖ 튜브로 옮겨 담아서 1000rpm에서 5분간 원심 분리하여 세포를 수득하였다. 상층액은 버리고 펠렛(pellet) 만 잘 남긴 후 테이핑하여 펠렛을 잘 풀어 준 후 각각 배지 1㎖를 가하여 펠렛을 재현탁하였다. 이 현탁액을 보르텍스(vortex)한 후 100㎕만 취하여 새 튜브로 옮기고 100㎕의 트리판 블루(trypan blue)를 넣고 잘 보르텍스한 후 혈구계산기(hemocytometer)를 이용하여 세포를 계수하였다. 세포 계수 후 점착된 세포 : 접종된 세포의 비를 계산하여 도 8에 결과를 표시하였으며, 점착된 세포의 형태는 도 9 및 10에 도시하였다.

PLGA는 소수성이기 때문에 수용액 내에서 높은 계면 자유 에너지를 가지게 되고 이로 인하여 세포의 부착 및 성장에 좋지 않은 영향을 미친다. 예를 들면 배양액, 세포 현탁액 및 세포 배양에 관계되는 액 등에 잘 젖지 않는다. 따라서 배양액이 젖지 않은 부분에는 세포가 배양되지 못하고 대부분의 구멍이 그대로 남게 되어 장기 형성이 되지 못하는 경우가 종종 발생된다. 이런 이유로 본 발명에서는 생분해성 고분자인 PLGA의 표면에 다양한 종류의 표면 개질을 시도하였고, 그 표면에 간세포가 어느 정도의 점착도를 보이는지 비교하였으며, 그 결과 간세포는 PLGA-g-Galactose 스캐폴드에 가장 잘 점착되었음을 알 수 있었고, 그 다음은 PLGA-AAc-HD>PLGA-AAc>PLGA 순으로 많은 세포가 점착됨을 알 수가 있었다. 갈락토오스는 간세포의 표면에 존재하는 아시알로글리코프로테인 수용체와의 상호작용을 하여 간세포의 점착을 조정하며, 점착에 주요소인 인테그린에 의한 시그널링 경로를 최소화 시키는 역할을 한다. 각각 실시예 3 및 실시예 2의 핵산디아민이나 AAc을 이용한 표면 개질 스캐폴드는 정전기적 인력에 의한 단백질의 증착과 친수성 증가로 인해 PLGA보다는 높은 세포 증착률을 보이는 것으로 사료된다. 결론적으로 PLGA의 표면 개질이 세포 점착률을 증가시킴을 확인할 수 있었다.

상기와 같이 구성되는 본 발명의 표면 개질된 생분해성 폴리에스테르 PLGA 스캐폴드는 PLGA의 표면에 리간드-수용체 상호작용에 의하여 간세포의 점착과 기능을 증대시키는 아크릴산, 핵산디아민 또는 갈락토오즈, 가장 바람직하기로는 갈락토오스를 그라프트 시킴으로 세포의 점착이 증대되며, 특히 상기 갈락토오즈는 간세포의 표면에 존재하는 아시아로그리코프로테인 수용체와의 상호작용을 하여 간세포의 점착을 조정하고 간세포의 기능을 상실을 야기하는 인테그린에 의한 시그널링 경로를 최소화시키는 역할을 하여 그 기능을 증대한다. 또한, 본 발명의 제조 방법 에 따르면, PLGA의 표면에 갈락토오즈를 그라프트시키기 위하여, 관능기가 없는 PLGA의 표면에 수용성단량체인 아크릴산(AAc)을 그라프트시켜 관능기를 도입하였으며, 갈락토오즈의 하이드록시기가 카르복실그룹으로 치환된 락토바이오닉산(lactobionic acid)을 핵산디아민을 커플링제로 사용하여 그라프트시켰으며, 그 결과 종래 PLGA 스캐폴드의 단점인 소수성이 한층 완화되었으며, 간세포의 점착능이 대폭 향상되었다.

Claims

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세포증식용 스캐폴드에 있어서, 상기 스캐폴드는 생분해성 고분자인 PLGA(poly(D,L-lactic-co-glycolic acid))에 아크릴산(AAc), 핵산디아민(Hexanediamine; HD) 또는 갈락토오스(Galactose)를 하나 이상 또는 전부를 그라프트하여 얻어진 세포 증착 및 배양용 스캐폴드로 구성됨을 특징으로 하는 표면 개질된 생분해성 폴리에스테르 PLGA 스캐폴드.
제 2항에 있어서, 상기 세포는 간세포(hepatocyte)임을 특징으로 하는 표면 개질된 생분해성 폴리에스테르 PLGA 스캐폴드.
PLGA(poly(D,L-lactic-co-glycolic acid))를 폴리에틸렌 글리콜과 혼합하여 삼차원의 PLGA 스캐폴드를 제조하는 단계,

상기 PLGA 스캐폴드에 플라즈마화된 아크릴산을 증착하는 단계,

상기 아크릴산이 증착된 PLGA 스캐폴드를 핵산디아민을 포함하는 완충액에 침지하는 단계, 및

상기 침지단계에 의해 아민화된 스캐폴드에 락토바이오닉산(lactobionic acid)을 첨가하여 반응을 종료한 후 세척 및 건조하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 표면 개질된 생분해성 폴리에스테르 PLGA 스캐폴드의 제조방법.